RU2372919C2

RU2372919C2 - Agent stimulating human leukaemia cell apoptosis (versions)

Info

Publication number: RU2372919C2
Application number: RU2007148014/15A
Authority: RU
Inventors: Сергей Николаевич Федоров (RU); Сергей Николаевич Федоров; Сергей Георгиевич Полоник (RU); Сергей Георгиевич Полоник; Лариса Кимовна Шубина (RU); Лариса Кимовна Шубина; Ирина Ивановна Капустина (RU); Ирина Ивановна Капустина; Валентин Аронович Стоник (RU); Валентин Аронович Стоник; Валерия Владимировна Шастина (RU); Валерия Владимировна Шастина; Янг Йонг Квак (KR); Янг Йонг Квак; Джу Ин Парк (KR); Джу Ин Парк; Джун О Джин (KR); Джун О Джин; Янг Хии Квон (KR); Янг Хии Квон
Priority date: 2007-12-21
Filing date: 2007-12-21
Publication date: 2009-11-20
Also published as: RU2007148014A

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: invention concerns medical products and covers applications of O- and S-glycosides 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone (judlone) derivatives of formula

1 as an agent that stimulates human leukaemia cell apoptosis. Disclosed compounds selectively stimulate human leukemia cell apoptosis as comparrf with a prototype juglone without affecting normal cells of human immune system (neutrophils).

EFFECT: invention allows extending range of products selectively stimulating leukaemia cell apoptosis.

4 cl, 13 dwg, 5 tbl, 14 ex

Description

Изобретение относится к медицине и касается средств, обладающих способностью стимулировать апоптоз клеток лейкемии человека.The invention relates to medicine and relates to agents having the ability to stimulate apoptosis of human leukemia cells.

Лейкозы представляют собой опухоли, диффузно поражающие гемопоэтическую ткань костного мозга. Уровень заболеваемости лейкозами в разных странах мира колеблется в широком диапазоне: от 3 до 10 человек на 100000 населения. При этом мужчины болеют различными формами лейкоза примерно в 1,5 раза чаще, чем женщины. Максимальный уровень заболеваемости хроническими лейкозами наблюдается у людей старше 40-50 лет, а острыми - в возрасте до 10-18 лет.Leukemia is a tumor diffusely affecting the hematopoietic tissue of the bone marrow. The incidence of leukemia in different countries of the world varies in a wide range: from 3 to 10 people per 100,000 population. At the same time, men suffer from various forms of leukemia about 1.5 times more often than women. The maximum incidence of chronic leukemia is observed in people over 40-50 years old, and acute - in the age of 10-18 years.

Для лейкозов характерны:Leukemia is characterized by:

- безграничный рост, неконтролируемое размножение клеток - гиперплазия;- unlimited growth, uncontrolled cell multiplication - hyperplasia;

- морфологическая анаплазия - потеря способности клетки к дифференцировке, созреванию, незрелость;- morphological anaplasia - loss of cell ability for differentiation, maturation, immaturity;

- угнетение нормального кроветворения за счет быстрого разрастания опухолевых элементов, «вытеснения» ими нормальных ростков кроветворения (метаплазия).- inhibition of normal hematopoiesis due to the rapid proliferation of tumor elements, their "crowding out" of normal hematopoietic growths (metaplasia).

Основным методом лечения лейкозов является химиотерапия [В.И.Махолкин, С.И.Овчаренко. Внутренние болезни. М., Медицина, 1999]. В качестве лекарственных средств используют как препараты, полученные химическим синтезом, так и выделенные из природных источников. По механизму действия на опухолевый процесс их можно условно разделить на две основные группы; а) антиметаболиты - вещества нарушающие метаболизм основных биохимических процессов, протекающих в быстроделящейся клетке (опухолевой), б) цитостатики - вещества, воздействующие непосредственно на процесс деления клеток.The main treatment for leukemia is chemotherapy [V.I. Makholkin, S.I. Ovcharenko. Internal illnesses. M., Medicine, 1999]. As drugs, both drugs obtained by chemical synthesis and isolated from natural sources are used. According to the mechanism of action on the tumor process, they can be divided into two main groups; a) antimetabolites - substances that disrupt the metabolism of the main biochemical processes that occur in a rapidly dividing cell (tumor), b) cytostatics - substances that directly affect the process of cell division.

К первым относятся такие лекарственные средства как метотрексат, меркаптопурин, тиогуанин, цитарабин, флударабин, гидроксимочевина, ко вторым - митосантрон, винкристин, винбластин, тенипозид, рубомицнн, доксорубомицин и другие [М.Д.Машковский. Лекарственные средства. Т 2, Изд. 14, М. ООО «Новая Волна». 2001. С.407].The former include drugs such as methotrexate, mercaptopurine, thioguanine, cytarabine, fludarabine, hydroxyurea, the second include mitosantrone, vincristine, vinblastine, teniposide, rubomycin, doxorubomycin and others [M.D. Mashkovsky. Medicines T 2, ed. 14, M. LLC "New Wave". 2001. P.407].

К сожалению, химиотерапия, как правило, имеет ряд сильно выраженных побочных эффектов. Вследствие слабой избирательности цитостатические препараты воздействуют как на больные, так и на здоровые клетки крови, что приводит к быстрой гибели значительного их числа и развитию почти полной цитопении - угнетению роста всех кровяных клеток (лейкоцитов, тромбоцитов и эритроцитов).Unfortunately, chemotherapy, as a rule, has a number of very pronounced side effects. Due to poor selectivity, cytostatic drugs affect both sick and healthy blood cells, which leads to the rapid death of a significant number of them and the development of almost complete cytopenia - inhibition of the growth of all blood cells (leukocytes, platelets and red blood cells).

Наиболее опасным при этом является развитие лейкопении, так как лейкоциты представляют собой один из главных компонентов естественной защиты организма против инфекции. Степень и длительность лейкоцитопении, развивающейся после химиотерапии, в значительной степени определяет количество жизнеопасных инфекционных осложнений.The most dangerous in this case is the development of leukopenia, since white blood cells are one of the main components of the body's natural defense against infection. The degree and duration of leukocytopenia developing after chemotherapy largely determines the number of life-threatening infectious complications.

Тромбоцитопения также представляет клиническую проблему, обусловливая геморрагические осложнения, нередко фатальные, особенно при наличии сопутствующей инфекции.Thrombocytopenia is also a clinical problem, causing hemorrhagic complications, often fatal, especially in the presence of concomitant infection.

Тяжелым осложнением применения химиотерапии при лечении лейкозов является угнетение роста нейтрофилов - нейтропения, которая приводит к инфекционным осложнениям. Учитывая высокую вероятность развития и потенциальную тяжесть инфекционных осложнений в условиях нейтропении, проводятся меры направленные на ограничение попадания возбудителей инфекции в организм пациентов извне с воздухом, пищей и водой, а также меры по борьбе с микроорганизмами, колонизирующими организм. Последний подход включает профилактическое назначение антибиотиков и противогрибковых препаратов.A serious complication of the use of chemotherapy in the treatment of leukemia is the inhibition of the growth of neutrophils - neutropenia, which leads to infectious complications. Given the high likelihood of developing and the potential severity of infectious complications in neutropenia, measures are being taken to limit the entry of infectious agents into the patient’s body from the outside with air, food and water, as well as measures to combat microorganisms that colonize the body. The latter approach includes the prophylactic use of antibiotics and antifungal drugs.

Острые лейкозы при своевременной диагностике излечиваются в 80-90% случаев. Хронические лейкозы излечиваются всего лишь в 20-40% случаев; больные лечатся годами, длительное время им необходим тщательный врачебный уход и применение разнообразных лекарственных средств, вследствие сравнительно быстрого привыкания опухолевых клеток к действию одного препарата [В.И.Махолкин, С.И.Овчаренко. Внутренние болезни. М., Медицина, 1999].Acute leukemia with timely diagnosis can be cured in 80-90% of cases. Chronic leukemia can be cured in only 20-40% of cases; patients are treated for years, for a long time they need careful medical care and the use of a variety of drugs, due to the relatively fast addiction of tumor cells to the action of one drug [V.I. Makholkin, S.I. Ovcharenko. Internal illnesses. M., Medicine, 1999].

Все это свидетельствует о необходимости поиска новых препаратов для лечения лейкозов, основанных на подходах, отличных от вышеупомянутых.All this indicates the need to search for new drugs for the treatment of leukemia, based on approaches other than the above.

В начале 70-х годов XX века биологами было введено в научный оборот новое представление - апоптоз, описывающее систему клеточной смерти, отличающуюся от некроза отсутствием воспалительных реакций и токсического отравления организма, характерного для некротического варианта распада клеток, наблюдающегося при применении традиционных противоопухолевых препаратов [Schutze-Osthoff К., Ferrari D., Los M. et all Apoptosis signaling by death receptors. Eur. J. Biochem. 1998, Vol.254. P.439-459; Blatt N.B., Glick G.D. Signaling pathways and effector mechanisms preprogrammed cell death. Bioorg. Med. Chem. 2001. Vol 9, P.1371-1384].In the early 70s of the XX century, biologists introduced a new concept into scientific circulation - apoptosis, which describes the system of cell death, which differs from necrosis by the absence of inflammatory reactions and toxic poisoning of the body, characteristic of the necrotic variant of cell decay observed with traditional antitumor drugs [Schutze Osthoff K., Ferrari D., Los M. et all Apoptosis signaling by death receptors. Eur. J. Biochem. 1998, Vol. 254. P.439-459; Blatt N. B., Glick G. D. Signaling pathways and effector mechanisms preprogrammed cell death. Bioorg. Med. Chem. 2001. Vol 9, P.1371-1384].

В ходе апоптоза клетки подвергаются характерным морфологическим изменениям, включающим конденсацию и фрагментацию ядра, сжатие цитоплазмы и образование так называемых апоптотических тел, которые содержат фрагменты ядра, окруженные цитоплазмой и клеточной мембраной. Апоптотические клетки быстро всасываются макрофагами.During apoptosis, cells undergo characteristic morphological changes, including condensation and fragmentation of the nucleus, contraction of the cytoplasm and the formation of so-called apoptotic bodies, which contain fragments of the nucleus surrounded by the cytoplasm and cell membrane. Apoptotic cells are rapidly absorbed by macrophages.

Позже было осознано, что апоптоз происходит во всех тканях организма, как часть нормального круговорота клеток. Например, апоптоз протекает в ходе эмбриогенеза в котором отдельные клетки (части тела) «приговариваются» к смерти в ходе развития организма.It was later realized that apoptosis occurs in all body tissues as part of the normal cell cycle. For example, apoptosis occurs during embryogenesis in which individual cells (parts of the body) are “sentenced” to death during the development of the body.

Апоптоз можно условно разделить на три этапа. На первом этапе клетка получает апоптотический сигнал. Большое число внутренних и внешних стимулов воздействия на клетку может активировать в ней апоптотическую последовательность реакций. Эти стимулы включают связывание с клеточными рецепторами на ее поверхности, удаление важнейших факторов роста или воздействие на нее различных химических агентов. Кроме того, окислительный стресс, облучение клетки УФ-светом либо ионизирующей радиацией, нагревание или изменение осмотического давления также являются факторами индуцирующими апоптоз.Apoptosis can be divided into three stages. At the first stage, the cell receives an apoptotic signal. A large number of internal and external stimuli of action on the cell can activate an apoptotic sequence of reactions in it. These stimuli include binding to cellular receptors on its surface, removal of critical growth factors, or exposure to various chemical agents. In addition, oxidative stress, irradiation of a cell with UV light or ionizing radiation, heating or a change in osmotic pressure are also factors inducing apoptosis.

На следующей ступени развития апоптоза клетка интегрирует поступающие отовсюду сигналы и может перейти (а может и не перейти) к процессу апоптоза, в ходе которого активируются ферментные системы, включается синтез вторичных мессенджеров липидного обмена, изменяется экспрессия генов и активируются специализированные протеазы (каспазы). Окончательное "решение" клетки на переход к апоптозу зависит от многих факторов. На финальном этапе апоптоза общий сигнальный механизм деградации одномоментно активируется таким образом, что клетка разом приобретает характерные морфологические особенности присущие апоптозу.At the next stage of apoptosis development, the cell integrates the signals coming from everywhere and can go (or maybe not) to the process of apoptosis, during which enzyme systems are activated, the synthesis of secondary lipid metabolism messengers is activated, gene expression changes and specialized proteases (caspases) are activated. The final "decision" of the cell to switch to apoptosis depends on many factors. At the final stage of apoptosis, the general signaling mechanism of degradation is simultaneously activated in such a way that the cell immediately acquires the characteristic morphological features inherent in apoptosis.

Одним из возможных подходов к уничтожению раковых лейкозных клеток может стать принудительная стимуляция (индукция) лейкозных клеток к апоптозу путем воздействия на них подходящими биологически активными природными соединениями [S.-Y.Sun, N.Hail, R.Lotan. Apoptosis as a novel target for cancer. J. Natl. Cancer Inst, 2004, V.96, No 9, P.662-672]. Анализ литературных данных показал, что перспективной группой природных соединений, способных вызывать апоптоз клеток, являются хиноны [Kim H.J., Mun J.Y., Chun Y.J., et all. Effects of a naphthoquinone analog on tumor growth and apoptosis induction Arch. Pharm. Res. 2003 Vol.26, No 5, P.405-410., Hussain H., Krohn K., Ahmad V.U., et all. Lapachole: an overview. Arkivoc 2007 (ii), P. 145-147].One of the possible approaches to the destruction of cancer leukemia cells can be forced stimulation (induction) of leukemia cells to apoptosis by exposing them to suitable biologically active natural compounds [S.-Y.Sun, N.Hail, R. Lotan. Apoptosis as a novel target for cancer. J. Natl. Cancer Inst, 2004, V. 96, No. 9, P.662-672]. Analysis of literature data showed that quinones are a promising group of natural compounds capable of inducing cell apoptosis [Kim H.J., Mun J.Y., Chun Y.J., et all. Effects of a naphthoquinone analog on tumor growth and apoptosis induction Arch. Pharm. Res. 2003 Vol.26, No. 5, P.405-410., Hussain H., Krohn K., Ahmad V.U., et all. Lapachole: an overview. Arkivoc 2007 (ii), P. 145-147].

Хиноидная структура широко распространена в природе. Согласно данным из природных источников выделено около 1500 соединений с хиноидным ядром [Thomson R.H., Naturally Occurring Quinones III, Chapman & Hall, London-New-York, 1987]. Хиноны являются важным классом природных и синтетических соединений с большим разнообразием функций. Хорошо известна их роль в биохимии живых клеток, например в переносе электронов по дыхательной цепи (убихинон Q), или в механизме свертывания крови (витамин К).The quinoid structure is widespread in nature. According to data from natural sources, about 1,500 compounds with a quinoid nucleus were isolated [Thomson R.H., Naturally Occurring Quinones III, Chapman & Hall, London-New-York, 1987]. Quinones are an important class of natural and synthetic compounds with a wide variety of functions. Their role in the biochemistry of living cells is well known, for example, in electron transfer through the respiratory chain (ubiquinone Q), or in the blood coagulation mechanism (vitamin K).

Многие хиноны, например 5-гидрокси-1,4-нафтохинон (юглон) и его 2-метилгомолог плюмбагин, выделенные из различных высших растений, ингибируют рост бактерий и грибов и используются растениями как защитные вещества [Жунгиету Г.И., Влад Л.А. Юглон и родственные 1,4-нафтохиноны, Штиинца, Кишинев, 1978]. Хиноидное ядро входит в структуру различных практически важных противоопухолевых препаратов (антрациклиновых цитостатиков и гетероциклических хинонов). К настоящему времени принято считать, что цитотоксический эффект хинонов обусловлен: а) их способностью продуцировать кислородсодержащие свободные радикалы, б) электрофильностью хиноидного ядра, легко образующего аддукты с различными бионуклеофилами [Ashe С. Antitumor quinones Mini Rev. Med. Chem, 2005, Vol.5, No 5, P.449-467].Many quinones, for example 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone (juglon) and its 2-methyl homolog plumbagin isolated from various higher plants inhibit the growth of bacteria and fungi and are used by plants as protective substances [Zhungietu G.I., Vlad L. BUT. Juglon and related 1,4-naphthoquinones, Shtiintsa, Chisinau, 1978]. The quinoid nucleus is part of the structure of various practically important antitumor drugs (anthracycline cytostatics and heterocyclic quinones). To date, it is generally accepted that the cytotoxic effect of quinones is due to: a) their ability to produce oxygen-containing free radicals, b) electrophilicity of the quinoid nucleus, which easily forms adducts with various bionucleophiles [Ashe C. Antitumor quinones Mini Rev. Med. Chem, 2005, Vol.5, No. 5, P.449-467].

Способность хинонов продуцировать свободные кислородные радикалы и присоединять нуклеофилы в значительной степени зависит от количества и природы заместителей присоединенных к хиноидному ядру, что открывает путь к получению новых соединений, путем модификации известных природных хинонов с уже установленной биологической активностью [Ollinger К., Brunmark A, Effect of hydroxy substituent position on 1,4-naphthoquinone toxicity to rat hepatocytes. J. Biol. Chem., 1991. Vol.256, No 32, P.21496-21503].The ability of quinones to produce free oxygen radicals and attach nucleophiles largely depends on the number and nature of the substituents attached to the quinoid nucleus, which opens the way to the production of new compounds by modifying the known natural quinones with already established biological activity [Ollinger K., Brunmark A, Effect of hydroxy substituent position on 1,4-naphthoquinone toxicity to rat hepatocytes. J. Biol. Chem., 1991. Vol. 256, No. 32, P.21496-21503].

