RU2386447C1 - Anticancer drug based on nanoparticles bearing recombinant human tumour necrosis factor alpha - Google Patents
Anticancer drug based on nanoparticles bearing recombinant human tumour necrosis factor alpha Download PDFInfo
- Publication number
- RU2386447C1 RU2386447C1 RU2008140246/15A RU2008140246A RU2386447C1 RU 2386447 C1 RU2386447 C1 RU 2386447C1 RU 2008140246/15 A RU2008140246/15 A RU 2008140246/15A RU 2008140246 A RU2008140246 A RU 2008140246A RU 2386447 C1 RU2386447 C1 RU 2386447C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- tnf
- nanoparticles
- double
- polyglucin
- spermidine
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к противоопухолевым средствам и может быть использовано в области медицины и фармацевтики.The invention relates to antitumor agents and can be used in the field of medicine and pharmaceuticals.
Как известно, заболеваемость злокачественными новообразованиями во многих странах мира продолжает неуклонно увеличиваться. Рост числа онкологических заболеваний обусловлен рядом факторов, важнейшими из которых являются увеличение числа лиц пожилого возраста и неблагоприятная экологическая обстановка. За последние 25-30 лет темп прироста частоты заболеваний данного типа превысил годовой темп прироста населения в развитых странах. К 2010 году число заболевших в мире прогнозируется до 12,5 млн человек. В РФ первичная заболеваемость злокачественными новообразованиями в 2004 г. составила 473 тыс. человек (326,3 на 100 тыс. населения) и продолжает неуклонно расти. Серьезной является и проблема ухудшения эпидемической обстановки во многих странах мира, что связано с прогрессирующим ослаблением иммунореактивности населения этих стран, увеличением частоты и выраженности приобретенных иммунодефицитов, обусловленных экологическими и социальными причинами, хроническими инфекционными заболеваниями.As you know, the incidence of malignant neoplasms in many countries of the world continues to increase steadily. The increase in the number of oncological diseases is due to a number of factors, the most important of which are the increase in the number of elderly people and an unfavorable environmental situation. Over the past 25-30 years, the rate of increase in the frequency of diseases of this type has exceeded the annual rate of population growth in developed countries. By 2010, the number of cases in the world is predicted to 12.5 million people. In 2004, the primary incidence of malignant neoplasms in 2004 amounted to 473 thousand people (326.3 per 100 thousand population) and continues to grow steadily. A serious problem is the deterioration of the epidemic situation in many countries of the world, which is associated with a progressive weakening of the immunoreactivity of the population of these countries, an increase in the frequency and severity of acquired immunodeficiencies due to environmental and social causes, chronic infectious diseases.
В связи с этим актуальность поиска новых средств и способов лечения злокачественных новообразований в нашей стране чрезвычайно велика. Это обусловлено как особенностями течения данного заболевания (гистологической гетерогенностью опухолей, их разной чувствительностью к химиопрепаратам, индивидуальными характеристиками функционирования иммунной системы больных, степенью развития заболевания), так и ограниченностью современного арсенала эффективных химиотерапевтических средств.In this regard, the relevance of the search for new means and methods of treating malignant neoplasms in our country is extremely high. This is due to both the characteristics of the course of the disease (histological heterogeneity of the tumors, their different sensitivity to chemotherapy drugs, individual characteristics of the functioning of the immune system of patients, the degree of development of the disease), and the limited modern arsenal of effective chemotherapeutic agents.
В последние годы значительное внимание с точки зрения терапевтического применения уделяется цитокинам - биологически активным факторам пептидной природы, которые вырабатываются клетками иммунной системы и являются одновременно и продуктами жизнедеятельности этой системы, и ее основными регуляторами. В настоящее время ряд цитокинов, таких как интерфероны и интерлейкины, применяются в онкологии в качестве иммуномодуляторов и противоопухолевых средств [1].In recent years, considerable attention from the point of view of therapeutic use has been given to cytokines, biologically active factors of a peptide nature, which are produced by the cells of the immune system and are both products of the vital functions of this system and its main regulators. Currently, a number of cytokines, such as interferons and interleukins, are used in oncology as immunomodulators and antitumor agents [1].
К числу перспективных противоопухолевых препаратов относятся представители семейства факторов некроза опухолей, в частности фактор некроза опухолей альфа (ФНО-α). Как известно, факторы некроза опухолей представляют собой полипотентные белки-цитокины, играющие ключевую роль во многих физиологических и патологических процессах организма. Фактор некроза опухолей альфа отличается способностью оказывать прямое цитотоксическое действие на опухолевые клетки разных типов, активировать противоопухолевый иммунный ответ и вызывать повреждение клеток эндотелия сосудов опухоли, результатом чего является ее геморрагический некроз [2-4].Promising antitumor drugs include representatives of the family of tumor necrosis factors, in particular tumor necrosis factor alpha (TNF-α). As is known, tumor necrosis factors are pluripotent cytokine proteins that play a key role in many physiological and pathological processes of the body. Tumor necrosis factor alpha is distinguished by its ability to exert a direct cytotoxic effect on different types of tumor cells, activate the antitumor immune response and cause damage to the tumor vessels endothelial cells, resulting in its hemorrhagic necrosis [2-4].
В настоящее время препараты ФНО-α производства фармацевтических компаний Asahi, Knoll, Genentech, Wadley Inst. Cetus, Dainippon и др. проходят клинические испытания в разных странах мира. Клинические исследования рекомбинантного ФНО-α человека за рубежом показали положительный эффект препарата на более, чем 10 видах опухолей, таких как меланома, липосаркома, нейробластома, рак легких и ряде других [5]. В 2000 г. в Европе был зарегистрирован препарат на основе ФНО-α и мелфалана для лечения неоперабельной мягкотканой саркомы конечностей методом региональной перфузии [6].Currently, drugs TNF-α produced by pharmaceutical companies Asahi, Knoll, Genentech, Wadley Inst. Cetus, Dainippon, etc. are undergoing clinical trials in different countries of the world. Clinical studies of recombinant human TNF-α abroad have shown a positive effect of the drug on more than 10 types of tumors, such as melanoma, liposarcoma, neuroblastoma, lung cancer and several others [5]. In 2000, a drug based on TNF-α and melphalan was registered in Europe for the treatment of inoperable soft tissue limb sarcoma by regional perfusion [6].
Технология получения рекомбинантного ФНО-α человека была разработана и в России, в частности, в ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора [7, 8]. В настоящее время завершена вторая фаза клинических испытаний лекарственной формы ФНО-α, препарата Альнорин. Исследования, выполненные в ВОНЦ РАМН (г.Москва), свидетельствуют о том, что введение Альнорина с последующей химиотерапией улучшает лечебный эффект у больных с диссеминированной меланомой кожи (до 59%), что проявляется в полной или частичной ремиссии метастазов либо стабилизации процесса [9]. Эти данные свидетельствуют о перспективности использования препарата ФНО-α в качестве современного средства для иммунотерапии онкологических заболеваний.The technology for the production of recombinant human TNF-α was also developed in Russia, in particular, in the Federal State Institution Scientific Center of the WB “Vector” of Rospotrebnadzor [7, 8]. Currently, the second phase of clinical trials of the dosage form of TNF-α, the drug Alnorin, has been completed. Studies performed at the All-Russian Scientific Research Center of Medical Sciences (Moscow) indicate that the administration of Alnorin with subsequent chemotherapy improves the therapeutic effect in patients with disseminated skin melanoma (up to 59%), which manifests itself in complete or partial remission of metastases or stabilization of the process [9 ]. These data indicate the promising use of the drug TNF-α as a modern means for immunotherapy of cancer.
Однако следует отметить, что по-прежнему нерешенной остается проблема быстрой деградации ФНО-α в кровеносном русле, а также ограниченная селективность накопления цитокина в ткани опухоли, что обуславливает необходимость его многократных инъекций для поддержания необходимой эффективной дозы. При этом установлено, что длительное введение ФНО-α в высоких дозах сопровождается разнообразными побочными эффектами и служит препятствием для внедрения этого препарата в медицинскую практику [10-12].However, it should be noted that the problem of the rapid degradation of TNF-α in the bloodstream, as well as the limited selectivity of the accumulation of cytokine in the tumor tissue, which necessitates its multiple injections to maintain the required effective dose, remains unresolved. It was found that prolonged administration of TNF-α in high doses is accompanied by a variety of side effects and serves as an obstacle to the introduction of this drug into medical practice [10-12].
В связи с этим, в течение ряда лет предпринимались многочисленные попытки снижения системной токсичности ФНО-α как за счет непосредственного ослабления его провоспалительных свойств, так и опосредованным образом, через повышение протеолитической устойчивости либо противоопухолевой активности. Одним из наиболее распространенных методических приемов, используемых для этих целей, является создание химерных форм ФНО-α либо композиционных препаратов с веществами-модификаторами биологических реакций.In this regard, over the years, numerous attempts have been made to reduce the systemic toxicity of TNF-α, both due to a direct weakening of its pro-inflammatory properties, and indirectly, through an increase in proteolytic resistance or antitumor activity. One of the most common methodological methods used for these purposes is the creation of chimeric forms of TNF-α or composite preparations with modifiers of biological reactions.
