RU2383618C1 - Immobilised biocatalyst for microbiological production of pectinases - Google Patents
Immobilised biocatalyst for microbiological production of pectinases Download PDFInfo
- Publication number
- RU2383618C1 RU2383618C1 RU2008127557/13A RU2008127557A RU2383618C1 RU 2383618 C1 RU2383618 C1 RU 2383618C1 RU 2008127557/13 A RU2008127557/13 A RU 2008127557/13A RU 2008127557 A RU2008127557 A RU 2008127557A RU 2383618 C1 RU2383618 C1 RU 2383618C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- biocatalyst
- immobilized
- polyvinyl alcohol
- pectinases
- Prior art date
Links
Landscapes
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к иммобилизованным биокатализаторам на основе ферментов или клеток, помещенных в гелевый носитель, а также к процессам получения продуктов микробиологического синтеза с использованием иммобилизованных биокатализаторов, в данном случае - к получению пектиназ-ферментов, катализирующих гидролиз пектиновых веществ.The invention relates to biotechnology, specifically to immobilized biocatalysts based on enzymes or cells placed in a gel carrier, as well as to processes for producing microbiological synthesis products using immobilized biocatalysts, in this case, to the production of pectinases-enzymes that catalyze the hydrolysis of pectin substances.
Изобретение наиболее эффективно может быть использовано в пищевой промышленности, поскольку подобные ферменты широко применяются при переработке овощей и фруктов, а также в процессах производства соков, вина, кофе, чая. Обработка пектиназами различного сырья, содержащего пектин, позволяет существенно увеличить сокоотделение, снизить вязкость жидких сред, обеспечить высокую эффективность последующих технологических стадий переработки сельскохозяйственного сырья, в частности фильтрации, стерилизации, расфасовки и др.The invention can be most effectively used in the food industry, since such enzymes are widely used in the processing of vegetables and fruits, as well as in the production of juices, wine, coffee, tea. Processing pectinases of various raw materials containing pectin, can significantly increase saponification, reduce the viscosity of liquid media, ensure high efficiency of subsequent technological stages of processing agricultural raw materials, in particular filtration, sterilization, packaging, etc.
Пектиназы в промышленном масштабе получают микробиологическим способом. В качестве продуцентов пектиназ широко используются микроскопические грибы родов Aspergillus, Penicillium, Rhizopus и др. [Favela-Torres Е., Volke-Sepulveda Т., Viniegra-Gonzalez G. Production of hydrolytic depolymerising pectinases (2006) Food Technol. Biotechnol. V.44, p.221-227; Dhillon S.S., Gill R.K., Gill S.S., Singh M. (2004) Studies of the utilization of citrus peel for pectinase production using fungus Aspergillus niger. // Intern. J. Enviorin. Studies, V.61, p.199-210], которые считаются наиболее эффективными продуцентами с точки зрения уровня синтеза пектолитических ферментов и состава синтезируемых ферментативных комплексов. Микроскопические грибы синтезируют преимущественно внеклеточные пектиназы, что существенно упрощает процесс выделения и очистки указанных ферментов в сравнении с внутриклеточными пектиназами бактерий [Elegado F.B., Fujio Y. Purification and some properties of polygalacturonase from Rhizopus sp. LKN (1994) World. J. Microbiol. Biotechnol., V.10, р.256-259]. Это предопределяет использование именно клеток микроскопических грибов, являющихся биокатализаторами, осуществляющими синтез и секрецию ферментов с пектолитической активностью, для получения пектиназ в промышленных масштабах на питательных средах с пектинсодержащими субстратами, являющимися индукторами синтеза пектиназ.Pectinases on an industrial scale are obtained by the microbiological method. Microscopic fungi of the genera Aspergillus, Penicillium, Rhizopus and others [Favela-Torres E., Volke-Sepulveda T., Viniegra-Gonzalez G. Production of hydrolytic depolymerising pectinases (2006) Food Technol are widely used as producers of pectinases. Biotechnol. V.44, p. 221-227; Dhillon S.S., Gill R.K., Gill S.S., Singh M. (2004) Studies of the utilization of citrus peel for pectinase production using fungus Aspergillus niger. // Intern. J. Enviorin. Studies, V.61, p.199-210], which are considered the most effective producers in terms of the level of synthesis of pectolytic enzymes and the composition of the synthesized enzymatic complexes. Microscopic fungi synthesize predominantly extracellular pectinases, which greatly simplifies the process of isolation and purification of these enzymes in comparison with intracellular bacterial pectinases [Elegado F.B., Fujio Y. Purification and some properties of polygalacturonase from Rhizopus sp. LKN (1994) World. J. Microbiol. Biotechnol., V.10, p. 256-259]. This determines the use of precisely microscopic fungal cells, which are biocatalysts that synthesize and secrete enzymes with pectolytic activity, for the production of pectinases on an industrial scale on nutrient media with pectin-containing substrates that are inducers of pectinase synthesis.
В качестве основных критериев сравнительной оценки эффективности функционирования различных биокатализаторов, предназначенных для получения пектиназ, обычно применяют следующие показатели:The following indicators are usually used as the main criteria for a comparative evaluation of the effectiveness of the functioning of various biocatalysts intended for the production of pectinases:
- суммарная пектолитическая активность (Ед.), которая может быть получена за все время использования биокатализатора, и- total pectolytic activity (Unit), which can be obtained for the entire time of use of the biocatalyst, and
- продуктивность процесса, проводимого с использованием биокатализатора для получения пектиназ (Ед.мл-1 ч-1).- the productivity of the process carried out using a biocatalyst to obtain pectinases (Ed.ml -1 h -1 ).
За единицу пектолитической активности принимают такое количество пектиназ, которое в течение 1 мин при температуре 50°С и рН 5,0 гидролизует полигалактуроновую кислоту с образованием 1 мкмоля редуцирующих сахаров, эквивалентных 1 мкмолю глюкозы [Avigal G. Colorimetric assays for hexuronic acids and some keto sugars. In book: Methods in Enzymology. Carbohydrate metabolism (Eds. Colowick S.P., Kaplan N.O.), V.XLI (Part B). N.Y. Acad. Press, 1975, p.29-30].A unit of pectolytic activity is the amount of pectinases that hydrolyzes polygalacturonic acid for 1 min at a temperature of 50 ° C and pH 5.0 to form 1 μmol of reducing sugars, equivalent to 1 μmol of glucose [Avigal G. Colorimetric assays for hexuronic acids and some keto sugars. In book: Methods in Enzymology. Carbohydrate metabolism (Eds. Colowick S.P., Kaplan N.O.), V.XLI (Part B). N.Y. Acad. Press, 1975, p.29-30].
Одним из перспективных приемов повышения эффективности процессов получения пектиназ является использование гетерогенных биокатализаторов на основе иммобилизованных клеток микроскопических грибов, позволяющих создавать высокие концентрации клеток в объеме реактора и, таким образом, увеличивать продуктивность процесса, а также скорость накопления внеклеточных пектиназ в среде культивирования.One of the promising methods for increasing the efficiency of pectinase production processes is the use of heterogeneous biocatalysts based on immobilized microscopic fungal cells, which allows creating high cell concentrations in the reactor volume and, thus, increasing the productivity of the process, as well as the rate of extracellular pectinase accumulation in the culture medium.
Известен способ получения пектиназ путем твердофазного культивирования иммобилизованных биокатализаторов на основе клеток микроскопических грибов Aspergillus niger [M.E.Acuna-Arguelles, M.Gutierrez-Rojas, G.Viniegra-Gonzalez, E.Faveva-Torres (1995) Production and properties of three pectinolytic activities produced by Aspergillus niger in submerged and solid-state fermentation. Appl. Microbiol. Biotechnol, V.43, p.808-814], Aspergillus foetidus [S.F.Cavalitto, J.A.Arcas, R.A.Hours (1996) Pectinase production profile of Aspergillus foetidus in solid state cultures at different acidities. Biotech. Lett., V.18, p.251-256], а также Aspergillus orizae, Aspergillus awamory, Trichoderma sp. и др. [Dartora A.B., Bertolin Т.Е., Ilibio D., Silveira M.M., Costa J.A.V. (2002) Evaluation of filamentous fungi and inducers for the production of endopolygalacturonase by solid state fermentation Z. Naturforch., V.57, р.666-670]. В качестве носителей иммобилизованных клеток в этом случае используют различные твердые субстраты, индуцирующие синтез пектиназ. Основой таких субстратов обычно служат частицы измельченных пектинсодержащих отходов переработки сельскохозяйственной продукции (свекловичный жом, апельсиновые и лимонные корки, пшеничные отруби, яблочный жом и др.). Далее субстрат увлажняют до содержания влаги 55-80% средой, содержащей источники азотного питания и микроэлементов, необходимые для микроорганизмов, а также посевной материал (суспензию спор) в концентрации 107-108 спор/г основного сухого вещества. При этом происходит адсорбционная иммобилизация спор на поверхности частиц носителя. Далее проводят культивирование клеток, иммобилизованных на твердом носителе, в условиях, наиболее благоприятных для метаболической активности соответствующих штаммов микроорганизмов. Средняя продуктивность процесса по пектолитической активности с такими иммобилизованными биокатализаторами составляет 0,14 Ед. мл-1 ч-1, а максимальная суммарная пектолитическая активность, накапливающаяся в среде за время использования иммобилизованных биокатализаторов (96 ч), достигает 40000 Ед.A known method for producing pectinases by solid-phase cultivation of immobilized biocatalysts based on cells of microscopic fungi Aspergillus niger [MEAcuna-Arguelles, M. Gutierrez-Rojas, G. Viniegra-Gonzalez, E. Faveva-Torres (1995) Production and properties of three pectinolytic activities produced Aspergillus niger in submerged and solid-state fermentation. Appl. Microbiol. Biotechnol, V.43, p.808-814], Aspergillus foetidus [SFCavalitto, JAArcas, RAHours (1996) Pectinase production profile of Aspergillus foetidus in solid state cultures at different acidities. Biotech Lett., V.18, p. 251-256], as well as Aspergillus orizae, Aspergillus awamory, Trichoderma sp. et al. [Dartora AB, Bertolin T.E., Ilibio D., Silveira MM, Costa JAV (2002) Evaluation of filamentous fungi and inducers for the production of endopolygalacturonase by solid state fermentation Z. Naturforch., V.57, p. .666-670]. In this case, various solid substrates inducing the synthesis of pectinases are used as carriers of immobilized cells. The basis of such substrates is usually particles of crushed pectin-containing wastes from agricultural products processing (beet pulp, orange and lemon peels, wheat bran, apple pulp, etc.). Next, the substrate is moistened to a moisture content of 55-80% with a medium containing sources of nitrogen nutrition and trace elements necessary for microorganisms, as well as seed (suspension of spores) at a concentration of 10 7 -10 8 spores / g of the main dry matter. In this case, adsorption immobilization of spores on the surface of carrier particles occurs. Next, cultivation of cells immobilized on a solid carrier is carried out under conditions most favorable for the metabolic activity of the corresponding strains of microorganisms. The average productivity of the process for pectolytic activity with such immobilized biocatalysts is 0.14 Units. ml -1 h -1 , and the maximum total pectolytic activity that accumulates in the medium during the use of immobilized biocatalysts (96 h) reaches 40,000 units.