Наиболее близким к заявляемому средству является 5-гидрокси-1,4-нафтохинон (юглон) - нафтохиноидный природный пигмент, содержащийся в корнях, листьях, коре, древесине и кожуре орехов [Жунгиету Г.И., Влад Л.А. Юглон и родственные 1,4-нафтохиноны, Штиинца, Кишинев, 1978]. Это соединение проявляет разнообразную и высокую физиологическую активность. Юглон и его 2-метилгомолог плюмбагин, выделенные из различных высших растений, ингибируют рост бактерий и грибов и используются растениями как защитные вещества.Closest to the claimed agent is 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone (yuglon) - a naphthoquinoid natural pigment contained in the roots, leaves, bark, wood and peel of nuts [Zhungietu G.I., Vlad L.A. Juglon and related 1,4-naphthoquinones, Shtiintsa, Chisinau, 1978]. This compound exhibits a diverse and high physiological activity. Yuglon and its 2-methyl homolog plumbagin isolated from various higher plants inhibit the growth of bacteria and fungi and are used by plants as protective substances.

Известно, что юглон проявляет противоопухолевую активность, в том числе в отношении клеток лейкоза человека Противоопухолевые свойства юглона изучались различными группами исследователей. В отчете Национального института рака США сообщалось, что юглон в дозах 4.0-10 мг/кг продлевал жизнь экспериментальных мышей с карциносаркомой Уокера-256 и саркомой-180 на 73 и 43% соответственно [J.S.Driscoll, G.F.Hazard, H.B.Wood, et all. Structure-Antitumor Activity Relationships Among Quinone Derivatives. 1974, Cancer Chemother. Repts. Part 2, Vol.4, No 2, P.1-35]. Юглон также проявлял цитотоксический эффект в отношении асцитных клеток карциномы Эрлиха, препятствуя вступлению опухолевых клеток в фазу митоза [Okada Т.А., Roberts E., Brodie A.F. Mitotic abnormalities produced by juglone in Erlich ascities tumor cells. Proc. Soc. Exp.Biol Med, 1967, Vol.126, P.583-588]. Положительной стороной противоопухолевого действия юглона является его способность стимулировать опухолевые клетки к апоптозу, причем этот эффект сохраняется и для клеток, устойчивых к действию других противоопухолевых препаратов [Segura-Aguilar J., Junsson К., Tidifelt U., et all. The cytotoxic effects of 5-OH-l,4-naphthoquinone and 5,8-diOH-l,4-naphthoquinone on doxorubicin-resistant human leukemia cells (HK-60). Leuk. Res., 1992, Vol.16, No 6-7, P.631-637].It is known that a juglon exhibits antitumor activity, including in relation to human leukemia cells. The antitumor properties of a juglon have been studied by various groups of researchers. A report by the US National Cancer Institute reported that a juglon in doses of 4.0-10 mg / kg prolonged the life of experimental mice with Walker-256 carcinosarcoma and 180-sarcoma-180 by 73 and 43%, respectively [J.S. Driscoll, G.F. Hazard, H. B. Wood, et all. Structure-Antitumor Activity Relationships Among Quinone Derivatives. 1974, Cancer Chemother. Repts Part 2, Vol.4, No. 2, P.1-35]. Yuglon also showed a cytotoxic effect against ascitic Ehrlich carcinoma cells, preventing the entry of tumor cells into the mitosis phase [Okada T.A., Roberts E., Brodie A.F. Mitotic abnormalities produced by juglone in Erlich ascities tumor cells. Proc. Soc. Exp. Biol Med, 1967, Vol. 126, P.583-588]. A positive side of the antitumor effect of a juglon is its ability to stimulate tumor cells to apoptosis, and this effect is also preserved for cells resistant to the action of other antitumor drugs [Segura-Aguilar J., K. Junsson, Tidifelt U., et all. The cytotoxic effects of 5-OH-l, 4-naphthoquinone and 5,8-diOH-l, 4-naphthoquinone on doxorubicin-resistant human leukemia cells (HK-60). Leuk. Res., 1992, Vol.16, No. 6-7, P.631-637].

Задача изобретения - расширение арсенала средств, способных избирательно стимулировать апоптоз лейкемических клеток.The objective of the invention is the expansion of the arsenal of tools that can selectively stimulate apoptosis of leukemic cells.

Задача решена применением производных O-гликозидов 5-гидрокси-1,4-нафтохинона (юглона) формулы 1,The problem is solved by the use of derivatives of O-glycosides of 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone (juglon) of formula 1,

где один из радикалов R₁ или R₂ является пер-O-ацетилированным O-монозидным или O-биозидным углеводным радикалом с 1,2-трансконфигурацией O-гликозидной связи, а второй радикал является Н, в качестве средства, стимулирующего апоптоз клеток лейкемии человека.where one of the radicals R ₁ or R ₂ is a per-O-acetylated O-monoside or O-bioside carbohydrate radical with a 1,2-trans configuration of the O-glycosidic bond, and the second radical is H, as a means of stimulating apoptosis of human leukemia cells .

Во втором варианте выполнения изобретения задача решена применением производных O-гликозидов 5-гидрокси-1,4-нафтохинона (юглона) формулы 1, где оба радикала R₁ и R₂ одновременно являются пер-O-ацетилированными O-монозидными или O-биозидными углеводными радикалами с 1,2-трансконфигурацией O-гликозидной связи, в качестве средства, стимулирующего апоптоз клеток лейкемии человека.In a second embodiment of the invention, the problem is solved by the use of 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone (juglon) O-glycoside derivatives of formula 1, where both R ₁ and R ₂ are simultaneously per-O-acetylated O-monoside or O-bioside carbohydrates radicals with 1,2-trans configuration of the O-glycosidic bond, as a means of stimulating apoptosis of human leukemia cells.

В третьем варианте выполнения изобретения задача решена применением производных S-гликозидов 5-гидрокси-1,4-нафтохинона (юглона) или их алкилзамещенных производных формулы 1, где один из радикалов R₁ или R₂ является пер-O-ацетилированным S-монозидным или S-биозидным углеводным радикалом с 1,2-трансконфигурацией S-гликозидной связи, а второй является Н либо линейным алкильным радикалом с углеводородной цепью с 1-8 атомами углерода, в качестве средства, стимулирующего апоптоз клеток лейкемии человека.In a third embodiment of the invention, the problem is solved by the use of 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone (juglone) S-glycoside derivatives or their alkyl substituted derivatives of formula 1, wherein one of the radicals R ₁ or R ₂ is per-O-acetylated S-monoside or S-bioside carbohydrate radical with a 1,2-trans configuration of S-glycosidic bond, and the second is H or a linear alkyl radical with a hydrocarbon chain with 1-8 carbon atoms, as a means of stimulating apoptosis of human leukemia cells.

В четвертом варианте выполнения изобретения задача решена применением производных S-гликозидов 5-гидрокси-1,4-нафтохинона (юглона) или их алкилзамещенных производных формулы 1, где оба радикала одновременно являются пер-O-ацетилированными S-монозидными или S-биозидными углеводными радикалами с 1,2-трансконфигурацией S-гликозидной связи, в качестве средства, стимулирующего апоптоз клеток лейкемии человека.In a fourth embodiment of the invention, the problem is solved by the use of 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone (juglon) S-glycoside derivatives or their alkyl substituted derivatives of formula 1, where both radicals are simultaneously per-O-acetylated S-monoside or S-bioside carbohydrate radicals with the 1,2-trans configuration of the S-glycosidic bond, as a means of stimulating apoptosis of human leukemia cells.

Производные O-гликозидов 5-гидрокси-1,4-нафтохинона (юглона) формулы 1, гдеDerivatives of O-glycosides of 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone (juglon) of formula 1, where

R₁ является O-монозидным (O-биозидным) пер-O-ацетилированным радикалом, a R₂=Н, либо R₁=H, a R₂ является O-монозидным (O-биозидным) пер-O-ацетилированным радикалом, получают путем автокаталитической конденсации эквимольных количеств 1,2-ортоэфиров D-глюкозы и мальтозы с соответствующими 2,5-дигидрокси- и 3,5-дигидрокси-1,4-нафтохинонами согласно патенту [SU 1088346 A1, 30.12.1986].R ₁ is an O-monoside (O-bioside) per-O-acetylated radical, a R ₂ = H, or R ₁ = H, and R ₂ is an O-monoside (O-bioside) per-O-acetylated radical, receive by autocatalytic condensation of equimolar amounts of 1,2-orthoesters of D-glucose and maltose with the corresponding 2,5-dihydroxy and 3,5-dihydroxy-1,4-naphthoquinones according to the patent [SU 1088346 A1, 12/30/1986].

Соединения формулы 1, где оба R₁ и R₂ являются O-монозидным (O-биозидным) пер-O-ацетилированным радикалом, получают аналогично, путем конденсации 2,3,5-тригидрокси-1,4-нафтохинона с 2 молями 1,2-ортоэфиров D-глюкозы или мальтозы [Примеры 1,2]The compounds of formula 1, where both R ₁ and R ₂ are an O-monoside (O-bioside) per-O-acetylated radical, are obtained similarly by condensation of 2,3,5-trihydroxy-1,4-naphthoquinone with 2 moles 1, 2-orthoesters of D-glucose or maltose [Examples 1,2]

Производные S-гликозидов формулы 1, в которых один из радикалов R₁ или R₂, является S-монозидным (S-биозидным) пер-O-ацетилированным радикалом, а другой водородом, либо линейным алкильным радикалом с углеводородной цепью с 1-8 атомами углерода, либо оба радикала R₁, R₂ являются S-монозидными (S-биозидными) пер-O-ацетилированными радикалами получают путем конденсации пер-O-ацетилированных 1-меркаптосахаров с соответствующими 2,3-замещенными галогеналкилюглонами (2,3-дигалогенюглонами) [Полоник С.Г., Толкач A.M., Шенцова Е.Б., Уварова Н.И. Синтез и цитостатическая активность 2-бром-3-алкилюглонов и родственных тиоглюкозидов на их основе. Хим.-фарм. журнал. 1995, №10, с.9-10. Примеры 3-6].Derivatives of S-glycosides of the formula 1 in which one of the radicals R ₁ or R ₂ is an S-monoside (S-bioside) per-O-acetylated radical, and the other is hydrogen, or a linear alkyl radical with a hydrocarbon chain with 1-8 atoms carbon, or both R ₁ , R ₂ are S-monoside (S-bioside) per-O-acetylated radicals obtained by condensation of per-O-acetylated 1-mercaptosugars with the corresponding 2,3-substituted halogenated (2,3-dihalogenated) ) [Polonik S.G., Pusher AM, Shentsova E.B., Uvarova N.I. Synthesis and cytostatic activity of 2-bromo-3-alkyl-glugons and related thioglucosides based on them. Chem.-farm. Journal. 1995, No. 10, pp. 9-10. Examples 3-6].

Соединения формулы 1, в которых R₁=Н, a R₂ является S-монозидным (S-биозидным) пер-O-ацетилированным радикалом, также могут быть получены региоизбирательным присоединением пер-O-ацетилированного 1 -меркаптомонозида (1-меркаптобиозида) к С=С-С=O системе связей юглона, с последующим окислением образующегося интермедиата кислородом воздуха [Отчет о НИР ТИБОХ ДВО РАН. 2001-2005 гг., тема: «Изучение новых морских природных соединений. Выделение, структуры, биосинтез и биологическая активность. Всеросс. научно-техн. информ. центр (ВНТИЦ), инв. №022006 06359. Пример 7].Compounds of formula 1 in which R ₁ = H and R ₂ is an S-monoside (S-bioside) per-O-acetylated radical can also be prepared by regio-selective addition of the per-O-acetylated 1-mercaptomonoside (1-mercaptobioside) to С = С-С = O of the juglone bond system, followed by oxidation of the resulting intermediate with atmospheric oxygen [Report on SRW TIBOCH FEB RAS. 2001-2005, topic: “The study of new marine natural compounds. Isolation, structures, biosynthesis and biological activity. All-Russian. scientific and technical inform. Center (VNTIC), inv. No. 022006 06359. Example 7].

Сведения, подтверждающие возможность получения гликозидов формулы 1.Information confirming the possibility of obtaining glycosides of the formula 1.

Пример 1. 2,3-Бис(2',3',4',6'-тетра-O-ацетил-β-D-глюкопиранозилокси)-5-гидрокси-1,4-нафтохинон. 2,3,5-Тригидрокси-1,4-нафтохинон, 103 мг (0.5 ммоль), 3,4,6-три-O-ацетил-1,2-O-(1-третбутоксиэтилиден)-α-D-глюкопираноза, 404 мг (1.0 ммоль) и 10 мл абс. хлорбензола кипятили 1 час в колбе с обратным холодильником, защищенным хлоркальциевой трубкой. Растворитель упарили в вакууме, из остатка препаративной тонкослойной хроматографией (ПТСХ) на стеклянной пластине размерами 20×20 см на незакрепленном слое SiO₂ в системе растворителей гексан-бензол-ацетон (2:1:1 v/v), двухкратное проявление, выделили кристаллический продукт реакции желтого света с R_f=0.41. После перекристаллизации из смеси бензол-МеОН получили желтые иглы с т.пл. 163-164°С. Вес 176 мг (40%). Спектр ЯМР ¹Н (300 МГц, CDCl₃, δ, м.д.): 2.01, 2.03, 2.04(2), 2.05(2), 2.09, 2.10 (8 × АсО), 3.83 м. (2Н, 2Н^5'), 4.12 м, (2Н, 2Н^6'), 4.28 м, (2Н, 2Н^6'), 5.20-5.35 м, (6Н, 2Н^2', 2Н³, 2Н^4'), 5.76 д,Example 1. 2,3-Bis (2 ', 3', 4 ', 6'-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosyloxy) -5-hydroxy-1,4-naphthoquinone. 2,3,5-Trihydroxy-1,4-naphthoquinone, 103 mg (0.5 mmol), 3,4,6-tri-O-acetyl-1,2-O- (1-tert-butoxyethylidene) -α-D-glucopyranose , 404 mg (1.0 mmol) and 10 ml abs. chlorobenzene was boiled for 1 hour in a flask with a reflux condenser protected by a calcium chloride tube. The solvent was evaporated in vacuo, preparative thin-layer chromatography (PTLC) on a glass plate measuring 20 × 20 cm on an unsecured SiO ₂ layer in a solvent system of hexane-benzene-acetone (2: 1: 1 v / v), two-fold development, isolated crystalline yellow light reaction product with R _f = 0.41. After recrystallization from a mixture of benzene-MeOH received yellow needles with so pl. 163-164 ° C. Weight 176 mg (40%). ¹ H NMR spectrum (300 MHz, CDCl ₃ , δ, ppm): 2.01, 2.03, 2.04 (2), 2.05 (2), 2.09, 2.10 (8 × AcO), 3.83 m. (2H, 2H ^{5 '} ), 4.12 m, (2Н, 2Н ^6' ), 4.28 m, (2Н, 2Н ^{6 '} ), 5.20-5.35 m, (6Н, 2Н ^2' , 2Н ³ , 2Н ^{4 '} ), 5.76 d,

(1Н, H^1', J=7.4 Гц), 5.91 д, (1Н, Н^1', J=7.2 Гц), 7.29 м, (1Н, Н⁶), 7.62 (м, 2Н, Н⁸ и Н⁷, 11.75 с, (1 Н, С⁵-ОН). ИК-спектр (CHCl₃, ν, см^-1): 1756 (СН₃СООR), 1668 (С=O), 1637 (С=O), 1458, 1370, 1249, 1191, 1089, 1041. Найдено, %: С 52.56; Н 5.03. С₃₈Н₄₂O₂₃. Вычислено, %: С 52.66; Н 4.88.(1H, H ^{1 '} , J = 7.4 Hz), 5.91 d, (1H, H ^1' , J = 7.2 Hz), 7.29 m, (1H, H ⁶ ), 7.62 (m, 2H, H ⁸ and H ⁷ , 11.75 s, (1 H, C ⁵ -O H ). IR spectrum (CHCl ₃ , ν, cm ^-1 ): 1756 (CH ₃ СOOR), 1668 (С = O), 1637 (С = O), 1458, 1370, 1249, 1191, 1089, 1041. Found,%: C 52.56; H 5.03. C ₃₈ H ₄₂ O _23. Calculated,%: C 52.66; H 4.88.

