RU2362805C1

RU2362805C1 - Line of cells of human melanoma kg, secreting recombinant granulocytic macrofagal colony-stimulating factor

Info

Publication number: RU2362805C1
Application number: RU2008105934/13A
Authority: RU
Inventors: Алексей Евгеньевич Бережной (RU); Алексей Евгеньевич Бережной; Сергей Сергеевич Ларин (RU); Сергей Сергеевич Ларин; Николай Васильевич Гнучев (RU); Николай Васильевич Гнучев; Георгий Павлович Георгиев (RU); Георгий Павлович Георгиев; Елена Сергеевна Захарова (RU); Елена Сергеевна Захарова; Анатолий Юрьевич Барышников (RU); Анатолий Юрьевич Барышников; Лев Вадимович Демидов (RU); Лев Вадимович Демидов; Ирина Николаевна Михайлова (RU); Ирина Николаевна Михайлова; Ольга Семеновна Бурова (RU); Ольга Семеновна Бурова; Лидия Федоровна Морозова (RU); Лидия Федоровна Морозова
Original assignee: Институт Биологии Гена Российской Академии Наук
Priority date: 2008-02-19
Filing date: 2008-02-19
Publication date: 2009-07-27

Abstract

FIELD: biotechnologies.

SUBSTANCE: invention relates to field of biotechnology, namely, to obtaining genetically modified cell lines and can be applied in medicine for immunotherapy and immuno-prophylaxis in patients with malignant neoplasms. By means of recombinant method line of cells of human melanoma KG is obtained, which secretes recombinant granulocytic-macrofagal colony-stimulating human factor. Obtained line is deposited with Specialised cell culture collection of vertebrates of Russian cell culture collection under number RCCC ("П") 699"Д".

EFFECT: line of human melanoma cells KG possesses stable cultural, morphological and immunological characteristics and possesses ability to secrete recombinant human GM-CSF, remaining after cell inactivation with ionising irradiation.

Description

Область техники настоящего изобретенияThe technical field of the present invention

Изобретение относится к области биологии и медицины, в частности к получению генно-модифицированных клеточных линий, используемых для иммунотерапии и иммунопрофилактики у пациентов со злокачественными новообразованиями.The invention relates to the field of biology and medicine, in particular to the production of genetically modified cell lines used for immunotherapy and immunoprophylaxis in patients with malignant neoplasms.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретенияBACKGROUND OF THE INVENTION

Активация иммунной системы может останавливать пролиферацию микрометастатических очагов опухолевых клеток, персистирующих в организме больных злокачественными новообразованиями после циторедуктивных вмешательств [1]. Более того, при помощи иммунотерапии можно добиться уменьшения и даже исчезновения относительно крупных метастазов и первичных опухолевых узлов в тех случаях, когда иные способы терапии невозможны. В литературе описан случай регресса опухоли размером в 690 кубических сантиметров в результате адоптивного переноса противоопухолевых Т-лимфоцитов [2]. Также отмечены случаи достижения полной ремиссии онкологических заболеваний после противоопухолевой вакцинации цельноклеточными генно-инженерными вакцинами [3].Activation of the immune system can stop the proliferation of micrometastatic foci of tumor cells that persist in the body of patients with malignant neoplasms after cytoreductive interventions [1]. Moreover, with the help of immunotherapy, it is possible to reduce and even disappear relatively large metastases and primary tumor nodes in cases where other methods of therapy are impossible. A case of tumor regression measuring 690 cubic centimeters as a result of adoptive transfer of antitumor T-lymphocytes has been described in the literature [2]. Cases of achieving complete remission of oncological diseases after antitumor vaccination with whole-cell genetically engineered vaccines have also been noted [3].

Известно два разных пути создания протективного иммунитета - активный и пассивный. Активной иммунизацией, или вакцинацией, называют стимуляцию формирования собственных антигенспецифических антител или Т-клеток при помощи введения целевого антигена в комбинации со средствами, индуцирующими иммунный ответ. Напротив, пассивная иммунизация подразумевает перенос сформированных в другом организме эффекторов иммунного ответа - иммуноглобулинов или лимфоцитов. Как и активная иммунотерапия, адоптивный перенос способен оказывать выраженное противоопухолевое действие [2].Two different ways of creating protective immunity are known - active and passive. Active immunization, or vaccination, is called the stimulation of the formation of their own antigen-specific antibodies or T cells by introducing the target antigen in combination with agents that induce an immune response. In contrast, passive immunization involves the transfer of immune response effectors formed in another organism — immunoglobulins or lymphocytes. Like active immunotherapy, adoptive transfer is able to have a pronounced antitumor effect [2].