Так, было показано, что получение химерных вариантов ФНО-α с α1-тимозином [13], лейкокинином [14] позволяет повысить противоопухолевую активность препарата за счет усиления его иммуномодулирующей активности. Конъюгат белка с монометоксиполиэтиленгликолем отличался более длительным, по сравнению с ФНО-α, периодом выведения из крови экспериментальных животных, что обусловило повышение противоопухолевой активности препарата в отношении трансплантированных опухолей Meth фибросаркомы и снижение интенсивности токсических проявлений [15]. Конъюгация ФНО-α с полимерами, такими как полиглюкин, поливинилпирролидон, дивиниловый эфир, позволило повысить устойчивость белка к протеолизу и противоопухолевую активность [16-20]. Получен ряд положительных результатов, касающихся изменения фармакокинетики препарата и усиления его противоопухолевых свойств в случае конъюгации ФНО-α с фрагментами антител против антигенов опухоли [21], а также лигандами опухолевых рецепторов, таких как лиганд интегринового рецептора V типа [22] либо трансферрин [23].So, it was shown that obtaining chimeric variants of TNF-α with α 1 -thymosin [13], leukokinin [14] allows to increase the antitumor activity of the drug by enhancing its immunomodulating activity. The protein conjugate with monomethoxypolyethylene glycol had a longer, compared with TNF-α, period of excretion from the blood of experimental animals, which led to an increase in the antitumor activity of the drug against transplanted Meth fibrosarcoma tumors and a decrease in the intensity of toxic manifestations [15]. Conjugation of TNF-α with polymers such as polyglucin, polyvinylpyrrolidone, divinyl ether, has increased the protein resistance to proteolysis and antitumor activity [16-20]. A number of positive results were obtained regarding changes in the pharmacokinetics of the drug and enhancement of its antitumor properties in the case of conjugation of TNF-α with antibody fragments against tumor antigens [21], as well as tumor receptor ligands, such as type V integrin receptor ligand [22] or transferrin [23 ].
Среди соединений, которые использовались в качестве биологически активных добавок при создании композиционных препаратов, можно выделить две группы соединений, различающихся по механизму их действия на организм.Among the compounds that were used as biologically active additives in the creation of composite preparations, two groups of compounds can be distinguished that differ in the mechanism of their action on the body.
Первую группу образуют вещества-синергисты ФНО-α. К ним относятся, например, интерфероны разных типов (α, β- и γ) [24, 25], трансформирующий ростовой фактор бета [26]. Предложен препарат для ингибирования роста опухолей, действующим началом которого, помимо ФНО-α, является соединение, блокирующее систему белка C (антитела против белка C и S, C4δ-связывающий белок) [27]. О'Conner с соавторами [28] был разработан противоопухолевый препарат, содержащий эффективное количество фактора некроза опухоли человека и C-реактивного белка, усиливающего антибластоидную активность ФНО-α.The first group is formed by TNF-α synergistic substances. These include, for example, interferons of various types (α, β- and γ) [24, 25], the transforming growth factor beta [26]. A drug has been proposed for inhibiting tumor growth, the active principle of which, in addition to TNF-α, is a compound that blocks the protein C system (antibodies against protein C and S, C4δ-binding protein) [27]. O'Conner et al. [28] developed an antitumor drug containing an effective amount of human tumor necrosis factor and C-reactive protein that enhances the anti-blastoid activity of TNF-α.
Препараты второй группы характеризуются наличием в своем составе биологически активных соединений, снижающих побочные эффекты ФНО-α. Для предотвращения повреждений клеток, вызванных цитотоксическим действием лимфокинов, используются акцеторы свободных радикалов или метаболические ингибиторы (мочевая кислота, бутионинсульфоксиамин, витамин C и др.) [29]. Для снижения или подавления токсического действия высоких доз ФНО, применяемых при лечении злокачественных новообразований, предложено введение в состав комплексного препарата нестероидных противовоспалительных средств, таких как индометацин, ибупрофен [30].The drugs of the second group are characterized by the presence in their composition of biologically active compounds that reduce the side effects of TNF-α. To prevent damage to cells caused by the cytotoxic effect of lymphokines, free radical accentors or metabolic inhibitors (uric acid, butionine sulfoxyamine, vitamin C, etc.) are used [29]. To reduce or suppress the toxic effect of high doses of TNF used in the treatment of malignant neoplasms, the introduction of non-steroidal anti-inflammatory drugs such as indomethacin, ibuprofen has been proposed in the complex preparation [30].
Известна противоопухолевая композиция, включающая интерлейкин-2, альфа-2-интерферон и двунитевую РНК (дн-РНК) [47]. Было показано, что добавление в композицию дн-РНК в качестве «катализатора», повышающего активность цитокинов, позволило снизить дозы ИЛ-2 и ФНО, необходимые для достижения терапевтического эффекта. Однако следует отметить, что для получения положительного эффекта введения композиционного препарата при использовании такой дн-РНК/цитокинотерапии проводили с использованием доз порядка 103-104 ME на кг массы тела, т.е. доз, которые, как известно [1], уже способны вызывать токсические реакции.Known antitumor composition comprising interleukin-2, alpha-2-interferon and double-stranded RNA (dn-RNA) [47]. It was shown that the addition of dnRNA to the composition as a “catalyst” that increases the activity of cytokines allowed us to reduce the doses of IL-2 and TNF necessary to achieve a therapeutic effect. However, it should be noted that in order to obtain a positive effect of the introduction of the composite preparation when using such dn-RNA / cytokine therapy, doses of about 10 3 -10 4 ME per kg body weight were used, i.e. doses, which, as is known [1], are already capable of causing toxic reactions.
При всех несомненных достоинствах данного подхода следует отметить, что введение в состав комплексного или композиционного препарата биологического модификатора направлено, как правило, на решение лишь какой-либо одной из проблем: повышения протеолитической устойчивости, усиления противоопухолевой активности ФНО либо снижения выраженности его побочного действия.With all the undoubted advantages of this approach, it should be noted that the introduction of a biological modifier into the composition of a complex or composite preparation is usually aimed at solving only one of the problems: increasing proteolytic stability, enhancing the antitumor activity of TNF or reducing the severity of its side effect.
Попыткой комплексного решения проблемы протеолитической устойчивости ФНО-α и усиления накопления в ткани опухоли является создание препаратов, содержащих ФНО-α в составе наночастиц. Как известно, патологическая сосудистая стенка опухоли, в отличие от нормальной, проницаема для крупных молекул с молекулярной массой 40 kDa и выше и мелких частиц, которые накапливаются в межклеточном пространстве опухоли [31]. При онкопатологии накоплению также способствует недостаточность лимфатической системы, ответственной за дренаж макромолекул в нормальных тканях. Размер пор эндотелия кровеносных сосудов большинства опухолей колеблется в пределах от 200 до 600 нм в диаметре, что позволяет частицам соответствующего размера проникать непосредственно в опухолевую ткань.An attempt to comprehensively solve the problem of proteolytic stability of TNF-α and enhance accumulation in tumor tissue is the creation of drugs containing TNF-α in the composition of nanoparticles. As is known, the pathological vascular wall of the tumor, in contrast to the normal one, is permeable to large molecules with a molecular mass of 40 kDa and above and small particles that accumulate in the intercellular space of the tumor [31]. With oncopathology, the accumulation is also facilitated by the insufficiency of the lymphatic system responsible for the drainage of macromolecules in normal tissues. The pore size of the blood vessel endothelium of most tumors ranges from 200 to 600 nm in diameter, which allows particles of an appropriate size to penetrate directly into the tumor tissue.
В настоящее время созданы и исследованы два типа наночастиц, несущих ФНО-α: наночастицы, содержащие в качестве носителя неорганические компоненты, и липосомы.Currently, two types of nanoparticles carrying TNF-α have been created and studied: nanoparticles containing inorganic components as carriers and liposomes.
Visaria R.K. с соавторами была продемонстрирована возможность использования наночастиц, состоящих из покрытых полиэтиленгликолем частиц коллоидального золота, в качестве систем доставки ФНО-α для термальной терапии опухолей [32]. Было показано, что данная конструкция тормозит как скорость кровотока в сосудистой системе опухоли, так и ее рост. Повышение накопления ФНО-α в составе частиц золота, покрытых модифицированным полиэтиленгликолем, в опухоли и снижение - в органах, обогащенных клетками РЭС (печень, селезенка и др.), отмечали и авторы работы [33]. Наночастицы, ядро которых было образовано частицами кремния, а органическая оболочка содержала малеимидные группы для связывания ФНО-α, инициировали иммунный ответ, который по интенсивности был характерен для мембраносвязанного ФНО-α [34].Visaria R.K. et al. demonstrated the possibility of using nanoparticles consisting of colloidal gold particles coated with polyethylene glycol as TNF-α delivery systems for thermal therapy of tumors [32]. It was shown that this design inhibits both the blood flow velocity in the vascular system of the tumor and its growth. An increase in the accumulation of TNF-α in the composition of gold particles coated with modified polyethylene glycol in the tumor and a decrease in organs enriched in RES cells (liver, spleen, etc.) were also noted by the authors of [33]. Nanoparticles, the core of which was formed by silicon particles, and the organic shell contained maleimide groups for the binding of TNF-α, initiated an immune response, which in intensity was characteristic of membrane-bound TNF-α [34].