Пример 2. 2,3-Бис-[2',3',6'-три-O-ацетил-4'-O-(2'',3'',4'',6''-тетра-O-ацетил-α-D-глюкопиранозил)-β-D-глюкопиранозилокси)]-5-гидрокси-1,4-нафтохинон. 2,3,5-Тригидрокси-1,4-нафтохинон, 42 мг (0.2 ммоль), 3,6-ди-O-ацетил-1,2-O-(1-метокси-этилиден)-4-O-(2,3,4,6-тетра-O-ацетил-α-D-глюкопиранозил)-α-D-глюкопиранозу, 260 мг (0.4 ммоль) и 6 мл абс. хлорбензола кипятили 1 час в колбе с обратным холодильником, защищенным хлоркальциевой трубкой. Растворитель упарили в вакууме, из остатка ПТСХ на стеклянной пластине размерами 20×20 см на незакрепленном слое SiO₂ в системе растворителей гексан-бензол-ацетон (2:1:1 v/v), двухкратное проявление, выделили продукт реакции с R_f=0.21, светло желтый аморфный порошок, вес 212 г (86%), Спектр ¹Н ЯМР (300 МГц, СDСl₃, δ, м.д., J/Гц): 2.01(2), 2.02(3), 2.06(7), 2.11(2), все с, 3Н (14 × ОАс); 3.82 м, (2Н, углеводные протоны), 3.94-4.13 м, (6Н, углеводные протоны), 4.19-4.31 м, (4Н, углеводные протоны), 4.50 м, (2Н, углеводные протоны), 4.87 м, (2Н, углеводные протоны), 5.03-5.17 м, (4Н, углеводные протоны), 5.23-5.40 мд, (4Н, углеводные протоны), 5.43 д, (1Н, Н^1'', J_1'',2''=3.7 Гц), 5.44 д, (1Н, Н^1'', J_1'',2''=3.8 Гц), 5.65 д, (1Н, Н^1', J_1',2'=6.9 Гц), 5.81 д, (1Н, Н^1', J_1',2'=6.9 Гц), 7.29 м, (1Н, Н⁶), 7.62 м, (2Н, Н⁸ и Н⁷), 11.74 с, (1Н, С⁵-ОН). ИК-спектр (СНСl₃), ν/см^-1: 1754(COOR), 1672(C=O). 1456. Найдено (%): С, 51.87; Н, 5.12. С₆₂Н₇₄O₃₉. Вычислено (%): С, 51.60; Н, 5.17.Example 2. 2,3-Bis- [2 ', 3', 6'-tri-O-acetyl-4'-O- (2``, 3 '', 4``, 6 '' - tetra-O -acetyl-α-D-glucopyranosyl) -β-D-glucopyranosyloxy)] - 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone. 2,3,5-Trihydroxy-1,4-naphthoquinone, 42 mg (0.2 mmol), 3,6-di-O-acetyl-1,2-O- (1-methoxy-ethylidene) -4-O- ( 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-α-D-glucopyranosyl) -α-D-glucopyranose, 260 mg (0.4 mmol) and 6 ml abs. chlorobenzene was boiled for 1 hour in a flask with a reflux condenser protected by a calcium chloride tube. The solvent was evaporated in vacuo, from a PTLC residue on a 20 × 20 cm glass plate on an unsecured SiO ₂ layer in a solvent system of hexane-benzene-acetone (2: 1: 1 v / v), a two-fold development, the reaction product was isolated with R _f = 0.21, light yellow amorphous powder, weight 212 g (86%), ¹ H NMR spectrum (300 MHz, CDCl ₃ , δ, ppm, J / Hz): 2.01 (2), 2.02 (3), 2.06 ( 7), 2.11 (2), all s, 3H (14 × OAc); 3.82 m, (2Н, carbohydrate protons), 3.94-4.13 m, (6Н, carbohydrate protons), 4.19-4.31 m, (4Н, carbohydrate protons), 4.50 m, (2Н, carbohydrate protons), 4.87 m, (2Н, carbohydrate protons), 5.03-5.17 m, (4Н, carbohydrate protons), 5.23-5.40 ppm, (4Н, carbohydrate protons), 5.43 d, (1Н, Н ^{1 ''} , J 1`` _{, 2 ''} = 3.7 Hz ), 5.44 d, (1H, H ^1`` , J _{1 '', 2 ''} = 3.8 Hz), 5.65 d, (1H, H ^{1 '} , J _{1', 2 '} = 6.9 Hz), 5.81 d, (1Н, Н ^{1 '} , J _{1', 2 '} = 6.9 Hz), 7.29 m, (1Н, Н ⁶ ), 7.62 m, (2Н, Н ⁸ and Н ⁷ ), 11.74 s, (1Н, С ⁵ - About N ). IR spectrum (CHCl ₃ ), ν / cm ^-1 : 1754 (COOR), 1672 (C = O). 1456. Found (%): C, 51.87; H, 5.12. C ₆₂ H ₇₄ O ₃₉ . Calculated (%): C, 51.60; H, 5.17.

Пример 3. 3-(Тетра-O-ацетил-β-D-глюкопиранозил-1-тио)-2-этил-5-гидрокси-1,4-нафтохинон. К смеси 2-этил-3-бром-5-гидрокси-1,4-нафтохинона 120 мг (0.42 ммоль), тетра-O-ацетил-1-тио-β-D-глюкопиранозы, 153 мг (0.42 ммоль), в 5 мл сухого ацетонитрила прибавляли 140 мг (1.0 ммоль) тонкорастертого К₂СО₃ и перемешивали 40 мин при 25°С, контролируя ход реакции ТСХ. Неорганические соли отфильтровали, осадок промыли толуолом, фильтрат упарили. Остаток кристаллизовали из смеси бензол - абс. МеОН и получили светло-коричневые иглы с т.пл. 189-191°С. Вес 143 мг (61%). Спектр ЯМР ¹Н (CDCl₃, δ, м.д.): 1.87 т (3Н, СН₂СН ₃, J=7.5 Гц), 1.87, 2.02, 2.03, 2.12 (4 × АсО), 2.89 кв, (2Н, СH ₂СН₃), 3.67 ддд, (1Н, Н^5', J_4',5'=9.8 Гц, J_5',6a'=1.9 Гц, J_5',6b'=5.0 Гц), 4.04 дд, (1Н, 1Н^6', J_6а',6b'=12.0 Гц), 4.12 дд. (2Н, 2Н^6'), 5.08 т, (1Н, Н^4', J_3',4'=9.2 Гц), 5.12 т (1Н, H^2', J_2',3'=9.2 Гц), 5.27 т, (1Н, Н^3'), 5.46 д. (1Н, Н^1', J_1',2'=10.0 Гц), 7.60 д, (1Н, Н⁶, J_6,7=7.7 Гц), 7.66 м, (2Н, Н⁸ и Н⁷), 11.97 с, (1Н, C⁵-OH). ИК-спектр (СНСl₃, ν, см^-1): 1755 (СН₃СООR), 1660 (С=O), 1633. Найдено, %: С 55.21; Н 5.03; S 5.62. C₂₆H₂₈O₁₂S. Вычислено, %: С 55.31; Н 5.00; S 5.68.Example 3. 3- (Tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl-1-thio) -2-ethyl-5-hydroxy-1,4-naphthoquinone. To a mixture of 2-ethyl-3-bromo-5-hydroxy-1,4-naphthoquinone 120 mg (0.42 mmol), tetra-O-acetyl-1-thio-β-D-glucopyranose, 153 mg (0.42 mmol), in 5 mg of dry acetonitrile was added 140 mg (1.0 mmol) of finely ground K ₂ CO ₃ and stirred for 40 min at 25 ° C, monitoring the progress of the TLC reaction. Inorganic salts were filtered off, the precipitate was washed with toluene, and the filtrate was evaporated. The residue was crystallized from benzene - abs. Meon and got a light brown needle with so pl. 189-191 ° C. Weight 143 mg (61%). ¹ H NMR spectrum (CDCl ₃ , δ, ppm): 1.87 t (3H, CH ₂ C H ₃ , J = 7.5 Hz), 1.87, 2.02, 2.03, 2.12 (4 × AcO), 2.89 q, ( 2H, C H ₂ CH ₃ ), 3.67 ddd, (1H, H ^{5 '} , J _{4', 5 '} = 9.8 Hz, J _{5', 6a '} = 1.9 Hz, J _{5', 6b '} = 5.0 Hz), 4.04 dd, (1H, 1H ^{6 '} , J _{6a', 6b '} = 12.0 Hz), 4.12 dd. (2H, 2H ^{6 '} ), 5.08 t, (1H, H ^4' , J _{3 ', 4'} = 9.2 Hz), 5.12 t (1H, H ^{2 '} , J _{2', 3 '} = 9.2 Hz), 5.27 t, (1H, H ^{3 '} ), 5.46 d. (1H, H ^1' , J _{1 ', 2'} = 10.0 Hz), 7.60 d, (1H, H ⁶ , J _6.7 = 7.7 Hz), 7.66 m, (2H, H ⁸ and H ⁷ ), 11.97 s, (1H, C ⁵ -O H ). IR spectrum (CHCl ₃ , ν, cm ^-1 ): 1755 (CH ₃ COOR), 1660 (C = O), 1633. Found,%: C 55.21; H 5.03; S 5.62. C ₂₆ H ₂₈ O ₁₂ S. Calculated,%: C 55.31; H 5.00; S 5.68.

Пример 4. 2-[2',3',6'-Три-O-ацетил-4'-O-(2'',3'',4'',6''-тетра-O-ацетил-α-D-глюкопиранозил)-β-D-глюкопиранозил-1'-тио)]-3-метил-5-гидрокси-1,4-нафтохинон. К суспензии 90 мг (0.33 ммоль) 2-бром-3-метил-5-гидрокси-1,4-нафто-хинона, 217 мг (0.33 ммоль) 2',3',6'-три-O-ацетил-4'-O-(2'',3'',4'',6''-тетра-O-ацетил-α-D-глюкопиранозил)-1-тио-β-D-глюкопиранозы в 5 мл сухого ацетона прибавляли 47 мг (0.33 ммоль) тонкорастертого К₂СО₃ и перемешивали 1 час при 25°С. Неорганические соли отфильтровали, осадок промыли ацетоном, фильтрат упарили. Остаток кристаллизовали из абс. МеОН и получили желтые кристаллы. Вес 206 мг (75%). Т. пл. 185-187°С. Спектр ¹Н ЯМР (300 МГц, CDCl₃, δ, м.д., J/Гц): 1.94, 2.00, 2.01, 2.02, 2.05, 2.06, 2.01 (7 × ОАс), 2.32 с, (3Н, АrСН₃), 3.92 дцд, (1Н, Н^5'', J_4'',5''=9.2.0 Гц, J_5'',6''=2.4 Гц, J_5'',6''=2.0 Гц), 3.69 ддд, (1Н, Н^5', J_4',5'=10.0 Гц, J_5',6'=4.0 Гц, J_5',6'=5.0 Гц, 3.96 т (1Н, Н^4'', J_3'',4''=5.3 Гц), 4.03 дд, (1Н, Н^6'', J_6'',6''=10.7 Гц), 4.11 дд, (1Н Н^6', J_6',6'=12.5), 4.24 дд, (1Н, Н^6'), J=9.7 Гц, J=8.7 Гц); 4.35 дд, (1Н, Н^6''), 4.85 д.д, (1Н, Н^2'', J_2'',3''=10.5 Гц), 4.97 дд, (Н^2', J_2',3'=10.5 Гц), 5.04 т, (1Н, Н^4', J_3',4'=9.0 Гц), 5.31 дд, (1Н, Н^3'), 5.33 д, (1Н, Н^3''), 5.39 д (1Н, Н^1'', J_1'',2''=4.2 Гц), 5.62 д (1Н, Н^1', J_1',2'=10.0 Гц), 7.25 дд, (1Н, Н⁶, J_6,7=7.5 Гц, J_6,8=2.0 Гц), 7.51 т (1Н⁸, J_7,8=7.5 Гц), 7.65 дд, (1Н⁷); 12.05 с, (1Н, С⁵-ОН). ИК-спектр (СНСl₃), ν/см^-1: 1755 (COOR), 1667(СО), 1635, 1593, 1457, 1368, 1274, 1248, 1044. Найдено (%): С, 53.95; Н, 4.90; S, 4.01. C₃₇H₄₁O₁₉S. Вычислено (%): С, 54.08; Н, 5.03; S, 3.90.Example 4. 2- [2 ', 3', 6'-Tri-O-acetyl-4'-O- (2``, 3 '', 4``, 6 '' - tetra-O-acetyl-α -D-glucopyranosyl) -β-D-glucopyranosyl-1'-thio)] - 3-methyl-5-hydroxy-1,4-naphthoquinone. To a suspension of 90 mg (0.33 mmol) of 2-bromo-3-methyl-5-hydroxy-1,4-naphthoquinone, 217 mg (0.33 mmol) of 2 ', 3', 6'-tri-O-acetyl-4 '-O- (2``, 3'', 4``, 6''- tetra-O-acetyl-α-D-glucopyranosyl) -1-thio-β-D-glucopyranose in 5 ml of dry acetone was added 47 mg (0.33 mmol) of finely ground K ₂ CO ₃ and stirred for 1 hour at 25 ° C. Inorganic salts were filtered off, the precipitate was washed with acetone, and the filtrate was evaporated. The residue was crystallized from abs. Meon and received yellow crystals. Weight 206 mg (75%). T. pl. 185-187 ° C. ¹ H NMR spectrum (300 MHz, CDCl ₃ , δ, ppm, J / Hz): 1.94, 2.00, 2.01, 2.02, 2.05, 2.06, 2.01 (7 × OAc), 2.32 s, (3H, ArCH ₃ ), 3.92 dCD (1H, H ^{5 '',} J _{4 '', 5 ''} = 9.2.0 Hz, J _{5 '', 6 '=} 2.4 Hz, J _5'',6' = 2.0 Hz ), 3.69 ddd, (1H, H ^{5 '} , J _{4', 5 '} = 10.0 Hz, J _{5', 6 '} = 4.0 Hz, J _{5', 6 '} = 5.0 Hz, 3.96 t (1H, H ^4'' , J _3'',4'' = 5.3 Hz), 4.03 dd, (1H, H ^6`` , J _6'',6'' = 10.7 Hz), 4.11 dd, (1H H ^6' , J _{6 ', 6'} = 12.5), 4.24 dd, (1H, H ^{6 '} ), J = 9.7 Hz, J = 8.7 Hz); 4.35 dd (1H, H ^{6 '),} 4.85 dd (1H, H ^2'', J _{2', 3 ''} = 10.5 Hz), 4.97 dd (H ^{2 ',} J _{2', 3 '} = 10.5 Hz), 5.04 t, (1H, H ^4' , J _{3 ', 4'} = 9.0 Hz), 5.31 dd, (1H, H ^{3 '} ), 5.33 d, (1H, H ^3'' ) , 5.39 d (1H, H ^1`` , J _{1 '', 2 ''} = 4.2 Hz), 5.62 d (1H, H ^{1 '} , J _{1', 2 '} = 10.0 Hz), 7.25 dd, (1H, H ⁶ , J _6.7 = 7.5 Hz, J _6.8 = 2.0 Hz), 7.51 t (1H ⁸ , J _7.8 = 7.5 Hz), 7.65 dd, (1H ⁷ ); 12.05 s, (1H, C ⁵ -O H ). IR spectrum (CHCl ₃ ), ν / cm ^-1 : 1755 (COOR), 1667 (CO), 1635, 1593, 1457, 1368, 1274, 1248, 1044. Found (%): C, 53.95; H, 4.90; S, 4.01. C ₃₇ H ₄₁ O ₁₉ S. Calculated (%): C, 54.08; H, 5.03; S, 3.90.

Пример 5. 2,3-Бис(2',3',4'-три-O-ацетил-β-D-ксилопиранозил-1-тио)-5-гидрокси-1,4-нафтохинон. К суспензии 243 мг (1.0 ммоль) 2,3-дихлор-5-гидрокси-1,4-нафтохинона, 582 мг (2 ммоль) три-O-ацетил-1-тио-β-D-ксилопиранозы в 20 мл сухого ацетона прибавляли 420 мг (3 ммоль) тонкорастертого К₂СО₃ и перемешивали 0.5 час при 25°С, контролируя ход реакции ТСХ. Неорганические соли отфильтровали, осадок промыли ацетоном, фильтрат упарили. Остаток кристаллизовали из смеси бензол - абс. МеОН и получили светло-коричневые иглы с т.пл. 138-140°С. Вес 540 мг (72%), Спектр ¹Н ЯМР (300 МГц, СDСl₃, δ, м.д., J/Гц): 2.04, 2.06, 2.08, 2.09, 2.11 (2) (6 × ОАс), 3.45 д.д, (1Н, Н^5a', J_4',5а'=7.8 Гц, J_5a',5b'=11.9 Гц), 3.47 д.д, (1 Н, H^5a', J_4',5a'=7.38 Гц, J_5a',5b'=11.9 Гц), 4.19 д.д, (1H, Н^5b', J_4',5b'=4.9 Гц), 4.27 д.д, (1H, H^5b', J_4',5b'=4.4 Гц), 4.95 м, (2Н, 2Н^4'); 5.07 т, (1H, H^2', J_1'2'=8.1 Гц; J_2'3'=7.9 Гц), 5.09 т, (1H, H^2', J_1'2'=7.0 Гц, J_2'3'=7.9 Гц), 5.19 т,Example 5. 2,3-Bis (2 ', 3', 4'-tri-O-acetyl-β-D-xylopyranosyl-1-thio) -5-hydroxy-1,4-naphthoquinone. To a suspension of 243 mg (1.0 mmol) of 2,3-dichloro-5-hydroxy-1,4-naphthoquinone, 582 mg (2 mmol) of tri-O-acetyl-1-thio-β-D-xylopyranose in 20 ml of dry acetone 420 mg (3 mmol) of finely ground K ₂ CO _{3 were} added and stirred for 0.5 hour at 25 ° C, monitoring the progress of the TLC reaction. Inorganic salts were filtered off, the precipitate was washed with acetone, and the filtrate was evaporated. The residue was crystallized from benzene - abs. Meon and got a light brown needle with so pl. 138-140 ° C. Weight 540 mg (72%), ¹ H NMR Spectrum (300 MHz, CDCl ₃ , δ, ppm, J / Hz): 2.04, 2.06, 2.08, 2.09, 2.11 (2) (6 × OAc), 3.45 dd, (1H, H ^{5a '} , J _{4', 5a '} = 7.8 Hz, J _{5a', 5b '} = 11.9 Hz), 3.47 dd, (1 H, H ^5a' , J _{4 ', 5a '} = 7.38 Hz, J _{5a', 5b '} = 11.9 Hz), 4.19 dd, (1H, H ^5b' , J _{4 ', 5b'} = 4.9 Hz), 4.27 dd, (1H, H ^{5b '} , J _{4 ', 5b'} = 4.4 Hz), 4.95 m, (2H, 2H ^{4 '} ); 5.07 t, (1H, H ^{2 '} , J _1'2' = 8.1 Hz; J _{2'3 '} = 7.9 Hz), 5.09 t, (1H, H ^2' , J _{1'2 '} = 7.0 Hz, J _{2 '3'} = 7.9 Hz), 5.19 t,

(1Н, Н^3'), 5.22 т, (1Н, Н^3'); 5.69 д, (1Н, Н^1' J_1'2=7.0 Гц); 5.89 д, (1Н, H^1' J_1'2'=8.1 Гц), 7.29 м, (1Н, Н⁶), 7.62 м, (2Н, Н⁸ и Н⁷), 11.83 с, (1Н, С⁵-ОН). ИК-спектр (СНСl₃), ν/см^-1: 1753 (COOR), 1670 (CO), 1594 (C-C), 1558. Найдено (%): С, 51.10; Н, 4.72; S, 8.61. С₃₂Н₃₄O₁₇S₂. Вычислено (%): С, 50.93; Н, 4.54; S, 8.50.(1H, H ^{3 '} ), 5.22 t, (1H, H ^3' ); 5.69 d, (1H, H ^{1 '} J _1'2 = 7.0 Hz); 5.89 d, (1Н, H ^{1 '} J _1'2' = 8.1 Hz), 7.29 m, (1Н, Н ⁶ ), 7.62 m, (2Н, Н ⁸ and Н ⁷ ), 11.83 s, (1Н, С ⁵ -O N ). IR spectrum (CHCl ₃ ), ν / cm ^-1 : 1753 (COOR), 1670 (CO), 1594 (CC), 1558. Found (%): C, 51.10; H, 4.72; S, 8.61. C ₃₂ H ₃₄ O ₁₇ S ₂ . Calculated (%): C, 50.93; H, 4.54; S, 8.50.