Среди наиболее эффективных форм активации собственного противоопухолевого иммунитета пациента выделяют цельноклеточные противоопухолевые вакцины, секретирующие иммуномодулирующие цитокины. Для получения таких вакцин опухолевые клетки трансфицируют генными конструкциями, кодирующими соответствующие цитокины, инактивируют гамма-облучением и вводят в организм больных. Секреция опухолевыми клетками таких цитокинов, как гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), интерлейкин-2 (IL-2), IL-12 способствует формированию сильного специфичного противоопухолевого иммунного ответа. Последние достижения в области активной специфической иммунотерапии связаны с применением вакцин на основе клеток, секретирующих химерные молекулы, состоящие из активных центров нескольких цитокинов (например, GIFT, соединяющий активность GM-CSF и IL-2) [4].Among the most effective forms of activation of a patient's own antitumor immunity, whole-cell antitumor vaccines secreting immunomodulating cytokines are distinguished. To obtain such vaccines, tumor cells are transfected with gene constructs encoding the corresponding cytokines, inactivated by gamma radiation, and introduced into the body of patients. The secretion by tumor cells of cytokines such as granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), interleukin-2 (IL-2), IL-12 promotes the formation of a strong specific anti-tumor immune response. Recent advances in the field of active specific immunotherapy are associated with the use of vaccines based on cells secreting chimeric molecules consisting of the active centers of several cytokines (for example, GIFT, which combines the activity of GM-CSF and IL-2) [4].

Вакцинация аутологичными опухолевыми клетками пациентов сопряжена со многими техническими сложностями, такими как доступность опухоли для хирургического удаления, возможность установления краткосрочных культур опухолевых клеток, количество получаемых клеток, эффективность доставки терапевтического гена и уровень его экспрессии. В связи с этим D.Pardoll предложил использовать для вакцинации аллогенные стабильно трансфицированные клетки с высоким уровнем экспрессии GM-CSF [1]. Идея была подкреплена установленным фактом кросс-презентации опухолевых антигенов дендритными клетками пациента, а также тем, что многие из иммунологически значимых опухолевых антигенов оказались общими как для опухолей одинакового гистологического происхождения, так и для новообразований различного генеза.Vaccination with autologous tumor cells of patients is fraught with many technical difficulties, such as the availability of a tumor for surgical removal, the ability to establish short-term cultures of tumor cells, the number of cells received, the efficiency of delivery of the therapeutic gene and its expression level. In this regard, D. Pardoll proposed using allogeneically stably transfected cells with high GM-CSF expression for vaccination [1]. The idea was supported by the established fact of the cross-presentation of tumor antigens by the patient’s dendritic cells, as well as the fact that many of the immunologically significant tumor antigens were common both for tumors of the same histological origin and for neoplasms of different genesis.

Несмотря на то, что подход заостряет вопрос адекватности антигенов вакцины и собственно опухоли, проведенные клинические испытания показали, что эффективность аллогенной вакцинации не уступает результатам, полученным при помощи аутологичных клеток [5]. Более того, эффект аллогенной стимуляции и возможность вводить действительно большие количества клеток пациентам с незначительным объемом опухолевого поражения позволили получить наиболее значительные результаты за всю историю активной специфической иммунотерапии опухолей [3].Despite the fact that the approach raises the question of the adequacy of vaccine antigens and the tumor itself, clinical trials have shown that the effectiveness of allogeneic vaccination is not inferior to the results obtained using autologous cells [5]. Moreover, the effect of allogeneic stimulation and the ability to administer really large numbers of cells to patients with a small volume of tumor damage allowed to obtain the most significant results in the history of active specific tumor immunotherapy [3].

Через некоторое время после введения вакцины, представляющей собой инактивированные генно-модифицированные опухолевые клетки, секретирующие GM-CSF, в области инъекции создается градиент концентрации этого цитокина. GM-CSF вызывает положительный хемотаксис и активацию моноцитов и гранулоцитов крови, а также тканевых макрофагов. Иммуногистохимическое исследование области введения вакцины через 24-48 часов после инъекции выявляет инфильтрацию гранулоцитами и клетками моноцитарного/макрофагального ряда [6]. Под действием GM-CSF повышается продукция IL-1 и фактора некроза опухолей (TNF) макрофагами и развивается местная воспалительной реакция, в процессе которой макрофаги, гранулоциты и дополнительно привлекаемые в область инъекции NK и NKT-клетки постепенно уничтожают введенные клетки вакцины.Some time after the introduction of the vaccine, which is an inactivated genetically modified tumor cells secreting GM-CSF, a concentration gradient of this cytokine is created in the injection area. GM-CSF causes positive chemotaxis and activation of blood monocytes and granulocytes, as well as tissue macrophages. An immunohistochemical study of the vaccine administration area 24-48 hours after injection reveals infiltration with granulocytes and monocytic / macrophage cells [6]. Under the influence of GM-CSF, the production of IL-1 and tumor necrosis factor (TNF) by macrophages increases and a local inflammatory reaction develops, during which macrophages, granulocytes and NK and NKT cells additionally attracted to the injection area gradually destroy the introduced vaccine cells.

