RU2406757C1

RU2406757C1 - Rhodosporidium diobovatum yeast strain - carotenoid producer

Info

Publication number: RU2406757C1
Application number: RU2009126299/10A
Authority: RU
Inventors: Михаил Михайлович Вустин (RU); Михаил Михайлович Вустин; Марина Александровна Великая (RU); Марина Александровна Великая; Сергей Павлович Синеокий (RU); Сергей Павлович Синеокий
Priority date: 2009-07-10
Filing date: 2009-07-10
Publication date: 2010-12-20

Abstract

FIELD: chemistry; biochemistry.

SUBSTANCE: invention relates to biotechnology, particularly microbiology. The Rhodosporidium diobovatum VKPM Y - 3159 strain is cultured on a culture medium containing sources of carbon, nitrogen and mineral salts for 72 hours. Biomass containing carotenoids in amount 5.0-6.5 mg/g of dry biomass is obtained, including β-carotene in amount of 3.0-4.5 mg/g of dry biomass.

EFFECT: wider range of yeast strains which produce carotenoids with higher specific productivity, possibility of growing the strain on such cheap substrates as distillery stillage and fermentolysate of plant wastes.

2 ex

Description

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам производства каротиноидов, и касается нового штамма дрожжей, используемого для получения кормовой биомассы, обогащенной каротиноидами и применяемой в животноводстве, а также для получения чистых каротиноидов, применяемых в пищевой промышленности и медицине.The invention relates to the microbiological industry, in particular to methods for the production of carotenoids, and relates to a new strain of yeast used to produce feed biomass enriched in carotenoids and used in animal husbandry, as well as to obtain pure carotenoids used in food industry and medicine.

Среди дрожжей известны различные продуценты каротиноидов, отличающиеся как по уровню накопления и составу пигментного комплекса, так и по условиям культивирования и по видам используемого сырья.Among the yeast, various carotenoid producers are known, differing both in the level of accumulation and composition of the pigment complex, and in the cultivation conditions and in the types of raw materials used.

Штамм дрожжей Rhodotorula glutinis 214 (SU 531844) выращивают на минеральной среде с использованием в качестве источника углерода углеводородов нефти (1,0-1,5 об.%) или углеводов (2-4 об.%). При этом удельная продуктивность дрожжей по каратиноидам составляет около 800 мкг/г сухой биомассы на среде с углеводородами нефти и около 980 мкг/г сухой биомассы на углеводной среде. Недостатком данного штамма является невысокий уровень накопления каротиноидов.The yeast strain Rhodotorula glutinis 214 (SU 531844) is grown on a mineral medium using petroleum hydrocarbons (1.0-1.5 vol.%) Or carbohydrates (2-4 vol.%) As a carbon source. In this case, the specific yeast productivity of carotenoids is about 800 μg / g dry biomass in a medium with oil hydrocarbons and about 980 μg / g dry biomass in a carbohydrate medium. The disadvantage of this strain is the low level of accumulation of carotenoids.

Штамм дрожжей Sporobolomyces pararosens Т (SU 391174), растущий на среде гидролизат верхового торфа, на 5-ые сутки культивирования штамм накапливает до 3200 мкг каротиноидов с 1 литра культуральной среды. Недостатками данного штамма являются невысокий уровень накопления каротиноидов и большая продолжительность процесса культивирования.The strain of yeast Sporobolomyces pararosens T (SU 391174), growing on a peat hydrolyzate medium, on the 5th day of cultivation, the strain accumulates up to 3200 μg of carotenoids from 1 liter of culture medium. The disadvantages of this strain are the low level of accumulation of carotenoids and the long duration of the cultivation process.

Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому результату является штамм дрожжей Rhodosporidium diobovatum (RU 2103351), который за 72 часа культивирования на минеральной среде синтезирует каротиноиды в количестве до 2000 мкг/г сухой биомассы, 50% из которых составляет β-каротин - провитамин А, являющийся наиболее ценным для использования в животноводстве в качестве фактора роста. Недостатком данного штамма являются его невысокая удельная продуктивность по каротиноидам.The closest to the invention in technical essence and the achieved result is a strain of the yeast Rhodosporidium diobovatum (RU 2103351), which in 72 hours of cultivation on a mineral medium synthesizes carotenoids in an amount of up to 2000 μg / g dry biomass, 50% of which is β-carotene - provitamin And, which is the most valuable for use in livestock as a growth factor. The disadvantage of this strain is its low specific productivity for carotenoids.

Технической задачей заявляемого изобретения является получение штамма дрожжей Rhodosporidium diabovatum, имеющего высокую удельную продуктивность по каротиноидам.The technical task of the invention is to obtain a strain of the yeast Rhodosporidium diabovatum having high specific carotenoid productivity.