Пример 6. 2,3-Бис-[2',3',6'-три-O-ацетил-4'-O-(2'',3'',4'',6''-тетра-O-ацетил-α-D-глюкопиранозил)-β-D-глюкопиранозил-1-тио)]-5-гидрокси-1,4-нафтохинон. К суспензии 24 мг (0.1 ммоль) 2,3-дихлор-5-гидрокси-1,4-нафтохинона, 130 мг (0.2 ммоль) 2',3',6'-три-O-ацетил-4'-O-(2'',3'',4'',6''-тетра-O-ацетил-α-D-глюкопиранозил)-1-тио-β-D-глюкопиранозы в 5 мл сухого ацетонитрила прибавляли 25 мг (0.2 ммоль) тонкорастертого К₂СО₃ и перемешивали 40 мин при 25°С, контролируя ход реакции ТСХ. Неорганические соли отфильтровали, осадок промыли толуолом, фильтрат упарили в вакууме, из остатка ПТСХ на стеклянной пластине размерами 20×20 см на незакрепленном слое SiO₂ в системе растворителей гексан-бензол-ацетон (2:1:1 v/v), двухкратное проявление, выделили продукт реакции с R_f=0.15, желтый аморфный порошок, вес 102 мг (69%). Спектр ¹Н ЯМР (300 МГц, СDСl₃, δ, м.д., J/Гц): 2.01(2), 2.02(3), 2.06(7), 2.11(2), все с, 3Н (14 × ОАс); 3.73 м, (2 Н, углеводные протоны), 3.89-4.15 м, (6Н, углеводные протоны), 4.25 м, (4Н, углеводные протоны), 4.87 м, (3Н, углеводные протоны), 5.15 м, (3Н, углеводные протоны), 5.24-5.46 м, (6Н, углеводные протоны), 5.52 д,Example 6. 2,3-Bis- [2 ', 3', 6'-tri-O-acetyl-4'-O- (2``, 3 '', 4``, 6 '' - tetra-O -acetyl-α-D-glucopyranosyl) -β-D-glucopyranosyl-1-thio)] - 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone. To a suspension of 24 mg (0.1 mmol) of 2,3-dichloro-5-hydroxy-1,4-naphthoquinone, 130 mg (0.2 mmol) of 2 ', 3', 6'-tri-O-acetyl-4'-O- (2``, 3 '', 4``, 6 '' - tetra-O-acetyl-α-D-glucopyranosyl) -1-thio-β-D-glucopyranose in 5 ml of dry acetonitrile was added 25 mg (0.2 mmol ) finely ground K ₂ CO ₃ and stirred for 40 min at 25 ° C, monitoring the progress of the TLC reaction. Inorganic salts were filtered off, the precipitate was washed with toluene, the filtrate was evaporated in vacuo, from the PTLC residue on a 20 × 20 cm glass plate on an unsecured SiO ₂ layer in a hexane-benzene-acetone solvent system (2: 1: 1 v / v), two-fold manifestation , isolated the reaction product with R _f = 0.15, yellow amorphous powder, weight 102 mg (69%). ¹ H NMR spectrum (300 MHz, CDCl ₃ , δ, ppm, J / Hz): 2.01 (2), 2.02 (3), 2.06 (7), 2.11 (2), all s, 3H (14 × OAc); 3.73 m, (2 Н, carbohydrate protons), 3.89-4.15 m, (6Н, carbohydrate protons), 4.25 m, (4Н, carbohydrate protons), 4.87 m, (3Н, carbohydrate protons), 5.15 m, (3Н, carbohydrate protons), 5.24-5.46 m, (6Н, carbohydrate protons), 5.52 d,

(1Н, Н^1'', J_1'',2''=4.1 Гц), 5.55 д, (1Н, Н^1'', J_1'',2''=3.1 Гц), 5.60 д, (1Н, Н^1', J_1',2'=10.1 Гц), 5.85 д, (1Н, Н^1', J_1',2'=10.1 Гц), 7.29 м, (1Н, Н⁶), 7.64 м, (2Н, Н⁸ и Н⁷), 11.84 с, (1 Н, С⁵-ОН). ИК-спектр (СНСl₃), ν/см^-1: 1755(COOR), 1670(C=0), 1632, 1454. Найдено (%): С, 50.50; Н, 4.92; S, 4.56. C₆₂H₇₄O₃₇S₂. Вычислено (%): С, 50.47; Н, 5.06; S, 4.35(1H, H ^1`` , J _{1 '', 2 ''} = 4.1 Hz), 5.55 d, (1H, H ^1`` , J _{1 '', 2 ''} = 3.1 Hz), 5.60 d, (1H , Н ^{1 '} , J _{1', 2 '} = 10.1 Hz), 5.85 d, (1Н, Н ^1' , J _{1 ', 2'} = 10.1 Hz), 7.29 m, (1Н, Н ⁶ ), 7.64 m, (2H, H ⁸ and H ⁷ ), 11.84 s, (1 H, C ⁵ -O H ). IR spectrum (CHCl ₃ ), ν / cm ^-1 : 1755 (COOR), 1670 (C = 0), 1632, 1454. Found (%): C, 50.50; H, 4.92; S, 4.56. C ₆₂ H ₇₄ O ₃₇ S ₂ . Calculated (%): C, 50.47; H, 5.06; S, 4.35

Пример 7. 3-(2',3',4',6'-Тетра-O-ацетил-β-D-галактопиранозил-1'-тио)-5-гидрокси-1,4-нафтохинон. К раствору 364 мг (1.0 ммоль) тетра-O-ацетил-1-тио-β-D-галактопиранозы в 40 мл теплого (40-45°С) спирта добавили 174 мг (1.0 ммоль) тонкорастертого юглона и перемешивали в открытой колбе. Наблюдали быстрое изменение цвета реакционной смеси от светло-желтой до темно-коричневой. Спустя 15-20 мин началось выпадение желтого осадка 3-ацетилтиогалактозида юглона. Реакционную смесь перемешивали 4 час в открытом сосуде для окисления промежуточно образующегося гидрохинонового интермедиата, выдерживали ночь в открытом сосуде при комнатной температуре, выпавший осадок отфильтровали, промыли холодным этанолом и получили 3-ацетилтиогалактозид юглона. Выход 414 мг (79%). Т.пл. 226-228°С. Спектр ¹Н ЯМР (500 МГц, СDСl₃, δ, м.д., У/Гц): 2.01, 2.08, 2.12, 2.24 (4 × ОАс); 3.85 м, (1Н, Н^5'), 4.01 м, (1Н, Н^6'), 4.20 д.д, (1Н^6', J_5',6a'=4.5 Гц; J_6a',5b'=11.3 Гц), 4.88 д. (1Н, Н^1', J_1'2'=10.0 Гц). 14 д.д, (1Н, Н^3', J_3'4'=3.3 Гц, J_2'3'=9.9 Гц), 5.52 д, (1Н, Н^4'), 5.56 т, (1Н, Н^2'), 7.06 с, 1Н, Н²), 7.25 д.д, (1Н, Н⁶, J_6,7=8.1 Гц, J_6,8=1.5 Гц), 7.61 д.д, (1H⁸, J_7,8=7.5 Гц), 7.65 т, (1Н⁷); 11.56 с, (1Н, С⁵-ОН). ИК-спектр (СНСl₃), ν/см^-1: 1754 (COOR), 1655, 1634 (СО), 1567 (С=С), 1456, 1370, 1270. Найдено (%): С, 52.51; Н, 4.53; S, 6.05. C₂₃H₂₄O₁₂S. Вычислено (%): С, 52.67; Н, 4.61; S, 6.11.Example 7. 3- (2 ', 3', 4 ', 6'-Tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl-1'-thio) -5-hydroxy-1,4-naphthoquinone. To a solution of 364 mg (1.0 mmol) of tetra-O-acetyl-1-thio-β-D-galactopyranose in 40 ml of warm (40-45 ° С) alcohol, 174 mg (1.0 mmol) of finely ground juglon was added and stirred in an open flask. A rapid color change of the reaction mixture was observed from light yellow to dark brown. After 15-20 minutes, a yellow precipitate of 3-acetylthiogalactoside juglone began to precipitate. The reaction mixture was stirred for 4 hours in an open vessel to oxidize the intermediate hydroquinone intermediate, kept at room temperature overnight, the precipitate was filtered off, washed with cold ethanol and yuglon 3-acetylthiogalactoside was obtained. Yield 414 mg (79%). Mp 226-228 ° C. ¹ H NMR spectrum (500 MHz, CDCl ₃ , δ, ppm, V / Hz): 2.01, 2.08, 2.12, 2.24 (4 × OAc); 3.85 m, (1H, H ^{5 '} ), 4.01 m, (1H, H ^6' ), 4.20 dd, (1H ^{6 '} , J _{5', 6a '} = 4.5 Hz; J _{6a', 5b '} = 11.3 Hz), 4.88 d. (1H, H ^{1 '} , J _1'2' = 10.0 Hz). 14 dd, (1H, H ^{3 '} , J _3'4' = 3.3 Hz, J _{2'3 '} = 9.9 Hz), 5.52 d, (1H, H ^4' ), 5.56 t, (1H, H ^{2 '} ), 7.06 s, 1H, H ² ), 7.25 dd, (1H, H ⁶ , J _6.7 = 8.1 Hz, J _6.8 = 1.5 Hz), 7.61 dd, (1H ⁸ , J _7.8 = 7.5 Hz), 7.65 t, (1H ⁷ ); 11.56 s, (1H, C ⁵ -O H ). IR spectrum (CHCl ₃ ), ν / cm ^-1 : 1754 (COOR), 1655, 1634 (CO), 1567 (C = C), 1456, 1370, 1270. Found (%): C, 52.51; H, 4.53; S, 6.05. C ₂₃ H ₂₄ O ₁₂ S. Calculated (%): C, 52.67; H, 4.61; S, 6.11.

Полученные вышеописанными способами, исследованные и заявляемые по новому назначению ацетилированные О- и S-гликозиды ряда 5-гидрокси-1,4-нафтохинона (юглона) сведены в таблицу 1.Obtained by the above methods, investigated and claimed for a new purpose, acetylated O- and S-glycosides of the 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone (juglon) series are summarized in table 1.

Таблица 1Table 1 Исследованные О- и S-гликозиды ряда 5-гидрокси-1,4-нафтохинона (юглона)The investigated O- and S-glycosides of the series 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone (juglon)

Connection No. Deputies Deputy structures one R ₁ = R ₂ = N (juglon)

2 R ₁ = Ac ₄ GlcO; R ₂ = N 3 R ₁ = H; R ₂ = Ac ₄ GlcO four R ₁ = R ₂ = Ac ₄ GlcO 5 R ₁ = Ac ₇ MaltO; R ₂ = H 6 R ₁ = H; R ₂ = Ac ₇ MaltO 7 R ₁ = Ac ₄ GlcS; R ₂ = H 8 R ₁ = H; R ₂ = Ac ₄ GlcS 9 R ₁ = R ₂ = Ac ₄ GlcS 10 R ₁ = Ac ₄ GlcS; R ₂ = Me eleven R ₁ = H; R ₂ = Ac ₄ GalS 12 R ₁ = H; R ₂ = Ac ₄ ManS 13 R ₁ = H; R ₂ = Ac ₃ XylS fourteen R ₁ = H; R ₂ = Ac ₃ -L-AraS fifteen R ₁ = H; R ₂ = Ac ₇ MaltS

Известно, что ацетилированные O-гликозиды юглона обладают антигрибковой активностью [Полоник С.Г., Толкач A.M., Стехова С.И. и др. Синтез и изучение противогрибковой активности ацетилированных гликозидов гидроксиюглонов. Хим.-фарм. журнал. 1992, №6, с.31-32]. Для этих соединений и ацетилированных S-гликозидов юглона также характерна противоопухолевая и иммуностимулирующая активность [Полоник С.Г., Прокофьева Н.Г., Агафонова И.Г. и др. Противоопухолевая и иммуностимулирующая активность О- и S-гликозидов 5-гидрокси-14-нафтохинона (юглона). Хим.-фарм. журн., 2003, Т. 37, №8, с.3-4].It is known that acetylated Oglycosides of the juglone possess antifungal activity [Polonik S.G., Tolkach A.M., Stekhova S.I. et al. Synthesis and study of the antifungal activity of acetylated glycosides of hydroxyglucones. Chem.-farm. Journal. 1992, No. 6, p.31-32]. These compounds and acetylated S-glycosides of the juglone are also characterized by antitumor and immunostimulating activity [Polonik S.G., Prokofieva N.G., Agafonova I.G. et al. Antitumor and immunostimulating activity of O- and S-glycosides of 5-hydroxy-14-naphthoquinone (juglon). Chem.-farm. Zh., 2003, T. 37, No. 8, pp. 3-4].

Однако новое назначение ацетилированных О- и S-гликозидов ряда 5-гидрокси-1,4-нафтохинона (юглона) в качестве средства, обладающего способностью избирательно стимулировать апоптоз клеток лейкемии человека, не вытекает с очевидностью из их известных свойств и обнаружено авторами впервые.However, the new purpose of acetylated O- and S-glycosides of the 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone (juglon) series as an agent with the ability to selectively stimulate apoptosis of human leukemia cells does not follow with obviousness from their known properties and was first discovered by the authors.

Технический результат заключается в более выраженной способности (в 2-3 раза более высокая активность и меньший временной промежуток, необходимый для стимуляции апоптоза) ацетилированных О- или S-гликозидов юглона избирательно стимулировать апоптоз клеток лейкоза человека по сравнению с прототипом юглоном без воздействия на нормальные клетки иммунной системы человека (нейтрофилы). Это снижает риск возникновения нейтропении, сопровождающий лечение лейкемии традиционными противораковыми препаратами. Изобретение расширяет арсенал средств, стимулирующих апоптоз клеток лейкемии человека.The technical result consists in a more pronounced ability (2-3 times higher activity and a shorter time period necessary to stimulate apoptosis) of acetylated O- or S-glycosides of juglone selectively stimulate apoptosis of human leukemia cells compared to the prototype juglon without affecting normal cells human immune system (neutrophils). This reduces the risk of neutropenia that accompanies leukemia treatment with traditional anti-cancer drugs. The invention expands the arsenal of agents that stimulate apoptosis of human leukemia cells.

На фиг.1 представлена цитотоксическая активность гликозидов юглона 2-15 в отношении клеток лейкемии человека HL-60, определенная методом микроскопии - цифровой фотографии. Представлен один из трех независимых экспериментов.Figure 1 shows the cytotoxic activity of glycosides of juglone 2-15 in relation to human leukemia cells HL-60, determined by microscopy - digital photography. One of three independent experiments is presented.

На фиг.2 представлен дозозависимый цитотоксический эффект юглона 1 (Juglone) и его гликозидов 3 (U-112) и 11 (TU-299) в отношении клеток лейкемии человека HL-60, определенный методом МТТ после 24 часов инкубирования клеток с веществами. Каждая точка на графике соответствует усредненному числу живых клеток, выраженному в процентах ± SD (стандартное отклонение от среднего), полученному из трех независимых опытов, по три образца на каждую концентрацию вещества в каждом из опытов.Figure 2 presents the dose-dependent cytotoxic effect of juglone 1 (Juglone) and its glycosides 3 (U-112) and 11 (TU-299) in relation to human leukemia cells HL-60, determined by MTT after 24 hours of incubation of cells with substances. Each point on the graph corresponds to the average number of living cells, expressed as a percentage ± SD (standard deviation from the mean) obtained from three independent experiments, three samples for each substance concentration in each experiment.

На фиг.3 представлен дозозависимый цитотоксический эффект O-глюкозида юглона 3 (U-112) в отношении различных видов клеток лейкемии, полученный методом МТТ после 24 часов инкубирования клеток с веществами. Каждая точка на графике соответствует усредненному числу живых клеток, выраженному в процентах ± SD (стандартное отклонение от среднего), полученному из трех независимых опытов, по три образца на каждую концентрацию вещества в каждом из опытов.Figure 3 presents the dose-dependent cytotoxic effect of Oglucoside Juglon 3 (U-112) in relation to various types of leukemia cells obtained by MTT after 24 hours of incubation of cells with substances. Each point on the graph corresponds to the average number of living cells, expressed as a percentage ± SD (standard deviation from the mean) obtained from three independent experiments, three samples for each substance concentration in each experiment.

