RU2404242C1

RU2404242C1 - Method for faster formation of callus in mammals

Info

Publication number: RU2404242C1
Application number: RU2009141384/10A
Authority: RU
Inventors: Людмила Борисовна Буравкова (RU); Людмила Борисовна Буравкова; Александр Самуилович Капланский (RU); Александр Самуилович Капланский; Елена Ромуальдовна Андреева (RU); Елена Ромуальдовна Андреева; Мария Петровна Валюшкина (RU); Мария Петровна Валюшкина; Анатолий Иванович Григорьев (RU); Анатолий Иванович Григорьев
Priority date: 2009-11-10
Filing date: 2009-11-10
Publication date: 2010-11-20

Abstract

FIELD: veterinary science.

SUBSTANCE: multipotent mesenchymal stromal cells (MMSC), previously cultivated under the following gas conditions, are added to the area of fracture: 5% O₂, 5% CO₂, 90% N₂.

EFFECT: invention makes it possible to accelerate process of callus formation.

1 dwg, 1 tbl, 1 ex

Description

Изобретение относится к области биотехнологии и ветеринарии, а именно к способу ускоренного формирования костной мозоли у млекопитающих.The invention relates to the field of biotechnology and veterinary medicine, and in particular to a method for accelerated formation of bone marrow in mammals.

В настоящее время возможность использования технологий клеточной и тканевой инженерии для улучшения заживления и восстановления функциональной активности ткани при различных повреждениях опорно-двигательного аппарата вызывает все больший интерес [1, 4, 8]. Поиск в этой области ведется, в основном, по двум направлениям: совершенствование носителей для доставки клеточного материала в область повреждения и направленное изменение свойств самих клеток, вводимых в область дефекта. Изменение свойств клеток может осуществляться как с помощью введения дополнительного генетического материала [10], так и за счет модификации свойств клеток, вызванных изменением параметров окружающей их среды [11]. Улучшение регенерации костной ткани после введения в область дефекта ММСК (мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток) было продемонстрировано в ряде исследований, результаты которых обобщены в обзорах [1, 2, 8].Currently, the possibility of using cell and tissue engineering technologies to improve healing and restore the functional activity of tissue with various injuries of the musculoskeletal system is of increasing interest [1, 4, 8]. Search in this area is carried out mainly in two directions: the improvement of carriers for the delivery of cellular material to the area of damage and the directed change in the properties of the cells themselves introduced into the area of the defect. Changing the properties of cells can be carried out both by introducing additional genetic material [10], and by modifying the properties of cells caused by changes in their environmental parameters [11]. Improvement of bone tissue regeneration after the introduction of MMSC (multipotent mesenchymal stromal cells) into the defect region has been demonstrated in a number of studies, the results of which are summarized in reviews [1, 2, 8].

Введение ММСК экспериментальным животным при различных повреждениях, таких как острая почечная недостаточность [12], блеомицин-индуцированное повреждение легких [13], дефекты хряща [14], костно-хрящевые дефекты [15] и др., приводит к улучшению различных параметров регенерации тканей.The introduction of MMSCs in experimental animals with various injuries, such as acute renal failure [12], bleomycin-induced lung damage [13], cartilage defects [14], bone-cartilage defects [15], etc., leads to an improvement in various parameters of tissue regeneration .

Известно, что введение костномозговых мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) влияет на формирование костной мозоли после перелома. В настоящее время, в связи со стремительным развитием клеточных подходов в регенеративной и восстановительной медицине, все больший интерес привлекает возможность получения в короткий срок достаточно большого количества клеточного материала за счет экспансии in vitro клеток, полученных из организма. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки или мезенхимальные стромальные клетки-предшественники (МСК) являются стволовыми клетками взрослого организма, которые локализуются в костном мозге, жировой ткани, а также в ряде других тканей и органов. Эти клетки обладают высоким пролиферативным потенциалом, являются самообновляющейся популяцией клеток, поддерживающих свое недифференцированное состояние, а также способны к дифференцировке в определенные типы клеток под действием дифференцировочных стимулов. В свою очередь, мультипотентность МСК определяет выполняемую ими уникальную функцию формирования, поддержания и репарации тканей, а также лежит в основе современных технологий тканевой инженерии. В связи с этим, со времен открытия этих клеток А.Я.Фриденштейном интерес к ним непрерывно растет, однако все большее число работ ставит новые вопросы в отношении функционирования МСК in vivo и in vitro.It is known that the administration of bone marrow multipotent mesenchymal stromal cells (MMSCs) affects the formation of bone marrow after a fracture. Currently, in connection with the rapid development of cellular approaches in regenerative and regenerative medicine, the possibility of obtaining a sufficiently large amount of cellular material in the short term due to the expansion of in vitro cells obtained from the body is attracting increasing interest. Multipotent mesenchymal stromal cells or mesenchymal stromal progenitor cells (MSCs) are adult stem cells that are localized in bone marrow, adipose tissue, and a number of other tissues and organs. These cells have a high proliferative potential, are a self-renewing population of cells that maintain their undifferentiated state, and are also capable of differentiating into certain types of cells under the action of differentiating stimuli. In turn, the multipotency of MSCs determines their unique function of tissue formation, maintenance and repair, and also underlies modern tissue engineering technologies. In this regard, since the discovery of these cells by A.Ya. Fridenshtein, interest in them has been continuously growing, however, an increasing number of works raise new questions regarding the functioning of MSCs in vivo and in vitro.

Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК), которые могут быть выделены из костного мозга, являются в настоящее время наиболее востребованными для репарации различных тканевых дефектов, в связи с их высокой пролиферативной активностью в условиях in vitro и способностью к остеогенной, адипогенной, хондрогенной и, возможно, ангиогенной дифференцировке [1, 2, 3, 4, 5]. Способность ММСК к дифференцировке в остеогенном направлении дала основание предполагать, что их применение при лечении переломов и повреждений больших участков костей может улучшить процесс заживления, что и было продемонстрировано в ряде исследований [6, 7, 8].Multipotent mesenchymal stromal cells (MMSCs) that can be isolated from bone marrow are currently the most popular for the repair of various tissue defects, due to their high proliferative activity in vitro and the ability to osteogenic, adipogenic, chondrogenic and, possibly angiogenic differentiation [1, 2, 3, 4, 5]. The ability of MMSCs to differentiate in the osteogenic direction gave reason to believe that their use in the treatment of fractures and injuries of large areas of bones can improve the healing process, which has been demonstrated in a number of studies [6, 7, 8].

Ранее авторами было показано, что культивирование ММСК из костного мозга крыс в условиях пониженного содержания кислорода приводит к увеличению их пролиферативной активности и повышению устойчивости к различным повреждающим факторам [5].Previously, the authors showed that the cultivation of MMSCs from rat bone marrow under conditions of low oxygen content leads to an increase in their proliferative activity and increased resistance to various damaging factors [5].

Авторами были протестированы клеточные препараты ММСК, предкультивированных в условиях нормоксии (20% O₂, 5% CO₂, 75% N₂) и пониженного содержания кислорода (5% O₂, 5% СО₂, 90% N₂). Нами было неожиданно обнаружено, что введение ММСК, культивируемых при различном содержании О₂, имеет различное влияние на формирование костной мозоли в области экспериментального перелома у млекопитающих. Гистоморфометрический анализ костной мозоли на 14 сутки после операции продемонстрировал достоверное увеличение коэффициента утолщения при использовании ММСК, предкультивированных в условиях пониженного содержания кислорода (5% O₂, 5% СО₂, 90% N₂).The authors tested cell preparations of MMSCs that were pre-cultured under normoxia conditions (20% O ₂ , 5% CO ₂ , 75% N ₂ ) and low oxygen content (5% O ₂ , 5% CO ₂ , 90% N ₂ ). We unexpectedly found that the introduction of MMSCs cultured at different O ₂ contents has a different effect on the formation of bone marrow in the experimental fracture region in mammals. Histomorphometric analysis of bone marrow on the 14th day after the operation showed a significant increase in the thickening coefficient when using MMSCs precultured under conditions of low oxygen content (5% O ₂ , 5% CO ₂ , 90% N ₂ ).

Известен способ восстановления целостности кости при использовании импланта на основе культуры клеток, содержащей клетки-предшественники остеогенеза [RU 2240135 С1]. Однако указанный способ имеет ряд недостатков. Так, в соответствии с данным способом необходимо предварительное формирование импланта, а также использование индукторов остеогенеза.A known method of restoring bone integrity using an implant based on a cell culture containing osteogenesis precursor cells [RU 2240135 C1]. However, this method has several disadvantages. So, in accordance with this method, the preliminary formation of the implant is necessary, as well as the use of osteogenesis inducers.

Известен способ репаративного остеогенеза при введении суспензионного клеточного ксенотрансплантата мезенхимальных стволовых клеток человека, включающий введение мезенхимальных стволовых клеток в область дефекта кости, что обеспечивало ускорение и улучшение качества регенерации. При этом на 90-е сутки эксперимента во всех группах в области дефекта сформировался полноценный костный регенерат, и костная ткань успешно встраивалась в костный орган [7]. Данный способ взят в качестве ближайшего аналога. Отличием является использование ММСК, предкультивированных в условиях пониженного содержания кислорода (5% O₂, 5% CO₂, 90% N₂), что позволяет быстрее наращивать костную мозоль.A known method of reparative osteogenesis with the introduction of a suspension cell xenograft of human mesenchymal stem cells, including the introduction of mesenchymal stem cells in the area of the bone defect, which accelerated and improved the quality of regeneration. Moreover, on the 90th day of the experiment, in all groups in the defect area a full-fledged bone regenerate was formed, and bone tissue was successfully integrated into the bone organ [7]. This method is taken as the closest analogue. The difference is the use of MMSCs, pre-cultivated under conditions of low oxygen content (5% O ₂ , 5% CO ₂ , 90% N ₂ ), which allows faster bone marrow growth.