Однако следует отметить, что общим недостатком конструкций [32-34], содержащих неорганические частицы, является отсутствие систем их биодеградации, в результате чего кумуляция данных частиц в организме приводит к развитию серьезных токсических эффектов, в частности цитотоксичности [35].However, it should be noted that a common drawback of the constructions [32–34] containing inorganic particles is the lack of biodegradation systems, as a result of which the accumulation of these particles in the body leads to the development of serious toxic effects, in particular cytotoxicity [35].
Другим вариантом наноконструкций, которые были разработаны для защиты ФНО-α от деградации, являются липосомы [36-40]. К сожалению, выяснилось, что существенным недостатком липосомальных форм является их быстрая опсонизация при внутривенном введении и последующий захват клетками ретикулоэндотелиальной системы [41]. Липосомы, содержавшие ФНО-α, быстро узнавались клетками мононуклеарной фагоцитирующей системы, имели малое время циркуляции и селективно разрушались в ретикуло-эндотелиальной системе опухоли.Liposomes are another variant of nanoconstructions that have been developed to protect TNF-α from degradation [36–40]. Unfortunately, it turned out that a significant drawback of liposomal forms is their rapid opsonization upon intravenous administration and subsequent capture by the cells of the reticuloendothelial system [41]. Liposomes containing TNF-α were quickly recognized by cells of the mononuclear phagocytic system, had a short circulation time and selectively destroyed in the reticuloendothelial system of the tumor.
Для преодоления захвата липосом мононуклеарами крови и опухоли были разработаны так называемые «липосомы-невидимки», содержащие полиэтиленгликоль (ПЭГ), что приводило к повышению осмотического давления вокруг липосом и препятствовало их сближению с клеткой [42-45]. Пегилированные липосомы невидимы для клеток ретикулоэндотелиальной системы и долгое время циркулируют в крови, но при этом имеют существенный недостаток - плохо накапливаются в клетках-мишенях. Помимо этого, выяснилось, что «липосомы-невидимки», содержащие ФНО-α, нестабильны при хранении. И, наконец, известно, что абсолютное большинство типов липосом накапливается в печени (в гепатоцитах, в частности, до 97% фосфатидилхолиновых липосом) и селезенке [46]. Поэтому использование липосом в качестве носителя ФНО-α имеет серьезный недостаток, связанный с тем, что ФНО-α, благодаря своим провоспалительным свойствам, может способствовать развитию гепатотоксичности.To overcome the capture of liposomes by blood and tumor mononuclear cells, the so-called "invisible liposomes" containing polyethylene glycol (PEG) were developed, which led to an increase in the osmotic pressure around the liposomes and prevented their approach to the cell [42–45]. Pegilated liposomes are invisible to the cells of the reticuloendothelial system and circulate in the blood for a long time, but at the same time they have a significant drawback - they do not accumulate well in target cells. In addition, it turned out that "invisible liposomes" containing TNF-α are unstable during storage. And, finally, it is known that the vast majority of liposome types accumulate in the liver (in hepatocytes, in particular, up to 97% of phosphatidylcholine liposomes) and the spleen [46]. Therefore, the use of liposomes as a carrier of TNF-α has a serious drawback due to the fact that TNF-α, due to its pro-inflammatory properties, can contribute to the development of hepatotoxicity.
Приведенные литературные данные свидетельствуют о возможности изменения фармако-токсических свойств ФНО-α в результате его конъюгирования, включения в состав композиционного препарата либо введения в наноконструкцию (наночастицу). Как тот, так и другой подходы имеют свои достоинства и недостатки. Создание химерных форм и композиций ФНО-α направлено на повышение протеолитической устойчивости, усиление антибластоидной активности либо снижение токсичности белка, но при этом не ставится задача повышения накопления ФНО-α в ткани опухоли. Введение ФНО-α в состав наноконструкций позволяет приблизиться к решению проблемы селективности накопления вещества в ткани опухоли, однако компоненты наноконструкций являются, преимущественно, биологически инертными веществами, и нередко существует проблема их биодеградации.The published data indicate the possibility of changing the pharmaco-toxic properties of TNF-α as a result of its conjugation, inclusion in the composition of a composite preparation, or introduction into a nanoconstruction (nanoparticle). Both approaches have their advantages and disadvantages. The creation of chimeric forms and compositions of TNF-α is aimed at increasing proteolytic stability, enhancing anti-blastoid activity or reducing protein toxicity, but the goal is not to increase the accumulation of TNF-α in tumor tissue. The introduction of TNF-α into nanoconstructions allows one to approach the solution of the problem of selectivity of substance accumulation in the tumor tissue, however, the components of nanoconstructions are mainly biologically inert substances, and there is often a problem of their biodegradation.
Для комплексного решения проблемы необходимо получить биодеградируемую наноконструкцию, повышающую протеолитическую устойчивость ФНО-α, его накопление в опухоли и содержащую в своем составе, помимо ФНО-α, вещество-синергист, обладающее противоопухолевыми и иммуномодулирующими свойствами.For a comprehensive solution to the problem, it is necessary to obtain a biodegradable nanoconstruction that increases the proteolytic stability of TNF-α, its accumulation in the tumor and containing, in addition to TNF-α, a synergist substance with antitumor and immunomodulating properties.
Ранее в ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» были созданы двухслойные молекулярные конструкции, содержащие в центральной части нуклеотидный материал (двуспиральные дрожжевые РНК), покрытый оболочкой из спермидин-полиглюкина, а на поверхности - антигены инфекционного агента. На основе этих конструкций были получены экспериментальные образцы кандидатных вакцин против ВИЧ, туберкулеза, клещевого энцефалита, показана их высокая эффективность при иммунизации лабораторных животных [48-50]. Созданная конструкция, содержащая полинуклеотидный и полисахаридный материал, в физиологических условиях имели сферическую вирусоподобную форму, в связи с чем получила название «вирусоподобная частица» (ВПЧ), и размеры от 25 до 40 нм, что позволяет отнести ее к категории наноматериалов.Previously, two-layer molecular constructs were created in the Central part of the State Scientific Center of the Scientific and Research Center of the Vektor Vector, containing nucleotide material (double-stranded yeast RNA) coated with a spermidine-polyglucin membrane and antigens of an infectious agent on the surface. Based on these constructions, experimental samples of candidate vaccines against HIV, tuberculosis, tick-borne encephalitis were obtained, and their high efficiency was shown in immunization of laboratory animals [48-50]. The created construction, containing polynucleotide and polysaccharide material, under physiological conditions had a spherical virus-like shape, in connection with which it received the name “virus-like particle” (HPV), and sizes from 25 to 40 nm, which allows it to be classified as nanomaterials.
Наиболее близким аналогом (прототипом), по мнению заявителя, является конструкция наночастиц, содержащих ФНО-α, предложенная Ya-Ping LI с соавторами [53]. Осуществленное ими инкапсулирование рекомбинантного ФНО-α человека в полицианоакрилатные нанокапсулы (poly(methoxypolyethyleneglycol cyanoacry-late-co-n-hexadecyl cyanoacrylate, PEG-PHDCA) приводило к удлинению времени полужизни ФНО-α в 7 раз. Содержащая ФНО-α наночастица накапливалась преимущественно в опухолевых тканях и ингибировала рост опухоли на 78,3%, в то время как свободный ФНО-α в той же дозе вызывал ингибирование опухоли лишь на 15,4%.The closest analogue (prototype), according to the applicant, is the design of nanoparticles containing TNF-α, proposed by Ya-Ping LI with co-authors [53]. Their encapsulation of recombinant human TNF-α into polycyanoacrylate nanocapsules (poly (methoxypolyethyleneglycol cyanoacry-late-co-n-hexadecyl cyanoacrylate, PEG-PHDCA) led to an increase in the half-life of TNF-α by a factor of 7. tumor tissue and inhibited tumor growth by 78.3%, while free TNF-α at the same dose caused tumor inhibition by only 15.4%.
Однако в данной публикации отсутствуют сведения о возможности деградации данного типа полимерных материалов в биологической среде организма, возможности их кумуляции и, как следствие, отсутствуют данные об отдаленной специфической токсичности данной препаративной формы.However, in this publication there is no information about the possibility of degradation of this type of polymer materials in the biological environment of the body, the possibility of their cumulation and, as a result, there is no data on the long-term specific toxicity of this formulation.
Сведения об известных наноконструкциях, содержащих в своем составе полинуклеотидный комплекс (двуспиральную РНК, дсРНК) и ФНО-α, в литературных источниках в настоящее время отсутствуют.Information on known nanoconstructions containing a polynucleotide complex (double-stranded RNA, dsRNA) and TNF-α is currently not available in the literature.
Техническим результатом заявляемого технического решения является создание такого противоопухолевого средства на основе наночастиц, несущих рекомбинантный фактор некроза опухолей альфа человека, которое представляет собой биодеградирумые наночастицы, обладающие противоопухолевым действием при более низких эффективных дозах ФНО-α и пониженной токсичностью, по сравнению с известными выше приведенными аналогами.The technical result of the claimed technical solution is the creation of such an antitumor agent based on nanoparticles carrying a recombinant tumor necrosis factor alpha human, which is a biodegradable nanoparticles with antitumor activity at lower effective doses of TNF-α and reduced toxicity, compared with the known above analogues .