Несмотря на простоту получения пектиназ с помощью таких иммобилизованных биокатализаторов, применение последних сопряжено с рядом значительных технологических сложностей и ограничений, так как этот вариант обладает следующими недостатками:Despite the simplicity of obtaining pectinases using such immobilized biocatalysts, the use of the latter involves a number of significant technological difficulties and limitations, since this option has the following disadvantages:
- для культивирования на твердой среде требуется наличие больших площадей для размещения емкостей с исходным основным твердым субстратом и осуществления твердофазного культивирования клеток с обеспечением их требуемой аэрацией;- for cultivation on a solid medium requires the presence of large areas for placement of containers with the original main solid substrate and the implementation of solid-phase cultivation of cells with the required aeration;
- процесс характеризуется относительно большими временными и энергетическими затратами;- the process is characterized by relatively large time and energy costs;
- при твердофазном культивировании клеток нельзя добиться однородного их роста по объему всего реактора с твердофазной средой, что усугубляется отсутствием перемешивания системы и отрицательно сказывается на показателях продуктивности биомассы;- during solid-phase cultivation of cells, it is impossible to achieve uniform growth over the volume of the entire reactor with a solid-phase medium, which is exacerbated by the lack of mixing of the system and negatively affects the biomass productivity indices;
- при использовании такого биокатализатора для получения пектиназ предполагается обводнение использованной твердой среды для экстракции внеклеточных ферментов из коржа, пронизанного грибным мицелием и образующегося в процессе культивирования клеток, с последующим его, так называемым "отжимом", в результате которого клетки, составляющие биокатализатор, теряют жизнеспособность и не могут быть использованы повторно;- when using such a biocatalyst for the production of pectinases, it is assumed that the solid medium used is used to extract extracellular enzymes from the cake penetrated by fungal mycelium and formed during cell cultivation, followed by its so-called “squeezing”, as a result of which the cells that make up the biocatalyst lose viability and cannot be reused;
- сам биокатализатор и остатки твердой питательной среды представляют собой массовый отход производства в каждом рабочем цикле биокатализатора.- the biocatalyst itself and the remains of a solid nutrient medium represent a massive waste of production in each working cycle of the biocatalyst.
Все это отрицательно сказывается на экономических показателях процесса производства пектиназ с использованием такого иммобилизованного биокатализатора, который не обеспечивает хорошей технологичности процесса в целом.All this negatively affects the economic performance of the pectinase production process using such an immobilized biocatalyst that does not provide a good technological process as a whole.
Иммобилизация клеток с применением более совершенных носителей позволяет осуществлять ферментацию в жидких питательных средах, многократно использовать одни и те же клетки, продуцирующие внеклеточные пектиназы, и увеличить, таким образом, длительность использования одного и того же биокатализатора, а также повысить суммарный выход получаемой пектолитической активности и сократить экономические расходы на регулярное наращивание биомассы клеток и ее последующую утилизацию.The immobilization of cells using more advanced carriers allows fermentation in liquid nutrient media, reuse of the same cells producing extracellular pectinases, and thus increase the duration of use of the same biocatalyst, as well as increase the total yield of the resulting pectolytic activity and reduce economic costs for the regular increase in cell biomass and its subsequent disposal.
Так, известен иммобилизованный биокатализатор на основе клеток гриба Aspergillus awamori, адсорбированных на нерастворимом носителе - пенополиуретане. Процесс проводят следующим образом: в жидкую среду для выращивания клеток, содержащую пектин (20 г/л), лактозу (20 г/л), (NH4)2SO4 (0,7 г/л), KCl (0,05 г/л) и MgSO4×H2O (0,001 г/л), помещают пенополиуретановую подложку в форме диска диаметром 4,5-5,0 см и толщиной 1,0-1,5 см, затем вносят споры гриба в концентрации (1,7-1,9)×105 спор/мл, которые адсорбируются на поверхности пенополиуретановой подложки, а далее в процессе культивирования проращивают, формируя губчато-нитчатую мицелиальную биомассу на поверхности носителя. В ходе ферментации иммобилизованные указанным образом клетки секретируют внеклеточные пектиназы [Блиева Р.К., Родионова Н.А. Фракционирование и очистка пектинрасщепляющих ферментов, образуемых иммобилизованными клетками Aspergillus awamori // Прикл. биохим. микробиол., 1987, Т.23, с.561-567]. Средняя продуктивность процесса по пектолитической активности составляет 0,25 Ед. мл-1 ч-1, а максимальная пектолитическая активность, суммарно накапливающаяся в среде за все время использования биокатализатора (1440 ч), достигает 48000 Ед [Блиева Р.К., Родионова Н.А., Мартинович Л.И. Образование пектинрасщепляющих ферментов иммобилизованными клетками Aspergillus awamori. // Микробиология, 1989, Т.58, с.246-250].Thus, an immobilized biocatalyst based on Aspergillus awamori fungal cells adsorbed on an insoluble carrier, polyurethane foam, is known. The process is carried out as follows: in a liquid medium for cell growth containing pectin (20 g / l), lactose (20 g / l), (NH 4 ) 2 SO 4 (0.7 g / l), KCl (0.05 g / l) and MgSO 4 × H 2 O (0.001 g / l), a polyurethane foam substrate is placed in the form of a disk with a diameter of 4.5-5.0 cm and a thickness of 1.0-1.5 cm, then the spores of the fungus are introduced in a concentration (1.7-1.9) × 10 5 spores / ml, which are adsorbed on the surface of the polyurethane foam substrate, and then germinate during cultivation, forming a spongy filamentous mycelial biomass on the surface of the carrier. During fermentation, cells immobilized in this way secrete extracellular pectinases [Blieva R.K., Rodionova N.A. Fractionation and purification of pectin-cleaving enzymes formed by immobilized Aspergillus awamori cells // Prikl. biochem. microbiol., 1987, Vol. 23, p. 561-567]. The average productivity of the process for pectolytic activity is 0.25 units. ml -1 h -1 , and the maximum pectolytic activity that accumulates in the medium for the entire time the biocatalyst is used (1440 h) reaches 48000 units [Blieva R.K., Rodionova N.A., Martinovich L.I. Formation of pectin-cleaving enzymes with immobilized Aspergillus awamori cells. // Microbiology, 1989, T.58, p.246-250].
Данный иммобилизованный биокатализатор обладает рядом недостатков:This immobilized biocatalyst has several disadvantages:
- основным условием применения такого биокатализатора для получения пектиназ является отсутствие в питательной среде каких-либо твердых частиц, содержащих пектиновые вещества (свекловичный жом, яблочный жом и др.), так как в этом случае при возникающем механическом воздействии на биомассу наблюдается разрушение самого иммобилизованного биокатализатора, в частности отслоение мицелия от пенополиуретановой подложки;- the main condition for the use of such a biocatalyst for the production of pectinases is the absence in the nutrient medium of any solid particles containing pectin substances (beet pulp, apple pulp, etc.), since in this case, when the mechanical effect on the biomass occurs, the immobilized biocatalyst itself is destroyed. in particular peeling of the mycelium from a polyurethane foam substrate;
- для сохранения эффективного функционирования иммобилизованного биокатализатора при его использовании для получения пектиназ необходимо обязательное периодическое (через каждые 230 ч) обновление мицелия на подложке, для чего проводят частичное удаление биомассы мицелия с пенополиуретановой поверхности с последующим наращиванием в течение 48-96 ч новой активной биомассы на поверхности подложки.- to maintain the effective functioning of the immobilized biocatalyst when it is used to obtain pectinases, it is necessary to periodically (every 230 hours) update the mycelium on the substrate, for which a partial removal of mycelium biomass from the polyurethane foam surface is carried out, followed by the accumulation of new active biomass for 48-96 hours surface of the substrate.