Примеры конкретного осуществления изобретения.Examples of specific embodiments of the invention.

В работе использовали среду роста: α-МЕМ (ICN, США) с добавлением 2 мМ L-глутамина (Sigma, США), 1 мМ пирувата натрия, 100 ед/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина (Gibco, США) и 10% фетальной коровьей сыворотки (ФКС) (Hyclone, США) для культивирования клеток; 20 mM фосфатный буфер (ФБ) (Gibco, США) для отмывки клеток; 0,02% раствор трипсина с 0,05% ЭДТА (Gibco, США) для открепления клеток от подложки.We used the growth medium: α-MEM (ICN, USA) with the addition of 2 mM L-glutamine (Sigma, USA), 1 mM sodium pyruvate, 100 u / ml penicillin and 100 mg / ml streptomycin (Gibco, USA) and 10 % fetal cow serum (FCC) (Hyclone, USA) for cell culture; 20 mM phosphate buffer (FB) (Gibco, USA) for washing cells; 0.02% trypsin solution with 0.05% EDTA (Gibco, USA) to detach cells from the substrate.

Получение и культивирование ММСК из костного мозга крыс проводили следующим образом. Клетки выделяли из костного мозга бедренной кости 1,5 месячной крысы-самца линии Вистар, как описано в [5]. Культивирование выделенных ММСК проводили в CO₂-инкубаторе (20% O₂, 5% CO₂, 75% N₂). После первого пассажа часть клеток помещали в СО₂-инкубатор (N-MMCK), а другую часть - в мультигазовый инкубатор, в котором поддерживалась газовая среда 5% О₂, 5% CO₂ и 90% N₂ (НУР-ММСК).Obtaining and culturing MMSCs from rat bone marrow was performed as follows. Cells were isolated from the bone marrow of the femur of a 1.5 month old Wistar male rat, as described in [5]. The cultivation of the isolated MMSCs was carried out in a CO ₂ incubator (20% O ₂ , 5% CO ₂ , 75% N ₂ ). After the first passage, part of the cells was placed in a CO ₂ incubator (N-MMCK), and the other part was placed in a multi-gas incubator, in which a gas medium of 5% O ₂ , 5% CO ₂ and 90% N _{2 was} maintained (NUR-MMSK).

В экспериментах по изучению регенеративного потенциала ММСК были использованы клетки второго пассажа.In experiments to study the regenerative potential of MMSCs, cells of the second passage were used.

Для анализа прироста клеток в культуре использовали метод видеомикроскопии. С помощью микроскопа Leica DM IL (объектив х10) (Leica, Germany), снабженного цифровой видеокамерой, изображение архивировали и, впоследствии, в каждом флаконе анализировали 10 стационарных полей зрения площадью 1,0 мм² каждые 24 часа, начиная с первого дня после посадки и до момента пассирования. Клетки подсчитывали с помощью программы анализа изображения SigmaScan Pro 5.0 Image Analysis Software (SPSS Inc. USA). Количество клеточных удвоений рассчитывали по формуле:To analyze cell growth in culture, the method of video microscopy was used. Using a Leica DM IL microscope (x10 lens) (Leica, Germany) equipped with a digital video camera, the image was archived and, subsequently, 10 stationary fields of view with an area of 1.0 mm ² every 24 hours were analyzed in each bottle, starting from the first day after planting and until the moment of passage. Cells were counted using SigmaScan Pro 5.0 Image Analysis Software (SPSS Inc. USA). The number of cell duplications was calculated by the formula:

П=3,32lg(x/x₀).P = 3.32 log (x / x ₀ ).

Иммунофенотип ММСК на втором пассаже был охарактеризован с помощью моноклональных антител к следующим маркерным молекулам: CD90, CD45, CD54, CD73, CD11b, CD44 (BD Bioscience, США), а жизнеспособность клеток оценивали с помощью набора AnnexinV-FITC Kit (Immunotech, Франция) на проточном цитофлуориметре Epics XL (Beckman Coulter, США).The MMSC immunophenotype at passage 2 was characterized using monoclonal antibodies to the following marker molecules: CD90, CD45, CD54, CD73, CD11b, CD44 (BD Bioscience, USA), and cell viability was assessed using the AnnexinV-FITC Kit (Immunotech, France) Epics XL flow cytometer (Beckman Coulter, USA).

Клеточные препараты.Cellular preparations.

Для приготовления клеточных препаратов ММСК открепляли от пластика трипсинизацией, инактивировали фермент добавлением среды роста, после чего клетки ресуспендировали в необходимом количестве культуральной среды, не содержащей ФКС. Транспортировку и хранение клеточных препаратов осуществляли на льду в течение 2-4 часов при температуре +4°С. Перед введением клеточного препарата клетки ресуспендировали и отбирали необходимую аликвоту.To prepare cell preparations, MMSCs were detached from plastic by trypsinization, the enzyme was inactivated by the addition of growth medium, after which the cells were resuspended in the required amount of a culture medium that did not contain FCC. Transportation and storage of cell preparations was carried out on ice for 2-4 hours at a temperature of + 4 ° C. Before the introduction of the cell preparation, the cells were resuspended and the necessary aliquot was selected.