Ключевым фактором, обусловливающим иммуногенность GM-CSF-секретирующих вакцин, является способность этого цитокина индуцировать дифференцировку ранних предшественников в направлении наиболее эффективных профессиональных антигенпрезентирующих клеток - дендритных клеток [7]. Показано, что этот процесс происходит в области инъекции секретирующих GM-CSF опухолевых клеток, если введенные клетки продуцируют достаточное количество цитокина - не менее 36 нг на 10⁶ клеток за 24 часа [3]. Существенно то, что максимальная концентрация GM-CSF создается в непосредственной близости от инъецируемых генно-модифицированных клеток. В результате в зрелые дендритные клетки (DC) дифференцируются их предшественники, локализующиеся около клеток вакцины, и, следовательно, фагоцитирующие продукты распада опухолевых клеток. Исследование последовательных биоптатов места инъекции вакцины показывает, что уже к 3-4 суткам среди инфильтрирующих область клеток наблюдается значительное количество DC, экспрессирующих молекулы костимуляции, а к 5 суткам эти клетки обнаруживают в регионарных лимфатических узлах [9].A key factor determining the immunogenicity of GM-CSF-secreting vaccines is the ability of this cytokine to induce differentiation of early progenitors in the direction of the most effective professional antigen-presenting cells - dendritic cells [7]. It was shown that this process occurs in the area of injection of tumor-secreting GM-CSF tumor cells if the introduced cells produce a sufficient amount of cytokine - at least 36 ng per 10 ⁶ cells in 24 hours [3]. It is significant that the maximum concentration of GM-CSF is created in the immediate vicinity of the injected genetically modified cells. As a result, their precursors localized near vaccine cells and, consequently, phagocytic decay products of tumor cells differentiate into mature dendritic cells (DC). The study of successive biopsy samples of the injection site of the vaccine shows that by 3-4 days, among the cells that infiltrate the region, a significant amount of DC expressing costimulation molecules is observed, and by 5 days these cells are found in regional lymph nodes [9].

Дальнейшие этапы иммунного ответа заключаются в презентации антигенных пептидов из опухолевых антигенов в контексте молекул главного комплекса гистосовместимости (МНС) II класса наивным CD4⁺ Т-хелперам (Th₀), что стимулирует их дифференцировку в зрелые Т-хелперы 1 и 2 типов. В результате кросс-презентации опухолевых антигенов дендритными клетками происходит праймирование наивных CD8⁺ Т-лимфоцитов, что стимулирует их дифференцировку в функционально активные цитотоксические Т-лимфоциты. CD4⁺Т-хелперы первого типа способствуют формированию клонов CD8⁺CTL. Кроме этого, было обнаружено, что метастазы вакцинируемых GM-CSF-секретирующими вакцинами пациентов оказываются обильно инфильтрированы лимфоцитами, большая часть (до 96%) которых является CD4⁺Th₁-клетками, эффекторами реакции гиперчувствительности замедленного (туберкулинового) типа [3, 10, 11].Further stages of the immune response consist in the presentation of antigenic peptides from tumor antigens in the context of molecules of the main histocompatibility complex (MHC) of class II by naive CD4 ⁺ T-helpers (Th ₀ ), which stimulates their differentiation into mature T-helpers of types 1 and 2. As a result of the cross-presentation of tumor antigens by dendritic cells, naive CD8 ⁺ T-lymphocytes are primed, which stimulates their differentiation into functionally active cytotoxic T-lymphocytes. CD4 ⁺ T-helpers of the first type contribute to the formation of CD8 ⁺ CTL clones. In addition, it was found that metastases of patients vaccinated with GM-CSF-secreting vaccines are found to be abundantly infiltrated by lymphocytes, most of which (up to 96%) are CD4 ⁺ Th ₁ -cells, delayed (tuberculin) type hypersensitivity reaction effectors [3, 10, eleven].