Указанный технический результат достигается тем, что в противоопухолевом средстве на основе наночастиц, несущих рекомбинантный фактор некроза опухолей альфа, согласно изобретению, каждая наночастица содержит ядро, состоящее из полинуклеотидного комплекса, представляющего собой двуспиральную РНК (дсРНК) - индуктор интерфероногенеза, и покрытое слоем конъюгата спермидина с полиглюкином, удерживаемого за счет ионного взаимодействия между отрицательно заряженным полинуклеотидным комплексом и положительно заряженным спермидином, а рекомбинантный фактор некроза опухолей альфа человека ковалентно связан с активированным полиглюкином. Полиглюкин активирован периодатом натрия.The specified technical result is achieved by the fact that in an antitumor agent based on nanoparticles carrying a recombinant tumor necrosis factor alpha, according to the invention, each nanoparticle contains a nucleus consisting of a polynucleotide complex, which is a double-stranded RNA (dsRNA), an interferonogenesis inducer, and coated with a spermidine conjugate layer with polyglucin, retained due to ionic interaction between the negatively charged polynucleotide complex and positively charged spermidine, and rivers the human alpha tumor necrosis factor is covalently linked to activated polyglucin. Polyglukin is activated by sodium periodate.
В качестве двуспиральной РНК противоопухолевое средство содержит двуспиральную РНК из дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Наночастицы имеют сферическую форму с размером порядка 50-70 нм, что позволяет избежать захвата их клетками ретикуло-эндотелиальной системы. Причем на одну молекулу двуспиральной РНК из дрожжей Saccharomyces cerevisiae приходится 60-80 молекул рекомбинантного человеческого ФНО-α с цитолитической активностью не ниже 106 МЕ/мг белка, 60-80 молекул полиглюкина и 1000-1300 молекул спермидина.As a double-stranded RNA, the antitumor agent contains double-stranded RNA from Saccharomyces cerevisiae yeast. Nanoparticles have a spherical shape with a size of the order of 50-70 nm, which avoids the capture of the cells of the reticulo-endothelial system. Moreover, one molecule of double-stranded RNA from Saccharomyces cerevisiae yeast accounts for 60-80 molecules of recombinant human TNF-α with a cytolytic activity of at least 106 IU / mg protein, 60-80 polyglucin molecules and 1000-1300 spermidine molecules.
Лечебное действие средства заключается в том, что дсРНК и ФНО-α в составе наночастиц взаимно потенцируют эффекты на злокачественные клетки, что позволяет снизить эффективную дозу ФНО-α и ослабить токсические эффекты цитокина.The therapeutic effect of the drug lies in the fact that dsRNA and TNF-α in the nanoparticles mutually potentiate effects on malignant cells, which reduces the effective dose of TNF-α and weaken the toxic effects of the cytokine.
Исследование образца препарата наночастиц с ФНО-α методом сканирующей зондовой микроскопии показало, что наночастицы имеют сферическую форму с размером частиц порядка 50-70 нм.The study of a sample of the preparation of nanoparticles with TNF-α by scanning probe microscopy showed that the nanoparticles have a spherical shape with a particle size of about 50-70 nm.
Исследование противоопухолевой активности препарата наночастиц с ФНО-α в экспериментах на мышах с трансплантированной карциномой Эрлиха показало, что препарат обладает повышенной способностью ингибировать рост опухоли, по сравнению с монопрепаратом ФНО-α. Эффективная доза ФНО-α в составе наночастиц в 10-100 раз ниже эффективной дозы входящего в его состав ФНО-α.A study of the antitumor activity of the preparation of nanoparticles with TNF-α in experiments on mice with transplanted Ehrlich carcinoma showed that the drug has an increased ability to inhibit tumor growth, compared with the single drug TNF-α. The effective dose of TNF-α in the composition of the nanoparticles is 10-100 times lower than the effective dose of TNF-α included in its composition.
Оценка токсических свойств препарата наночастиц с ФНО-α, в сравнении с препаратом ФНО-α, на мышах-опухоленосителях с трансплантированной карциномой Эрлиха показала, что максимально переносимая доза для наночастиц с ФНО-α в 1,5 раза превышала значения, полученные для ФНО-α.Assessment of the toxic properties of the preparation of nanoparticles with TNF-α, in comparison with the preparation of TNF-α, on tumor-bearing mice with transplanted Ehrlich carcinoma showed that the maximum tolerated dose for nanoparticles with TNF-α was 1.5 times higher than the values obtained for TNF-α α.
Следовательно, наночастица, представляющая композицию из двух биологически активных веществ дсРНК и ФНО-α, обладает более высокой противоопухолевой активностью и сниженной токсичностью, по сравнению с ФНО-α.Therefore, the nanoparticle, which is a composition of two biologically active substances dsRNA and TNF-α, has a higher antitumor activity and reduced toxicity compared to TNF-α.
Обоснование критерия «изобретательский уровень»Justification of the criterion of "inventive step"
Создание заявляемой конструкции наночастиц в качестве средства депонирования и доставки ФНО-α с повышенным противоопухолевым и пониженным токсическим действием является неочевидным для специалиста в области медицины и биотехнологии, поскольку потребовались дополнительные научные исследования и получение следующих данных:The creation of the claimed design of nanoparticles as a means of deposition and delivery of TNF-α with increased antitumor and reduced toxic effects is not obvious to a specialist in the field of medicine and biotechnology, since additional scientific research and obtaining the following data were required:
1) может ли введение ФНО-α в состав заявляемой наноконструкций обеспечить повышение его накопления в ткани опухоли, что, в свою очередь, обусловлено как размерами, так и особенностями проникновения заявляемых наночастиц через сосуды опухоли;1) whether the introduction of TNF-α into the composition of the claimed nanostructures can increase its accumulation in the tumor tissue, which, in turn, is due to both the size and the features of the penetration of the claimed nanoparticles through the vessels of the tumor;
2) известно, что препарат двуспиральной РНК из дрожжей S. cerevisiae, образующий ядро наночастицы, обладает противоопухолевыми и иммуномодулирующими свойствами [51], однако требовалось установить и экспериментально обосновать, может ли дсРНК привести к модуляции и усилению противоопухолевых свойств ФНО-α и как следствие, снижению токсических свойств цитокина;2) it is known that the double-stranded RNA preparation from S. cerevisiae yeast, which forms the nucleus of the nanoparticle, has antitumor and immunomodulating properties [51], however, it was necessary to establish and experimentally substantiate whether dsRNA can modulate and enhance the antitumor properties of TNF-α and, as a result reducing the toxic properties of the cytokine;
3) в качестве оболочки, окружающей ядро наночастицы и обеспечивающей экспонирование ФНО-α на ее поверхности, предлагается использовать полиглюкин. С одной стороны, известно его применение для депонирования и защиты от деградации терапевтических средств [15], а также стимуляции иммунного ответа [52], а с другой стороны, необходимо было установить возможность создания конъюгата полиглюкин-спермидин- ФНО-α и возможность создания всей наноконструкции с требуемыми фармакологическими свойствами. Неочевидным является и количественное содержание заявляемых компонентов, входящих в состав наночастиц.3) it is proposed to use polyglucin as a shell surrounding the core of the nanoparticle and providing exposure of TNF-α on its surface. On the one hand, its use is known for deposition and protection against degradation of therapeutic agents [15], as well as stimulation of the immune response [52], and on the other hand, it was necessary to establish the possibility of creating a polyglukin-spermidine-TNF-α conjugate and the possibility of creating the whole nanoconstructions with the required pharmacological properties. Non-obvious is the quantitative content of the claimed components that make up the nanoparticles.
Изобретение иллюстрируется следующими чертежами.The invention is illustrated by the following drawings.
Фиг.1. Внешний вид наночастицы, несущей ФНО-α, где:Figure 1. Appearance of a nanoparticle carrying TNF-α, where:
А - схема конструкции наночастицы;A is a design diagram of a nanoparticle;
Б - изображение частицы, полученное методом сканирующей зондовой микроскопии. Образец наночастиц с ФНО-α, 10 мкг/мл. Условия сканирования: кантиливер NSG10, площадь сканирования 2,5×2,5 мкм.B — image of a particle obtained by scanning probe microscopy. A sample of nanoparticles with TNF-α, 10 μg / ml. Scanning conditions: cantilever NSG10, scanning area 2.5 × 2.5 μm.
Фиг.2. Электрофореграмма препарата наночастиц с ФНО-α и его компонентов в 1%-ном геле агарозы, где дорожки:Figure 2. Electrophoregram of the preparation of nanoparticles with TNF-α and its components in a 1% agarose gel, where the tracks:
И - исходная двуспиральная РНК (дсРНК);And - the original double-stranded RNA (dsRNA);
1 - дсРНК в оболочке из конъюгата «спермидин-полиглюкин»;1 - dsRNA in the shell of the conjugate "spermidine-polyglucin";
2 - дсРНК в оболочке из конъюгата "спермидин-полиглюкин-ФНО-α.2 - dsRNA in the shell of the conjugate "spermidine-polyglucin-TNF-α.