Экспериментальная модель операционного перелома малой берцовой кости у крыс.An experimental model of an operational fracture of the tibia in rats.

В эксперименте были использованы крысы-самцы линии Вистар (32 особи весом около 300 г). Программа исследования была одобрена Комиссией ГНЦ РФ-ИМБП РАН по биомедицинской этике. Наркотизация животных осуществлялась путем введения в левую икроножную мышцу 0,1% атропина в количестве, соответствующем весу животного (согласно инструкции производителя). Затем в эту же мышцу вводили «Золитил-100» в дозе 8 мг/кг (согласно инструкции производителя). После того, как животное переставало реагировать на раздражение, его фиксировали, выстригали шерсть в зоне планируемого операционного вмешательства, трижды обрабатывали 3% йодом и 96% спиртом и проводили рассечение в средней части малой берцовой кости [9].In the experiment, male Wistar rats were used (32 individuals weighing about 300 g). The research program was approved by the Commission of the SSC RF-IBMP RAS for Biomedical Ethics. Anesthesia of animals was carried out by introducing into the left gastrocnemius muscle 0.1% of atropine in an amount corresponding to the weight of the animal (according to the manufacturer's instructions). Then, Zolitil-100 was injected into the same muscle at a dose of 8 mg / kg (according to the manufacturer's instructions). After the animal ceased to respond to irritation, it was fixed, the hair was cut in the area of the planned surgical intervention, three times treated with 3% iodine and 96% alcohol and a dissection was performed in the middle part of the tibia [9].

Экспериментальные животные были разделены на 4 группы. Животным 1-й группы проводили операционный перелом (группа П) без каких-либо последующих дополнительных воздействий. Животным 2-й группы после перелома в зону повреждения и прилежащую мышечную ткань вводили 0,25 мл среды роста без ФКС (группа П+С). Животным 3-й и 4-й групп непосредственно в область перелома сразу после хирургического вмешательства вводили суспензию N- или НУР-ММСК в малом объеме культуральной среды. Животным 3-й группы - 0,25 мл среды роста без ФКС, содержащей 5-10⁵ N-MMCK (группа П+N-MMCK), крысам 4-й группы - 0,25 мл среды роста без ФКС, содержащей 5-10⁵ НУР-ММСК (группа П+НУР-ММСК). После операции раны послойно зашивали хирургической нитью. В пред- и послеоперационный периоды животные содержались в стандартных условиях вивария. В периоде реабилитации подвижность животных была в пределах нормы.Experimental animals were divided into 4 groups. Animals of the 1st group underwent an operational fracture (group P) without any subsequent additional effects. After a fracture, animals of the 2nd group were injected with 0.25 ml of growth medium without FCC (group P + C) into the damage zone and adjacent muscle tissue. Animals of the 3rd and 4th groups directly into the fracture area immediately after surgery were injected with a suspension of N- or NUR-MMSC in a small volume of the culture medium. Animals of the 3rd group — 0.25 ml of growth medium without FCS containing 5-10 ⁵ N-MMCK (group P + N-MMCK), rats of the 4th group — 0.25 ml of growth medium without FCS containing 5- 10 ⁵ NUR-MMSK (group P + NUR-MMSK). After surgery, the wounds were sutured in layers with surgical suture. In the pre- and postoperative periods, the animals were kept under standard vivarium conditions. During the rehabilitation period, the mobility of the animals was within normal limits.

Гистологический анализ.Histological analysis.

Оценку состояния костной мозоли у животных проводили через 14 суток после оперативного вмешательства. Крыс декапитировали, выделяли оперированную кость и очищали ее от мягких тканей. Отделяли зону костной мозоли и фиксировали в 4% парафармальдегиде на 0,1 М ФБ (рН 7,0-7,2) с 2,5% сахарозы при 4°С. После фиксации в течение 10 суток проводили декальцинацию в 10% ЭДТА (рН 7,0-7,2). Затем образцы обезвоживали, заливали в гистопласт и готовили срезы толщиной 5 мкм. Препараты окрашивали гематоксилин-эозином, толуидиновым синим пикрофуксином. Далее на срезах определяли объем костных мозолей, объем хряща и объем новообразованной кости при помощи программы «МОП-ВИДЕОПЛАН», после чего рассчитывали коэффициент утолщения по формуле: диаметр костной мозоли/диаметр зрелой кости.Assessment of the state of bone marrow in animals was performed 14 days after surgery. Rats were decapitated, the operated bone was isolated and cleaned of soft tissues. The bone marrow zone was separated and fixed in 4% parapharmaldehyde on 0.1 M FB (pH 7.0-7.2) with 2.5% sucrose at 4 ° C. After fixation for 10 days, decalcification was performed in 10% EDTA (pH 7.0–7.2). Then the samples were dehydrated, poured into the histoplast and sections 5 μm thick were prepared. The preparations were stained with hematoxylin-eosin, toluidine blue picrofuxin. Then, the volume of bone corns, the volume of cartilage and the volume of the newly formed bone were determined on the slices using the MOP-VIDEOPLAN program, after which the thickening coefficient was calculated by the formula: bone marrow diameter / mature bone diameter.