Таким образом, при эксплуатации данного иммобилизованного биокатализатора необходима регулярная утилизация отработанной мицелиальной биомассы, а также экономические и временные затраты на ее регенерацию на носителе, что в целом существенно снижает технологичность процесса получения пектиназ.Thus, the operation of this immobilized biocatalyst requires regular disposal of spent mycelial biomass, as well as the economic and time costs of its regeneration on a carrier, which, on the whole, significantly reduces the manufacturability of the pectinase production process.
Известны иммобилизованные биокатализаторы для получения пектиназ на основе клеток мицелиальных грибов, включенных в матрицу полимерного геля. В большинстве случаев в составе таких иммобилизованных биокатализаторов используют клетки мицелиальных грибов Aspergillus niger 26 или Aspergillus sp. В качестве носителя наиболее часто при этом применяют Са-альгинатный гель. Сам иммобилизованный биокатализатор представляет собой клетки мицелиального гриба, обладающие секреторной пектолитической активностью, включенные в сферические гранулы (диаметром 2-4 мм) ионо-тропного Са-альгинатного геля. Такой иммобилизованный биокатализатор получают на основе композиций, представляющих собой суспензию спор (от 2×107 до 109 спор/мл) в водном 0,1%-ном растворе Тритона Х-100 или 0,01% растворе Твин-80 в смеси с 2-3%-ным раствором альгината натрия, которую прокапывают в раствор 1,5-2,0%-ного хлорида кальция при комнатной температуре, выдерживают полученные гранулы в том же растворе 1-2 ч при 0-4°С, отделяют от раствора, промывают 3-4 раза дистиллированной водой и далее культивируют сформированный таким образом иммобилизованный биокатализатор в питательной среде для получения пектиназ. Максимальное значение средней продуктивности такого процесса по пектолитической активности составляет 0,57 Ед мл-1 ч-1 [Nighojkar S., Phanse Y., Sinha D., Nighojkar A., Kumar A. Production of polygalacturonase by immobilized cells of Aspergilus niger using orange peel as inducer (2006) Proc. Biochem., V.41, p.1136-1140], а максимальная пектолитическая активность, суммарно накапливающаяся в среде за время использования иммобилизованных биокатализаторов (648 ч), достигает 71700 Ед [Angelova М., Sheremetska P., Lekov М., Enhanced polymethylgalacturonase production from Aspergillus niger 26 by calcium alginate immobilisation. (1998) Proc. Biochem., V.33, p.299-305].Immobilized biocatalysts are known for the production of pectinases based on cells of mycelial fungi included in a polymer gel matrix. In most cases, the cells of such immobilized biocatalysts use Aspergillus niger 26 or Aspergillus sp. The carrier most often used is Ca-alginate gel. The immobilized biocatalyst itself is a mycelial fungus cell with secretory pectolytic activity included in spherical granules (2-4 mm in diameter) of an ion-tropic Ca-alginate gel. Such an immobilized biocatalyst is obtained on the basis of compositions representing a suspension of spores (from 2 × 10 7 to 10 9 spores / ml) in an aqueous 0.1% solution of Triton X-100 or 0.01% solution of Tween-80 mixed with A 2-3% solution of sodium alginate, which is instilled in a solution of 1.5-2.0% calcium chloride at room temperature, the granules obtained are kept in the same solution for 1-2 hours at 0-4 ° C, separated from solution, washed 3-4 times with distilled water and then cultivated thus formed immobilized biocatalyst in a nutrient medium e to produce pectinases. The maximum value of the average productivity of this process for pectolytic activity is 0.57 U ml -1 h -1 [Nighojkar S., Phanse Y., Sinha D., Nighojkar A., Kumar A. Production of polygalacturonase by immobilized cells of Aspergilus niger using orange peel as inducer (2006) Proc. Biochem., V.41, p.1136-1140], and the maximum pectolytic activity accumulating in the medium during the use of immobilized biocatalysts (648 h) reaches 71700 units [Angelova M., Sheremetska P., Lekov M., Enhanced polymethylgalacturonase production from Aspergillus niger 26 by calcium alginate immobilization. (1998) Proc. Biochem., V.33, p. 299-305].
Несмотря на возможность длительной эксплуатации таких иммобилизованных биокатализаторов и довольно высокую получаемую при этом суммарную пектолитическую активность, основным недостатком данного технического решения, существенно ограничивающим его применение, являются недостаточные механическая прочность и операционная стабильность гранул иммобилизованного биокатализатора, которые сказываются на том, что:Despite the possibility of long-term operation of such immobilized biocatalysts and the rather high total pectolytic activity obtained in this case, the main disadvantage of this technical solution, which significantly limits its application, is the insufficient mechanical strength and operational stability of the granules of the immobilized biocatalyst, which affect the fact that:
- в ходе ферментации происходит изменение формы биокатализатора - его деформация под действием внешних факторов, в частности сжатия вследствие сдвиговых напряжений, возникающих при перемешивании среды, а также из-за давления кислорода извне гранул, подаваемого в реактор, и углекислого газа, выделяемого клетками внутри гранул (в результате ухудшаются процессы массопереноса в частицах носителя, что приводит к снижению продуктивности иммобилизованной культуры);- during the fermentation, the biocatalyst shape changes - its deformation under the influence of external factors, in particular compression due to shear stresses that occur when the medium is mixed, and also due to the pressure of oxygen from outside the granules supplied to the reactor, and carbon dioxide released by cells inside the granules (as a result, mass transfer processes in the carrier particles are worsened, which leads to a decrease in the productivity of the immobilized culture);
- имеет место постепенное разрушение матрицы Са-альгинатного геля в среде культивирования иммобилизованных клеток, содержащей фосфат-ионы, являющиеся, в свою очередь, обязательным компонентом питательных сред, используемых для синтеза пектиназ;- there is a gradual destruction of the Ca-alginate gel matrix in the culture medium of immobilized cells containing phosphate ions, which, in turn, are an essential component of nutrient media used for the synthesis of pectinases;
- происходит биохимическое разрушение матрицы носителя, представляющего собой природный полисахарид, под действием гидролитических ферментов, синтезируемых и выделяемых в среду самими иммобилизованными клетками мицелиальных грибов.- there is a biochemical destruction of the matrix of the carrier, which is a natural polysaccharide, under the action of hydrolytic enzymes synthesized and secreted into the medium by the immobilized cells of mycelial fungi.
Для упрочнения гранул подобных иммобилизованных биокатализаторов предложена их дополнительная обработка сшивающим агентом, в частности глутаровым альдегидом. Так, гранулы, полученные включением спор мицелиальных грибов в Са-альгинатный гель аналогично тому, как это описано выше, переносят после экспонирования их в 1,5-2,0%-ном растворе хлорида кальция при 0-4°С в течение 1-2 ч в 0,3 М раствор глутарового альдегида и выдерживают в нем 0,5 ч, после чего 3-4 раза промывают дистиллированной водой. В результате происходит упрочнение гранул, но вследствие высокой токсичности глутарового альдегида по отношению к клеткам все основные характеристики (средняя продуктивность процесса с использованием биокатализатора и суммарно накапливающаяся в среде пектолитическая активность) снижаются в 4,8-8,0 раз [Nighojkar S., Phanse Y., Sinha D., Nighojkar A., Kumar A. Production of polygalacturonase by immobilized cells of Aspergillus niger using orange peel as inducer (2006) Proc. Biochem., V.41, p.1136-1140], что является существенным недостатком такого технического решения.To strengthen the granules of such immobilized biocatalysts, their additional treatment with a crosslinking agent, in particular glutaraldehyde, is proposed. So, the granules obtained by the inclusion of spores of mycelial fungi in a Ca-alginate gel, similarly as described above, are transferred after exposure to a 1.5-2.0% solution of calcium chloride at 0-4 ° C for 1- 2 hours in a 0.3 M solution of glutaraldehyde and incubated in it for 0.5 hours, after which it is washed 3-4 times with distilled water. As a result, granules harden, but due to the high toxicity of glutaraldehyde with respect to cells, all the main characteristics (average productivity of the process using a biocatalyst and pectolytic activity accumulating in the medium) decrease by 4.8–8.0 times [Nighojkar S., Phanse Y., Sinha D., Nighojkar A., Kumar A. Production of polygalacturonase by immobilized cells of Aspergillus niger using orange peel as inducer (2006) Proc. Biochem., V.41, p.1136-1140], which is a significant disadvantage of such a technical solution.