Поставленная задача решена путем создания штамма дрожжей Rhodosporidium diabovatum ВКПМ Y-3159, имеющего удельную продуктивность по каротиноидам 5000-6500 мкг/г сухой биомассы.The problem is solved by creating a strain of the yeast Rhodosporidium diabovatum VKPM Y-3159, having a specific productivity for carotenoids of 5000-6500 μg / g of dry biomass.

Заявляемый штамм получен из коллекционного штамма Rhodosporidium diobovatum ВКПМ Y-305 путем обработки его нитрозогуанидином (НГ) и последующей многоступенчатой селекции (шесть циклов), при которой отбор мутантов осуществлялся визуально по интенсивности окраски.The inventive strain was obtained from the collection strain Rhodosporidium diobovatum VKPM Y-305 by treating it with nitrosoguanidine (NG) and subsequent multi-stage selection (six cycles), in which mutants were selected visually by color intensity.

Штамм депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) под регистрационным номером ВКПМ Y - 3159.The strain is deposited in the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) under registration number VKPM Y - 3159.

Культурально-морфологические признаки.Cultural and morphological characters.

На жидкой среде мальтэкстракт (Difco) 3-дневная культура при 22°С имеет клетки от овальных до сильно вытянутых размером (1,0-6,0)×(2,0-9,0) мкм. Часто встречается псевдомицелий. Культура способна образовывать небольшой осадок.On a liquid medium, the malt extract (Difco) 3-day culture at 22 ° C has cells from oval to very elongated in size (1.0-6.0) × (2.0-9.0) microns. Pseudomycelia is often found. The culture is able to form a small precipitate.

На агаризованной среде мальтэкстракт (Difco) после семи дней выращивания при 25°С клетки морфологически сходны с клетками на жидком мальтэкстракте. Колонии ярко-оранжевого цвета с шероховатой поверхностью и неровным краем.On an agar medium, malt extract (Difco) after seven days of growth at 25 ° C, cells are morphologically similar to cells on liquid maltextract. Colonies are bright orange with a rough surface and an uneven edge.

На среде кукурузный агар (Difco) культура через 7 суток выращивания при 25°С способна образовывать истинный мицелий.On medium, corn agar (Difco) culture after 7 days of cultivation at 25 ° C is able to form true mycelium.

Физиолого-биохимические признаки.Physiological and biochemical characteristics.

На среде YNB (Difco) культура ассимилирует галактозу, сахарозу, мальтозу, целлобиозу, трегалозу, рафинозу, D-ксилозу, L-арабинозу, D-рибозу, рибитол, янтарную кислоту, лимонную кислоту, мелицитозу, α-метил-d-глюкозид, арбутин, крахмал (медленно). Не ассимилирует лактозу, L-рамнозу, эритритол, D-манитол, инозитол, мелибиозу. Утилизирует аммонийный нитратный азот. Для роста не требует витаминов. На среде с 50%-ной глюкозой рост отсутствует. Крахмал не накапливает. Мочевину разлагает. Брожение отсутствует. При температуре 35°С не растет. Оптимальная температура роста 29-30°С. Диапазон рН для роста 2,5-7,0. Оптимум рН 5,0-5,5. Аэроб.On YNB medium (Difco), the culture assimilates galactose, sucrose, maltose, cellobiose, trehalose, raffinose, D-xylose, L-arabinose, D-ribose, ribitol, succinic acid, citric acid, melicitose, α-methyl-d-glucoside, arbutin, starch (slow). Does not assimilate lactose, L-rhamnose, erythritol, D-mannitol, inositol, melibiosis. Utilizes ammonium nitrate nitrogen. It does not require vitamins for growth. On a medium with 50% glucose, growth is absent. Starch does not accumulate. Urea decomposes. No fermentation. At a temperature of 35 ° C does not grow. The optimum growth temperature is 29-30 ° C. The pH range for growth is 2.5-7.0. The optimum pH is 5.0-5.5. Aerobe.

Штамм непатогенен.The strain is non-pathogenic.

Биотехнологическая характеристика.Biotechnological characteristic.

Штамм способен продуцировать каротиноидов до 6,5 мг/г сухой биомассы, в том числе β-каротина до 4,5 мг/г.The strain is capable of producing carotenoids up to 6.5 mg / g dry biomass, including β-carotene up to 4.5 mg / g.

В ферментере на глюкозе в качестве единственного источника углерода штамм способен накапливать более 100 г сухой биомассы с 1 л питательной среды.In a glucose fermenter, as a sole carbon source, a strain is able to accumulate more than 100 g of dry biomass from 1 liter of culture medium.