Статистический анализ.Statistical analysis.

Полученные данные подвергали статистической обработке с использованием Т-критерия Стьюдента.The data obtained were subjected to statistical processing using Student's T-test.

Результаты.Results.

Культивирование при пониженном содержании кислорода приводило к двукратному увеличению пролиферативной активности ММСК. На 6-й день культивирования число клеточных удвоений при пониженном содержании кислорода (5%) составляло 4,02±0,9, а в нормальных условиях (20% O₂) - 1,9±0,3, что согласуется с ранее полученными данными [5].Cultivation at a low oxygen content led to a twofold increase in the proliferative activity of MMSCs. On the 6th day of cultivation, the number of cell doublings at a reduced oxygen content (5%) was 4.02 ± 0.9, and under normal conditions (20% O ₂ ) - 1.9 ± 0.3, which is consistent with previously obtained data [5].

Культивируемые N-MMCK и НУР-ММСК различались морфологически: в культурах N-MMCK на первом пассаже преобладали сильно распластанные клетки, а среди НУР-ММСК было больше мелких вытянутых клеток. (См. чертеж. Морфологическая гетерогенность МСК костного мозга крыс на начальных этапах культивирования в нормоксии и гипоксии. Представлены двухпараметрические гистограммы распределения клеток по размеру (ось ординат) и гранулярности (ось абсцисс) для клеток 4 пассажа, а также микрофотографии (х200) для клеток 2 пассажа после инкубации в течение 96 часов в нормоксии (а) и гипоксии (б). Иммунофенотипирование клеток к маркерам, специфичным для ММСК: CD90 (99,8-100%), CD54 (99,5-98,9%), CD73 (94,70-99,8%), CD44 (96,3-97,0%), не выявило различий между N-ММСК и НУР-ММСК. Те и другие клетки были негативны по маркерам CD11b (0,39-1,25%), CD45 (0,35-1,43%). Жизнеспособность N-ММСК и НУР-ММСК в исследуемых культурах также не отличалась и составляла 91,6±2% (4,36% апоптотических клеток, 3,98% некротических клеток).Cultured N-MMCK and NUR-MMSCs differed morphologically: in the first passage cultures of N-MMCK strongly spread flattened cells prevailed, and among the NUR-MMSCK there were more small elongated cells. (See the drawing. Morphological heterogeneity of rat bone marrow MSCs at the initial stages of cultivation in normoxia and hypoxia. Two-parameter histograms of cell size distribution (ordinate axis) and granularity (abscissa axis) for cells of passage 4, as well as micrographs (x200) for cells are presented 2 passages after incubation for 96 hours in normoxia (a) and hypoxia (b). Immunophenotyping of cells to markers specific for MMSC: CD90 (99.8-100%), CD54 (99.5-98.9%), CD73 (94.70-99.8%), CD44 (96.3-97.0%), did not reveal differences between N-MMSC and NUR-MMSK. the nets were negative for the markers CD11b (0.39-1.25%), CD45 (0.35-1.43%). The viability of N-MMSCs and NUR-MMSCs in the studied cultures also did not differ and amounted to 91.6 ± 2 % (4.36% apoptotic cells, 3.98% necrotic cells).

Визуальный осмотр малых берцовых костей экспериментальных животных показал, что у крыс всех 4-х групп в месте перелома произошло образование веретенообразной костной мозоли различной величины, достаточно прочно скрепляющей проксимальные и дистальные отломки кости.A visual examination of the tibia of experimental animals showed that in rats of all 4 groups at the fracture site a spindle-shaped bone callus of various sizes was formed that firmly fastened the proximal and distal bone fragments.

Гистологическое исследование области перелома у животных контрольной и экспериментальных групп позволило установить, что сращение костных отломков во всех случаях шло по типу вторичного заживления. Костная мозоль состояла из эндостальной мозоли, соединяющей костные отломки и представляющей собой фиброзную ткань, и периостальной мозоли, включающей хрящевую ткань, балки ретикулофиброзной кости и фиброзную ткань. Во всех исследуемых группах в эндостальной мозоли обнаруживались дистальные и/или проксимальные отломки малой берцовой кости. Большинство отломков были смещены друг относительно друга. Балки ретикулофиброзной кости располагались проксимально и дистально относительно хряща. Поверхность трабекул покрывали остеобласты. Таким образом, на срезах во всех исследуемых группах можно было видеть участки тканей, характерных для костной мозоли, соотношение которых было различным в сравниваемых группах.Histological examination of the fracture area in animals of the control and experimental groups revealed that the fusion of bone fragments in all cases proceeded by the type of secondary healing. Bone callus consisted of endosteal callus connecting bone fragments and representing fibrous tissue, and periosteal callus, including cartilage, beams of reticulofibrous bone and fibrous tissue. In all studied groups, distal and / or proximal fragments of the tibia were found in the endostal callus. Most of the fragments were displaced relative to each other. Reticulofibrotic bone beams were located proximal and distal to the cartilage. The surface of the trabeculae was covered with osteoblasts. Thus, on sections in all the studied groups, it was possible to see tissue sections characteristic of callus, the ratio of which was different in the compared groups.