Фиг.3. Влияние препаратов наночастиц с ФНО-α и ФНО-α на рост перевивной опухоли карциномы Эрлиха.Figure 3. The effect of preparations of nanoparticles with TNF-α and TNF-α on the growth of a transplantable tumor of Ehrlich carcinoma.
По оси абсцисс - доза препаратов, Е/мышь; по оси ординат - торможение роста опухоли, %, при введении ФИО-α (темные столбики) или наночастиц с ФНО-α (столбики со штриховкой), * - различия с контролем статистически достоверны, р≤0,05.On the abscissa axis is the dose of drugs, E / mouse; along the ordinate axis - inhibition of tumor growth,%, with the introduction of full name-α (dark bars) or nanoparticles with TNF-α (bars with hatching), * - differences with control are statistically significant, p≤0.05.
Фиг.4. Гибель животных с перевивной карциномой Эрлиха после введения препаратов наночастиц с ФНО-α и ФНО-α.Figure 4. The death of animals with transplantable Ehrlich carcinoma after administration of preparations of nanoparticles with TNF-α and TNF-α.
По оси абсцисс - доза препаратов, мг/кг; по оси ординат - гибель животных, %, при введении ФНО-α (темные столбики) или наночастиц с ФНО-α (столбики со штриховкой).On the abscissa axis is the dose of drugs, mg / kg; along the ordinate axis - the death of animals,%, with the introduction of TNF-α (dark bars) or nanoparticles with TNF-α (bars with hatching).
Описание конструкции наночастицы с ФНО-αDescription of the design of nanoparticles with TNF-α
Каждая наночастица (фиг.1) содержит ядро 1, состоящее из полинуклеотидного комплекса, представляющего собой двуспиральную РНК (дсРНК) - индуктор интерфероногенеза, покрытое слоем 2 конъюгата спермидин/полиглюкина и прикрепленных к нему молекул 3 рекомбинантного фактора некроза опухолей альфа человека (ФНО-α), удерживаемого за счет ионного взаимодействия между отрицательно заряженным полинуклеотидным комплексом и положительно заряженным спермидином. В качестве двуспиральной РНК противоопухолевое средство содержит двуспиральную РНК из дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Наночастицы имеют сферическую форму с размером порядка 50-70 нм, что позволяет избежать захвата их клетками ретикуло-эндотелиальной системы организма. Причем на одну молекулу двуспиральной РНК из дрожжей Saccharomyces cerevisiae приходится 60-80 молекул рекомбинантного человеческого ФНО-α с цитолитической активностью не ниже 106 МЕ/мг белка, 60-80 молекул полиглюкина и 1000-1300 молекул спермидина.Each nanoparticle (Fig. 1) contains a
Для лучшего понимания сущности изобретения ниже следуют примеры получения наночастиц с ФНО-α.For a better understanding of the invention, the following are examples of the preparation of nanoparticles with TNF-α.
Пример 1. Синтез конъюгата полиглюкин-спермидин-ФНО-αExample 1. Synthesis of the conjugate polyglucin-spermidine-TNF-α
Для синтеза конъюгата 60 мг (1,2 мкМ) полиглюкина с молекулярной массой 50 000 Да растворяют в 0,5 мл 50 мМ раствора периодата натрия и инкубируют 50 мин при комнатной температуре. Активированный полисахарид отделяют от периодата натрия гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-50 (V=2 мл) в 50 мМ бикарбонатном буфере, pH 8,6 и добавляют раствор 50 мМ бикарбонатного буфера, pH 8,6 (4-6 мл), содержащий 17 мг рекомбинантного ФНО-α. После инкубации в течение 3 ч при 6°C в раствор вносят 0,05 мл раствора, содержащего 2,25 мг (15 мкМ) спермидина, тщательно перемешивают. Еще через 5 ч добавляют 0,1 мл свежеприготовленного 10 мМ раствора периодата натрия. После инкубации в течение часа при 6°C непрореагировавшие компоненты удаляют гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-50 (V=20 мл) в фосфатно-солевом буфере, содержащем 0,15 М NaCl, pH 7,2. Затем дополнительно образец диализуют против двух смен того же буфера, по 200 мл каждая. Препарат стерилизуют фильтрованием (0,2 мкМ).To synthesize the conjugate, 60 mg (1.2 μM) of polyglucin with a molecular weight of 50,000 Da are dissolved in 0.5 ml of a 50 mM sodium periodate solution and incubated for 50 min at room temperature. The activated polysaccharide is separated from the sodium periodate by gel filtration on a Sephadex G-50 column (V = 2 ml) in 50 mM bicarbonate buffer, pH 8.6, and a solution of 50 mM bicarbonate buffer, pH 8.6 (4-6 ml), is added. containing 17 mg of recombinant TNF-α. After incubation for 3 hours at 6 ° C, 0.05 ml of a solution containing 2.25 mg (15 μM) of spermidine was added to the solution, mixed thoroughly. After another 5 hours, 0.1 ml of freshly prepared 10 mM sodium periodate solution was added. After incubation for one hour at 6 ° C, unreacted components were removed by gel filtration on a Sephadex G-50 column (V = 20 ml) in phosphate-buffered saline containing 0.15 M NaCl, pH 7.2. Then, an additional sample is dialyzed against two shifts of the same buffer, 200 ml each. The drug is sterilized by filtration (0.2 μM).
При анализе полученного конъюгата на электрофореграмме в 10% полиакриламидном геле наблюдалось «облако» с кажущейся молекулярной массой в районе 120 кДа. При гель-фильтрации на сефадексе G-50 конъюгат элюировался в районе молекулярных масс 40-45 кДа.When analyzing the obtained conjugate on an electrophoregram in a 10% polyacrylamide gel, a “cloud” was observed with an apparent molecular weight in the region of 120 kDa. During gel filtration on Sephadex G-50, the conjugate was eluted in the region of molecular masses of 40-45 kDa.
Пример 2. Сборка наночастиц с ФНО-αExample 2. Assembly of nanoparticles with TNF-α
Для получения наночастиц, содержащих дсРНК и ФНО-α, к раствору дрожжевой дсРНК добавляли раствор конъюгата полиглюкин/спермидин/ФНО-α в соотношении: 1 мг дсРНК - 2 мг (по белковой компоненте) конъюгата. Для формирования частиц раствор инкубировали при 4°C в течение 2 часов. Анализ полученной наночастицы проводили гель-фильтрацией на колонке с сефарозой CL-6B и электрофорезом в 1%-ном геле агарозы.To obtain nanoparticles containing dsRNA and TNF-α, a polyglukin / spermidine / TNF-α conjugate solution was added to the yeast dsRNA solution in the ratio: 1 mg dsRNA - 2 mg (in terms of the protein component) of the conjugate. To form particles, the solution was incubated at 4 ° C for 2 hours. The analysis of the obtained nanoparticles was carried out by gel filtration on a column with CL-6B Sepharose and electrophoresis in a 1% agarose gel.
Количественный состав наночастиц, содержащей фактор некроза опухоли альфа и двуспиральные РНК из дрожжей Saccharomyces cerevisiae (в центральной части): на одну молекулу двуспиральной РНК из дрожжей Saccharomyces cerevisiae приходится 60-80 молекул рекомбинантного человеческого ФНО-α с цитолитической активностью не ниже 106 МЕ/мг белка, 60-80 молекул полиглюкинаи 1000-1300 молекул спермидина.The quantitative composition of nanoparticles containing tumor necrosis factor alpha and double-stranded RNA from Saccharomyces cerevisiae yeast (in the central part): 60-80 recombinant human TNF-α molecules with a cytolytic activity of at least 106 IU / mg are produced per double-stranded RNA molecule from Saccharomyces cerevisiae yeast protein, 60-80 polyglucinol molecules; and 1000-1300 spermidine molecules.
Пример 3. Характеристика наночастиц с ФНО-αExample 3. Characterization of nanoparticles with TNF-α
Теоретическая схема молекулярной конструкции, несущей ФНО-α, представлена на Фиг.1А. Анализ образца, проведенный методом зондовой микроскопии, показал, что конструкция имеет сферическую форму с диаметром около 50-70 нм (Фиг.1Б.).A theoretical diagram of the molecular structure carrying TNF-α is shown in FIG. 1A. Analysis of the sample by probe microscopy showed that the design has a spherical shape with a diameter of about 50-70 nm (Fig.1B.).
При анализе препарата гель-фильтрацией на колонке с сефарозой CL-6B показано, что собранная нанобиочастица элюируется ранее исходной РНК, в свободном объеме (свободный объем для сефарозы CL-6B, согласно паспортным характеристикам фирмы изготовителя, от 4 МДа и выше). Анализ наночастицы и ее компонента, дсРНК, покрытой оболочкой из полиглюкина, электрофорезом в 1%-ном геле агарозы показал, что в каждом образце присутствует два вида частиц, соответствующих L- и М-формам дсРНК (Фиг.2). Судя по размеру зон, частицы сохраняют компактную и однородную форму. Их подвижность в электрофорезе снижается, по сравнению с компонентами исходной дсРНК, что свидетельствует об увеличении их массы и объема, т.е. об образовании наноструктур.When analyzing the preparation by gel filtration on a CL-6B Sepharose column, it was shown that the collected nanobioparticle was eluted earlier than the initial RNA in a free volume (free volume for CL-6B Sepharose, according to the manufacturer's passport data, from 4 MDa and higher). Analysis of the nanoparticle and its component, dsRNA coated with a polyglucin membrane by electrophoresis in a 1% agarose gel showed that in each sample there are two types of particles corresponding to the L and M forms of dsRNA (Figure 2). Judging by the size of the zones, the particles retain a compact and uniform shape. Their mobility in electrophoresis decreases, compared with the components of the initial dsRNA, which indicates an increase in their mass and volume, i.e. on the formation of nanostructures.