Другая субпопуляция Т-лимфоцитов - CD8⁺CTL - осуществляют уничтожение опухолевых клеток и клеток эндотелия опухолевой стромы в случае распознавания кросс-презентируемых ими опухолевых антигенов. Для реализации противоопухолевого эффекта необходима секреция интерферона-гамма [12]. Под действием интерферона-гамма усиливается экспрессия МНС I на клетках опухоли и опухолевой стромы, что повышает эффективность распознавания и мощность активирующего сигнала и тем самым позволяет Т-клетке осуществлять индукцию апоптоза в клетке-мишени: выделяемый цитотоксическими клетками (CTL) перфорин формирует поры в клеточной мембране мишени, через которые в опухолевую клетку проникает гранзим В, который запускает каскад программированной клеточной гибели. Весьма вероятно, кроме данного механизма используются и другие способы уничтожения опухолевых клеток как Т-лимфоцитами, так и другими клетками. В частности, способность уничтожать клетки различных опухолей проявляют NK и NKT-клетки, а также активированные различными факторами (в том числе, и GM-CSF) гранулоциты и макрофаги.Another subpopulation of T-lymphocytes - CD8 ⁺ CTL - destroy tumor cells and tumor stromal endothelial cells in case of recognition of tumor antigens that they cross-present. To realize the antitumor effect, the secretion of interferon-gamma is necessary [12]. Under the action of interferon-gamma, the expression of MHC I on tumor cells and tumor stroma is enhanced, which increases the recognition efficiency and the power of the activating signal and thereby allows the T cell to induce apoptosis in the target cell: perforin released by cytotoxic cells (CTL) forms pores in the cell the target membrane through which granzyme B enters the tumor cell, which triggers a cascade of programmed cell death. In addition to this mechanism, it is very likely that other methods of killing tumor cells with both T-lymphocytes and other cells are also used. In particular, NK and NKT cells, as well as granulocytes and macrophages activated by various factors (including GM-CSF), show the ability to destroy cells of various tumors.

В ряде клинических испытаний было показано, что применение GM-CSF-секретирующих вакцин влияет на уровень этого цитокина в сыворотке крови пациентов, что стимулирует пролиферацию ранних миелоидных предшественников и, в том числе, предшественников дендритных клеток, что может быть существенно для противоопухолевого эффекта иммунизации [5].A number of clinical trials have shown that the use of GM-CSF-secreting vaccines affects the level of this cytokine in the blood serum of patients, which stimulates the proliferation of early myeloid precursors, including dendritic cell precursors, which may be essential for the antitumor effect of immunization [ 5].

Цельноклеточные противоопухолевые вакцины на основе GM-CSF могут представлять собой транзиторно трансфицированные аутологичные клетки пациента, получаемые после хирургического удаления опухоли, либо же аллогенные опухолевые клетки культивируемых in vitro клеточных культур, секретирующих GM-CSF в результате транзиторной или стабильной трансфекции. Между этими двумя подходами существуют значительные различия как в иммунологических эффектах, так и в технологии приготовления вакцины.Whole-cell antitumor vaccines based on GM-CSF can be transiently transfected autologous patient cells obtained after surgical removal of the tumor, or allogeneic tumor cells of in vitro cultured cell cultures secreting GM-CSF as a result of transient or stable transfection. Between these two approaches, there are significant differences in both the immunological effects and the vaccine preparation technology.

Аутологичной вакцинации всегда предшествует хирургическое вмешательство, необходимое для того, чтобы получить опухолевую ткань. Из удаленных опухолевых узлов получают моноклеточную суспензию, которую культивируют in vitro в виде краткосрочной культуры клеток. Далее клетки трансфицируют генной конструкцией, кодирующей GM-CSF, инактивируют путем ионизирующего облучения и в таком виде вводят пациентам; часть клеток консервируют замораживанием для последующих вакцинаций. Продолжительность процесса приготовления вакцины составляет от 20 суток до трех месяцев [8].Autologous vaccination is always preceded by the surgical intervention necessary to obtain tumor tissue. A single cell suspension is obtained from the removed tumor nodes, which is cultured in vitro as a short-term cell culture. Next, the cells are transfected with a gene construct encoding GM-CSF, inactivated by ionizing radiation, and administered to patients as such; part of the cells is preserved by freezing for subsequent vaccinations. The duration of the vaccine preparation process is from 20 days to three months [8].

Существенным недостатком аутологичной вакцинации является необходимость проделывать все перечисленные манипуляции индивидуально для каждого пациента. Это приводит к тому, что метод крайне сложно стандартизовать, и резко повышается стоимость вакцинации. Очевидно также, что аутологичную вакцинотерапию можно проводить только тем пациентам, опухоль которых доступна для хирургической резекции.A significant drawback of autologous vaccination is the need to do all of the above manipulations individually for each patient. This leads to the fact that the method is extremely difficult to standardize, and the cost of vaccination rises sharply. It is also obvious that autologous vaccine therapy can be carried out only for those patients whose tumor is available for surgical resection.

