RU2390253C1

RU2390253C1 - Method of lactoferrin obtaining from dairy raw materials

Info

Publication number: RU2390253C1
Application number: RU2008151488/13A
Authority: RU
Inventors: Зинаида Семеновна Зобкова (RU); Зинаида Семеновна Зобкова; Анна Викторовна Мишина (RU); Анна Викторовна Мишина; Галина Владимировна Шехватова (RU); Галина Владимировна Шехватова; Владислав Владимирович Смолянинов (RU); Владислав Владимирович Смолянинов
Priority date: 2008-12-25
Filing date: 2008-12-25
Publication date: 2010-05-27

Abstract

FIELD: agriculture.

SUBSTANCE: invention refers to the dairy industry. The method of lactoferrin obtaining from dairy raw materials includes a lactoferrin chromatography from dairy raw materials on a column with a sorbent carbossimetilcellulose, balanced by 0.05 M sodium-phosphatic buffer, lactoferrin elution by 0.05 M sodium-phosphatic buffer, an ultrafiltration, salt rejection and a lactoferrin solvent lyophilising. The method differs because of the raw cow milk usage as dairy raw materials, a lactoferrin chromatography is carried out with a sorbent, by carbossimetilcellulose, balanced natrium phosphate buffer 0,05 M at pH=7.7 lactoferrin elution is carried out with natrium phosphate buffer 0.05 M at pH=7.7, in a gradient of sodium chloride concentration 0.1-1.2 M, at elution the lactoferrin solvent fractions with optical density 0.5 units and at length of a wave of 280 nanometres are gathered and then directed to the second chromatography with similar parametres, and then the allocated fractions are directed to an ultrafiltration, salt rejection and lyophilising.

EFFECT: method allows receiving native lactoferrin with cleanliness not less than 98 %.

1 ex

Description

Изобретение относится к молочной промышленности. Известен способ получения лактоферрина из женского молока, включающий обезжиривание, удаление казеинов, фракционирование сульфатом аммония, диализ и лиофилизацию целевого продукта, отличающийся тем, что фракционирование ведут ступенчато: сначала добавляют сульфат аммония до концентрации 35-45% от насыщения, осадок удаляют, затем к супернатанту добавляют сульфат аммония до концентрации 70-80% от насыщения; а перед диализом осадок от фракционирования растворяют в дистиллированной воде, инкубируют с 1,3-3,7М хлоридом натрия при рН 3,6-4,4 и удаляют образующийся осадок при помощи фильтрования (см. патент РФ №1709606).The invention relates to the dairy industry. A known method of producing lactoferrin from human milk, including degreasing, removing caseins, fractionation with ammonium sulfate, dialysis and lyophilization of the target product, characterized in that the fractionation is carried out stepwise: first add ammonium sulfate to a concentration of 35-45% of saturation, the precipitate is removed, then to ammonium sulfate is added to the supernatant to a concentration of 70-80% of saturation; and before dialysis the precipitate from fractionation is dissolved in distilled water, incubated with 1.3-3.7 M sodium chloride at pH 3.6-4.4 and the precipitate formed is removed by filtration (see RF patent No. 1709606).