После обработки препаратов РНКазой (0,05 мг/мл) методом гель-электрофореза было установлено, что если для исходной двуспиральной РНК полная деградация наблюдается уже через 30 мин инкубации, то в собранной конструкции нуклеотидный материал сохраняется интактным не менее суток. Это свидетельствует о полноте упаковки в оболочку и снижении доступности нуклеотидного материала для деградирующих факторов. Частицы в стерильном препарате сохраняют свою компактную структуру при хранении в условиях бытового холодильника не менее 6 мес.After processing the preparations with RNase (0.05 mg / ml) by gel electrophoresis, it was found that while complete degradation was observed for the initial double-stranded RNA after 30 minutes of incubation, the nucleotide material remained intact for at least 24 hours in the assembled construct. This indicates the completeness of packaging in the shell and a decrease in the availability of nucleotide material for degrading factors. Particles in a sterile preparation retain their compact structure when stored in a domestic refrigerator for at least 6 months.
Пример 4. Изучение противоопухолевой активности наночастиц с ФНО-αExample 4. The study of the antitumor activity of nanoparticles with TNF-α
Влияние препарата наночастиц с ФНО-α на развитие опухоли изучают на белых беспородных мышах ICR, самцах, с трансплантированной опухолью карциномы Эрлиха. Клетки опухоли перевивают внутримышечно, в дозе 105 клеток на животное. Препарат наночастиц с ФНО-α вводят внутрибрюшинно, в диапазоне доз от 102 до 104 Е/мышь массой 20 г. В качестве препарата сравнения используют ФНО-α в эквивалентных дозах, контрольным животным вводят физиологический раствор. Инъекции тестируемых препаратов проводят трехкратно, с интервалом в один день, курс инъекций начинают на 7 день после трансплантации опухолевых клеток.The effect of the preparation of nanoparticles with TNF-α on tumor development is studied on white outbred ICR mice, males, with a transplanted Ehrlich carcinoma tumor. Tumor cells are transplanted intramuscularly at a dose of 105 cells per animal. The preparation of nanoparticles with TNF-α is administered intraperitoneally, in a dose range of 10 2 to 10 4 U / mouse weighing 20 g. TNF-α in equivalent doses is used as a reference drug, physiological saline is administered to control animals. Injections of the tested drugs are carried out three times, with an interval of one day, the course of injections begins on the 7th day after the transplantation of tumor cells.
Эффект препаратов на развитие опухоли оценивают по изменению массы опухолевого узла по окончании эксперимента (15 сутки после трансплантации опухоли). Процент торможения роста опухоли на фоне введения препаратов рассчитывают по следующей формуле:The effect of drugs on tumor development is assessed by the change in the mass of the tumor node at the end of the experiment (15 days after tumor transplantation). The percentage of inhibition of tumor growth during administration of drugs is calculated by the following formula:
ТРО(%)=(Вк-Во)·100/Вк,SRW (%) = (Vk-Va) · 100 / Vk,
где Вк - средний показатель роста опухоли в контрольной группе;where Bk is the average tumor growth in the control group;
Во - средний показатель опытной группы.In - the average indicator of the experimental group.
Данные экспериментов обрабатывают методами вариационной статистики с помощью пакета программ "Statgraphics, Vers. 5.0" (Statistical Graphics Corp., USA). Достоверность обнаруженных различий оценивают по t-критерию Стьюдента.The experimental data are processed by methods of variation statistics using the software package "Statgraphics, Vers. 5.0" (Statistical Graphics Corp., USA). The reliability of the detected differences is evaluated by t-student test.
Результаты исследования противоопухолевой активности препарата наночастиц с ФНО-α, в сравнении с препаратом ФНО-α, представлены на фиг 3. Установлено, что введение ФНО-α ни в одной из использованных доз не оказывало достоверно выраженного ингибирования роста опухоли. Тенденция к снижению средней массы опухоли была отмечена лишь в группе мышей, которым препарат вводили в наибольшей дозе 104 Е/20 г, при этом процент торможения роста опухоли не превышал 20%. Препарат наночастиц с ФНО-α ослаблял рост опухоли уже в дозе 102Е/20 г (по ФНО-α, на 19%). Трехкратное введение препарата наночастиц с ФНО-α в дозах 103-104 Е/20 г вызывало статистически значимое ингибирование роста опухоли. Средний вес опухолевого узла в опытной группе животных в конце эксперимента был, соответственно, на 28 и 29% ниже контрольного показателя (различия достоверны, р<0,05) (фиг.3).The results of a study of the antitumor activity of the preparation of nanoparticles with TNF-α, in comparison with the preparation of TNF-α, are presented in Fig. 3. It was found that the administration of TNF-α in none of the doses used showed a significantly pronounced inhibition of tumor growth. The trend towards a decrease in the average tumor mass was observed only in the group of mice to which the drug was administered at the highest dose of 10 4 U / 20 g, while the percentage of inhibition of tumor growth did not exceed 20%. The preparation of nanoparticles with TNF-α attenuated tumor growth already at a dose of 10 2 U / 20 g (according to TNF-α, by 19%). Three-time administration of a preparation of nanoparticles with TNF-α at doses of 10 3 -10 4 U / 20 g caused a statistically significant inhibition of tumor growth. The average weight of the tumor node in the experimental group of animals at the end of the experiment was, respectively, 28 and 29% lower than the control indicator (differences are significant, p <0.05) (Fig. 3).
Таким образом, на экспериментальной опухолевой модели было показано, что торможение роста опухоли при введении наночастиц с ФНО-α наблюдалось в дозах, в 10-100 раз более низких, чем после инъекций препарата ФНО-α.Thus, in an experimental tumor model, it was shown that inhibition of tumor growth with the introduction of nanoparticles with TNF-α was observed in doses 10-100 times lower than after injection of the drug TNF-α.
Пример 5. Исследование токсических свойств препарата наночастиц с ФНО-αExample 5. The study of the toxic properties of the drug nanoparticles with TNF-α
Уровень токсичности препарата определяют в экспериментах на белых беспородных мышах ICR, самцах, с перевивной опухолью Эрлиха, в сравнении с ФНО-α. Клетки опухоли перевивают внутримышечно, в дозе 5·105 клеток на животное. Препараты наночастиц с ФНО-α и ФНО-α растворяют в 0,9% растворе хлористого натрия и вводят внутрибрюшинно однократно, в диапазоне доз от 50 до 750 мг/кг в объеме 0,2 мл на 20 г массы тела животных. Подсчет павших животных и появление клинических признаков отравления проводят в течение суток после введения препаратов.The toxicity level of the drug is determined in experiments on white outbred ICR mice, males, with an Ehrlich transplant tumor, in comparison with TNF-α. Tumor cells are transplanted intramuscularly at a dose of 5 · 10 5 cells per animal. Preparations of nanoparticles with TNF-α and TNF-α are dissolved in a 0.9% sodium chloride solution and administered intraperitoneally once, in a dose range of 50 to 750 mg / kg, in a volume of 0.2 ml per 20 g of animal body weight. Counting dead animals and the appearance of clinical signs of poisoning is carried out within a day after the administration of drugs.
Данные, полученные в ходе исследования, приведены на Фиг.4. Видно, что доза 750 мг/кг как для препарата наночастиц с ФНО-α, так и ФНО-α была абсолютно летальной и приводила к 100% гибели животных в течение 4 часов после введения. Максимально переносимая доза для наночастиц с ФНО-α составила 150 мг/кг, для ФНО-α - 100 мг/кг веса тела. Таким образом, результаты токсикологических экспериментов свидетельствуют о том, что препарат наночастиц с ФНО-α отличается более низким уровнем токсичности, по сравнению с препаратом ФНО-α.The data obtained during the study are shown in Figure 4. It can be seen that the dose of 750 mg / kg for both the preparation of nanoparticles with TNF-α and TNF-α was absolutely lethal and led to 100% death of animals within 4 hours after administration. The maximum tolerated dose for nanoparticles with TNF-α was 150 mg / kg, for TNF-α - 100 mg / kg body weight. Thus, the results of toxicological experiments indicate that the preparation of nanoparticles with TNF-α is characterized by a lower level of toxicity compared to the preparation of TNF-α.
ЛитератураLiterature
1. Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., Воробьев А.А. Эндогенные иммуномодуляторы. Санкт-Петербург, 1992, «Гиппократ».1. Ketlinsky S.A., Simbirtsev A.S., Vorobyov A.A. Endogenous immunomodulators. St. Petersburg, 1992, Hippocrates.