В группе П периостальная мозоль состояла из массива хрящевых клеток и широко петлистой ретикулофиброзной костной ткани. На границе ретикулофиброзной кости и хряща новообразованная кость содержала большое количество сосудов и остеокластов. В центре трабекул, на границе с хрящом, наблюдались мелкие изогенные группы хрящевых клеток. Пространство между некрозированными участками кости было заполнено фиброзной тканью, врастающей со стороны эндоста.In group P, the periosteal callus consisted of an array of cartilage cells and widely looped reticulofibrotic bone tissue. At the border of the reticulofibrotic bone and cartilage, the newly formed bone contained a large number of vessels and osteoclasts. In the center of the trabeculae, on the border with the cartilage, small isogenic groups of cartilage cells were observed. The space between the necrotic areas of the bone was filled with fibrous tissue growing from the endosteum.

У животных группы П+С, костная мозоль в качественном отношении не отличалась от группы П, но количественные различия были довольно значительными. Размеры костной мозоли у крыс группы П+С были больше, чем у группы П, в основном, за счет увеличения объема хрящевой части периостальной мозоли. Сосудистая сеть в этой группе была слабо развита.In animals of group P + C, bone marrow did not qualitatively differ from group P, but quantitative differences were quite significant. The size of bone marrow in rats of group P + C was larger than in group P, mainly due to an increase in the volume of the cartilaginous part of the periosteal callus. The vasculature in this group was poorly developed.

В группе П+HYP-MMCK размеры костной мозоли у крыс были наиболее крупными по сравнению с костной мозолью животных других групп. Увеличение размеров костной мозоли происходило за счет разрастания хрящевой ткани, в которой определялись врастающие со стороны внутренних слоев надкостницы пучки соединительной ткани. Кроме того, соединительная ткань обнаруживалась в толще самого хряща в виде отдельных островков. Со стороны молодой костной ткани в хрящевую ткань внедрялись пальцевидные костные отростки, которые замещали разрушающийся хрящ. На поверхности отростков наблюдались остеобласты, а между отростками - многочисленные кровеносные сосуды. В трабекулах молодой кости часто находились единичные хондроциты. Эндостальная мозоль, в основном, состояла из клеток молодой костной ткани.In the P + HYP-MMCK group, the size of the bone marrow in rats was the largest compared to the bone callus of animals of other groups. The increase in bone marrow size occurred due to the growth of cartilage tissue, in which connective tissue bundles growing from the inner layers of the periosteum were determined. In addition, connective tissue was found in the thickness of the cartilage itself in the form of separate islands. From the side of the young bone tissue, finger-shaped bone processes were introduced into the cartilaginous tissue, which replaced the destroyed cartilage. Osteoblasts were observed on the surface of the processes, and numerous blood vessels between the processes. In the trabeculae of the young bone, often there were single chondrocytes. Endosteal callus mainly consisted of cells of young bone tissue.

У животных группы П+N-MMCK объем хрящевой ткани был меньше, чем у крыс группы П+HYP-MMCK. В целом, костная мозоль походила на таковую у крыс группы П+HYP-MMCK и отличалась только меньшими размерами.In animals of group P + N-MMCK, the volume of cartilage was less than in rats of group P + HYP-MMCK. In general, bone marrow was similar to that in rats of the P + HYP-MMCK group and differed only in smaller sizes.

Результаты количественного гистометрического анализа костных мозолей, которые подтвердили гистологические наблюдения, представлены в таблице.The results of a quantitative histometric analysis of bone calluses, which confirmed histological observations, are presented in the table.

Таблица Table Гистоморфометрический анализ костных мозолей у крыс с экспериментальным переломом малоберцовой костиHistomorphometric analysis of bone marrow in rats with experimental fracture of the fibula Экспериментальная группаExperimental group Объем костной мозоли (мм³)Bone callus volume (mm ³ ) Объем хряща (мм³)Cartilage volume (mm ³ ) Объем новообразованной костной ткани (мм³)The volume of newly formed bone tissue (mm ³ ) Коэффициент утолщенияThickening coefficient ПP 10,3±2,310.3 ± 2.3 1,1±0,71.1 ± 0.7 5,7±1,85.7 ± 1.8 3,8±0,73.8 ± 0.7 П+СP + C 12,7±3,4*12.7 ± 3.4 * 1,9±0,7*1.9 ± 0.7 * 5,8±1,65.8 ± 1.6 3,6±0,63.6 ± 0.6 П+N-MMCKP + N-MMCK 14,6±2,7*14.6 ± 2.7 * 1,9±0,8*1.9 ± 0.8 * 6,5±2,16.5 ± 2.1 4,5±0,7^*,** 4,5 ± 0,7 ^{*, **} П+HYP-MMCKP + HYP-MMCK 13,7±2,0*13.7 ± 2.0 * 2,4±0,5^*,** 2.4 ± 0.5 ^{*, **} 6,0±1,86.0 ± 1.8 5,0±1,6^*,** 5.0 ± 1.6 ^{*, **} Обозначения:Designations: * - достоверные различия по отношению к группе П;* - significant differences in relation to group P; ** - достоверные различия по отношению к группе П+С.** - significant differences in relation to the P + C group.