Согласно другому техническому решению тех же авторов [Nighojkar S., Phanse Y., Sinha D., Nighojkar A., Kumar A. Production of polygalacturonase by immobilized cells of Aspergilus niger using orange peel as inducer (2006) Proc. Biochem., V.41, p.1136-1140] упрочнение гранул биокатализатора, полученного включением клеток мицелиальных грибов в Са-альгинатный гель, достигается в результате частичной замены Са-альгинатного геля на гель поливинилового спирта, сшитого ионами бората. Это известное техническое решение реализуется следующим образом: к 20 мл смеси 10% раствора поливинилового спирта и 0,5% раствора альгината натрия добавляют 5 мл суспензии спор мицелиального гриба Aspergillus niger с концентрацией 107 спор/мл. Для формирования гранул иммобилизованного биокатализатора полученную смесь прокапывают в насыщенный раствор борной кислоты, содержащий 0,3 М CaCl2·2H2O, и аккуратно перемешивают в течение 1 ч. Далее полученные гранулы переносят в 0,3 М раствор NaH2PO4×2H2O (рН 4,5) на 2 ч для придания им прочности, после чего их промывают водой и далее культивируют в питательной среде для получения пектиназ. Таким образом, в состав полученного иммобилизованного биокатализатора входят клетки мицелиального гриба, альгинат в комплексе с ионами кальция, поливиниловый спирт в комплексе с ионами бората и водная фаза. Точное содержание компонентов из опубликованной информации вычислить невозможно, т.к. неизвестно, в какой пропорции ионы кальция и бората связываются полимерными компонентами системы - альгинатом и поливиниловым спиртом, соответственно. Средняя продуктивность этого иммобилизованного биокатализатора по пектиназной активности составляет 0,012 Ед. мл-1 ч-1, а максимальная ферментативная активность, суммарно накапливающаяся в среде за все время использования биокатализатора (72 ч), достигает 222 Ед.According to another technical solution of the same authors [Nighojkar S., Phanse Y., Sinha D., Nighojkar A., Kumar A. Production of polygalacturonase by immobilized cells of Aspergilus niger using orange peel as inducer (2006) Proc. Biochem., V.41, p.1136-1140] hardening of biocatalyst granules obtained by incorporation of mycelial fungal cells into a Ca-alginate gel is achieved by partially replacing the Ca-alginate gel with a polyvinyl alcohol gel crosslinked with borate ions. This well-known technical solution is implemented as follows: to 20 ml of a mixture of 10% polyvinyl alcohol solution and 0.5% sodium alginate solution, 5 ml of spore suspension of Aspergillus niger filamentous fungus with a concentration of 10 7 spores / ml are added. To form granules of an immobilized biocatalyst, the resulting mixture was instilled into a saturated solution of boric acid containing 0.3 M CaCl 2 · 2H 2 O and gently stirred for 1 h. Next, the obtained granules were transferred to a 0.3 M solution of NaH 2 PO 4 × 2H 2 O (pH 4.5) for 2 hours to give them strength, after which they are washed with water and then cultivated in a nutrient medium to obtain pectinases. Thus, the composition of the obtained immobilized biocatalyst includes mycelial fungal cells, alginate in combination with calcium ions, polyvinyl alcohol in complex with borate ions, and the aqueous phase. The exact content of the components from the published information cannot be calculated, because it is not known in what proportion calcium and borate ions are bound by the polymer components of the system — alginate and polyvinyl alcohol, respectively. The average productivity of this immobilized biocatalyst for pectinase activity is 0.012 units. ml -1 h -1 , and the maximum enzymatic activity, cumulatively accumulating in the medium for the entire time of use of the biocatalyst (72 h), reaches 222 units.
Данное техническое решение как наиболее близкое к заявляемому по составу иммобилизованного биокатализатора, принципу иммобилизации клеток мицелиальных грибов (включение в матрицу гелевого носителя) и полимерной основе носителя (содержащий поливиниловый спирт гелевый носитель) принято за прототип.This technical solution, as the closest to the claimed composition of the immobilized biocatalyst, the principle of immobilization of mycelial fungal cells (inclusion of a gel carrier in the matrix) and the polymer carrier base (gel carrier containing polyvinyl alcohol), was adopted as a prototype.
Это известное техническое решение имеет следующие недостатки:This known technical solution has the following disadvantages:
1. В состав иммобилизованного биокатализатора-прототипа входят полианион-альгинат и полиол-поливиниловый спирт, предрасположенные к образованию нерастворимых полимерных комплексов, в свою очередь способных блокировать («закупоривать») транспортные каналы в клеточной стенке, через которые клеткой осуществляется секреция продуктов биосинтеза (в данном случае, пектиназ), что может быть одной из причин низкой продуктивности прототипа. Таким образом, присутствие поливинилового спирта в составе известного иммобилизованного биокатализатора является неблагоприятным фактором.1. The composition of the immobilized biocatalyst prototype includes polyanion alginate and polyol-polyvinyl alcohol, predisposed to the formation of insoluble polymer complexes, which in turn are capable of blocking ("clogging") the transport channels in the cell wall through which the cells secrete biosynthesis products (into in this case, pectinases), which may be one of the reasons for the low productivity of the prototype. Thus, the presence of polyvinyl alcohol in the known immobilized biocatalyst is an unfavorable factor.
2. Полимерная матрица носителя иммобилизованного биокатализатора-прототипа представляет собой смешанный гель альгината кальция и поливинилового спирта, сшитого ионами бората. Процесс сшивания проводится в среде борной кислоты с низким значением рН, что отрицательно сказывается на жизнеспособности клеток и предопределяет низкий уровень суммарной пектиназной активности готового иммобилизованного биокатализатора.2. The polymer matrix of the carrier of the immobilized biocatalyst prototype is a mixed gel of calcium alginate and polyvinyl alcohol crosslinked by borate ions. The crosslinking process is carried out in a medium of boric acid with a low pH, which negatively affects the viability of the cells and determines the low level of total pectinase activity of the finished immobilized biocatalyst.
3. Сам иммобилизованный биокатализатор не выдерживает эксплуатации более 72 ч вследствие того, что носитель теряет свою исходную прочность и разрушается в среде культивирования.3. The immobilized biocatalyst itself cannot withstand operation for more than 72 hours due to the fact that the carrier loses its initial strength and is destroyed in the cultivation medium.
4. Кроме того, данный носитель (однофазный полимерный гидрогель) характеризуется недостаточной пористостью, что создает серьезные диффузионные ограничения в подаче питательных веществ к клеткам и отводе метаболитов в среду культивирования. Малый размер (не более 0,01-0,03 мкм) пор носителя у иммобилизованного биокатализатора-прототипа обусловлен тем, что при сшивании поливинилового спирта избытком боратных ионов образуется очень частая мелкопористая полимерная сетка [А.П.Синицын, Е.И.Райнина, В.И.Лозинский, С.Д.Спасов. (1994) Иммобилизованные клетки микроорганизмов. // 2-е изд., МГУ, М., с.144], диффузия высокомолекулярных растворимых веществ в которой стерически затруднена, что препятствует секреции макромолекул пектиназ из иммобилизованных клеток во внешнюю среду. Все эти обстоятельства предопределяют низкую среднюю продуктивность процесса по пектолитической активности.4. In addition, this carrier (single-phase polymer hydrogel) is characterized by insufficient porosity, which creates serious diffusion restrictions in the supply of nutrients to the cells and the removal of metabolites into the culture medium. The small size (not more than 0.01-0.03 microns) of the pores of the carrier of the immobilized prototype biocatalyst is due to the fact that when polyvinyl alcohol is crosslinked with an excess of borate ions, a very frequent finely porous polymer network is formed [A.P. Sinitsyn, E.I. Raininina , V.I. Lozinsky, S.D. Spasov. (1994) Immobilized cells of microorganisms. // 2nd ed., Moscow State University, Moscow, p. 144], the diffusion of high molecular weight soluble substances in which is sterically difficult, which prevents the secretion of pectinase macromolecules from immobilized cells into the external environment. All these circumstances predetermine the low average productivity of the process in terms of pectolytic activity.
Задачей предлагаемого технического решения является разработка высокопродуктивного иммобилизованного биокатализатора на основе клеток мицелиальных грибов, способных в иммобилизованном состоянии секретировать внеклеточные пектиназы в течение длительного времени культивирования.The objective of the proposed technical solution is to develop a highly productive immobilized biocatalyst based on cells of mycelial fungi, capable of secreting extracellular pectinases in an immobilized state over a long period of cultivation.
Поставленная задача решается тем, что заявляемый иммобилизованный биокатализатор для микробиологического получения пектиназ содержит способные продуцировать пектиназы клетки мицелиального гриба, включенные в матрицу содержащего поливиниловый спирт гелевого носителя, который представляет собой криогель поливинилового спирта с макропорами сечением 0,5-5,0 мкм, причем иммобилизованный биокатализатор получен на основе следующих компонентов, взятых в соотношении, мас.%: клетки мицелиального гриба (по сухой массе) 0,001÷0,1; поливиниловый спирт 8,4÷12,5; водная фаза - до 100.The problem is solved in that the claimed immobilized biocatalyst for microbiological production of pectinases contains pectinases capable of producing mycelial fungal cells included in a matrix of a polyvinyl alcohol-containing gel carrier, which is a polyvinyl alcohol cryogel with macropores with a cross section of 0.5-5.0 μm, and immobilized the biocatalyst is obtained on the basis of the following components, taken in the ratio, wt.%: cells of the mycelial fungus (by dry weight) 0.001 ÷ 0.1; polyvinyl alcohol 8.4 ÷ 12.5; aqueous phase up to 100.
Применение в качестве носителя иммобилизованных клеток криогеля поливинилового спирта - гелевого материала, формируемого при замораживании-оттаивании раствора данного полимерного гелеобразователя [В.И.Лозинский (2002) Криогели на основе природных и синтетических полимеров: получение, свойства и области применения. // Успехи химии, Т.71, с.559-585], обусловлено высокой пористостью образующейся гелевой матрицы, обеспечивающей незатрудненную диффузию субстратов и продуктов, соответственно, к и от иммобилизованных клеток, а также хорошими эксплуатационными характеристиками материала такого носителя.The use of polyvinyl alcohol as a carrier of immobilized cryogel cells, a gel material formed by freezing and thawing a solution of this polymer gelling agent [V.I. Lozinsky (2002) Cryogels based on natural and synthetic polymers: production, properties and applications. // Advances in Chemistry, T.71, p.559-585], due to the high porosity of the formed gel matrix, which provides easy diffusion of substrates and products, respectively, to and from immobilized cells, as well as good performance characteristics of the material of such a carrier.