На фиг.4 представлен эффект индукции апоптоза юглоном 1 (Juglone) и его гликозидами 3 (U-112) и 11 (TU-299), взятыми в концентрации 1 µM, через 24 часа инкубирования с клетками лейкемии HL-60, полученный методом проточной цитометрии с окрашиванием апоптотических клеток флуоресцентными красителями Annexin V-FITC и PI. Эффект представлен в виде числа апоптотических клеток, выраженного в процентах (правый нижний квадрант - ранний апоптоз; правый верхний квадрант - поздний апоптоз). Представлен один из трех независимых экспериментов.Figure 4 shows the effect of apoptosis induction by juglone 1 (Juglone) and its glycosides 3 (U-112) and 11 (TU-299), taken at a concentration of 1 μM, after 24 hours of incubation with HL-60 leukemia cells obtained by flow cytometry with staining of apoptotic cells with Annexin V-FITC and PI fluorescent dyes. The effect is presented as the number of apoptotic cells, expressed as a percentage (right lower quadrant - early apoptosis; right upper quadrant - late apoptosis). One of three independent experiments is presented.

На фиг.5 представлено влияние юглона 1 (Juglone) и его гликозидов 3 (U-112) и 11 (TU-299), взятыми в концентрации 1 µM на величину самопроизвольного апоптоза нейтрофилов крови человека, полученное методом проточной цитометрии через 24 часа инкубирования клеток с веществами. Каждый "столбик" соответствует усредненному количеству апоптотических клеток, выраженному в процентах ± SD стандартное отклонение от среднего), полученному из трех независимых опытов.Figure 5 shows the effect of juglone 1 (Juglone) and its glycosides 3 (U-112) and 11 (TU-299) taken at a concentration of 1 μM on the value of spontaneous apoptosis of human blood neutrophils obtained by flow cytometry after 24 hours of cell incubation with substances. Each "column" corresponds to the average number of apoptotic cells, expressed as a percentage ± SD standard deviation from the mean) obtained from three independent experiments.

На фиг.6 представлен эффект индукции апоптоза юглоном 1 (Juglone) и его гликозидами 3 (U-112) и 11 (TU-299), взятыми в концентрации 1 µМ, в лейкемических клетках различных типов, определенный методом проточной цитометрии через 24 часа инкубирования клеток с веществами. Каждый "столбик" соответствует усредненному количеству апоптотических клеток в процентах ± SD (стандартное отклонение от среднего), полученному из трех независимых опытов.Figure 6 shows the effect of apoptosis induction by juglone 1 (Juglone) and its glycosides 3 (U-112) and 11 (TU-299) taken at a concentration of 1 μM in various types of leukemic cells, determined by flow cytometry after 24 hours of incubation cells with substances. Each “column” corresponds to the average number of apoptotic cells in percent ± SD (standard deviation from the mean) obtained from three independent experiments.

На фиг.7 представлена дозозависимая индукция апоптоза юглоном 1 и его гликозидами 3 и 11 в клетках лейкемии HL-60, определенная методом проточной цитометрии через 24 часа инкубирования веществ с клетками. Каждая точка на графике соответствует усредненному количеству апоптотических клеток в процентах ± SD (стандартное отклонение от среднего), полученному из трех независимых экспериментов.Figure 7 shows the dose-dependent induction of apoptosis by juglon 1 and its glycosides 3 and 11 in HL-60 leukemia cells, determined by flow cytometry after 24 hours of incubation of substances with cells. Each point on the graph corresponds to the average number of apoptotic cells in percent ± SD (standard deviation from the mean) obtained from three independent experiments.

На фиг.8 представлена времязависимая индукция апоптоза юглоном 1 и его гликозидами 3 и 11, взятыми в концентрации 1 µМ, в клетках лейкемии HL-60, определенная методом проточной цитометрии. Каждая точка на графике соответствует усредненному количеству апоптотических клеток в процентах ± SD (стандартное отклонение от среднего), полученному из трех независимых экспериментов.On Fig presents the time-dependent induction of apoptosis by juglon 1 and its glycosides 3 and 11, taken at a concentration of 1 μm, in HL-60 leukemia cells, determined by flow cytometry. Each point on the graph corresponds to the average number of apoptotic cells in percent ± SD (standard deviation from the mean) obtained from three independent experiments.

На фиг.9 представлен эффект юглона 1 (Juglone) и его гликозидов 3 (U-112) и 11 (TU-299), взятых в концентрации 1 µМ, на клеточный цикл клеток лейкемии HL-60, определенный методом проточной цитометрии через 24 часа инкубирования клеток с веществами. Эффект представлен в виде числа клеток, находящихся в той или иной фазе клеточного цикла, выраженного в процентах. Наличие клеток в фазе Sub-G₁ является характерным признаком апоптоза. Представлен один из трех независимых экспериментов.Figure 9 shows the effect of juglone 1 (Juglone) and its glycosides 3 (U-112) and 11 (TU-299), taken at a concentration of 1 μM, on the cell cycle of HL-60 leukemia cells, determined by flow cytometry after 24 hours incubating cells with substances. The effect is presented as the number of cells in a given phase of the cell cycle, expressed as a percentage. The presence of cells in the Sub-G ₁ phase is a characteristic sign of apoptosis. One of three independent experiments is presented.

На фиг.10 представлен тест TUNEL на индукцию апоптоза в клетках лейкемии HL-60, обработанных юглоном 1 (Juglone) и его гликозидами 3 (U-112) и 11 (TU-299) в концентрации 1 µМ. Представлен один из трех независимых экспериментов.Figure 10 presents the TUNEL test for the induction of apoptosis in HL-60 leukemia cells treated with juglone 1 (Juglone) and its glycosides 3 (U-112) and 11 (TU-299) at a concentration of 1 μM. One of three independent experiments is presented.

На фиг.11 представлено влияние юглона 1 (Juglone) и гликозидов юглона 3 (U-112) и 11 (TU-299), взятых в концентрации 1 µМ, на уровень глутатиона в клетках лейкемии HL-60. Концентрация глутатиона выражена в µМ/10⁶ клеток. Каждый "столбик" соответствует усредненному значению концентрации глутатиона ± SD (стандартное отклонение от среднего), полученному из трех независимых опытов.Figure 11 shows the effect of juglone 1 (Juglone) and glycosides of juglone 3 (U-112) and 11 (TU-299), taken at a concentration of 1 μM, on the level of glutathione in HL-60 leukemia cells. Glutathione concentration is expressed in µM / 10 ⁶ cells. Each "bar" corresponds to the average concentration of glutathione ± SD (standard deviation from the mean) obtained from three independent experiments.

На фиг.12 представлены эффекты юглона 1 (Juglone) и гликозидов юглона 3 (U-112) и 11 (TU-299), взятых в концентрации 1 µМ, а также глутатиона, ацетилцистеина (NAC) и дифенилениодониум хлорида (DPI) - ингибитора флавинсодержащей NADPH-оксидазы на проницаемость митохондриальных мембран в клетках HL-60. Представлен один из трех независимых экспериментов.On Fig presents the effects of juglone 1 (Juglone) and glycosides of juglone 3 (U-112) and 11 (TU-299), taken at a concentration of 1 μM, as well as glutathione, acetylcysteine (NAC) and diphenylene iodonium chloride (DPI) inhibitor flavin-containing NADPH oxidase permeability of mitochondrial membranes in HL-60 cells. One of three independent experiments is presented.

На Фиг.13 представлен эффект 1 µM концентрации гликозидов 3 (U-112) и 11 (TU-299), а также юглона 1 (Juglone) на внутриклеточные уровни прокаспаз-3, -8 и -9 в клетках HL-60. Представлен один из трех независимых экспериментов.On Fig presents the effect of 1 μM concentration of glycosides 3 (U-112) and 11 (TU-299), as well as juglone 1 (Juglone) on intracellular levels of procaspase-3, -8 and -9 in HL-60 cells. One of three independent experiments is presented.

Исследование биологической активностиThe study of biological activity

I. Материалы и методы.I. Materials and methods.

1. Принятые сокращения.1. Accepted abbreviations.

U-112- гликозид юглона, соединение 3 (см. таблицу 1); TU-299- гликозид юглона, соединение 11 (см. таблицу 1); mM - миллимоль/литр; µM - микромоль/литр; µл - микролитр; SD - стандартное отклонение от среднего; МТТ - метод определения цитотоксичности веществ (см. пункт.4. Определение цитотоксичности); Annexin V-FITC - флуоресцентный краситель; PI - пропидиум иодид, флуоресцентный краситель; TUNEL - метод определения апоптоза (см. пункт. 6. Анализ методом TUNEL); Sub-G₁ - одна из фаз клеточного цикла, характерная для клеток, находящихся в апоптозе; PBS - фосфатно-солевой буферный раствор; FBS - сыворотка крови бычьих эмбрионов; ДМСО - диметилсульфоксид; GSH-глутатион, GSSG-диглутатион, дисульфид глутатиона; ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота.U-112-juglon glycoside, compound 3 (see table 1); TU-299-Juglon glycoside, compound 11 (see table 1); mM is millimol / liter; µM - micromol / liter; µl - microliter; SD is the standard deviation from the mean; MTT - a method for determining the cytotoxicity of substances (see paragraph 4. Determination of cytotoxicity); Annexin V-FITC - fluorescent dye; PI - propidium iodide, fluorescent dye; TUNEL - apoptosis determination method (see clause 6. Analysis by the TUNEL method); Sub-G ₁ is one of the phases of the cell cycle characteristic of cells in apoptosis; PBS - phosphate buffered saline; FBS - serum of bovine embryos; DMSO - dimethyl sulfoxide; GSH-glutathione, GSSG-digglutathione, glutathione disulfide; EDTA - Ethylenediaminetetraacetic acid.

2. Культивирование клеток.2. The cultivation of cells.

HL-60, THP-1, NB4 или К562 клетки из коллекции АТТСС (American Type Tissue Culture Collection, Rockville, MD) культивировали в среде RPMI-1640, содержащей 10% FBS, 100 ед/мл пенициллина и 100 µг/мл стрептомицина, в атмосфере, содержащей 5% СО₂, при 37°С, и пересеивали каждые 2 дня.HL-60, THP-1, NB4 or K562 cells from the ATTCC collection (American Type Tissue Culture Collection, Rockville, MD) were cultured in RPMI-1640 medium containing 10% FBS, 100 units / ml penicillin and 100 μg / ml streptomycin, in an atmosphere containing 5% CO ₂ , at 37 ° C, and were reseeded every 2 days.

Нейтрофилы, клетки иммунной системы человека, выделяли из свежей человеческой крови.Neutrophils, cells of the human immune system, were isolated from fresh human blood.

3. Приготовление растворов веществ.3. Preparation of solutions of substances.

Базовые (стоковые) растворы гликозидов с концентрацией вещества 20 mM готовили в диметилсульфоксиде (ДМСО) (Fisher, USA), из которого получали растворы нужной концентрации разбавлением в культуральной среде. Содержание ДМСО в разбавленных растворах не превышало 0,5% во всех опытах.Basic (stock) glycoside solutions with a substance concentration of 20 mM were prepared in dimethyl sulfoxide (DMSO) (Fisher, USA), from which solutions of the desired concentration were obtained by dilution in a culture medium. The content of DMSO in dilute solutions did not exceed 0.5% in all experiments.

4. Определение цитотоксичности веществ методом цифровой фотографии - микроскопии.4. Determination of cytotoxicity of substances by digital photography - microscopy.

Цитотоксические свойства гликозидов 5-гидрокси-1,4-нафтохинонов изучались на опухолевых клетках человека с использованием метода микроскопии - цифровой фотографии. В работе использовали микроскоп Axiovert 200 (Zeiss, Germany), снабженный цифровьм фотоаппаратом Hamamatsu Orca ER C4742-95 (Hamamatsu Photonics K.K., Japan). Клетки лейкоза человека HL-60 (3×10⁵ клеток на лунку) выращивали в 6-луночном планшете в течение 24 час в 3 мл среды 10% FBS/RPMI. В лунку с клетками добавляли рассчитанное количество разбавленного раствора гликозида и инкубировали планшет в течение 24 час. Обработанные клетки фотографировали и сравнивали их фотографии с фотографией необработанных контрольных клеток. Цитотоксический эффект гликозидов проявлялся в характерных морфологических изменениях клеток (округление клетки, сморщивание и нарушение целостности мембраны, распад клетки на апоптотические тела). Концентрация исследуемого вещества считалась цитотоксической при наличии более 50% клеток, имеющих характерные морфологические изменения.The cytotoxic properties of 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone glycosides were studied on human tumor cells using the method of microscopy - digital photography. We used an Axiovert 200 microscope (Zeiss, Germany) equipped with a Hamamatsu Orca ER C4742-95 digital camera (Hamamatsu Photonics KK, Japan). HL-60 human leukemia cells (3 × 10 ⁵ cells per well) were grown in a 6-well plate for 24 hours in 3 ml of 10% FBS / RPMI medium. A calculated amount of a diluted glycoside solution was added to the cell well and the plate was incubated for 24 hours. Treated cells were photographed and their photographs compared with photographs of untreated control cells. The cytotoxic effect of glycosides was manifested in characteristic morphological changes in cells (rounding of the cell, wrinkling and violation of the integrity of the membrane, cell breakdown into apoptotic bodies). The concentration of the test substance was considered cytotoxic in the presence of more than 50% of cells with characteristic morphological changes.

5. МТТ колориметрический тест оценки жизнеспособности клеток и цитотоксичности веществ.5. MTT colorimetric test for assessing cell viability and cytotoxicity of substances.

3-(4,5-этилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразол бромид (МТТ) (Sigma, St. Louis, МО, U.S.A.) был использован для определения цитотоксичности веществ. Клетки лейкемии HL-60 (NB4, THP-1, К562) были высеяны в 96-луночный планшет (1×10⁴ клеток на лунку в 50 мкл среды) и затем обработаны растворами (в 50 мкл среды) юглона 1 или его гликозидов 3 или 11 различной концентрации. Затем раствор МТТ (5 мг/мл) был добавлен в каждую лунку и клетки инкубировали при 37 С и 5% СО₂ в течение 4 часов. Клеточную суспензию центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 мин и клетки в каждой лунке экстрагировали затем 100 мкл диметилсульфоксида. Затем определяли оптическую плотность растворов в каждой лунке на планшетном ридере-спектрофотометре (Bio-Teck Instruments. Inc., США) при 550 нм. Процентное содержание живых клеток затем вычисляли по формуле (ОП_эксп/ОП_ктрл)×100, где3- (4,5-ethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazole bromide (MTT) (Sigma, St. Louis, MO, USA) was used to determine the cytotoxicity of the substances. HL-60 leukemia cells (NB4, THP-1, K562) were plated in a 96-well plate (1 × 10 ⁴ cells per well in 50 μl of medium) and then treated with solutions (in 50 μl of medium) of juglon 1 or its glycosides 3 or 11 different concentrations. Then, an MTT solution (5 mg / ml) was added to each well and the cells were incubated at 37 ° C and 5% CO ₂ for 4 hours. The cell suspension was centrifuged at 1000 rpm for 5 min and the cells in each well were then extracted with 100 μl of dimethyl sulfoxide. Then, the optical density of the solutions in each well was determined on a plate reader spectrophotometer (Bio-Teck Instruments. Inc., USA) at 550 nm. The percentage of living cells was then calculated by the formula (OD _exp / OD _ctrl ) × 100, where

ОП_эксп - оптическая плотность экспериментальной лунки, ОП_ктрл - оптическая плотность контрольной лунки.OD _exp is the optical density of the experimental well, OD _ctrl is the optical density of the control well.

6. Тест на апоптоз с использованием цитометрического анализа.6. Test for apoptosis using cytometric analysis.

Клетки (1×10⁶) обрабатывали юглоном или гликозидами в указанных концентрациях, инкубировали в течение указанного промежутка времени, затем промывали фосфатным буфером (PBS) путем центрифугирования при 1000 об/мин в течение 5 мин. Затем клетки обрабатывали для обнаружения раннего и позднего апоптоза флуоресцентными красителями Аннексин V-FITC и пропидиум иодид (PI) в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя. Клетки (1×10⁵- 5×10⁵) ресуспендировали в 500 µл связывающего буфера (Annexin V-FITC Apoptosis Detection kit. Medical & Biological Laboratories), добавляли 5 µл Annexin V-FITC и 5 µл PI и инкубировали в течение 15 мин в темноте при комнатной температуре. Затем клетки (1×10⁴) анализировали на проточном цитометре производства США (Beckton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) для обнаружения раннего и позднего апоптоза.Cells (1 × 10 ⁶ ) were treated with juglon or glycosides at the indicated concentrations, incubated for a specified period of time, then washed with phosphate buffer (PBS) by centrifugation at 1000 rpm for 5 min. The cells were then treated to detect early and late apoptosis with the fluorescent dyes Annexin V-FITC and propidium iodide (PI) in accordance with the manufacturer's recommendations. Cells (1 × 10 ⁵ - 5 × 10 ⁵ ) were resuspended in 500 μl of binding buffer (Annexin V-FITC Apoptosis Detection kit. Medical & Biological Laboratories), 5 μl of Annexin V-FITC and 5 μl of PI were added and incubated for 15 min in the dark at room temperature. Then the cells (1 × 10 ⁴ ) were analyzed on a flow cytometer manufactured in the USA (Beckton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) to detect early and late apoptosis.

7. Изучение клеточного цикла.7. The study of the cell cycle.