Штамм хранится в 10% глицерине при - 70°С в кельвинаторе или парах жидкого азота без потери жизнеспособности в течение 10 лет.The strain is stored in 10% glycerol at - 70 ° C in a kelvinator or vapor of liquid nitrogen without loss of viability for 10 years.

Пример 1. Культивирование штамма Rhodosporidium diobovatum ВКПМ Y - 3159 в колбах.Example 1. Cultivation of a strain of Rhodosporidium diobovatum VKPM Y - 3159 in flasks.

Штамм дрожжей культивируют в колбах на 750 мл при температуре 28°С при 250 об/мин на питательной среде следующего состава (мас.%): глюкоза - 10,0; дрожжевой экстракт - 0,6; пептон - 0,5; KH₂PO₄ - 0,1; MgSO₄ - 0,05, NaCl - 0,01; CaCl₂ - 0,01; вода - остальное. Время выращивания 72 ч.The yeast strain is cultivated in 750 ml flasks at a temperature of 28 ° C at 250 rpm on a nutrient medium of the following composition (wt.%): Glucose - 10.0; yeast extract - 0.6; peptone - 0.5; KH ₂ PO ₄ - 0.1; MgSO ₄ - 0.05; NaCl - 0.01; CaCl ₂ - 0.01; water is the rest. Growing time 72 hours

Удельное суммарное содержание каротиноидов определяют спектрофотометрическим методом (J. Gen. Microbiol. 1979. V.115. P.173-183), для определения процентного соотношения каротиноидов в смеси используют жидкостную хроматографическую систему HPLC (колонка С-18), применяя в качестве стандарта чистый кристаллический препарат β-каротина фирмы "Sigma".The specific total carotenoid content is determined spectrophotometrically (J. Gen. Microbiol. 1979. V.115. P.173-183), to determine the percentage of carotenoids in the mixture using HPLC liquid chromatographic system (column C-18), using as standard Pure crystalline preparation of β-carotene from Sigma.

Удельная продуктивность каротиноидов составила 6000 мкг/г сухой биомассы, в том числе β-каротина 4440 мкг/г сухой биомассы.The specific productivity of carotenoids was 6000 μg / g dry biomass, including β-carotene 4440 μg / g dry biomass.

Пример 2. Культивирование штамма Rhodosporidium diobovatum ВКПМ Y - 3159 в ферментере.Example 2. Cultivation of a strain of Rhodosporidium diobovatum VKPM Y - 3159 in a fermenter.

Штамм дрожжей выращивали в 3-х литровом ферментере КФ 103/4 (Россия) на питательной среде по примеру 1. Условия культивирования: температура культивирования - 28°С, растворимый кислород рО₂ 40-60%, рН=5,0, подпитка 50% глюкозой в течение всего процесса. Время выращивания 72 ч.The yeast strain was grown in a 3-liter fermenter KF 103/4 (Russia) on a nutrient medium according to example 1. Cultivation conditions: cultivation temperature - 28 ° C, soluble oxygen pO ₂ 40-60%, pH = 5.0, recharge 50 % glucose throughout the process. Growing time 72 hours

Содержание каротиноидов в биомассе составило 5850 мкг/г сухой биомассы, в том числе β-каротина 4270 мкг/г сухой биомассы. Уровень сухой биомассы составил 110 г/л питательной среды. Следовательно, съем с литра культуральной жидкости составил 0,65 г суммарных каротиноидов, в том числе 0,47 г β-каротина.The carotenoid content in the biomass was 5850 μg / g dry biomass, including β-carotene 4270 μg / g dry biomass. The dry biomass level was 110 g / l of nutrient medium. Therefore, I will eat 0.65 g of total carotenoids per liter of culture fluid, including 0.47 g of β-carotene.

Таким образом, заявляемый штамм имеет высокую удельную продуктивность по каротиноидам, среди которых β-каротин составляет более 70%. Важной характеристикой штамма является также его способность хорошо утилизировать спирты, органические кислоты и некоторые пентозы, что позволяет выращивать его на таких дешевых субстратах, как послеспиртовая барда и ферментолизат растительных отходов.Thus, the inventive strain has a high specific productivity for carotenoids, among which β-carotene is more than 70%. An important characteristic of the strain is its ability to utilize alcohols, organic acids, and some pentoses well, which makes it possible to grow it on such cheap substrates as post alcohol alcohol and fermentolizate of plant wastes.

Claims

The yeast strain Rhodosporidium diobovatum VKPM Y - 3159 is a producer of carotenoids.