Ограничением подхода является и количество получаемых от пациента клеток. Как правило, значительное количество клеток удается получить от пациентов с крупными и многочисленными опухолевыми узлами. Такие пациенты часто находятся в тяжелом состоянии, имеют явно выраженную вторичную иммуносупрессию и, как следствие, слабо отвечают на иммунотерапию. Напротив, пациенты с невысокой степенью прогрессии и распространения опухолевого процесса, обладающие высоким шансом на результативную вакцинацию, в большинстве случаев имеют опухоли меньшего размера, из которых не удается получить достаточного числа клеток.A limitation of the approach is the number of cells received from the patient. As a rule, a significant number of cells can be obtained from patients with large and numerous tumor nodes. Such patients are often in serious condition, have pronounced secondary immunosuppression and, as a result, respond poorly to immunotherapy. On the contrary, patients with a low degree of progression and spread of the tumor process, who have a high chance of successful vaccination, in most cases have smaller tumors, from which it is not possible to obtain a sufficient number of cells.

Проведенные клинические испытания аутологичных GM-CSF-секретирующих вакцин показали, что эффективность вакцинотерапии зависит не только от количества вводимых клеток, но и от количества секретируемого ими цитокина [5]. Продуктивность клеток вакцины принято оценивать по количеству GM-CSF, секретируемого за сутки одним миллионом клеток, культивируемых in vitro. Соответственно в условиях транзиторной трансфекции эта продуктивность зависит как от доли трансфицированных клеток, так и от количества цитокина, вырабатываемого каждой такой клеткой. Несмотря на то, что применяемые в настоящее время векторы на основе аденоассоциированных вирусов позволяют добиваться высокой продуктивности, сохраняется известная зависимость результата вакцинотерапии как от эффективности трансфекции, так и от способности клеток индивидуума продуцировать достаточное количество цитокина [5, 9, 13].Clinical trials of autologous GM-CSF-secreting vaccines have shown that the effectiveness of vaccine therapy depends not only on the number of introduced cells, but also on the amount of cytokine secreted by them [5]. Vaccine cell productivity is usually estimated by the number of GM-CSF secreted per day by one million cells cultured in vitro. Accordingly, under conditions of transient transfection, this productivity depends both on the proportion of transfected cells and on the amount of cytokine produced by each such cell. Despite the fact that currently used vectors based on adeno-associated viruses allow achieving high productivity, the known dependence of the result of vaccine therapy on both the efficiency of transfection and the ability of individual cells to produce a sufficient amount of cytokine remains [5, 9, 13].

Значимым фактором, отрицательно сказывающимся на эффективности аутологичной вакцинотерапии, является период времени, необходимый для приготовления вакцины. Известно, что непосредственно после удаления основной опухоли в организме больного происходят изменения, приводящие к стимуляции роста удаленных метастазов [14]. В этот же период исчезает или ослабляется ряд факторов, обусловливавших подавление противоопухолевого иммунного ответа, и формируются условия для развития эффективного противоопухолевого иммунитета. В случае, когда иммунизацию проводят в первые дни после удаления опухоли, ее эффективность становится существенно выше. Наоборот, вакцинотерапия, начатая через 15 или более суток после хирургической санации, оказывается менее эффективной за счет того, что остающиеся в организме опухолевые клетки получают необходимое время, чтобы адаптироваться, сформировать строму и эффективно противостоять иммунному ответу [5].A significant factor that negatively affects the effectiveness of autologous vaccine therapy is the period of time required to prepare the vaccine. It is known that immediately after removal of the main tumor in the patient’s body, changes occur that lead to stimulation of the growth of distant metastases [14]. In the same period, a number of factors that suppress the suppression of the antitumor immune response disappear or weaken and conditions are formed for the development of an effective antitumor immunity. In the case when the immunization is carried out in the first days after removal of the tumor, its effectiveness becomes significantly higher. On the contrary, vaccine therapy started 15 or more days after surgical debridement is less effective due to the fact that the remaining tumor cells in the body receive the necessary time to adapt, form a stroma and effectively resist the immune response [5].