Предлагаемое изобретение предусматривает формирование криогеля поливинилового спирта с одновременной иммобилизацией клеток мицелиальных грибов. После иммобилизации препарат помещается в среду культивирования, содержащую компоненты, необходимые для роста мицелия, т.е. образования полноценных жизнеспособных клеток, которые в таком иммобилизованном состоянии синтезируют и секретируют пектиназы. При этом заявляемый диапазон сечения макропор данного носителя найден экспериментально и обусловлен тем, что при сечении пор меньше 0,5 мкм наблюдается угнетение развития мицелия продуцента пектиназ в матрице криогеля поливинилового спирта, а при сечении пор более 5,0 мкм имеет место заметное прорастание гиф за пределы носителя, что при работе в реакторах с перемешиванием частиц иммобилизованного биокатализатора вызывает отрыв фрагментов мицелия, загрязняющих, тем самым, культуральную среду, содержащую целевой продукт.The present invention provides for the formation of a polyvinyl alcohol cryogel with simultaneous immobilization of mycelial fungal cells. After immobilization, the drug is placed in a culture medium containing the components necessary for the growth of mycelium, i.e. the formation of full-fledged viable cells, which in such an immobilized state synthesize and secrete pectinases. Moreover, the claimed range of macropore cross-section of this carrier was found experimentally and is due to the fact that when the pore cross section is less than 0.5 μm, inhibition of the development of mycelium of the pectinase producer in the polyvinyl alcohol cryogel matrix is observed, and when the pore cross section is more than 5.0 μm, a noticeable germination of hyphae occurs the limits of the carrier, which when working in reactors with mixing particles of an immobilized biocatalyst causes separation of mycelial fragments, thereby polluting the culture medium containing the target product.
Состав заявляемого иммобилизованного биокатализатора также найден экспериментально, причем, как оказалось, поливиниловый спирт в этом случае, в отличие от прототипа, не оказывает негативного влияния на биосинтетический и секреторный потенциал иммобилизованных клеток. Нижний предел концентрации заявляемого содержания поливинилового спирта определяется тем, что при меньшей, чем 8,4 мас.% концентрации этого гелеобразующего полимера, заметно снижаются физико-механическе характеристики иммобилизованного биокатализатора, а при более чем 12,5 мас.% содержании поливинилового спирта сильно повышается ее вязкость исходной системы, используемой для приготовления иммобилизованного биокатализатора, что затрудняет равномерное диспергирование биомассы в такой среде. Нижний предел концентрации клеток в заявляемом составе иммобилизованного биокатализатора определяется тем, что при использовании меньшей, чем 0,001 мас.% концентрации получаемый иммобилизованный биокатализатор обладает заметно меньшей пектолитической активностью, а верхний предел концентрации клеток определяется тем, что при использовании концентрации больше 0,1 мас.% происходит неполное включение всех клеток, введенных в смесь с раствором полимера, в формирующийся криогель поливинилового спирта и затем наблюдается их вымывание при помещении полученных гранул в культуральную среду для получения пектиназ. Таким образом, превышение указанного верхнего предела концентрации клеток нецелесообразно.The composition of the claimed immobilized biocatalyst is also found experimentally, and, as it turned out, polyvinyl alcohol in this case, unlike the prototype, does not adversely affect the biosynthetic and secretory potential of the immobilized cells. The lower concentration limit of the claimed polyvinyl alcohol content is determined by the fact that at less than 8.4 wt.% The concentration of this gelling polymer, the physicomechanical characteristics of the immobilized biocatalyst are noticeably reduced, and at more than 12.5 wt.% The content of polyvinyl alcohol increases its viscosity of the initial system used to prepare the immobilized biocatalyst, which makes it difficult to uniformly disperse biomass in such an environment. The lower limit of cell concentration in the inventive composition of the immobilized biocatalyst is determined by the fact that when using less than 0.001 wt.% Concentration, the resulting immobilized biocatalyst has significantly less pectolytic activity, and the upper limit of cell concentration is determined by the fact that when using a concentration of more than 0.1 wt. % there is an incomplete inclusion of all cells introduced into the mixture with the polymer solution into the cryogel of polyvinyl alcohol formed and then their washing out is observed when eschenii granules obtained in the culture medium for pectinases. Thus, exceeding the specified upper limit of the concentration of cells is impractical.
Получение биомассы клеток каждого конкретного мицелиального гриба для последующего включения в матрицу гелевого носителя проводится с применением известных биотехнологических приемов в соответствии с частными характеристиками конкретной культуры.Obtaining the biomass of cells of each specific mycelial fungus for subsequent inclusion in the matrix of the gel carrier is carried out using known biotechnological techniques in accordance with the particular characteristics of a particular culture.
После получения клеток (для включения в криогель поливинилового спирта могут быть использованы как покоящиеся (споровый материал), так и вегетативные формы) их диспергируют в растворе поливинилового спирта с последующей криогенной обработкой (замораживанием, выдерживанием в замороженном состоянии и оттаиванием) полученной суспензии, что в результате приводит к образованию полимерного криогеля, содержащего включенные в его матрицу клетки мицелиального гриба, обладающего пектолитической активностью.After receiving the cells (for inclusion in the cryogel of polyvinyl alcohol, both resting (spore material) and vegetative forms can be used) they are dispersed in a solution of polyvinyl alcohol with subsequent cryogenic treatment (freezing, keeping in a frozen state and thawing) of the resulting suspension, which the result leads to the formation of a polymer cryogel containing the cells of mycelial fungus included in its matrix with pectolytic activity.
В ходе криогенной обработки получаемому биокатализатору известными способами может быть придана любая необходимая форма, в частности форма сферических гранул, частиц неправильной формы, гелевых блоков, дисков, листов, трубок и др. Для этого суспензия биомассы в растворе гелеобразователя замораживается либо в соответствующей форме, либо гранулируется с помощью специального устройства, например криогрануляционных установок [Патент РФ №2036095 (1992); Патент РФ №2104866 (1996)].In the course of cryogenic treatment, the obtained biocatalyst can be imparted by known methods any desired shape, in particular the shape of spherical granules, irregularly shaped particles, gel blocks, discs, sheets, tubes, etc. For this, the biomass suspension in the gelling agent solution is frozen either in the appropriate form, or granulated using a special device, such as cryogranulation units [RF Patent No. 2036095 (1992); RF patent No. 2104866 (1996)].
Получение пектиназ с помощью заявляемого иммобилизованного биокатализатора проводят путем культивирования иммобилизованных клеток в различного рода аэробных реакторах с жидкими питательными средами, традиционно применяемыми в процессах с клетками мицелиальных грибов, являющихся продуцентами внеклеточных пектиназ. Затем целевые ферменты, накопленные в культуральной среде, могут быть либо непосредственно использованы (например, в виде концентратов или высушенных препаратов) в соответствующих процессах обработки пектинсодержащих субстратов, либо, в случае необходимости (например, для получения образцов реагентной чистоты), выделены из культуральной жидкости известными приемами (например, с помощью высаливания, различных видов хроматографии, ультрафильтрации, изоэлектрофокусирования и др.).The production of pectinases using the inventive immobilized biocatalyst is carried out by culturing immobilized cells in various kinds of aerobic reactors with liquid nutrient media, traditionally used in processes with cells of mycelial fungi, which are producers of extracellular pectinases. Then, the target enzymes accumulated in the culture medium can either be directly used (for example, in the form of concentrates or dried preparations) in the corresponding processes for processing pectin-containing substrates, or, if necessary (for example, to obtain samples of reagent purity), isolated from the culture fluid known techniques (for example, using salting out, various types of chromatography, ultrafiltration, isoelectric focusing, etc.).
Такой иммобилизованный биокатализатор для микробиологического получения пектиназ и такое сочетание признаков, как обладающие способностью секретировать пектиназы клетки мицелиального гриба, включенные в матрицу именно макропористого (сечение пор 0,5-5,0 мкм) криогеля поливинилового спирта, а также такой качественный и количественный состав заявляемого иммобилизованного биокатализатора, как клетки мицелиального гриба (0,001÷0,1 мас.%), способного секретировать внеклеточные пектиназы, гелеобразующий полимер - поливиниловый спирт (8,4÷12,5 мас.%) и водная фаза (до 100 мас.%), ранее известны не были и являются новым, то есть предлагаемое техническое решение отвечает критерию «новизна».Such an immobilized biocatalyst for microbiological production of pectinases and such a combination of features as cells capable of secreting pectinases from mycelial fungus cells included in the matrix of precisely macroporous (pore cross section 0.5-5.0 μm) polyvinyl alcohol cryogel, as well as such qualitative and quantitative composition of the claimed immobilized biocatalyst, like mycelial fungal cells (0.001 ÷ 0.1 wt.%), capable of secreting extracellular pectinases, gelling polymer - polyvinyl alcohol (8.4 ÷ 12.5 wt. %) and the aqueous phase (up to 100 wt.%) were not previously known and are new, that is, the proposed technical solution meets the criterion of "novelty."
Ниже приводятся конкретные примеры реализации заявляемого технического решения.The following are specific examples of the implementation of the proposed technical solution.