Клетки (1×10⁶) обрабатывали юглоном или гликозидами в указанных концентрациях, инкубировали в течение 24 часов, затем промывали фосфатным буфером (PBS) путем центрифугирования при 1000 об/мин в течение 5 мин. После этого клетки были суспендированы в PBS и зафиксированы холодным 70% этанолом в течение 3 часов. Фиксированные клетки были прокрашены 50 µг/мл PI (пропидиум-иодида), содержащим 50 µг/мл РНКазы А, при 37°С в течение 30 мин. ДНК клеток (10,000 клеток на экспериментальную группу) была затем проанализирована с помощью клеточного цитометра с использованием лизирующего буфера Lysis II и программного обеспечения CELL-FIT (BD).Cells (1 × 10 ⁶ ) were treated with juglon or glycosides at the indicated concentrations, incubated for 24 hours, then washed with phosphate buffer (PBS) by centrifugation at 1000 rpm for 5 minutes. After this, the cells were suspended in PBS and fixed with cold 70% ethanol for 3 hours. Fixed cells were stained with 50 μg / ml PI (propidium iodide) containing 50 μg / ml RNase A at 37 ° C for 30 minutes. Cell DNA (10,000 cells per experimental group) was then analyzed using a cell cytometer using Lysis II lysis buffer and CELL-FIT (BD) software.

8. Наблюдение апоптоза методом TUNEL. Клетки HL-60 (1×10⁴ клеток на лунку) были высеяны в 96-луночный планшет и обработаны растворами юглона 1 или гликозидов 3 (U-112) или 11 (TU-299) в указанных концентрациях в течение 6 часов. Затем клетки были отмыты PBS методом центрифугирования и зафиксированы в 100 µл на каждую лунку свежеприготовленного 4% формальдегида в PBS (pH 7.4) в течение 10 мин. Полученные слайды были проинкубированы в течение 5 мин с 0.1% Тритон Х-100, промыты дважды PBS и высушены. Набор реагентов TUNEL (Roche, Basel, Switzerland) был использован для обнаружения апоптоза в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя.8. Observation of apoptosis by the TUNEL method. HL-60 cells (1 × 10 ⁴ cells per well) were seeded in a 96-well plate and treated with solutions of juglon 1 or glycosides 3 (U-112) or 11 (TU-299) at the indicated concentrations for 6 hours. Then the cells were washed with PBS by centrifugation and fixed in 100 μl per well of freshly prepared 4% formaldehyde in PBS (pH 7.4) for 10 min. The resulting slides were incubated for 5 min with 0.1% Triton X-100, washed twice with PBS and dried. The TUNEL reagent kit (Roche, Basel, Switzerland) was used to detect apoptosis in accordance with the manufacturer's recommendations.

Клетки были инкубированы в течение 60 мин при 37°С с реакционной смесью (50 µл на каждый слайд), содержащей флуоресцеин-12-dUTP, в присутствии терминальной деоксинуклеотидил трансферазы (TdT), при этом зеленая флуоресцентная метка присоединялась по свободным 3'-ОН группам фрагментированной ДНК. Затем образцы были промыли три раза PBS, обработали 500 µл буферного раствора, содержащего PI, в течение 15 мин, и проанализировали с помощью флуоресцентного микроскопа (Carl Zeiss, LSM 510) при длине волны возбуждения 450-500 нм и длине волны обнаружения 515-565 нм.Cells were incubated for 60 min at 37 ° C with a reaction mixture (50 μl per slide) containing fluorescein-12-dUTP in the presence of terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT), with the green fluorescent label attached via free 3'-OH fragmented DNA groups. Then the samples were washed three times with PBS, treated with 500 μl of PI-containing buffer solution for 15 min, and analyzed using a fluorescence microscope (Carl Zeiss, LSM 510) at an excitation wavelength of 450-500 nm and a detection wavelength of 515-565 nm

9. Методика изучения влияния производных юглона на ред/окс цикл глутатиона (GSSG/GSH recycling assay)9. Methodology for studying the effect of juglone derivatives on the red / ox cycle of glutathione (GSSG / GSH recycling assay)

Уровень общего глутатиона (GSSG) и восстановленной формы (GSH) в клетках HL-60 определяли с использованием колориметрического GSSG/ GSH ред/окс теста. Клетки (0.5-1.0×10⁶ клеток/опыт в чашке Петри, диаметром 10 см) обрабатывали раствором указанной концентрации юглона 1 или гликозида юглона 3 (U-112) или 11 (TU-299) в 10 мл среды, собирали центрифугированием, помещали в 1 М раствор хлорной кислоты, содержащей 2 мМ ЭДТА, центрифуговали, нейтрализовали 4 М раствором КОН, содержащим 0.6 М МОПС, снова центрифугировали. Общий уровень глутатиона GSSG и восстановленной формы GSH в супернатанте определяли спектрофотометрически с использованием теста глутатион-редуктаза / 5.5'-дитиобис-(2-нитробензойной кислота). Количественные измерения глутатиона в клетках проводили по калибровкам, построенным для заведомых концентраций GSSG.The levels of total glutathione (GSSG) and reduced form (GSH) in HL-60 cells were determined using a colorimetric GSSG / GSH red / ox test. Cells (0.5-1.0 × 10 ⁶ cells / experiment in a Petri dish, 10 cm in diameter) were treated with a solution of the indicated concentration of juglone 1 or juglone glycoside 3 (U-112) or 11 (TU-299) in 10 ml of medium, collected by centrifugation, placed in a 1 M solution of perchloric acid containing 2 mM EDTA was centrifuged, neutralized with a 4 M KOH solution containing 0.6 M MOPS, centrifuged again. The total levels of glutathione GSSG and the reduced form of GSH in the supernatant were determined spectrophotometrically using the glutathione reductase / 5.5′-dithiobis- (2-nitrobenzoic acid) test. Quantitative measurements of glutathione in cells were performed according to calibrations constructed for known concentrations of GSSG.

10. Методика изучения проницаемости митохондриальной мембраны. Клетки HL-60 (1-5×10⁶ клеток/опыт в чашке Петри, диаметром 10 см) обрабатывали раствором 1 µМ концентрации юглона 1 или гликозида юглона 3 (U-112) или 11 (TU-299) в 10 мл среды, собирали и отмывали в PBS методом центрифугирования. Затем клетки (1×10⁶ клеток/мл) инкубировали с 40 µМ раствором флуоресцентного зонда 3,30-дигексилоксакарбоцианин иодидом (DiOC₆(3), Molecular probes) в течение 30 мин при 37°С, отмывали фосфатно-солевым буфером и измеряли их флуоресценцию методом проточной цитометрии.10. Methodology for studying the permeability of the mitochondrial membrane. HL-60 cells (1-5 × 10 ⁶ cells / experiment in a Petri dish, 10 cm in diameter) were treated with a solution of 1 μM concentration of juglone 1 or juglone glycoside 3 (U-112) or 11 (TU-299) in 10 ml of medium, collected and washed in PBS by centrifugation. Then the cells (1 × 10 ⁶ cells / ml) were incubated with a 40 μM fluorescent probe solution of 3.30-dihexyloxacarbocyanine iodide (DiOC ₆ (3), Molecular probes) for 30 min at 37 ° C, washed with phosphate-buffered saline and measured their fluorescence by flow cytometry.

11. Вестерн-блоттинг анализ.11. Western blot analysis.

HL-60 клетки (1×10⁷ клеток в чашке Петри, 10 см диаметром) инкубировали с 1 µМ растворами юглона 1 или гликозида юглона 3 (U-112) или 11 (TU-299) в 10 мл среды RPMI - 1640, содержащей 10% FBS, в течение 24 час. Затем клетки промыли холодным PBS (2×10 мл), суспендировали в лизирующем буфере, содержащем 20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 50 mM NaCl, 1.0% Triton X-100, 50 mM NaF, 2,5 mM Na₃VO₄ и ингибиторы протеаз (1 mM PMSF, 20 ед/мл апротинина). Лизаты (25 µг) подвергли электрофорезу на 10% додецилсульфат-полиакриламидном геле, перенесли на нитроцеллюлозную мембрану, которую блокировали в течение 1 час при 25°С в блокирующем буфере (10 mM Tris-HCl, 0,15 М NaCl, 0,1% азида натрия и 5% обезжиренного молока) и инкубировали в течение ночи при 4°С с соотвтетствующими первичными антителами в разбавлении (1:1000). Затем мембраны инкубировали с вторичными антителами против IgG, в разбавлении 1:5000 в апоптоз блокирующем буфере. Сигналы комплексов белок - антитело регистрировали по хемилюминесцентному свечению.HL-60 cells (1 × 10 ⁷ cells in a Petri dish, 10 cm in diameter) were incubated with 1 μM solutions of juglone 1 or juglone glycoside 3 (U-112) or 11 (TU-299) in 10 ml of RPMI-1640 medium containing 10% FBS, within 24 hours. Then the cells were washed with cold PBS (2 × 10 ml), suspended in lysis buffer containing 20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 50 mM NaCl, 1.0% Triton X-100, 50 mM NaF, 2.5 mM Na ₃ VO ₄ and protease inhibitors (1 mM PMSF, 20 u / ml aprotinin). Lysates (25 μg) were subjected to electrophoresis on 10% dodecyl sulfate-polyacrylamide gel, transferred to a nitrocellulose membrane, which was blocked for 1 hour at 25 ° C in blocking buffer (10 mM Tris-HCl, 0.15 M NaCl, 0.1% sodium azide and 5% skim milk) and incubated overnight at 4 ° C with the appropriate primary antibodies in dilution (1: 1000). The membranes were then incubated with secondary anti-IgG antibodies, in a 1: 5000 dilution in apoptosis blocking buffer. Signals of protein – antibody complexes were recorded by chemiluminescent luminescence.

II Результаты исследования биологической активности производных O- и S-гликозидов 5-гидрокси-1,4-нафтохинона (юглона)II. Results of the study of the biological activity of the derivatives of O- and S-glycosides of 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone (juglon)

Соединения 2-15 проявили стимулирующую активность на нескольких линиях клеток лейкемии человека, что подтверждается данными по исследованию цитотоксичности, изучению апоптоза методами TUNEL и проточной цитометрии, изучению влияния производных юглона на ред/окс цикл глутатиона, изучению проницаемости митохондриальной мембраны, по воздействию на клеточный цикл и экспериментам по активации прокаспаз-3, -8 или -9 методом вестерн иммуноблоттинга. Для экспериментов были выбраны соединения 2-15 представленные в Табл. 1. Было обнаружено, что соединения 2-15 индуцируют апоптоз клеток лейкемии человека при оптимальных концентрациях 0.5-5 µМ. Оптимальное время воздействия на опухолевые клетки - 24 часа. Апоптотические изменения (ранний и поздний апоптоз) в клетках измерялись с использованием флуоресцентных красителей Аннексин V-FITC и пропидиум-иодид (PI). При этом также наблюдалось значительное увеличение числа клеток, находящихся в фазе клеточного цикла Sub-G₁, что характерно именно для клеток, находящихся в состоянии апоптоза. В клетках, подвергшихся обработке соединениями 2-15, также регистрировалась характерные для апоптоза фрагментация ДНК и увеличение проницаемости митохондриальной мембраны. Обработка соединениями 2-15 приводила к уменьшению внутриклеточного уровня глутатиона. Соединения 2-15 также изменяли проницаемость митохондриальной мембраны клеток лейкемии, и это изменение в свою очередь блокировалось глутатионом. Исследованные гликозиды вызывали апоптоз в различных линиях лекемических клеток, включая HL-60 (острая промиелоцитарная лейкемия), NB4 (острая промиелоцитарная лейкемия), ТНР-1 (острая моноцитарная лейкемия), К562 (хроническая миелогенная лейкемия).Compounds 2-15 showed stimulating activity on several lines of human leukemia cells, which is confirmed by data on the study of cytotoxicity, the study of apoptosis by TUNEL and flow cytometry, the effect of juglone derivatives on the red / ox cycle of glutathione, the permeability of the mitochondrial membrane, and the effect on the cell cycle and experiments on the activation of procaspase-3, -8 or -9 by Western immunoblotting. For experiments were selected compounds 2-15 are presented in Table. 1. It was found that compounds 2-15 induce apoptosis of human leukemia cells at optimal concentrations of 0.5-5 μM. The optimal time for exposure to tumor cells is 24 hours. Apoptotic changes (early and late apoptosis) in cells were measured using annexin V-FITC fluorescent dyes and propidium iodide (PI). At the same time, a significant increase in the number of cells in the phase of the cell cycle Sub-G _{1 was} also observed, which is typical for cells in a state of apoptosis. In cells treated with compounds 2–15, DNA fragmentation characteristic of apoptosis and an increase in the permeability of the mitochondrial membrane were also recorded. Treatment with compounds 2-15 resulted in a decrease in the intracellular level of glutathione. Compounds 2-15 also altered the permeability of the mitochondrial membrane of leukemia cells, and this change was in turn blocked by glutathione. The studied glycosides induced apoptosis in various leukemic cell lines, including HL-60 (acute promyelocytic leukemia), NB4 (acute promyelocytic leukemia), THP-1 (acute monocytic leukemia), K562 (chronic myelogenous leukemia).

1. Результаты по цитотоксичности.1. Results on cytotoxicity.

Гликозиды 2-15 показали цитотоксические свойства на клетках опухолей человека. Цитотоксический эффект оценивали на клетках HL-60 методом микроскопии - цифровой фотографии по наличию характерных для апоптоза морфологических изменений клеток. На фиг.1 представлены фотографии клеток HL-60, обработанных растворами гликозидов 2-15 различной концентрации. Для большинства гликозидов представлены фотографии эффекта двух концентраций: первая, при которой цитотоксическое действие данного гликозида не выявляено после 24 часов инкубации с клетками; вторая, при которой уже явно виден цитотоксический эффект гликозида, проявляющийся в характерных морфологических изменениях клеток (округление клетки, сморщивание и нарушение целостности мембраны, распад клетки на апоптотические тела). Приведенные данные показывают, что цитотоксическая активность гликозидов юглона 2-15 в отношении клеток лейкемии HL-60 зависит от химической структуры веществ, и действующие концентрации для большинства из них находятся в пределах 0.5-1 µМ.Glycosides 2-15 showed cytotoxic properties on human tumor cells. The cytotoxic effect was evaluated on HL-60 cells by microscopy, a digital photograph by the presence of morphological changes characteristic of apoptosis. Figure 1 presents photographs of HL-60 cells treated with solutions of glycosides 2-15 of various concentrations. For most glycosides, photographs of the effect of two concentrations are presented: the first, in which the cytotoxic effect of this glycoside is not detected after 24 hours of incubation with cells; the second, in which the cytotoxic effect of the glycoside is already clearly visible, manifested in characteristic morphological changes in the cells (rounding of the cell, wrinkling and violation of the integrity of the membrane, cell breakdown into apoptotic bodies). The data presented show that the cytotoxic activity of juglon 2-15 glycosides in relation to HL-60 leukemia cells depends on the chemical structure of the substances, and the effective concentrations for most of them are in the range of 0.5-1 μM.

В таблице 2 приведены сводные данные по влиянию гликозидов 2-15 на жизнеспособность клеток лейкемии HL-60, полученные на основе анализа фотографий на Фиг.1.Table 2 summarizes the effect of glycosides 2-15 on the viability of HL-60 leukemia cells, obtained from the analysis of photographs in FIG. 1.

Таблица 2table 2 Цитотоксические свойства О- и S-гликозидов юглона 2-15, полученные методом микроскопии - цифровой фотографии на клетках лейкемии HL-60Cytotoxic properties of O- and S-glycosides of juglone 2-15, obtained by microscopy - digital photography on leukemia cells HL-60 № гликозидовGlycoside number Концентрация гликозида, µМThe concentration of glycoside, µM 0.5 µМ0.5 µM 1.0 µМ1.0 µM 2.5 µМ2.5 µM 5.0 µМ5.0 µM 22 ++ ++ ++ ++ 33 ++ ++ ++ ++ 4four -- -- ++ ++ 55 -- ++ ++ ++ 66 -- ++ ++ ++ 77 -- -- ++ ++ 88 -- ++ ++ ++ 99 -- -- -- ++ 1010 ++ ++ ++ ++ 11eleven -- ++ ++ ++ 1212 -- ++ ++ ++ 1313 -- ++ ++ ++ 14fourteen -- ++ ++ ++ 15fifteen -- ++ ++ ++ «+» положительный цитотоксический эффект
«-« цитотоксический эффект отсутствует"+" Positive cytotoxic effect
"-" cytotoxic effect is absent

Основываясь на данных, представленных в таблице 2, можно сделать следующие заключения относительно влияния структуры на проявление активности в ряду гликозидов 2-15:Based on the data presented in table 2, the following conclusions can be made regarding the influence of the structure on the manifestation of activity in the series of glycosides 2-15:

1) Гликозиды с метильной группой в положении 3 существенно более токсичны, чем соединения несущие в положении 3 водород или вторую углеводную цепь. Например, гликозид 10 был намного более активен, чем гликозиды 7 и 9.1) Glycosides with a methyl group in position 3 are significantly more toxic than compounds carrying hydrogen or a second carbohydrate chain in position 3. For example, glycoside 10 was much more active than glycosides 7 and 9.

2) O-Гликозиды более активны, чем S-гликозиды. Например, гликозид 2 болеее активен, чем 7, а гликозид 3 более активен, чем 8.2) O-glycosides are more active than S-glycosides. For example, glycoside 2 is more active than 7, and glycoside 3 is more active than 8.

3) Гликозиды с моносахаридным радикалом являются более активными, чем гомологичные им гликозиды с дисахаридным радикалом. Например, гликозиды 2 и 3 более активны, чем гликозиды 5 и 6.3) Glycosides with a monosaccharide radical are more active than glycosides homologous to them with a disaccharide radical. For example, glycosides 2 and 3 are more active than glycosides 5 and 6.