В то же время вакцинотерапия аутологичными опухолевыми клетками обладает существенным преимуществом вследствие максимального иммунологического соответствия антигенного состава вакцины и исходной опухоли. Одной из наиболее важных составляющих эффекторной части иммунного ответа на опухоль является цитотоксическая активность CD8⁺Т-лимфоцитов, специфичных к определенным опухолевым антигенам. Необходимым условием осуществления цитотоксической активности является экспрессия в клетках опухоли специфического антигена, а также его презентация в контексте молекул МНС I класса. В то же время для формирования клонов CTL с противоопухолевой активностью требуется введение того же антигена в составе вакцинопрепарата. Установлено, что опухолевые клетки содержат, как правило, не один антиген, а некоторый их набор из нескольких десятков известных антигенов, уникальный для каждой опухоли [15]. В условиях экспериментальных исследований показано, что чем ближе антигенный состав вакцины и опухоли, тем большего эффекта можно добиваться при помощи цельноклеточной вакцинотерапии. Важно также и то, что влияние на формирование и эффективность иммунного ответа оказывает не только наличие или отсутствие определенного антигена в клетках вакцины, но и соотношение количества отдельных антигенов. Несмотря на то, что антигенный состав хирургически удаленной опухоли и ее оставшихся в организме метастазов может различаться, вакцины, созданные на основе аутологичных клеток, максимально приближены по антигенному составу к опухолевым клеткам пациента [16].At the same time, vaccine therapy with autologous tumor cells has a significant advantage due to the maximum immunological correspondence of the antigenic composition of the vaccine and the original tumor. One of the most important components of the effector part of the immune response to a tumor is the cytotoxic activity of CD8 ⁺ T-lymphocytes specific for specific tumor antigens. A necessary condition for the implementation of cytotoxic activity is the expression of a specific antigen in the tumor cells, as well as its presentation in the context of MHC class I molecules. At the same time, the formation of CTL clones with antitumor activity requires the introduction of the same antigen in the composition of the vaccine. It has been established that tumor cells contain, as a rule, not one antigen, but a certain set of several dozen known antigens, unique for each tumor [15]. In experimental studies, it was shown that the closer the antigenic composition of the vaccine and the tumor, the greater the effect can be achieved using whole-cell vaccine therapy. It is also important that the formation and effectiveness of the immune response is influenced not only by the presence or absence of a specific antigen in the vaccine cells, but also by the ratio of the number of individual antigens. Despite the fact that the antigenic composition of a surgically removed tumor and its remaining metastases in the body may vary, vaccines created on the basis of autologous cells are as close as possible to the tumor cells of the patient [16].

В отличие от аутологичных вакцин аллогенные вакцины представляют собой модифицированные клетки, ранее полученные от других пациентов и некоторое время культивируемые in vitro. Как правило, это стабильные, однородные, хорошо пролиферирующие клеточные линии с высоким содержанием иммуногенных опухолеассоциированных антигенов, общих для многих видов опухолей [17]. Выбранные для приготовления вакцины линии трансфицируют генными конструкциями, кодирующими GM-CSF, и далее проводят селекцию и клонирование, в результате которого получают стабильный клон - вариант исходной клеточной линии, все клетки которого секретируют определенное количество цитокина. При помощи дальнейших модификаций (повторной трансфекции, субклонирования, амплификации) возможно получение стабильного варианта клеточной линии с очень высокой продуктивностью. Полученные таким образом клоны создают основу аллогенной вакцины: клетки одного такого клона, нескольких вариантов модификации одной исходной линии или даже комбинация клонов нескольких разных линий выращивают в необходимом количестве, инактивируют гамма-облучением и вводят пациентам.Unlike autologous vaccines, allogeneic vaccines are modified cells previously obtained from other patients and cultivated in vitro for some time. As a rule, these are stable, homogeneous, well-proliferating cell lines with a high content of immunogenic tumor-associated antigens common to many types of tumors [17]. The lines selected for preparation of the vaccine are transfected with gene constructs encoding GM-CSF, and then selection and cloning are carried out, as a result of which a stable clone is obtained - a variant of the original cell line, all cells of which secrete a certain amount of cytokine. With the help of further modifications (repeated transfection, subcloning, amplification), it is possible to obtain a stable variant of the cell line with very high productivity. The clones obtained in this way form the basis of an allogeneic vaccine: cells of one such clone, several variants of modification of one initial line, or even a combination of clones of several different lines are grown in the required amount, inactivated by gamma radiation, and administered to patients.