Пример 1. Иммобилизованный биокатализатор на основе клеток мицелиального гриба Aspergillus niger F-679 (ВКПМ) для получения внеклеточных пектиназExample 1. Immobilized biocatalyst based on cells of the mycelial fungus Aspergillus niger F-679 (VKPM) for the production of extracellular pectinases
Для получения иммобилизованного биокатализатора к 100 г 11%-ного водного раствора поливинилового спирта прибавляют 10 мл суспензии клеток (покоящаяся форма) мицелиального гриба Aspergillus niger с концентрацией 5×106 кл./мл и перемешивают до получения однородной массы, которую затем используют для формирования сферических гранул диаметром 1,4-1,6 мм. Гранулирование проводят с помощью криогрануляционной установки по Патенту РФ №2036095 известным методом: замораживание осуществляют при -15°С, продолжительность выдерживания в замороженном состоянии 24 ч, оттаивание гранул проводят при 8°С. Получают 110 г гранул криогеля поливинилового спирта, содержащего клетки мицелиального гриба, включенные в гелевую матрицу, сечение макропор которой, измеренное с помощью световой микроскопии тонких срезов, составляет 1,5-2,5 мкм. Приготовленный таким образом иммобилизованный биокатализатор имеет следующий состав, мас.%: клетки мицелиального гриба 0,018; поливиниловый спирт 10; водная фаза - до 100.To obtain an immobilized biocatalyst, 100 ml of a suspension of cells (resting form) of Aspergillus niger mycelium fungus with a concentration of 5 × 10 6 cells / ml are added to 100 g of an 11% aqueous solution of polyvinyl alcohol and mixed until a homogeneous mass is obtained, which is then used to form spherical granules with a diameter of 1.4-1.6 mm Granulation is carried out using a cryogranulation plant according to RF Patent No. 2036095 by a known method: freezing is carried out at -15 ° C, the duration of aging in a frozen state is 24 hours, thawing of granules is carried out at 8 ° C. Obtain 110 g of polyvinyl alcohol cryogel granules containing mycelial fungal cells included in the gel matrix, the macropore cross section of which, measured by light microscopy of thin sections, is 1.5-2.5 microns. The immobilized biocatalyst prepared in this way has the following composition, wt.%: Mycelial fungal cells 0.018; polyvinyl alcohol 10; aqueous phase up to 100.
Ферментационный процесс получения пектиназ проводят в условиях, аналогичных прототипу (500-мл колба Эрленмейера, содержащая 100 мл питательной среды (рН 5,0) следующего состава, г/л: свекловичный пектин (15,0), NH4SO4 (5,0), MgSO4×7H2O (0,2), FeSO4×7H2O (0,01); NaCl (5,0), KH2PO4 (0,1), температура культивирования 30°С). При использовании заявляемого биокатализатора средняя продуктивность процесса по пектолитической активности составляет 1,41 Ед. мл-1 ч-1, а максимальная пектолитическая активность, суммарно накапливающаяся в среде за все время ферментации (648 ч), достигает 191870 Ед.The fermentation process for the production of pectinases is carried out under conditions similar to the prototype (500 ml Erlenmeyer flask containing 100 ml of nutrient medium (pH 5.0) of the following composition, g / l: beet pectin (15.0), NH 4 SO 4 (5, 0), MgSO 4 × 7H 2 O (0.2), FeSO 4 × 7H 2 O (0.01); NaCl (5.0), KH 2 PO 4 (0.1), cultivation temperature 30 ° C) . When using the inventive biocatalyst, the average productivity of the process for pectolytic activity is 1.41 Units. ml -1 h -1 , and the maximum pectolytic activity, cumulatively accumulating in the medium during the entire fermentation (648 h), reaches 191870 Units.
Пример 2. Иммобилизованный биокатализатор на основе клеток мицелиального гриба Aspergillus foetidus F-531(ВКПМ) для получения внеклеточных пектиназExample 2. Immobilized biocatalyst based on cells of the mycelial fungus Aspergillus foetidus F-531 (VKPM) for the production of extracellular pectinases
Для получения иммобилизованного биокатализатора к 47,5 г 12%-ного водного раствора поливинилового спирта прибавляют 2,5 мл суспензии клеток (вегетативная форма) мицелиального гриба Aspergillus foetidus F-531 с концентрацией 5×108 кл./мл, полученных после смыва спор с поверхности твердой питательной среды 0,9% раствором NaCl и их экспонирования в этом растворе в течение 1 ч при комнатной температуре с целью инициации процесса вегетации спор, перемешивают до получения однородной массы, которую затем используют для формирования гранул. Гранулирование проводят путем заливки полученной однородной массы в лунки 96-луночных иммунологических плашек со сферическим дном по 0,15 мл. Криогенную обработку проводят известным методом: замораживание осуществляют при -13°С, продолжительность выдерживания в замороженном состоянии 16 ч, оттаивание гранул проводят при 4°С. Получают 50 г гранул криогеля поливинилового спирта, содержащего споры мицелиального гриба, включенные в гелевую матрицу, сечение макропор которой, измеренное с помощью световой микроскопии тонких срезов, составляет 3,5-5,0 мкм. Приготовленный таким образом иммобилизованный биокатализатор имеет следующий состав, мас.%: клетки мицелиального гриба 0,1; поливиниловый спирт 11,4; водная фаза - до 100.To obtain an immobilized biocatalyst, 2.5 ml of a cell suspension (vegetative form) of Aspergillus foetidus F-531 mycelium fungus with a concentration of 5 × 10 8 cells / ml obtained after washing off the spores is added to 47.5 g of a 12% aqueous solution of polyvinyl alcohol from the surface of the solid nutrient medium with a 0.9% NaCl solution and exposing them in this solution for 1 h at room temperature in order to initiate the spore vegetation process, mix until a homogeneous mass is obtained, which is then used to form granules. Granulation is carried out by pouring the obtained homogeneous mass into the wells of 96-well immunological plates with a spherical bottom of 0.15 ml. Cryogenic processing is carried out by a known method: freezing is carried out at -13 ° C, the duration of aging in the frozen state is 16 hours, the thawing of granules is carried out at 4 ° C. Get 50 g of granules of cryogel polyvinyl alcohol containing spores of mycelial fungus included in the gel matrix, the macropore cross section of which, measured using light microscopy of thin sections, is 3.5-5.0 microns. The immobilized biocatalyst prepared in this way has the following composition, wt.%: Mycelial fungal cells 0.1; polyvinyl alcohol 11.4; aqueous phase up to 100.
Ферментационный процесс для получения пектиназ проводят в следующих условиях: 1-литровый реактор, снабженный термостатируемой рубашкой, системами перемешивания, контроля рН и температуры, содержащий среду следующего состава, г/л: цитрусовый пектин (8,0), глюкоза (10,0), NH4NO3 (7,5), KH2PO4 (1,0), MgSO4×7H2O (0,5), FeSO4×7H2O (0,01), CaCl2 (0,1); температура процесса 28±1°С. При использовании заявляемого биокатализатора средняя продуктивность процесса по пектолитической активности составляет 1,43 Ед. мл-1 ч-1, а максимальная пектолитическая активность, суммарно накапливающаяся в среде за все время его использования (744 ч), достигает 106500 Ед.The fermentation process for the production of pectinases is carried out under the following conditions: a 1-liter reactor equipped with a thermostatically controlled jacket, mixing systems, pH and temperature control, containing a medium of the following composition, g / l: citrus pectin (8.0), glucose (10.0) , NH 4 NO 3 (7.5), KH 2 PO 4 (1.0), MgSO 4 × 7H 2 O (0.5), FeSO 4 × 7H 2 O (0.01), CaCl 2 (0, one); process temperature 28 ± 1 ° C. When using the inventive biocatalyst, the average productivity of the process for pectolytic activity is 1.43 Units. ml -1 h -1 , and the maximum pectolytic activity, accumulating in the medium for the entire time of its use (744 h), reaches 106500 Units.
Пример 3. Иммобилизованный биокатализатор на основе клеток мицелиального гриба Aspergillus awamory F-9 (ВКПМ) для получения внеклеточных пектиназExample 3. An immobilized biocatalyst based on cells of the mycelial fungus Aspergillus awamory F-9 (VKPM) for the production of extracellular pectinases
Для получения иммобилизованного биокатализатора к 115 г 13%-ного водного раствора поливинилового спирта прибавляют 5 мл суспензии (3×108 кл/мл) клеток (вегетативная форма) мицелиального гриба Aspergillus awamory F-9, полученной после смыва спор с поверхности твердой питательной среды стерильной водопроводной водой и их экспонирования в течение 30 мин при комнатной температуре с целью инициации выхода клеток из состояния покоящейся формы, и перемешивают до получения однородной массы, которую затем используют для получения гранул. Гранулирование проводят путем заливки полученной однородной массы в 96-луночные иммунологические плашки с плоским дном (по 0,25 мл в лунку). Криогенную обработку проводят известным методом: замораживание осуществляют при -20°С, продолжительность выдерживания в замороженном состоянии 16 ч, оттаивание гранул проводят при 6°С. Получают 120 г криогеля поливинилового спирта, содержащего клетки мицелиального гриба, включенные в гелевую матрицу, сечение макропор которой, измеренное с помощью световой микроскопии тонких срезов, составляет 0,5-1,2 мкм. Приготовленный таким образом иммобилизованный биокатализатор имеет следующий состав, мас.%: клетки мицелиального гриба 0,087; поливиниловый спирт, 12,5; водная фаза - до 100.To obtain an immobilized biocatalyst, 115 ml of a suspension (3 × 10 8 cells / ml) of cells (vegetative form) of Aspergillus awamory F-9 mycelial fungus obtained after washing the spores from the surface of a solid nutrient medium are added to 115 g of a 13% aqueous solution of polyvinyl alcohol sterile tap water and expose them for 30 min at room temperature in order to initiate the release of cells from the state of the resting form, and mix until a homogeneous mass is obtained, which is then used to obtain granules. Granulation is carried out by pouring the obtained homogeneous mass into 96-well immunological plates with a flat bottom (0.25 ml per well). Cryogenic processing is carried out by a known method: freezing is carried out at -20 ° C, the duration of exposure in the frozen state is 16 hours, the thawing of granules is carried out at 6 ° C. Get 120 g of polyvinyl alcohol cryogel containing cells of the mycelial fungus included in the gel matrix, the macropore cross section of which, measured using light microscopy of thin sections, is 0.5-1.2 microns. Thus prepared immobilized biocatalyst has the following composition, wt.%: Cells of mycelial fungus 0,087; polyvinyl alcohol, 12.5; aqueous phase up to 100.