2. Carswell Е.А., Old L.J., Kassel R.L. et al.. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1975. - Vol.72. - P.3666-3670.2. Carswell E.A., Old L.J., Kassel R.L. et al .. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA - 1975 .-- Vol. 72. - P.3666-3670.
3. Nobuhara M., Kanamori Т., Ashida Y. et al. // Jpn. J. Cancer Res. - 1987. - Vol.78, No2. - P.193-201.3. Nobuhara M., Kanamori T., Ashida Y. et al. // Jpn. J. Cancer Res. - 1987. - Vol. 78, No. 2. - P.193-201.
4. Debs R.J., Fuchs H.J., Philip R., et al. // Cancer Res. - 1990. - Vol.50, No2. - P.375-380.4. Debs R.J., Fuchs H.J., Philip R., et al. // Cancer Res. - 1990. - Vol.50, No2. - P.375-380.
5. van Horssen R., ten Hagen T.L., Eggermont A.M.M. TNF-α in cancer treatment: molecular sights, antitumor effects, and clinical utility // The Oncologist - 2006. - Vol.11,. No.4. - P.397-408.5. van Horssen R., ten Hagen T.L., Eggermont A.M.M. TNF-α in cancer treatment: molecular sights, antitumor effects, and clinical utility // The Oncologist - 2006. - Vol. 11 ,. No.4. - P.397-408.
6. Eggermont A.M., ten Hagen T.L.. // Curr. Oncol. Rep. - 2001. - Vol.3, No4. - P.359-367.6. Eggermont A.M., ten Hagen T. L. .. // Curr. Oncol. Rep. - 2001 .-- Vol.3, No4. - P.359-367.
7. Патент РФ 2144958, МПК C12N 15/28, опубл. 27.01.2000.7. RF patent 2144958,
8. Патент РФ 2158303, МПК С12N 1/21, опубл. 27.10.2000.8. RF patent 2158303,
9. Абрамов М.Е., Гуторов С.Л., Масычева В.И. и др. // Биотехнология и онкология: Тез. докладов, 2005. - С.40-43.9. Abramov M.E., Gutorov S.L., Masycheva V.I. et al. // Biotechnology and Oncology: Abstracts. reports, 2005. - P.40-43.
10. Asher A., Mule J.J., Reichert СМ. et al. // J. Immunol. http://-1987.-Vol.138, http://No3.-P.963-974.10. Asher A., Mule J. J., Reichert CM. et al. // J. Immunol. http: //-1987.-Vol.138, http: //No3.-P.963-974.
11. Lienard D., Ewalenko P., Delmotte J.J. et al. // J. Clin. Oncol. - 1992. - Vol.10, No1. - P.52-60.11. Lienard D., Ewalenko P., Delmotte J.J. et al. // J. Clin. Oncol. - 1992. - Vol.10, No1. - P.52-60.
12. Pfreundschuh M.G., Steinmetz H.T., Tuschen R. et al. // Eur. J. Cancer Clin. Oncol. - , No2. - P.379-388.12. Pfreundschuh M.G., Steinmetz H.T., Tuschen R. et al. // Eur. J. Cancer Clin. Oncol. -, No2. - P.379-388.
13. Патент РФ №2058390, МПК С12N 15/28, 1996 г.13. RF patent №2058390,
14. Международная заявка (WO) №91/01998, МПК С07К 13/00, 1991 г.14. International application (WO) No. 91/01998, IPC S07K 13/00, 1991
15. Tsutsumi Y., Kihira Т., Tsunoda S. et al. // British J.Cancer. - 1995. - Vol.71. - P.963-968.15. Tsutsumi Y., Kihira T., Tsunoda S. et al. // British J. Cancer. - 1995. - Vol. 71. - P.963-968.
16. Kamada H. et al. // Cancer Res. - 1998. - Vol.58. - P.290-295.16. Kamada H. et al. // Cancer Res. - 1998 .-- Vol. 58. - P.290-295.
17. Kamada H. et al. // http://BBRC.-1999.-Vol.257, No.2. - P.448-453.17. Kamada H. et al. // http: //BBRC.-1999.-Vol.257, No.2. - P.448-453.
18. Kamada H. et al. // Cancer Res. - 2000. - Vol.60. P.6416-6420.18. Kamada H. et al. // Cancer Res. - 2000. - Vol.60. P.6416-6420.
19. Li Y.-P. et.al. // Acta Pharmacol. Sin. - 2001. - Vol.22, No.6. - P.549-555.19. Li Y.-P. et.al. // Acta Pharmacol. Sin. - 2001 .-- Vol.22, No.6. - P.549-555.
20. Li Y.-P. et.al. // Biol.Pharm. Bull. - 2001. - Vol.24, No.6. - P.666-670.20. Li Y.-P. et.al. // Biol. Pharm. Bull. - 2001 .-- Vol.24, No.6. - P.666-670.
21. Cooke S.P. et al. // Bioconjugate http://Chemistry.-2002.-Vol. 13, No.1. - P.7-15.21. Cooke S.P. et al. // Bioconjugate http: //Chemistry.-2002.-Vol. 13, No.1. - P.7-15.
22. Curnis F. et al. // Cancer Res. - 2000. - Vol.18. - P.1185-1190.22. Curnis F. et al. // Cancer Res. - 2000. - Vol. 18. - P.1185-1190.
23. Jiang Y.Y. et al. // Bioconjugate http://Chemistry.-2007.-Vol.18, No.1. - P.41-91.23. Jiang Y.Y. et al. // Bioconjugate http: //Chemistry.-2007.-Vol.18, No.1. - P.41-91.
24. Kirsch M., Fisher H., Schackert G. // J.Neurooncol. - 1994. - Vol.20. - P.35-45.24. Kirsch M., Fisher H., Schackert G. // J. Neurooncol. - 1994 .-- Vol.20. - P.35-45.
25. Заявка Венгрии (HU) №1737891, кл.4 A61К 37/00, 1986 г.25. Application of Hungary (HU) No. 1737891, cl. 4 A61K 37/00, 1986
26. Заявка ЕПВ (ЕР) №325471, МПК А61К 37/36, 1989 г.26. Application EPO (EP) No. 325471, IPC A61K 37/36, 1989
27. Международная заявка (WO) №91/01753, МПК А61К 39/395, 1991 г.27. International application (WO) No. 91/01753, IPC A61K 39/395, 1991.
28. Патент США (US) №4857314, МПК А61К 37/02, 1989 г.28. US patent (US) No. 4857314, IPC A61K 37/02, 1989
29. Заявка ЕПВ (ЕР) №269017, МПК А61К45/06, 1988 г.29. Application EPO (EP) No. 269017, IPC A61K45 / 06, 1988
30. Международная заявка (WO) №8802632, МПК А61К 37/02, 1988 г.30. International application (WO) No. 8802632, IPC A61K 37/02, 1988
31. Imoto Н., Sakamura Y., Ohkouchi К et al. // Cancer Res. - 1992 - vol.52. - P.4396-4401.31. Imoto N., Sakamura Y., Ohkouchi K et al. // Cancer Res. - 1992 - vol. 52. - P.4396-4401.
32. Visaria R.K. et al. // Mol.Cancer http://Ther.-2006.-Vol.5, No.4. - P. 1014-1020.32. Visaria R.K. et al. // Mol.Cancer http: //Ther.-2006.-Vol.5, No.4. - P. 1014-1020.
33. Paciotti G.F. et al. // Drug Deliv. - 2004. - Vol.11, No.3. - P. 169-183.33. Paciotti G.F. et al. // Drug Deliv. - 2004 .-- Vol.11, No.3. - P. 169-183.
34.Bryde S. et al. // Bioconjugate Chemistry. - 2005. - Vol.l6, No.6. - P. 1459-1467.34 Bryde S. et al. // Bioconjugate Chemistry. - 2005. - Vol.l6, No.6. - P. 1459-1467.
35. Pan Y., Neuss S., Leifert A. et al. // Small. - 2007. - Vol.3, No 11. - P.1941-1949.35. Pan Y., Neuss S., Leifert A. et al. // Small. - 2007. - Vol.3, No 11. - P.1941-1949.
36. Utsumi Т., Mien-Chie Hung M-C, Klostergaard J. // Cancer Res. - 1991. - Vol.51. - P.3362-3366.36. Utsumi, T., Mien-Chie Hung M-C, Klostergaard J. // Cancer Res. - 1991 .-- Vol. 51. - P.3362-3366.
37. Weber F., Kremer C, Klinkhammer M. et al. // J. Neurooncol. http://-1994.-Vol.18, No3. - P.217-224.37. Weber F., Kremer C, Klinkhammer M. et al. // J. Neurooncol. http: //-1994.-Vol. 18, No3. - P.217-224.
38. Lodato R.F., Feig В., Akimaru K. et al. // J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. - 1995. - Vol.17, No1. - P.19-29.38. Lodato R.F., Feig B., Akimaru K. et al. // J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. - 1995 .-- Vol.17, No1. - P.19-29.
39. Kedar E., Palgi O., Golod G., et al. // J. Immunother. http://-1997.-Vol.20, No3. - P.180-193.39. Kedar E., Palgi O., Golod G., et al. // J. Immunother. http: //-1997.-Vol.20, No3. - P.180-193.