Наиболее близким техническим решением к заявляемому является способ получения лактоферрина из творожной или подсырной сыворотки методом ионообменной хроматографии с использованием ионообменной целлюлозы. Способ заключается в следующем: молочную сыворотку, полученную при производстве творога кислотным или кислотно-сычужным способами, нейтрализуют до рН 6,5 раствором гидроокиси натрия, центрифугируют для отделения иммуноглобулинов и фосфата кальция; далее подготовленную сыворотку подают на колонку с сорбентом карбоксиметилцеллюлозой, уравновешенной буферным раствором рН 6,5, содержащим 50 мМоль натрия фосфорнокислого. Элюирование лактоферрина проводят с помощью 0,05М фосфатного буфера, содержащего 1,0 М хлористого натрия. Полученный раствор обессоливают ультрафильтрацией, подвергают микрофильтрации и лиофильно высушивают (см. ТИ ТУ 9224-001-93467423-06).The closest technical solution to the claimed is a method for producing lactoferrin from cottage cheese or cheese whey by ion exchange chromatography using ion exchange cellulose. The method consists in the following: milk whey obtained in the production of cottage cheese by acid or acid rennet methods is neutralized to pH 6.5 with a solution of sodium hydroxide, centrifuged to separate immunoglobulins and calcium phosphate; Further, the prepared serum is fed to a column with a sorbent carboxymethyl cellulose, balanced with a buffer solution of pH 6.5, containing 50 mmol of sodium phosphate. Elution of lactoferrin is carried out using 0.05 M phosphate buffer containing 1.0 M sodium chloride. The resulting solution is desalted by ultrafiltration, subjected to microfiltration and freeze-dried (see TI TU 9224-001-93467423-06).

Недостатком этого способа является то, что в качестве сырья используется творожная или подсырная сыворотка, содержание лактоферрина в которой крайне ограничено, а также то, что получаемый лактоферрин в своем составе содержит примеси других сывороточных белков.The disadvantage of this method is that curd or cheese whey is used as raw material, the content of lactoferrin in which is extremely limited, and also that the resulting lactoferrin in its composition contains impurities of other whey proteins.

Задачей заявленного изобретения является создание способа получения лактоферрина из сырого коровьего молока, обеспечивающего получение лактоферрина чистотой не менее 98%.The objective of the claimed invention is to provide a method for producing lactoferrin from raw cow's milk, providing lactoferrin with a purity of at least 98%.

Поставленная задача решена путем создания способа получения лактоферрина из молочного сырья, включающего хроматографию лактоферрина из молочного сырья в колонке с сорбентом карбоксиметилцеллюлозой, уравновешенным 0,05 М натрий-фосфатным буфером, элюирование лактоферрина 0,05 М натрий-фосфатным буфером, ультрафильтрацию, обессоливание и лиофилизации раствора лактоферрина, в котором, согласно изобретению, в качестве молочного сырья используют сырое коровье молоко, хроматографию лактоферрина из сырого коровьего молока проводят в колонке с сорбентом карбоксиметилцеллюлозой, уравновешенным 0,05 М натрий-фосфатным буфером при рН 7,7, элюирование лактоферрина проводят 0,05 М натрий-фосфатным буфером, в градиенте концентраций хлорида натрия 0,1-1,2 М, при элюировании собирают фракции раствора лактоферрина с оптической плотностью 0,5 ед. при длине волны 280 нм и направляют их на вторую хроматографию лактоферрина во вторую колонку с сорбентом карбоксиметилцеллюлозой, уравновешенным 0,05 М натрий-фосфатным буфером при рН 7,7, элюирование лактоферрина со второй колонки проводят 0,05 М натрий-фосфатным буфером, в градиенте концентраций хлорида натрия 0,1-1,2 М, при элюировании вновь собирают фракции раствора лактоферрина с оптической плотностью 0,5 ед. при длине волны 280 нм и направляют их на ультрафильтрацию, обессоливание и лиофилизацию.The problem is solved by creating a method for producing lactoferrin from milk raw materials, including chromatography of lactoferrin from milk raw materials in a column with a sorbent carboxymethyl cellulose balanced with 0.05 M sodium phosphate buffer, elution of lactoferrin with 0.05 M sodium phosphate buffer, ultrafiltration, desalination and lithium a solution of lactoferrin, in which, according to the invention, raw cow's milk is used as raw milk, chromatography of lactoferrin from raw cow's milk is carried out in a column with a carboxymethyl cellulose sorbent balanced with 0.05 M sodium phosphate buffer at pH 7.7, lactoferrin is eluted with 0.05 M sodium phosphate buffer, 0.1-1.2 M sodium chloride in a concentration gradient; solution fractions are collected while eluting lactoferrin with an optical density of 0.5 units. at a wavelength of 280 nm and direct them to the second chromatography of lactoferrin in a second column with a sorbent carboxymethyl cellulose balanced with 0.05 M sodium phosphate buffer at pH 7.7, the lactoferrin is eluted from the second column with 0.05 M sodium phosphate buffer, in the concentration gradient of sodium chloride 0.1-1.2 M, when eluting again collected fractions of a solution of lactoferrin with an optical density of 0.5 units at a wavelength of 280 nm and direct them to ultrafiltration, desalination and lyophilization.