Ферментационный процесс для получения пектиназ проводят в следующих условиях: 2-литровый реактор, снабженный термостатируемой рубашкой, системами перемешивания, контроля рН и температуры, содержащий среду следующего состава, г/л: яблочный пектин (15,0), NH4NO3 (7,5), KH2PO4 (1,0), MgSO4×7H2O (0,5), глюкоза (5,0); температура процесса 28±1°С. При использовании заявляемого биокатализатора средняя продуктивность процесса по пектолитической активности составляет 1,14 Ед. мл-1 ч-1, а максимальная пектолитическая активность, суммарно накапливающаяся в среде за все время его использования (720 ч), достигает 164160 Ед.The fermentation process for the production of pectinases is carried out under the following conditions: a 2-liter reactor equipped with a thermostatically controlled jacket, mixing systems, pH and temperature control, containing the following composition, g / l: apple pectin (15.0), NH 4 NO 3 (7 5), KH 2 PO 4 (1.0), MgSO 4 × 7H 2 O (0.5), glucose (5.0); process temperature 28 ± 1 ° C. When using the inventive biocatalyst, the average productivity of the process for pectolytic activity is 1.14 Units. ml -1 h -1 , and the maximum pectolytic activity, cumulatively accumulating in the medium for the entire time of its use (720 h), reaches 164160 Units.
Пример 4. Иммобилизованный биокатализатор на основе клеток мицелиального гриба Penicillium funiculosum F-149 (ВКПМ) для получения внеклеточных пектиназExample 4. Immobilized biocatalyst based on cells of the mycelial fungus Penicillium funiculosum F-149 (VKPM) to obtain extracellular pectinases
Для получения иммобилизованного биокатализатора к 1050 г 16%-ного водного раствора поливинилового спирта прибавляют 950 мл суспензии (5×105 кл/мл) клеток (покоящаяся форма) мицелиального гриба Penicillium funiculosum F-149, полученных после смыва спор с поверхности твердой питательной среды 0,9% раствором NaCl и их хранения в этом растворе в течение 16 ч при температуре 8°С, и перемешивают до получения однородной массы. Затем ее выливают ровным слоем толщиной 0,5 см на противень, который помещают в морозильную камеру при -18°С, где препарат выдерживают в замороженном состоянии 18 ч, оттаивание проводят при 4°С. Получают криогель поливинилового спирта в виде листового материала, содержащего клетки мицелиального гриба, включенные в гелевую матрицу, сечение макропор которой, измеренное с помощью световой микроскопии тонких срезов, составляет 0,8-1,9 мкм. Приготовленный таким образом иммобилизованный биокатализатор имеет следующий состав, мас.%: клетки мицелиального гриба 0,001; поливиниловый спирт 8,4; водная фаза - до 100.To obtain an immobilized biocatalyst, 950 ml of a suspension (5 × 10 5 cells / ml) of cells (resting form) of Penicillium funiculosum F-149 filamentous fungus obtained after washing spores from the surface of a solid nutrient medium are added to 1050 g of a 16% aqueous solution of polyvinyl alcohol 0.9% NaCl solution and their storage in this solution for 16 hours at a temperature of 8 ° C, and stirred until a homogeneous mass. Then it is poured with an even layer of a thickness of 0.5 cm onto a baking sheet, which is placed in a freezer at -18 ° C, where the preparation is kept frozen for 18 hours, thawing is carried out at 4 ° C. A polyvinyl alcohol cryogel is obtained in the form of a sheet material containing mycelial fungal cells included in a gel matrix, the macropore cross section of which, measured by light microscopy of thin sections, is 0.8-1.9 microns. The immobilized biocatalyst prepared in this way has the following composition, wt.%: Mycelial fungal cells 0.001; polyvinyl alcohol 8.4; aqueous phase up to 100.
Ферментационный процесс для получения пектиназ проводят в биореакторе с проточным режимом культивирования при непрерывном перемешивании среды (5-литровый реактор, снабженный термостатируемой рубашкой, системами перемешивания, контроля рН и температуры, содержащий среду следующего состава, г/л: пектат натрия (10,0), NH4NO3 (7,5), КН2РО4 (1), MgSO4×7H2O (0,05), глюкоза (5,0)), где иммобилизованный биокатализатор помещен в виде свернутого листа; температура процесса 28±1°С. При использовании заявляемого биокатализатора средняя продуктивность процесса по пектолитической активности составляет 1,45 Ед мл-1 ч-1, а максимальная пектолитическая активность, суммарно накапливающаяся в среде за все время использования биокатализатора (572 ч), достигает 830000 Ед.The fermentation process for the production of pectinases is carried out in a bioreactor with flow-through cultivation with continuous stirring of the medium (5-liter reactor equipped with a thermostatted jacket, mixing systems, pH and temperature control, containing a medium of the following composition, g / l: sodium pectate (10.0) , NH 4 NO 3 (7.5), KH 2 PO 4 (1), MgSO 4 × 7H 2 O (0.05), glucose (5.0)), where the immobilized biocatalyst is placed in the form of a folded sheet; process temperature 28 ± 1 ° C. When using the inventive biocatalyst, the average productivity of the process in terms of pectolytic activity is 1.45 U ml -1 h -1 , and the maximum pectolytic activity accumulating in the medium during the whole period of use of the biocatalyst (572 h) reaches 830000 Units.
Пример 5. Иммобилизованный биокатализатор на основе клеток мицелиального гриба Rhizopus oryzae F-814 (ВКПМ) для получения внеклеточных пектиназExample 5. An immobilized biocatalyst based on cells of the mycelial fungus Rhizopus oryzae F-814 (VKPM) for the production of extracellular pectinases
Для получения иммобилизованного биокатализатора к 500 г 12%-ного водного раствора поливинилового спирта прибавляют 100 мл суспензии (5×107 кл/мл) клеток (покоящаяся форма) мицелиального гриба Rhizopus oryzae F-814 и перемешивают до получения однородной массы, которую затем используют для формирования гранул с помощью криогрануляционной установки (Патент РФ №2036095) в следующих условиях: замораживание осуществляют при -13°С, продолжительность выдерживания в замороженном состоянии 28 ч, оттаивание гранул проводят при 4°С. Получают 600 г гранул криогеля поливинилового спирта, содержащего клетки мицелиального гриба, включенные в гелевую матрицу, сечение макропор которой, измеренное с помощью световой микроскопии тонких срезов, составляет 3,2-4,6 мкм. Приготовленный таким образом иммобилизованный биокатализатор имеет следующий состав, мас.%: клетки мицелиального гриба 0,04; поливиниловый спирт 10; водная фаза - до 100.To obtain an immobilized biocatalyst, 500 ml of a suspension (5 × 10 7 cells / ml) of cells (resting form) of the mycelial fungus Rhizopus oryzae F-814 are added to 500 g of a 12% aqueous solution of polyvinyl alcohol and mixed until a homogeneous mass is obtained, which is then used for the formation of granules using a cryogranulation unit (RF Patent No. 2036095) under the following conditions: freezing is carried out at -13 ° C, the duration of aging in a frozen state is 28 hours, the thawing of granules is carried out at 4 ° C. 600 g of polyvinyl alcohol cryogel granules are obtained containing mycelial fungal cells included in a gel matrix, the macropore cross section of which, measured by light microscopy of thin sections, is 3.2-4.6 μm. Thus prepared immobilized biocatalyst has the following composition, wt.%: Cells of the mycelial fungus 0.04; polyvinyl alcohol 10; aqueous phase up to 100.
Ферментационный процесс для получения пектиназ проводят в следующих условиях: 2,5-литровый реактор, снабженный термостатируемой рубашкой, системами перемешивания, контроля рН и температуры, содержащий среду, состав которой указан в Примере 2; температура процесса 30±0,5°С. При использовании заявляемого биокатализатора средняя продуктивность процесса по пектолитической активности составляет 1,05 Ед. мл-1 ч-1, а максимальная пектолитическая активность, суммарно накапливающаяся в среде за все время использования биокатализатора (600 ч), достигает 315000 Ед.The fermentation process for producing pectinases is carried out under the following conditions: a 2.5-liter reactor equipped with a thermostatically controlled jacket, mixing systems, pH and temperature control, containing a medium whose composition is indicated in Example 2; process temperature 30 ± 0.5 ° C. When using the inventive biocatalyst, the average productivity of the process for pectolytic activity is 1.05 Units. ml -1 h -1 , and the maximum pectolytic activity, cumulatively accumulating in the medium for the entire time the biocatalyst is used (600 h), reaches 315,000 units.