Как следует из таблицы, объем хрящевой ткани у крыс в группах П+С, П+N-MMCK и П+HYP-MMCK по сравнению с контрольными животными (группа П) достоверно увеличивался, что хорошо совпадает с увеличением объема костных мозолей в этих же группах животных. В группах П+N-ММСК и П+HYP-MMCK коэффициент утолщения превышал значения такового как по сравнению с контрольной группой П, так и группой П+С. При этом коэффициент утолщения у крыс группы П+HYP-MMCK был больше, чем у животных П+N-MMCK. Что же касается объема новообразованной костной ткани, заместившей хрящевую ткань периостальной костной мозоли, то различий в сравниваемых группах не наблюдалось.As follows from the table, the volume of cartilage tissue in rats in groups P + C, P + N-MMCK and P + HYP-MMCK compared with control animals (group P) significantly increased, which coincides well with an increase in the volume of bone corns in the same groups of animals. In the groups P + N-MMSC and P + HYP-MMCK, the thickening coefficient exceeded that as compared to the control group P and the group P + C. Moreover, the coefficient of thickening in rats of group P + HYP-MMCK was greater than in animals P + N-MMCK. As for the volume of newly formed bone tissue, which replaced the cartilaginous tissue of the periosteal callus, there were no differences in the compared groups.

Суммируя данные гистологических и гистоморфометрических исследований, можно констатировать, что у крыс с переломом малоберцовой кости, которым вводили ММСК, был увеличен размер развившейся костной мозоли, причем это увеличение было больше в группе животных, которым инъецировали ММСК, выращенные в гипоксической среде.Summarizing the data of histological and histomorphometric studies, it can be stated that in rats with a fracture of the fibula, which were injected with MMSC, the size of the developed bone marrow was increased, and this increase was greater in the group of animals that were injected with MMSCs grown in hypoxic medium.

В результате было выяснено, что ММСК, культивированные в условиях различного газового содержания, по-разному влияют на параметры заживления костных дефектов.As a result, it was found that MMSCs cultured under conditions of different gas contents have different effects on the healing parameters of bone defects.

Таким образом, проведенное исследование продемонстрировало эффективность введения суспензии ММСК, предварительная экспансия которых проведена in vitro в условиях различного содержания кислорода, для улучшения формирования костно-хрящевого регенерата на раннем этапе формирования костной мозоли при экспериментальном переломе малоберцовой кости у крыс.Thus, the study demonstrated the effectiveness of the administration of an MMSC suspension, preliminary expansion of which was carried out in vitro under conditions of different oxygen contents, to improve the formation of bone-cartilage regenerate at an early stage of bone callus formation during experimental fracture of the fibula in rats.

ЛитератураLiterature

1. Prockop D.J. Further proof of the plasticity of adult stem cells and their role in tissue repair. J. Cell Biol. 2003; 160 [6]: 807-809.1. Prockop D.J. Further proof of the plasticity of adult stem cells and their role in tissue repair. J. Cell Biol. 2003; 160 [6]: 807-809.

2. Bianco P., Riminucci M., Grothos S., et al. Bone marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential application. Stem Cells. 2001; 19: 180-192.2. Bianco P., Riminucci M., Grothos S., et al. Bone marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential application. Stem Cells. 2001; 19: 180-192.

3. Lennon D.P., Edmison J.M., Caplan A.I. Cultivation of rat marrow-derived mesenchymal stem cells in reduced oxygen tension: effects on in vitro and in vivo osteochondrogenesis. J. Cell Physiol. 2001; 187 [3]: 345-355.3. Lennon D.P., Edmison J.M., Caplan A.I. Cultivation of rat marrow-derived mesenchymal stem cells in reduced oxygen tension: effects on in vitro and in vivo osteochondrogenesis. J. Cell Physiol. 2001; 187 [3]: 345-355.

4. Davani S., Marandin A., Mersin N., et al. Mesenchymal progenitor cells differentiate into an endothelial phenotype, enhance vascular density and improve heart function in a rat cellular cardiomyoplasty model. Circulation. 2003; 108 [10]: 253-258.4. Davani S., Marandin A., Mersin N., et al. Mesenchymal progenitor cells differentiate into an endothelial phenotype, enhance vascular density and improve heart function in a rat cellular cardiomyoplasty model. Circulation. 2003; 108 [10]: 253-258.

5. Буравкова Л.Б., Анохина Е.Б. Влияние гипоксии на стромальные клетки-предшественники из костного мозга крыс на ранних этапах культивирования. Бюл. эксперим. биол. и мед. 2007; 143 (4): 386-389.5. Buravkova LB, Anokhina E.B. The effect of hypoxia on stromal progenitor cells from rat bone marrow in the early stages of cultivation. Bull. an experiment. biol. and honey. 2007; 143 (4): 386-389.