4) Пары O-гликозидов, например, 2 и 3 или 5 и 6, изомерные по положению сахаридного радикала, не различаются по проявлению биологической активности.4) Pairs of O-glycosides, for example, 2 and 3 or 5 and 6, isomeric in position of the saccharide radical, do not differ in the manifestation of biological activity.

5) В группе изомерных S-гликозидов, с различными моносахаридными радикалами, природа радикала не оказывает влияния на проявление биологической активности. Например, S-гликозиды D-галактозы 11, D-маннозы 12, D-ксилозы 13 и L-арабинозы 14 проявляют одинаковую активность.5) In the group of isomeric S-glycosides, with various monosaccharide radicals, the nature of the radical does not affect the manifestation of biological activity. For example, S-glycosides of D-galactose 11, D-mannose 12, D-xylose 13 and L-arabinose 14 exhibit the same activity.

Для двух структурно-родственных гликозидов юглона, 3-O-ацетилглюкозида 3 (U-112) и 3-3-ацетилгалактозида 11 (TU-299), в сравнении с прототипом юглоном 1, цитотоксичность была изучена более точным методом МТТ (см. п.5 Материалы и методы,) на тех же клетках HL-60. Как видно из результатов, представленных на фиг.2, гликозиды 3 (U-112) и 11 (TU-299), также как и юглон 1 (Juglone), после 24 часов инкубирования проявляют дозозависимый цитотоксический эффект в отношении HL-60 клеток. Приведенные данные свидетельствуют также о том, что в пределах действующих концентраций 1-2 µМ цитотоксический эффект юглона в 6-8 раз слабее, чем эффекты гликозидов 3 и 11. А в концентрации 0.5 µM, при которой гликозиды 3 и 11 способствуют гибели около 40-50% опухолевых клеток, юглон не проявляет цитотоксического эффекта.For two structurally related glycosides of the juglon, 3-O-acetylglucoside 3 (U-112) and 3-3-acetylgalactoside 11 (TU-299), in comparison with the prototype juglon 1, cytotoxicity was studied by the more accurate MTT method (see p. .5 Materials and methods,) on the same HL-60 cells. As can be seen from the results presented in figure 2, glycosides 3 (U-112) and 11 (TU-299), as well as juglon 1 (Juglone), after 24 hours of incubation exhibit a dose-dependent cytotoxic effect against HL-60 cells. The data also indicate that, within the current concentrations of 1-2 μM, the cytotoxic effect of the juglon is 6-8 times weaker than the effects of glycosides 3 and 11. And at a concentration of 0.5 μM, at which glycosides 3 and 11 contribute to the death of about 40 50% of tumor cells, juglone does not show a cytotoxic effect.

Для выяснения спектра действия этой группы соединений методом МТТ было изучено сравнительное действие наиболее активного 3-O- ацетилглюкозида 3 (U-112) на клетки нескольких типов острых и хронических лейкозов человека (HL-60, NB4, ТНР-1, К562). Результаты представлены на фиг.3. Установлено, что 3 (U-112) проявляет дозозависимое цитотоксическое действие на все вышеупомянутые клеточные линии, причем действует на них столь же эффективно, как и на клетки острого лейкоза HL-60. Так, приведенные данные свидетельствуют о том, что гликозид 3 в концентрациях 0.5-2 µМ способствует гибели 50-95% клеток лейкемии HL-60, ТНР-1, NB4 или К562 после 24 часов инкубирования с клетками.To determine the spectrum of action of this group of compounds by MTT, the comparative effect of the most active 3-O-acetylglucoside 3 (U-112) on the cells of several types of acute and chronic human leukemia (HL-60, NB4, THP-1, K562) was studied. The results are presented in figure 3. It was found that 3 (U-112) exerts a dose-dependent cytotoxic effect on all of the aforementioned cell lines, and acts on them as effectively as on the cells of acute leukemia HL-60. Thus, the data presented indicate that glycoside 3 at concentrations of 0.5–2 μM contributes to the death of 50-95% of HL-60, THP-1, NB4, or K562 leukemia cells after 24 hours of incubation with cells.

2. Оценка апоптоза с использованием метода проточной цитометрии2. Assessment of apoptosis using flow cytometry

Углубленное исследование причины цитоксических изменений, вызываемых гликозидами 2-15 в лейкемических клетках, проводили на примере структурно-родственных 3-O-ацетилгликозида юглона 3 и 3-S-ацетилгалактозида 11 с использованием метода проточной цитометрии (см. п.6 Материалы и методы). На фиг.4 показаны сравнительные эффекты гликозидов 3 и 11, а также юглона 1, взятых в концентрации 1 µM, на величину апоптоза клеток лейкемии HL-60, полученные через 24 часа инкубирования методом проточной цитометрии с окрашиванием лейкемических клеток флуоресцентными красителями Annexin-V-FITC/пропидиум-иодидом (PI). В этом методе апоптотические изменения клеток, наступающие под воздействием веществ, приводят к выходу фосфатидилсерина с внутренней на внешнюю поверхность мембраны лейкемических клеток. Краситель Annexin-V-FITC избирательно связывается с фосфатидилсерином. Появление среди клеток обработанных производными юглона популяции клеток несущих зеленую флуоресцентную метку Annexin-V-FITC (фиг.4), правый нижний квадрант), является свидетельством вхождения клеток в фазу раннего апоптоза. Спустя 24 час клетки претерпевают более глубокие изменения, приводящие к проникновению второго красителя PI внутрь клеток и окрашиванию компонентов ядра в красный цвет (правый верхний квадрант- клетки вступившие в фазу позднего апоптоза). Цифры в квадратах отражают процентное соотношение популяций клеток, находящихся на различных стадиях апоптоза. Как видно из представленных результатов, гликозиды значительно (в 2.5-3 раза) превосходят юглон по способности индуцировать апоптоз в клетках лейкемии HL-60. фиг.6 показывает результаты аналогичных опытов по индукции апоптоза, полученные на других типах лейкемических клеток. Из них также видно, что гликозиды (U-112, TU-299) способны более эффективно вызывать апоптоз, в сравнении с прототипом юглоном (Juglone). При исследовании влияния концентрации (Dose) на способность соединений 1, 3 и 11 вызывать апоптоз в клетках лейкемии HL-60 (фиг.7) также установлено, что в диапазоне эффективных концентраций 0.5-2 µМ, проапоптотическое действие гликозидов 3 и 11, оцениваемое по количеству клеток, перешедших в апоптоз, превосходит действие юглона в 2-6 раз. В таблице 3 представлены также результаты экспериментов по дозозависимой индукции апоптоза гликозидами 3 и 11 в другом типе лейкемических клеток - ТНР-1. Показано, что при концентрации 1 µМ, через 24 часа инкубирования, 3 вызывает апотоз 78%, a 11 - 64% ТНР-1 клеток. Эти данные являются результатом трех независимых экспериментов, по 2 опыта на каждую концентрацию. На фиг.8 представлена времязависимая индукция апоптоза юглоном 1 и его гликозидами 3 и 11, взятыми в концентрации 1 µМ, в клетках лейкемии HL-60, определенная методом проточной цитометрии. Приведенные данные также свидетельствуют о том, что гликозиды 3 (U-112) и 11 (TU-299) являются более эффективными стимуляторами апоптоза, чем юглон. Так, уже через 6 часов гликозиды 3 и 11 вызывают апоптоз около 40% HL-60 клеток, в то время как юглон в той же концентрации достигает такого же эффекта только через 24 часа инкубирования с клетками. Таким образом, нами показано, что индукция апоптоза в клетках лейкемии человека зависит от концентрации и от времени воздействия гликозидов 3 и 11 на клетки. Эти данные свидетельствуют, что антиопухолевая активность гликозидов 3 и 11 в отношении клеток лейкемии в значительной мере обусловлена апоптозом.An in-depth study of the cause of cytoxic changes caused by glycosides 2-15 in leukemic cells was carried out on the example of structurally related 3-O-acetylglycoside of juglone 3 and 3-S-acetylgalactoside 11 using flow cytometry (see section 6 Materials and methods) . Figure 4 shows the comparative effects of glycosides 3 and 11, as well as juglon 1, taken at a concentration of 1 μM, on the apoptosis of HL-60 leukemia cells obtained after 24 hours of incubation by flow cytometry staining leukemic cells with Annexin-V- fluorescent dyes. FITC / propidium iodide (PI). In this method, apoptotic changes in cells that occur under the influence of substances lead to the release of phosphatidylserine from the inner to the outer surface of the membrane of leukemic cells. Dye Annexin-V-FITC selectively binds to phosphatidylserine. The appearance of a cell population treated with a juglon derivative among the cells bearing the green Annexin-V-FITC fluorescent label (Figure 4), the lower right quadrant) is evidence of the entry of cells into the phase of early apoptosis. After 24 hours, the cells undergo deeper changes, leading to the penetration of the second dye PI inside the cells and the staining of the nucleus components in red (the right upper quadrant - the cells entered the phase of late apoptosis). The numbers in squares reflect the percentage of cell populations at different stages of apoptosis. As can be seen from the presented results, glycosides significantly (2.5-3 times) surpass the yuglon in its ability to induce apoptosis in HL-60 leukemia cells. 6 shows the results of similar experiments on the induction of apoptosis obtained on other types of leukemic cells. They also show that glycosides (U-112, TU-299) are capable of more efficiently inducing apoptosis compared to the prototype juglone (Juglone). When studying the effect of concentration (Dose) on the ability of compounds 1, 3, and 11 to induce apoptosis in HL-60 leukemia cells (Fig. 7), it was also found that in the range of effective concentrations of 0.5-2 μM, the proapoptotic effect of glycosides 3 and 11, evaluated by the number of cells that have undergone apoptosis is 2-6 times greater than the effect of the juglon. Table 3 also presents the results of experiments on dose-dependent induction of apoptosis by glycosides 3 and 11 in another type of leukemic cells - THP-1. It was shown that at a concentration of 1 μM, after 24 hours of incubation, 3 induces apotosis of 78%, and 11 - 64% of THP-1 cells. These data are the result of three independent experiments, 2 experiments per concentration. On Fig presents the time-dependent induction of apoptosis by juglon 1 and its glycosides 3 and 11, taken at a concentration of 1 μm, in HL-60 leukemia cells, determined by flow cytometry. The data presented also indicate that glycosides 3 (U-112) and 11 (TU-299) are more effective stimulators of apoptosis than yuglon. So, after 6 hours, glycosides 3 and 11 cause apoptosis of about 40% of HL-60 cells, while a juglon in the same concentration achieves the same effect only after 24 hours of incubation with cells. Thus, we have shown that the induction of apoptosis in human leukemia cells depends on the concentration and on the time of exposure of the glycosides 3 and 11 to the cells. These data indicate that the antitumor activity of glycosides 3 and 11 against leukemia cells is largely due to apoptosis.

Таблица 3Table 3 Влияние концентрации гликозидов 3 и 11 на величину общего (тотального) апоптоза в клетках лейкемии ТНР-1, определенное методом проточной цитометрииThe effect of the concentration of glycosides 3 and 11 on the value of total (total) apoptosis in THP-1 leukemia cells, determined by flow cytometry Тип клеточной культурыType of cell culture № гликозидаGlycoside number Концентрация гликозида, µМ
Количество апоптотических клеток, %*The concentration of glycoside, µM
The number of apoptotic cells,% * 0.0 µМ0.0 µM 0.2 µМ0.2 µM 1.0 µM1.0 µM ТНР-1TNR-1 33 5.7±2.2%5.7 ± 2.2% 31.6±5.2%31.6 ± 5.2% 78.1±11.1%78.1 ± 11.1% 11eleven 5.7±1.9%5.7 ± 1.9% 27.5±4.8%27.5 ± 4.8% 63.7±14.5%63.7 ± 14.5% * Значения в таблице представляют собой % от общего (тотального) апоптоза.* Values in the table represent% of total (total) apoptosis.

Важнейшей характеристикой веществ является избирательность их противоопухолевого действия. Для оценки этой характеристики методом проточной цитометрии было изучено действие гликозидов 3 и 11, а также прототипа юглона 1 на нормальные клетки человеческой иммунной системы - нейтрофилы. Нейтрофилы - неделящиеся, короткоживущие (2-3 суток) клетки с сегментированным ядром и набором гранул, высвобождаются костным мозгом со скоростью около 7 млн/мин. В норме около 60% высвобожденных нейтрофилов подвергаются спонтанному апоптозу. Дисфункции или недостаток нейтрофилов в организме приводят к тяжелым формам подверженности бактериальным инфекциям, что подчеркивает ключевую роль нейтрофилов в обеспечении врожденной формы иммунитета. С другой стороны, гиперактивация нейтрофилов также приводит к патологиям. Нейтрофилы обеспечивают основную защиту организма от гноеродных бактерий. Нейтрофилы сосредоточены главным образом в крови, за исключением случаев их локализации в очагах острого воспаления. Основная функция этих клеток - фагоцитоз. Нейтрофилы фагоцитируют бактерии и продукты распада тканей и разрушают их своими лизосомными ферментами. Как видно из данных, представленных на фиг.5, гликозиды юглона 3 и 11, так же как и сам юглон 1, в концентрациях 1 µМ не оказывают существенного влияния на процесс спонтанного апоптоза нейтрофилов, но в то же время и в той же концентрации, как следует из данных, представленных на фиг.6 и 7, индуцируют апоптоз 50-90% клеток лейкемии К562, NB4, ТНР-1 и HL-60, что свидетельствует об избирательном апоптоз-стимулирующем действии гликозидов юглона на клетки лейкемии человекаThe most important characteristic of substances is the selectivity of their antitumor effects. To evaluate this characteristic, the effect of glycosides 3 and 11, as well as prototype of juglon 1 on normal cells of the human immune system, neutrophils, was studied by flow cytometry. Neutrophils - non-fissile, short-lived (2-3 days) cells with a segmented nucleus and a set of granules, are released by the bone marrow at a rate of about 7 million / min. Normally, about 60% of the released neutrophils undergo spontaneous apoptosis. Dysfunctions or lack of neutrophils in the body lead to severe forms of susceptibility to bacterial infections, which emphasizes the key role of neutrophils in providing a congenital form of immunity. On the other hand, neutrophil hyperactivation also leads to pathologies. Neutrophils provide the main body defense against pyogenic bacteria. Neutrophils are concentrated mainly in the blood, with the exception of cases of their localization in the foci of acute inflammation. The main function of these cells is phagocytosis. Neutrophils phagocytize bacteria and tissue breakdown products and destroy them with their lysosomal enzymes. As can be seen from the data presented in figure 5, the glycosides of juglone 3 and 11, as well as juglone 1 itself, in concentrations of 1 μM do not significantly affect the process of spontaneous apoptosis of neutrophils, but at the same time, at the same concentration. as follows from the data presented in Fig.6 and 7, induce apoptosis of 50-90% of leukemia cells K562, NB4, THP-1 and HL-60, which indicates the selective apoptosis-stimulating effect of juglon glycosides on human leukemia cells

3. Исследование клеточного цикла методом проточной цитометрии.3. The study of the cell cycle by flow cytometry.

Результаты анализа методом проточной цитометрии (см. п.7 Материалы и методы) клеточного цикла клеток HL-60, обработанных растворами юглона 1 (Juglone) и гликозидов юглона 3 (U-112) и 11 (TU-299), взятых в концентрации 1 µM, представлены на фиг.9 и в таблице 4. Эффект представлен в виде числа клеток, находящихся в той или иной фазе клеточного цикла, выраженного в процентах. Показано, что через 24 часа инкубирования клеток с веществами, значительно увеличивается количество клеток, находящихся в фазе Sub-G₁, что является характерным признаком апоптоза. Приведенные данные свидетельствуют о том, что количество клеток, перешедших в фазу Sub-G₁ (22.3% и 22.6%) после воздействия гликозидов 3 и 11, в два раза больше количества клеток (12.0%), которые перешли в фазу Sub-G₁ под воздействием юглона. Эти данные также свидетельствуют о том, что гликозиды юглона являются более эффективными индукторами апоптоза по сравнению с юглоном.The results of the analysis by flow cytometry (see clause 7 Materials and methods) of the cell cycle of HL-60 cells treated with solutions of juglone 1 (Juglone) and glycosides of juglone 3 (U-112) and 11 (TU-299) taken at a concentration of 1 µM are presented in FIG. 9 and Table 4. The effect is presented as the number of cells in a given phase of the cell cycle, expressed as a percentage. It was shown that after 24 hours of incubation of cells with substances, the number of cells in the Sub-G ₁ phase significantly increases, which is a characteristic sign of apoptosis. The data presented indicate that the number of cells that entered the Sub-G ₁ phase (22.3% and 22.6%) after exposure to glycosides 3 and 11 is two times the number of cells (12.0%) that entered the Sub-G ₁ phase under the influence of a juglon These data also suggest that juglone glycosides are more effective inducers of apoptosis than juglone.

Таблица 4Table 4 Влияние гликозидов 3 и 11 в концентрации 1 µM на клеточный цикл клеток лейкемии HL-60, определенное методом проточной цитометрииThe effect of glycosides 3 and 11 at a concentration of 1 μM on the cell cycle of HL-60 leukemia cells, determined by flow cytometry ВеществоSubstance Фаза клеточного циклаCell cycle phase G1G1 SS G2/MG2 / m Sub-G₁ Sub-g ₁ КонтрольThe control 47.8±3.5*47.8 ± 3.5 * 36.0±6.536.0 ± 6.5 12.2±1.212.2 ± 1.2 4.6±1.64.6 ± 1.6 1 (юглон)1 (juglon) 43.2±2.643.2 ± 2.6 32.4±4.232.4 ± 4.2 11.9±4.311.9 ± 4.3 12.0±3.612.0 ± 3.6 3 (U-112)3 (U-112) 40.5±7.640.5 ± 7.6 29.4±2.529.4 ± 2.5 7.8±2.67.8 ± 2.6 22.3±6.922.3 ± 6.9 11 (TU-299)11 (TU-299) 39.9±3.939.9 ± 3.9 30.6±1.930.6 ± 1.9 7.1±3.17.1 ± 3.1 22.6±7.522.6 ± 7.5 * Процентное распределение клеток по фазам клеточного цикла. Результат 3-х измерений.* The percentage distribution of cells in the phases of the cell cycle. The result of 3 measurements.