Таким образом, заявляемое техническое решение приводит к получению иммобилизованного биокатализатора, имеющего следующие преимущества по сравнению с аналогами и прототипом:Thus, the claimed technical solution leads to an immobilized biocatalyst having the following advantages compared to analogues and prototype:
1. Заявляемое техническое решение предусматривает применение синтетического полимера - поливинилового спирта - для формирования гелевого носителя, устойчивого к ферментативной атаке иммобилизуемыми клетками, что в результате способствует длительному (до 744 ч) сохранению иммобилизованным биокатализатором высокой механической прочности.1. The claimed technical solution involves the use of a synthetic polymer - polyvinyl alcohol - to form a gel carrier that is resistant to enzymatic attack by immobilized cells, which as a result contributes to the long-term (up to 744 hours) preservation of high mechanical strength by an immobilized biocatalyst.
2. Включение клеток мицелиальных грибов, обладающих пектолитической активностью, в матрицу криогеля поливинилового спирта сохраняет их жизнеспособность и целевую ферментативную активность, что позволяет получать иммобилизованные биокатализаторы, обладающие высокой удельной и суммарной продуктивностями, и в то время как в случае прототипа наблюдалось заметное снижение этих показателей.2. The inclusion of mycelial fungal cells with pectolytic activity in the polyvinyl alcohol cryogel matrix retains their viability and targeted enzymatic activity, which allows to obtain immobilized biocatalysts with high specific and total productivity, while in the case of the prototype there was a noticeable decrease in these indicators .
3. В заявляемом техническом решении, в отличие от аналогов, не используются для упрочнения носителя токсичные вещества, например глутаровый альдегид, что в случае предлагаемого изобретения способствует сохранению более высокого уровня жизнеспособности иммобилизуемой биомассы, а также повышает технологическую и экологическую безопасность производства биокатализатора.3. In the claimed technical solution, in contrast to analogues, toxic substances, for example glutaraldehyde, are not used to harden the carrier, which in the case of the present invention helps to maintain a higher level of viability of immobilized biomass, and also increases the technological and environmental safety of biocatalyst production.
4. Поскольку носитель иммобилизованных клеток-продуцентов пектиназ - криогель поливинилового спирта - обладает макропористостью (сечение крупных пор от 0,5 до 5,0 мкм), то это обеспечивает благоприятные условия для иммобилизованной биомассы в отношении поступления субстратов (включая кислород для дыхания аэробных мицелиальных грибов) к клеткам и отвода продуктов жизнедеятельности, включая секретируемые внеклеточные пектиназы, от клеток, что в совокупности обеспечивает существенно лучшие показатели продуктивности заявляемого иммобилизованного биокатализатора по сравнению с аналогами и прототипом.4. Since the carrier of immobilized pectinase producing cells, polyvinyl alcohol cryogel, has macroporosity (large pore cross-sections from 0.5 to 5.0 μm), this provides favorable conditions for immobilized biomass with respect to the supply of substrates (including oxygen for respiration of aerobic mycelial fungi) to cells and the removal of waste products, including secreted extracellular pectinases, from cells, which together provides significantly better indicators of the productivity of the claimed immobilization bath biocatalyst in comparison with analogues and prototype.
5. Использование в качестве матрицы носителя вязкоупругого нехрупкого материала-криогеля поливинилового спирта, практически не подвергаемого абразивному износу, позволяет варьировать форму гранул биокатализатора и использовать его в различных реакторах, в том числе и в реакторах с интенсивным перемешиванием, что существенно увеличивает скорость массообменных биокаталитических процессов. Как результат, заявляемое изобретение позволяет получить иммобилизованный биокатализатор, обладающий существенно улучшенными (по отношению к аналогам и прототипу) характеристиками, а именно, как минимум, в 1,5 раза (Пример 2), а в максимуме - в 11,5 раз (Пример 4) увеличенной суммарно накапливающейся пектолитической активностью при использовании биокатализатора и, как минимум, в 1,8 раза (Пример 5), а в сравнении с прототипом - в 120 раз, увеличенной средней продуктивностью процесса по пектолитической активности.5. The use of a matrix of a carrier of a viscoelastic non-brittle cryogel material of polyvinyl alcohol, practically not subject to abrasive wear, allows you to vary the shape of the biocatalyst granules and use it in various reactors, including in reactors with intensive mixing, which significantly increases the rate of mass transfer biocatalytic processes . As a result, the claimed invention allows to obtain an immobilized biocatalyst having significantly improved (in relation to analogues and prototype) characteristics, namely, at least 1.5 times (Example 2), and at a maximum of 11.5 times (Example 4) increased total accumulating pectolytic activity when using a biocatalyst and at least 1.8 times (Example 5), and in comparison with the prototype - 120 times, increased average productivity of the process for pectolytic activity.
6. Заявляемое техническое решение обладает высокой универсальностью в отношении иммобилизуемых культур, поскольку положительный эффект при реализации данного изобретения может быть получен при использовании клеток самых разных мицелиальных грибов, являющихся продуцентами внеклеточных пектиназ (см. примеры 1-5).6. The claimed technical solution has high versatility in relation to immobilized cultures, since a positive effect in the implementation of this invention can be obtained using cells of various mycelial fungi, which are producers of extracellular pectinases (see examples 1-5).
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2008127557/13A RU2383618C1 (en) | 2008-07-09 | 2008-07-09 | Immobilised biocatalyst for microbiological production of pectinases |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2008127557/13A RU2383618C1 (en) | 2008-07-09 | 2008-07-09 | Immobilised biocatalyst for microbiological production of pectinases |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2008127557A RU2008127557A (en) | 2010-01-20 |
| RU2383618C1 true RU2383618C1 (en) | 2010-03-10 |
Family
ID=42120093
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2008127557/13A RU2383618C1 (en) | 2008-07-09 | 2008-07-09 | Immobilised biocatalyst for microbiological production of pectinases |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2383618C1 (en) |
-
2008
- 2008-07-09 RU RU2008127557/13A patent/RU2383618C1/en active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| NIGHOJKAR S. ЕТ AL. Production of polygalacturonase by immobilized cells of Aspergillus niger using orange peel as inducer. // Process Biochemistry, 41, 2006, pp.1136-1140. ANGELOVA M. ET AL. Enhanced polymethylgalacturonase production from Aspergillus niger 26 by calcium alginate immobilization. // Process Biochemistry, vol.33, no.3, 1998, pp.299-305. ЛОЗИНСКИЙ В.И. и др. Применение криогелей поливинилового спирта в биотехнологии. V. Сверхмакропористые носители для иммобилизации молекул. // Биотехнология, 1995, 1-2, с.32-37. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2008127557A (en) | 2010-01-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Idris et al. | Effect of sodium alginate concentration, bead diameter, initial pH and temperature on lactic acid production from pineapple waste using immobilized Lactobacillus delbrueckii | |
| Naidu et al. | Production of pectolytic enzymes–a review | |
| Margaritis et al. | Advances in ethanol production using immobilized cell systems | |
| Hatvani et al. | Production of laccase and manganese peroxidase by Lentinus edodes on malt-containing by-product of the brewing process | |
| FI68078B (en) | FOERFARANDE FOER FRAMSTAELLNING AV BIOLOGISKT AKTIVA MICROORGANISMMYCELIEPELLETS | |
| Akin | Biocatalysis with immobilized cells | |
| CA2575237A1 (en) | Processes for producing cellooligosaccharide | |
| US4996150A (en) | Biocatalyst immobilization in a gel of anionic polysaccharide and cationic polymer | |
| Lalou et al. | Bioflavour production from orange peel hydrolysate using immobilized Saccharomyces cerevisiae | |
| CN104911169B (en) | A kind of method for training cordyceps mycelium and fibrinolysin processed | |
| CN112011531A (en) | Enzyme preparation produced by using immobilized cell technology and preparation method thereof | |
| Ibrahim et al. | Potential use of nylon scouring pad cubes attachment method for pectinase production by Aspergillus niger HFD5A-1 | |
| Abbasi et al. | POLYGALACTURONASE (PG) PRODUCTION BY FUNGAL STRAINS USING AGRO-INDUSTRIAL BIOPRODUCT IN SOLID STATE FERMENTATION. | |
| Demirel et al. | The production of citric acid by using immobilized Aspergillus niger A-9 and investigation of its various effects | |
| Nava et al. | Effect of mixing on the solid-state fermentation of coffee pulp with Aspergillus tamarii | |
| Adedayo et al. | Pectinolytic activity of Aspergillus niger and Aspergillus flavus grown on grapefruit (citrus Parasidis) peel in solid state fermentation | |
| RU2383618C1 (en) | Immobilised biocatalyst for microbiological production of pectinases | |
| Adinarayana et al. | Production of alkaline protease by immobilized cells of alkalophilic Bacillus sp. | |
| Yaykaşlı et al. | Influence of alcohols on citric acid production by Aspergillus niger A-9 entrapped in polyacrylamide gels | |
| Osmolovskiy et al. | Solid-state and membrane-surface liquid cultures of micromycetes: Specific features of their development and enzyme production (a Review) | |
| Pashova et al. | Physiological aspects of immobilised Aspergillus niger cells producing polymethylgalacturonase | |
| da Silva et al. | Selection and isolation of fungi strains and the use of banana peel a suport for lipases production | |
| RU2626528C2 (en) | Immobilized bioacatalyst for fumaric acid production | |
| RU2391402C2 (en) | Biocatalyst for producing ethanol from pentose | |
| Zohri et al. | Continuous Ethanol Production from Molasses via Immobilized Saccharomyces cerevisiae on Different Carriers on Pilot Scale |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC43 | Official registration of the transfer of the exclusive right without contract for inventions |
Effective date: 20140325 |