6. Кругляков П.В., Соколова И.Б., Зинькова Н.Н. и др. Влияние сингенных мезенхимальных стволовых клеток на восстановление костной ткани у крыс при имплантации деминерализованного костного матрикса. Цитология. 2005; 47 [6]: 466-477.6. Kruglyakov P.V., Sokolova I.B., Zinkova N.N. et al. Effect of syngeneic mesenchymal stem cells on bone restoration in rats after implantation of a demineralized bone matrix. Cytology. 2005; 47 [6]: 466-477.

7. Фатхутдинов Т.Х., Гольдштейн Д.В., Пулин А.А., и др. Особенности репаративного остеогенеза при трансплантации мезенхимальных стволовых клеток. Бюл. эксперим. биол. и мед. 2005; 140 [7]: 109-113.7. Fathutdinov T.Kh., Goldstein D.V., Pulin A.A., et al. Features of reparative osteogenesis during transplantation of mesenchymal stem cells. Bull. an experiment. biol. and honey. 2005; 140 [7]: 109-113.

8. Деев Р.В., Исаев В.В., Кочиш А.Ю., и др. Клеточные технологии в травматологии и ортопедии; пути развития. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2007; 2 [4]: 18-30.8. Deev R.V., Isaev V.V., Kochish A.Yu., et al. Cellular technologies in traumatology and orthopedics; development ways. Cell transplantology and tissue engineering. 2007; 2 [4]: 18-30.

9. Дурнова Г.И., Логинов В.И., Капланский А.С. Заживление перелома малоберцовой кости у крыс при длительном вывешивании. Авиакосм. и эколог. мед. 2002; 36 [3]: 52-55.9. Durnova G.I., Loginov V.I., Kaplansky A.S. The healing of a fracture of the fibula in rats with prolonged hanging. Aerospace. and ecologist. honey. 2002; 36 [3]: 52-55.

10. Tsuchida H., Hashimoto J., Crawford E. et al. Engineered allogeneic mesenchymal stem cells repair femoral segmental defect in rats. Orthop. Res. 2003; 2 [1]: 44-53.10. Tsuchida H., Hashimoto J., Crawford E. et al. Engineered allogeneic mesenchymal stem cells repair femoral segmental defect in rats. Orthop. Res. 2003; 2 [1]: 44-53.

11. Hu X., Yu S.P., Fraser J.L., et al. Transplantation of hypoxia-preconditioned mesenchymal stem cells improves infarcted heart function via enhanced survival of implanted cells and angiogenesis. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2008; 135 [4]: 799-808.11. Hu X., Yu S.P., Fraser J. L., et al. Transplantation of hypoxia-preconditioned mesenchymal stem cells improves infarcted heart function via enhanced survival of implanted cells and angiogenesis. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2008; 135 [4]: 799-808.

12. Morigi I.M, Imberti В., Zoja C, et al. Mesenchymal stem cells are renotropic, helping to repair the kidney and improve function in acute renal failure. Am. Soc. Nephrol. 2004; 15: 1794-1804.12. Morigi I.M., Imberti B., Zoja C, et al. Mesenchymal stem cells are renotropic, helping to repair the kidney and improve function in acute renal failure. Am. Soc. Nephrol. 2004; 15: 1794-1804.

13. Rojas M., Xu J., Woods Ch. R., et al. Bone Marrow-Derived mesenchymal stem cells in repair of the injured lung. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2005; 33: 145-152.13. Rojas M., Xu J., Woods Ch. R., et al. Bone Marrow-Derived mesenchymal stem cells in repair of the injured lung. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2005; 33: 145-152.

14. Ponticiello M.S., Shingle R.M., Kadiyala S, et al. Gelatin-based resorbable sponge as a carrier matrix for human mesenchymal stem cells in cartilage regeneration therapy. J. Biomed. Mater. Res. 2000; 52 [2]: 246-55.14. Ponticiello M.S., Shingle R. M., Kadiyala S, et al. Gelatin-based resorbable sponge as a carrier matrix for human mesenchymal stem cells in cartilage regeneration therapy. J. Biomed. Mater. Res. 2000; 52 [2]: 246-55.

15. Im G-L, Kim D-Y., Shin J-H., et al. Repair of cartilage defect in the rabbit with cultured mesenchymal stem cells from bone marrow. J. Bone Joint Surg. [Br] 2001; 83-B: 289-94.15. Im G-L, Kim D-Y., Shin J-H., Et al. Repair of cartilage defect in the rabbit with cultured mesenchymal stem cells from bone marrow. J. Bone Joint Surg. [Br] 2001; 83-B: 289-94.

Claims

A method of forming bone marrow in mammals, comprising introducing multipotent mesenchymal stromal cells (MMSCs) into the fracture region, characterized in that MMSCs are precultured under the following gas conditions: 5% O ₂ , 5% CO ₂ , 90% N ₂ .