У аллогенных вакцин отсутствуют практически все технологические недостатки аутологичной вакцинации. Всем пациентам, включенным в программу биотерапии, вводят один и тот же препарат, заранее охарактеризованный по уровню продуктивности, экспрессии опухолеассоциированных антигенов, иммунофенотипу и т.д. Аллогенные вакцины не зависят от результатов хирургического лечения и могут быть применены у пациентов без оперативного вмешательства. Важно также и то, что начать вакцинотерапию возможно уже в первые дни после операции, или даже перед ней. При применении аллогенной вакцинации отсутствует техническое ограничение количества вводимых клеток, что позволяет применять большие количества клеток (до 500 миллионов клеток на одну вакцинацию), продуцирующих значительные количества GM-CSF, и тем самым добиваться максимально возможных результатов. Важным фактором является и то, что аллогенные вакцины существенно дешевле аутологичных и что их получение после разработки исходных клонов представляет собой гораздо менее трудоемкий процесс.Allogeneic vaccines lack almost all technological disadvantages of autologous vaccination. All patients included in the biotherapy program are given the same drug, previously characterized by the level of productivity, expression of tumor-associated antigens, immunophenotype, etc. Allogeneic vaccines are independent of the results of surgical treatment and can be used in patients without surgical intervention. It is also important that vaccine therapy can be started already in the first days after surgery, or even before it. When using allogeneic vaccination, there is no technical limitation on the number of introduced cells, which allows the use of large numbers of cells (up to 500 million cells per vaccination) producing significant amounts of GM-CSF, and thereby achieve the maximum possible results. An important factor is that allogeneic vaccines are significantly cheaper than autologous ones and that their preparation after the development of the initial clones is a much less labor-intensive process.

Вместе с тем, введение пациентам чужеродных для них аллогенных клеток требует тщательного подбора той или иной композиции вакцины для каждого конкретного пациента. Неактуальный для аутологичной вакцинации вопрос совместимости антигенного состава вакцины и опухоли становится принципиальным. В модельных системах было показано, что достаточно иммунизировать экспериментальных животных против одного из экспрессирующихся в опухоли антигенов, чтобы вызвать отторжение всей опухоли [18]. Вместе с тем, трансформированные вирусными онкогенами мышиные линии клеток, равно как и В-клеточные лимфомы представляют собой редчайшие случаи благоприятного совпадения наиболее критичных для иммунотерапии свойств опухолевых антигенов, таких как абсолютная специфичность для опухоли и необходимость антигена для выживания опухолевой клетки [19]. В подавляющем большинстве иных опухолей могут формироваться варианты опухолевых клеток, ускользающие от атаки Т-лимфоцитов и антител [20]. Теряющие антиген или необходимый для его презентации вариант МНС опухолевые субклоны становятся невосприимчивыми к иммунному ответу, продолжают расти и прогрессировать в организме и, в конечном итоге, приводят к его гибели.At the same time, the introduction to patients of allogeneic cells alien to them requires careful selection of one or another vaccine composition for each specific patient. The issue of compatibility of the antigenic composition of the vaccine and the tumor, which is irrelevant for autologous vaccination, becomes a matter of principle. In model systems, it was shown that it is sufficient to immunize experimental animals against one of the antigens expressed in the tumor to cause rejection of the entire tumor [18]. At the same time, murine cell lines transformed by viral oncogenes, as well as B-cell lymphomas, represent the rarest cases of favorable coincidence of the most critical properties of tumor antigens for immunotherapy, such as absolute specificity for the tumor and the need for antigen for tumor cell survival [19]. In the vast majority of other tumors, tumor cell variants may form that elude the attack of T-lymphocytes and antibodies [20]. The tumor subclones that lose the antigen or the variant of MHC necessary for its presentation become immune to the immune response, continue to grow and progress in the body and, ultimately, lead to its death.

Формирование вариантов опухолевых клеток, теряющих экспрессию опухолевого антигена, происходит в результате случайных генетических событий, приводящих к повреждению или выключению соответствующего гена. Поскольку такие события являются случайными, вероятность одновременной утраты двух или более антигенов в одной клетке существенно ниже вероятности потерять один антиген. Соответственно одновременная иммунизация несколькими антигенами, экспрессирующимися в опухоли, может быть более эффективной, нежели иммунизация против одного. Такие предпосылки подтверждаются результатами клинических испытаний [21]. Ввиду этого весьма вероятно, что при аллогенной вакцинации позитивные результаты можно ожидать только тогда, когда спектр опухолевых антигенов, экспрессирующихся клетками вакцины, широко пересекается со спектром опухолевых антигенов конкретной опухоли пациента. Поскольку антигенный состав вакцины известен заранее, целесообразно перед началом иммунотерапии провести определение антигенного профиля опухоли пациента. Кроме того, необходимо определить, какие из вариантов молекул МНС несет пациент, поскольку презентация ряда опухолеассоциированных антигенов (и, следовательно, возможность осуществления адаптивного иммунного ответа на них) уникальна для ограниченного числа вариантов молекул гистосовместимости.The formation of tumor cell variants that lose expression of the tumor antigen occurs as a result of random genetic events leading to damage or shutdown of the corresponding gene. Since such events are random, the probability of the simultaneous loss of two or more antigens in one cell is significantly lower than the probability of losing one antigen. Accordingly, simultaneous immunization with several antigens expressed in the tumor may be more effective than immunization against one. Such prerequisites are confirmed by the results of clinical trials [21]. In view of this, it is very likely that with allogeneic vaccination, positive results can be expected only when the spectrum of tumor antigens expressed by the vaccine cells intersects widely with the spectrum of tumor antigens of a particular patient's tumor. Since the antigenic composition of the vaccine is known in advance, it is advisable to determine the antigenic profile of the patient’s tumor before starting immunotherapy. In addition, it is necessary to determine which of the variants of the MHC molecules the patient carries, since the presentation of a number of tumor-associated antigens (and, therefore, the possibility of an adaptive immune response to them) is unique for a limited number of histocompatibility molecules.