4. Наблюдение апоптоза методом TUNEL.4. Observation of apoptosis by the TUNEL method.

Углубленное исследование причины цитоксических изменений, вызываемых гликозидами 2-15 в лейкемических клетках, проводили на примере структурно-родственных гликозидов юглона 3 и 11 с использованием метода TUNEL (см п.8. Материалы и методы). В этом методе фрагментированная ДНК, которая появляется в клетке в ходе апоптотических превращений, окрашиваается флуоресцентным красителем FITC по методу TUNEL и дает зеленую флуоресценцию, а геномная ДНК окрашивается другим флуоресцентным красителем, пропидиум иодидом (PI) в красный цвет. Клетки лейкемии HL-60 обрабатывали юглоном 1 (Juglone) и его гликозидами 3 (U-112) и 11 (TU-299) в концентрации 1 µM. Полученные результаты свидетельствуют о том, что действие гликозидов 3 (U-112) и 11 (TU-299) на HL-60 клетки обусловлено индукцией апоптоза, что доказано окрашиванием фрагментированной ДНК обработанных клеток красителем FITC в зеленый цвет. Контрольные, необработанные клетки (None), в которых нет фрагментированной ДНК, а также клетки, обработанные юглоном, не включили зеленую флуоресцентную метку, а имеющаяся геномная ДНК в них окрашена пропидиум-иодидом (PI) в красный цвет (см. фиг.10). Таким образом, согласно результатам, полученным методом TUNEL, антиопухолевое действие гликозидов 3 и 11 заключается в стимуляции (индукции) апоптоза в опухолевых клетках. В тех же условиях клетки, обработанные юглоном, не давали окрашивания красителем FITC, что свидельствует об отсутствии апоптоза.An in-depth study of the cause of cytoxic changes caused by glycosides 2-15 in leukemic cells was carried out on the example of structurally related glycosides of juglon 3 and 11 using the TUNEL method (see paragraph 8. Materials and methods). In this method, the fragmented DNA that appears in the cell during apoptotic transformations is stained with the FITC fluorescent dye according to the TUNEL method and gives green fluorescence, and genomic DNA is stained with another fluorescent dye, propidium iodide (PI) in red. HL-60 leukemia cells were treated with juglone 1 (Juglone) and its glycosides 3 (U-112) and 11 (TU-299) at a concentration of 1 μM. The results indicate that the effect of glycosides 3 (U-112) and 11 (TU-299) on HL-60 cells is due to the induction of apoptosis, which is proved by staining the fragmented DNA of the treated cells with FITC dye green. Control, untreated cells (None), in which there is no fragmented DNA, as well as cells treated with juglon, did not include a green fluorescent label, and the existing genomic DNA in them was stained with red propidium iodide (PI) (see Fig. 10) . Thus, according to the results obtained by the TUNEL method, the antitumor effect of glycosides 3 and 11 consists in stimulating (inducing) apoptosis in tumor cells. Under the same conditions, cells treated with juglon did not stain with FITC dye, which indicates the absence of apoptosis.

5. Изучение влияния производных юглона на ред/окс цикл глутатиона.5. The study of the effect of juglone derivatives on the red / ox cycle of glutathione.

Влияние гликозидов 3 или 11 и юглона (1) на уровень общего глутатиона (GSSG) и восстановленной формы (GSH) в клетках HL-60 определяли с использованием колориметрического GSSG/ GSH ред/окс теста (см п.9. Материалы и методы). Как видно из данных, представленных на фиг.11, предварительная обработка клеток лейкемии HL-60 гликозидами юглона 3 (U-112) и 11 (TU-299) в концентрации 1 µM приводит к резкому (на 90%) снижению уровня глутатиона. Это свидетельствует о том, что гликозиды 5-гидрокси-14-нафтохинона в клетках лейкемии HL-60 вовлекаются во внутриклеточные окислительно-восстановительные процессы, в ходе которых генерируются свободные радикалы, которые в свою очередь, быстро окисляют глутатион в глутатион-дисульфид (S. Ache. // Antitumor quinones. // Mini-Reviews In Medicinal Chemistry. 2005, 5, 449-467). Воздействие юглона в тех же условиях и в той же концентрации 1 µМ лишь немного увеличивает уровень глутатиона в клетках. Так как окислительный стресс является одним из факторов, приводящих к апоптотическим изменениям клетки, наблюдаемое резкое снижение уровня глутатиона является свидетельством того, что гликозиды 3 и 11, генерируя свободные радикалы, способны эффективно, в отличие от юглона, стимулировать апоптоз в клетках лейкемии HL-60 путем создания в них окислительного стресса.The effect of glycosides 3 or 11 and juglon (1) on the level of total glutathione (GSSG) and reduced form (GSH) in HL-60 cells was determined using the colorimetric GSSG / GSH red / ox test (see clause 9. Materials and methods). As can be seen from the data presented in Fig. 11, pretreatment of HL-60 leukemia cells with glycosides of juglone 3 (U-112) and 11 (TU-299) at a concentration of 1 μM leads to a sharp (90%) decrease in glutathione level. This suggests that 5-hydroxy-14-naphthoquinone glycosides in HL-60 leukemia cells are involved in intracellular redox processes, during which free radicals are generated, which in turn quickly oxidize glutathione to glutathione disulfide (S. Ache. // Antitumor quinones. // Mini-Reviews In Medicinal Chemistry. 2005, 5, 449-467). Exposure to a juglone under the same conditions and at the same concentration of 1 μM only slightly increases the level of glutathione in the cells. Since oxidative stress is one of the factors leading to apoptotic changes in the cell, the observed sharp decrease in glutathione levels indicates that glycosides 3 and 11, generating free radicals, are able, effectively, in contrast to juglon, to stimulate apoptosis in HL-60 leukemia cells by creating oxidative stress in them.

6. Влияние производных юглона на проницаемость митохондриальной мембраны клеток лейкемии HL-60.6. The effect of juglone derivatives on the permeability of the mitochondrial membrane of HL-60 leukemia cells.

Влияние гликозидов 3 и 11, а также юглона на проницаемость митохондриальной мембраны клеток лейкемии HL-60 изучали методом, описанным в п.10. (Материалы и методы). На Фиг.12 представлены эффекты юглона 1 (Juglone) и гликозидов юглона 3 (U-112) и 11 (TU-299), взятых в концентрации 1 µМ, а также различных антиоксидантов на проницаемость митохондриальных мембран в клетках HL-60. Показано, что гликозиды 3 и 11, в отличие от юглона, значительно (на 40-45%) изменяют мембранную проницаемость митохондрий, что впоследствие может привести к выходу цитохрома С из митохондрий и образованию апоптосомы в цитоплазме, которая в свою очередь активирует каспазу-9 и запускает таким образом механизм клеточного апоптоза. Наблюдаемое изменение мембранной проводимости блокируется только одним из четырех исследованных антиоксидантов, а именно глутатионом, что подтверждает результаты экспериментов по влиянию гликозидов 3 и 11 на внутриклеточный уровень глутатиона (Фиг.11).The effect of glycosides 3 and 11, as well as a juglon on the permeability of the mitochondrial membrane of HL-60 leukemia cells, was studied by the method described in paragraph 10. (Materials and methods). 12 shows the effects of juglone 1 (Juglone) and glycosides of juglone 3 (U-112) and 11 (TU-299) taken at a concentration of 1 μM, as well as various antioxidants on the permeability of mitochondrial membranes in HL-60 cells. It was shown that glycosides 3 and 11, unlike the yuglon, significantly (40-45%) change the membrane permeability of mitochondria, which subsequently can lead to the release of cytochrome C from mitochondria and the formation of apoptosome in the cytoplasm, which in turn activates caspase-9 and thus triggers the mechanism of cellular apoptosis. The observed change in membrane conductivity is blocked by only one of the four antioxidants studied, namely glutathione, which confirms the results of experiments on the effect of glycosides 3 and 11 on the intracellular level of glutathione (Figure 11).

7. Влияние гликозидов 3 (U-112) и 11 (TU-299), а также юглона 1 (Juglone) на внутриклеточные уровни прокаспаз-3, -8 и -9, измеренное методом вестерн иммуноблоттинга.7. The effect of glycosides 3 (U-112) and 11 (TU-299), as well as juglone 1 (Juglone) on intracellular levels of procaspase-3, -8 and -9, measured by Western immunoblotting.

На поздних стадиях апоптоза в клетках происходит активация набора внутриклеточных белков - ферментов, каспаз, вызывающих расщепление внутриклеточных биополимеров. В нормальных клетках эти белки находятся в неактивной форме, в виде предшественников - прокаспаз. В экспериментах по вестерн-блоттингу (см п.11 Материалы и методы), проведенных на клетках лейкемии HL-60, установлено, что гликозиды 3 и 11, в отличие от юглона, снижают уровень прокаспаз-3, -8, -9 в клетках (Фиг.13). Мы полагаем, что снижение уровня прокаспаз связано с их превращением в активную форму, при обработке клеток гликозидами юглона. Для обоснования этого вывода были проведены опыты по индукции апоптоза в клетках HL-60 и ТНР-1, предварительно обработанных ингибиторами прокаспаз (панкаспазы, каспазы-3, каспазы-8) при концентрациях ингибиторов 25 µМ. Полученные данные представлены в таблице 5. Значительное, в 2-4 раза, снижение уровня апоптоза в клетках, обработанных ингибиторами прокаспаз, указывает на то, что индуцируемый гликозидами 3 и 11 апоптоз в лейкемических клетках человека является каспазозависимым.In the late stages of apoptosis in cells, a set of intracellular proteins is activated - enzymes, caspases that cause the splitting of intracellular biopolymers. In normal cells, these proteins are in an inactive form, in the form of precursors - procaspases. In experiments on Western blotting (see clause 11 Materials and methods) conducted on HL-60 leukemia cells, it was found that glycosides 3 and 11, unlike juglons, reduce the level of procaspase-3, -8, -9 in cells (Fig.13). We believe that a decrease in the level of procaspases is associated with their conversion to the active form, when the cells are treated with juglon glycosides. To substantiate this conclusion, experiments were conducted on the induction of apoptosis in HL-60 and THP-1 cells pretreated with procaspase inhibitors (pancaspase, caspase-3, caspase-8) at inhibitor concentrations of 25 μM. The data obtained are presented in table 5. A significant 2-4-fold decrease in the level of apoptosis in cells treated with procaspase inhibitors indicates that apoptosis induced by glycosides 3 and 11 in human leukemic cells is caspase-dependent.

Таблица 5Table 5 Влияние гликозидов 3 и 11 на величину общего (тотального) апоптоза клеток лейкемии HL-60 и ТНР-1, предварительно обработанных ингибиторами прокаспаз в концентрации 25 µМ, определенное методом проточной цитометрииThe effect of glycosides 3 and 11 on the total (total) apoptosis of HL-60 and THP-1 leukemia cells pretreated with procaspase inhibitors at a concentration of 25 μM, determined by flow cytometry Тип клеточной культурыType of cell culture № гликозидаGlycoside number Наименование ингибитора (объект ингибирования) Количество апоптотических клеток в процентахName of inhibitor (object of inhibition) The number of apoptotic cells in percent Контроль**The control** zVAD-fmk (панкаспаза)zVAD-fmk (pan-caspase) zDEVD-fmk (каспаза-3)zDEVD-fmk (caspase-3) zIETD-fmk (каспаза-8)zIETD-fmk (caspase-8) HL-60Hl-60 3*3 * 85.0±5.585.0 ± 5.5 65.765.7 59.759.7 55.255.2 11*eleven* 83.4+11.883.4 + 11.8 49.749.7 45.145.1 42.442.4 ТНР-1TNR-1 3*3 * 78.1±11.178.1 ± 11.1 27.227.2 28.928.9 26.526.5 11*eleven* 63.7±14.563.7 ± 14.5 13.213.2 31.831.8 26.626.6 * Концентрация гликозидов 1 µМ.
** Представленные данные являются результатом трех независимых экспериментов.* The concentration of glycosides is 1 μM.
** The data presented are the result of three independent experiments.

Сопоставляя представленные результаты, полученные при изучении способности юглона и его О- и S-гликозидов индуцировать апоптотические изменения в клетках различных типов человеческой лейкемии, можно видеть, что в действии заявляемых гликозидов юглона и их прототипа (юглона) имеются существенные отличия. Юглон, как и его гликозидные производные, способен вызывать гибель клеток лейкемии человека HL-60, ТНР-1, NB4 и К562. Однако исследованные гликозиды юглона превосходят прототип (юглон) в качестве индукторов апоптоза по эффективности в 2-3 раза (например, при концентрации 1 µM) (см. фиг.4, 6, 7).Comparing the presented results obtained by studying the ability of a yuglon and its O- and S-glycosides to induce apoptotic changes in cells of various types of human leukemia, it can be seen that there are significant differences in the effect of the claimed glycosides of the yuglon and their prototype (yuglon). Yuglon, like its glycosidic derivatives, is capable of causing the death of human leukemia cells HL-60, THP-1, NB4, and K562. However, the studied Juglone glycosides outperform the prototype (Juglon) as apoptosis inducers in efficiency by 2–3 times (for example, at a concentration of 1 μM) (see Figs. 4, 6, 7).

Другим важным преимуществом заявляемых веществ является их способность индуцировать апоптоз в более короткие сроки. Так, если среди опухолевых клеток лейкемии HL-60 спустя 6 часов после их обработки гликозидами 40% клеток вступают в апоптоз, то прототип юглон способен индуцировать апоптоз всего в 8% клеток (см. фиг.8). Эксперименты с применением вестерн-иммуноблоттинга, показывают, что действие юглона на лейкозные клетки не вызывает активирования каспаз-3, 8, 9 (см. фиг.13), являющихся ключевыми внутриклеточными маркерами апоптоза.Another important advantage of the claimed substances is their ability to induce apoptosis in a shorter time. So, if among the tumor cells of HL-60 leukemia, 6 hours after their treatment with glycosides, 40% of the cells enter into apoptosis, then the prototype juglon is able to induce apoptosis in only 8% of the cells (see Fig. 8). Experiments using Western immunoblotting show that the effect of a juglon on leukemia cells does not cause activation of caspases-3, 8, 9 (see Fig. 13), which are key intracellular markers of apoptosis.

Наличие фрагментированной ДНК (важный и существенный признак апоптоза) в клетках, подвергшихся действию гликозидов юглона, в отличие от клеток, подвергшихся действию юглона (см. фиг.10), также указывает на то, что при воздействии гликозидов лейкозные клетки подвергаются апоптозу, в то время как гибель клеток под действием юглона протекает по иному механизму (маршруту).The presence of fragmented DNA (an important and essential sign of apoptosis) in cells exposed to juglone glycosides, in contrast to cells exposed to juglons (see Fig. 10), also indicates that leukemia cells undergo apoptosis when exposed to glycosides while cell death under the action of a juglone proceeds by a different mechanism (route).

Если апоптоз, вызываемый гликозидами юглона в различных типах клеток лейкемии человека, подтвержден тремя различными методами, то природа гибели клеток, вызываемой юглоном, остается во многом невыясненной, поскольку их апоптоз не подтверждается двумя методами из трех использованных в эксперименте.If apoptosis caused by juglone glycosides in various types of human leukemia cells is confirmed by three different methods, then the nature of cell death caused by juglone remains largely unclear, since their apoptosis is not confirmed by two of the three methods used in the experiment.

Установленный нами факт различных механизмов действия исследованных нами веществ и прототипа - юглона на лейкозные клетки, в свою очередь, свидетельствует о том, что и потенциальные области применения этих веществ и юглона, например в качестве индуктора апоптоза при исследованиях в молекулярной биологии или в качестве средств для лечения лейкоза, могут быть совершенно различными.The fact that we have established of the various mechanisms of action of the substances and prototype studied by us - the juglon on leukemia cells, in turn, indicates that the potential applications of these substances and the juglon, for example, as an inducer of apoptosis in studies in molecular biology or as means for leukemia treatment can be completely different.

Claims

1. The use of derivatives of O-glycosides of 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone (juglon) of formula 1, where one of the radicals R ₁ or R ₂ is

a per-O-acetylated O-monoside or O-bioside carbohydrate radical with a 1,2-trans configuration of the O-glycosidic bond, and the second radical is H as a means of stimulating apoptosis of human leukemia cells.

2. The use of derivatives of O-glycosides of 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone (juglon) of formula 1, where both the radicals R ₁ and R ₂ are simultaneously per-O-acetylated O-monoside or O-bioside carbohydrate radicals with 1,2 -configuration of the O-glycosidic bond as a means of stimulating apoptosis of human leukemia cells.

3. The use of derivatives of S-glycosides of 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone (juglon) and their alkyl substituted derivatives of formula 1, where one of the radicals R ₁ or R ₂ is a per-O-acetylated S-monoside or S-bioside carbohydrate radical with the 1,2-trans configuration of the S-glycosidic bond, and the second radical is H, or a linear alkyl radical with a hydrocarbon chain with 1-8 carbon atoms as a means of stimulating apoptosis of human leukemia cells.

4. The use of derivatives of S-glycosides of 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone (juglon) and their alkyl substituted derivatives of formula 1, where both R ₁ and R ₂ are simultaneously per-O-acetylated S-monoside or S-bioside carbohydrate radicals with the 1,2-trans configuration of the S-glycosidic bond as a means of stimulating apoptosis of human leukemia cells.