40. Yasui K, Nakamura Y. // Biol Pharm Bull. - 2000. - Vol.23, No4. - P.461-465.40. Yasui K, Nakamura Y. // Biol Pharm Bull. - 2000. - Vol.23, No4. - P. 461-465.
41. Безруков Д.А., Баландин Т.Г., Деев СМ. и др. // Вестник МИТХТ. - 2006. - т.1. - с.14-18.41. Bezrukov D.A., Balandin T.G., Deev SM. et al. // Vestnik MITT. - 2006. - t.1. - p. 14-18.
42. Ten Hagen T.L., Seynhaeve A.L., van Tiel S.T. et al. // Int. J. Cancer. http://-2002.-Vol.97, Nol. - P.115-120.42. Ten Hagen T.L., Seynhaeve A.L., van Tiel S.T. et al. // Int. J. Cancer. http: //-2002.-Vol. 97, Nol. - P.115-120.
43. Van der Veen A.H., Eggermont A.M., Seynhaeve A.L. et al // Int. J. Cancer. - 1998. - Vol.77, No6. - P.901-906.43. Van der Veen A.H., Eggermont A.M., Seynhaeve A.L. et al // Int. J. Cancer. - 1998 .-- Vol.77, No6. - P.901-906.
44. Sawa M., Duda E., Huang http://~L.IIInt. J. Pharm. http://-1999.-Vol.184, No1. - P.45-51.44. Sawa M., Duda E., Huang http: //~L.IIInt. J. Pharm. http: //-1999.-Vol.184, No1. - P. 45-51.
45. Yuyama Y., Tsujimoto M., Fujimoto Y. et al. // Cancer Lett. - 2000. - Vol.155,No1. - P.71-7.45. Yuyama Y., Tsujimoto M., Fujimoto Y. et al. // Cancer Lett. - 2000 .-- Vol. 155, No. 1. - P.71-7.
46. Каплун А.П., Ле Банг Шон, Краснопольский Ю.М. и др. // Вопросы мед. химии - 1999. - Т.45, №1. -С.46. Kaplun A.P., Le Bang Sean, Krasnopolsky Yu.M. et al. // Questions honey. chemistry - 1999. - V. 45, No. 1. -FROM.
47. Патент СССР №1836103, МПК А61К 37/66, опубл. 23.08.1993.47. USSR patent No. 1836103, IPC A61K 37/66, publ. 08/23/1993.
48.ПатентРФ №2242245, МПК А61К 31/713, опубл. 20.12.2004.48. Patent RF №2242245, IPC A61K 31/713, publ. 12/20/2004.
49. Патент РФ №2217162, МПК А61К 39/00, опубл. 20.05.2002.49. RF patent No. 2217162, IPC A61K 39/00, publ. 05/20/2002.
50. Патент РФ №2190018, МПК C12N 15/87, 27.09.2002.50. RF patent No. 2190018,
51. Масычева В.И., Даниленко Е.Д., Пустошилова Н.М., Белявская В.А. // Вестн. РАМН. - 1998. - №4. - С.13-17.51. Masycheva V.I., Danilenko E.D., Pustoshilova N.M., Belyavskaya V.A. // Vestn. RAMS. - 1998. - No. 4. - S.13-17.
52. Закенфельд Г.К. Иммунологический механизм действия полисахаридов дрожжевых клеток Saccharomyces cerevisiae. Рига: 1990; 15252. Zakenfeld G.K. Immunological mechanism of action of polysaccharides of yeast cells Saccharomyces cerevisiae. Riga: 1990; 152
53. Li Y.P., Pei Y.Y., Zhou Z.H. et al. // J. Control Release.- 2001. - Vol.71, No.3. - P.287-296 (прототип).53. Li Y.P., Pei Y.Y., Zhou Z.H. et al. // J. Control Release.- 2001. - Vol. 71, No.3. - P.287-296 (prototype).
Claims (5)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2008140246/15A RU2386447C1 (en) | 2008-10-13 | 2008-10-13 | Anticancer drug based on nanoparticles bearing recombinant human tumour necrosis factor alpha |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2008140246/15A RU2386447C1 (en) | 2008-10-13 | 2008-10-13 | Anticancer drug based on nanoparticles bearing recombinant human tumour necrosis factor alpha |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2386447C1 true RU2386447C1 (en) | 2010-04-20 |
Family
ID=46275093
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2008140246/15A RU2386447C1 (en) | 2008-10-13 | 2008-10-13 | Anticancer drug based on nanoparticles bearing recombinant human tumour necrosis factor alpha |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2386447C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2500381C1 (en) * | 2012-10-01 | 2013-12-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Ульяновский государственный университет" | Method for introducing gold nanoparticles by local skin application |
| RU2691938C1 (en) * | 2018-06-15 | 2019-06-19 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Antitumour agent based on biodegradable nanoparticles carrying a recombinant human tumor necrosis factor alpha |
-
2008
- 2008-10-13 RU RU2008140246/15A patent/RU2386447C1/en active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| LI YP. et al., PEGylated polycyanacrylate nanoparticles as a tumor necrosis-alpha carriers, J. Control Release, 2001 Apr., 28, v.71 (3), pp.287-296. LI YP. et al., Stealth polycyanoacrylate nanoparticles as a tumor necrosis factor-alpha carriers: pharmacokinetics and anti-tumor effects, Biol. Pharm. Bull., 2001 Jun, v.24 (6), pp.662-665. FANG С. et al., In vivo tumor targeting of tumor necrosis factor-alpha-loaded stealth nanoparticles: effect of MePEG molecular weight and particle size, Eur. J. Pharm. Sci., 2006 Jan, v.27 (1), pp.27-36. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2500381C1 (en) * | 2012-10-01 | 2013-12-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Ульяновский государственный университет" | Method for introducing gold nanoparticles by local skin application |
| RU2691938C1 (en) * | 2018-06-15 | 2019-06-19 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Antitumour agent based on biodegradable nanoparticles carrying a recombinant human tumor necrosis factor alpha |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Chew et al. | Biomaterial‐based implantable devices for cancer therapy | |
| Choi et al. | Recent trends in cell membrane-cloaked nanoparticles for therapeutic applications | |
| Lin et al. | GSH-responsive SN38 dimer-loaded shape-transformable nanoparticles with iRGD for enhancing chemo-photodynamic therapy | |
| Yao et al. | Neovasculature and circulating tumor cells dual-targeting nanoparticles for the treatment of the highly-invasive breast cancer | |
| CN110522919B (en) | Mannose receptor targeted composition, medicament, preparation method and application thereof | |
| Guo et al. | Direct site-specific treatment of skin cancer using doxorubicin-loaded nanofibrous membranes | |
| Song et al. | pH-responsive oxygen nanobubbles for spontaneous oxygen delivery in hypoxic tumors | |
| Li et al. | Deep penetration of nanoparticulate drug delivery systems into tumors: challenges and solutions | |
| Zhang et al. | Tumor vasculature-targeting nanomedicines | |
| CN104324384A (en) | Hyaluronic acid-quercetin conjugate self-assembly micelle preparation and preparation method thereof | |
| Shang et al. | Enhancing cancer chemo-immunotherapy by biomimetic nanogel with tumor targeting capacity and rapid drug-releasing in tumor microenvironment | |
| Jin et al. | Paclitaxel-loaded nanoparticles decorated with bivalent fragment HAb18 F (ab’) 2 and cell penetrating peptide for improved therapeutic effect on hepatocellular carcinoma | |
| Xiao et al. | Icaritin-loaded PLGA nanoparticles activate immunogenic cell death and facilitate tumor recruitment in mice with gastric cancer | |
| Chen et al. | Nanomaterials: small particles show huge possibilities for cancer immunotherapy | |
| Kim et al. | Innovations in lymph node targeting nanocarriers | |
| Wang et al. | Dual-ligand-modified liposomes co-loaded with anti-angiogenic and chemotherapeutic drugs for inhibiting tumor angiogenesis and metastasis | |
| RU2386447C1 (en) | Anticancer drug based on nanoparticles bearing recombinant human tumour necrosis factor alpha | |
| Huang et al. | Co-delivery of TRAIL and paclitaxel by fibronectin-targeting liposomal nanodisk for effective lung melanoma metastasis treatment | |
| Hyldbakk et al. | Intraperitoneal administration of cabazitaxel-loaded nanoparticles in peritoneal metastasis models | |
| Li et al. | Recent advances in peptide-based therapeutic strategies for breast cancer treatment | |
| Pan et al. | Self‐Adaptive Nanoregulator to Mitigate Dynamic Immune Evasion of Pancreatic Cancer | |
| Peng et al. | TME-related biomimetic strategies against cancer | |
| Nkanga et al. | Injectable hydrogel containing cowpea mosaic virus nanoparticles prevents colon cancer growth | |
| CN113599532A (en) | Drug and collagenase loaded albumin composite nanoparticles, preparation and application | |
| Zhang et al. | Polydopamine modified ceria nanorods alleviate inflammation in colitis by scavenging ROS and regulating macrophage M2 polarization |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| QB4A | Licence on use of patent |
Effective date: 20100805 |
|
| QC41 | Official registration of the termination of the licence agreement or other agreements on the disposal of an exclusive right |
Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20100805 Effective date: 20110715 |
|
| PD4A | Correction of name of patent owner |