Технический результат, проявляющийся при использовании созданного способа получения лакоферрина, заключается в получении нативного лактоферрина чистотой не менее 98% из сырого коровьего молока в качестве исходного сырья за счет двухэтапных адсорбции лактоферрина на карбокисметилцеллюлозе при рН 7,7 и элюирований белка с колонки 0,05 М натрий-фосфатным буфером в градиенте концентраций хлорида натрия 0,1-1,2М, причем на первом этапе выделяют фракции с оптической плотностью 0,5 ед. при длине волны 280 нм, выделенные фракции объединяют и направляют последовательно на вторую колонку с карбоксиметилцеллюлозой для второй хроматографии и элюирования.The technical result manifested by using the created method for producing lacoferrin is to obtain native lactoferrin with a purity of at least 98% from raw cow's milk as a feedstock due to two-stage adsorption of lactoferrin on carboxymethyl cellulose at pH 7.7 and elution of the protein from a column of 0.05 M sodium phosphate buffer in a concentration gradient of sodium chloride 0.1-1.2 M, and at the first stage, fractions with an optical density of 0.5 units are isolated. at a wavelength of 280 nm, the separated fractions are combined and sent sequentially to a second column with carboxymethyl cellulose for second chromatography and elution.

Лактоферрин, согласно заявленному способу, получают следующим образом.Lactoferrin, according to the claimed method, is prepared as follows.

Сырое коровье молоко, имеющее кислотность 16-18°Т (рН 6,5-6,6), направляют без предварительной подготовки на колонку с сорбентом карбоксиметилцеллюлозой для проведения первого этапа хроматографического выделения лактоферрина из сырого коровьего молока. Далее колонку заполняют 0,05 М натрий-фосфатным буфером при рН 7,7. В отличие от ранее известного способа рН буфера, равный 7,7 ед., позволяет максимально сорбировать лактоферрин из сырого коровьего молока на карбоксиметилцеллюлозе. Элюирование лактоферрина проводят 0,05 М натрий-фосфатным буфером, в градиенте концентраций хлорида натрия 0,1-1,2 М с целью максимального извлечения лактоферрина из сорбента, в отличие от известного способа, где концентрация хлорида натрия в буфере была постоянной и составляла 1,0 моль/л. При элюирований выделяют и собирают фракции с оптической плотностью 0,5 ед. при длине волны 280 нм. Собранные фракции раствора лактоферрина направляют последовательно на вторую колонку с карбоксиметилцеллюлозой для осуществления второго этапа хроматографии, параметры сорбции и элюирования которого такие же как на первом этапе. Применение двухэтапного метода хроматографии позволяет максимально извлечь лактоферрин из сырого коровьего молока. После второй хроматографии раствор лактоферрина направляют на ультрафильтр с размером пор 10 КДа для концентрирования белка. Далее проводят диализ раствора лактоферрина для удаления из него солей. После диализа проводят лиофилизацию раствора лактоферрина, в результате чего получается сухой препарат лактоферрина, сохраняющий свойства нативного лактоферрина.Raw cow milk having an acidity of 16-18 ° T (pH 6.5-6.6) is sent without preliminary preparation to a column with a sorbent carboxymethyl cellulose for the first stage of chromatographic isolation of lactoferrin from raw cow milk. The column is then filled with 0.05 M sodium phosphate buffer at pH 7.7. In contrast to the previously known method, the pH of the buffer, equal to 7.7 units, allows maximum sorption of lactoferrin from raw cow's milk on carboxymethyl cellulose. Elution of lactoferrin is carried out with 0.05 M sodium phosphate buffer, in a concentration gradient of sodium chloride 0.1-1.2 M in order to maximize the extraction of lactoferrin from the sorbent, in contrast to the known method, where the concentration of sodium chloride in the buffer was constant and amounted to 1 , 0 mol / L. When eluting, fractions with an optical density of 0.5 units are isolated and collected. at a wavelength of 280 nm. The collected fractions of the lactoferrin solution are sent sequentially to the second column with carboxymethyl cellulose to carry out the second chromatography step, the sorption and elution parameters of which are the same as in the first stage. The use of a two-stage chromatography method allows maximum extraction of lactoferrin from raw cow's milk. After the second chromatography, the lactoferrin solution is sent to an ultrafilter with a pore size of 10 KDa to concentrate the protein. Next, dialysis of the lactoferrin solution is carried out to remove salts from it. After dialysis, lyophilization of the lactoferrin solution is carried out, resulting in a dry preparation of lactoferrin, which retains the properties of native lactoferrin.

Пример 1. Сырое коровье молоко в количестве 1 т (рН 6,55) направляют на колонку с сорбентом карбоксиметилцеллюлозой, проводят сорбцию лактоферрина 0,05М натрий-фосфатным буфером при рН 7,7, элюируют 0,05 М натрий-фосфатным буфером в градиенте концентраций хлорида натрия 0,1-1,2 М, собирая фракции с оптической плотностью 0,5 ед. при длине волны 280 нм, фракции объединяют и направляют последовательно на вторую колонку с карбоксиметилцеллюлозой для второй хроматографии. После второй хроматографии раствор лактоферрина подвергают ультрафильтрации, диализу и лиофилизации. В результате получают сухой препарат лактоферрина в количестве 100 г, содержание лактоферрина в котором составляет 98%.Example 1. Raw cow's milk in an amount of 1 ton (pH 6.55) is sent to a column with a sorbent carboxymethyl cellulose, lactoferrin is sorbed with 0.05 M sodium phosphate buffer at pH 7.7, elute with 0.05 M sodium phosphate buffer in a gradient concentrations of sodium chloride 0.1-1.2 M, collecting fractions with an optical density of 0.5 units. at a wavelength of 280 nm, the fractions are combined and sent sequentially to a second column with carboxymethyl cellulose for second chromatography. After the second chromatography, the lactoferrin solution is subjected to ultrafiltration, dialysis and lyophilization. The result is a dry preparation of lactoferrin in an amount of 100 g, the lactoferrin content of which is 98%.

Claims

A method for producing lactoferrin from milk raw materials, including chromatography of lactoferrin from milk raw materials in a column with a sorbent carboxymethyl cellulose balanced with 0.05 M sodium phosphate buffer, elution of lactoferrin with 0.05 M sodium phosphate buffer, ultrafiltration, desalination and lyophilization of lactoferin solution that raw cow's milk is used as raw milk, lactoferrin chromatography is carried out in a column with a carboxymethyl cellulose sorbent balanced with 0.05 M sodium phosphate buffer at pH 7.7, elution of lactoferrin is performed with 0.05 M sodium phosphate buffer, 0.1-1.2 M gradient of sodium chloride concentration, and the fractions eluted lactoferrin solution with an optical density of 0.5 units. at a wavelength of 280 nm, and the isolated fractions are sent to the second chromatography of lactoferrin in a second column with a sorbent carboxymethyl cellulose balanced with 0.05 M sodium phosphate buffer at pH 7.7, the lactoferrin is eluted from the second column with 0.05 M sodium phosphate buffer in the concentration gradient of sodium chloride 0.1-1.2 M, when eluting again collected fractions of a solution of lactoferrin with an optical density of 0.5 units at a wavelength of 280 nm and the selected fractions are directed to ultrafiltration, desalination and lyophilization.