Возможный сценарий, когда опухоль содержит антигенные белки, продукты которых не могут быть представлены в МНС пациента, до настоящего момента не имеет определенного решения. Часть исследователей полагает, что целесообразно, тем не менее, проводить иммунизацию такими антигенами в расчете на то, что могут существовать не охарактеризованные варианты антигена, способные презентироваться в его МНС, либо же на то, что, даже будучи не презентированным в контексте молекул гистосовместимости, антиген может являться мишенью иммунного ответа [22]. Одновременно некоторые авторы полагают, что введение этих антигенов в состав вакцины отрицательно скажется на конечном результате вследствие того, что в критически важный момент вакцинации иммунная система окажется излишне «загружена» ответом в отношении неактуальных мишеней. Эта точка зрения подтверждается примерами из инфекционной иммунологии: при большинстве вирусных инфекций потенциально может формироваться иммунный ответ на сотни различных эпитопов вирусных антигенов, однако практически иммунный ответ осуществляется всего на несколько так называемых иммунодоминантных эпитопов [23, 24]. Ответ на иммунодоминантные эпитопы может оказаться неэффективным и даже вредным, поскольку доминирование не позволяет сформировать иммунный ответ на другие антигены, более эффективные для защиты от патогена, зато менее удобные для иммунного распознавания [25].A possible scenario when a tumor contains antigenic proteins whose products cannot be represented in the patient's MHC does not yet have a definite solution. Some researchers believe that it is nevertheless advisable to immunize with such antigens in the expectation that there may be uncharacterized variants of the antigen that can be presented in its MHC, or that, even if not presented in the context of histocompatibility molecules, antigen may be the target of an immune response [22]. At the same time, some authors believe that the introduction of these antigens into the vaccine will negatively affect the final result due to the fact that at the critical moment of vaccination, the immune system will be unnecessarily “loaded” with the response to irrelevant targets. This point of view is confirmed by examples from infectious immunology: with most viral infections, an immune response to hundreds of different epitopes of viral antigens can potentially be formed, however, an almost immune response is carried out to only a few so-called immunodominant epitopes [23, 24]. The response to immunodominant epitopes can be ineffective and even harmful, since dominance does not allow the formation of an immune response to other antigens that are more effective for protection against a pathogen, but less convenient for immune recognition [25].

Определение иммунофенотипа пациентов по локусам лейкоцитарных антигенов гистосовместимости человека-А (HLA-A) и HLA-B необходимо также и для того, чтобы оценить степень совместимости МНС пациента и клеток вакцины. Как и в случае антигенного состава, в настоящий момент нет единого мнения относительно того, какие именно варианты молекул гистосовместимости у клеток вакцины оптимальны для введения тем или иным пациентам. В целом, возможно три варианта аллогенных вакцин: 1) максимально возможное (или полное) соответствие вводимых клеток HLA-фенотипу пациента, 2) отсутствие соответствия (незначительное совпадение) МНС пациента и клеток вакцины или 3) использование в качестве аллогенной вакцины опухолевых клеток, не экспрессирующих на поверхности антигены гистосовместимости.The determination of the immunophenotype of patients by loci of human histocompatibility leukocyte antigens A-A (HLA-A) and HLA-B is also necessary in order to assess the degree of compatibility of the patient's MHC and vaccine cells. As in the case of the antigenic composition, at the moment there is no consensus on which particular variants of histocompatibility molecules in vaccine cells are optimal for administration to one or another patient. In general, there are three possible variants of allogeneic vaccines: 1) the maximum possible (or complete) correspondence of the introduced cells to the patient's HLA phenotype, 2) the lack of correspondence (slight coincidence) of the patient's MHC and vaccine cells, or 3) the use of tumor cells as an allogeneic vaccine expressing histocompatibility antigens on the surface.

При использовании в качестве вакцины опухолевых клеток с высокой степенью совместимости аллогенная вакцинация приближается по иммунологическим эффектам к вакцинации собственными клетками опухоли пациента: при первых введениях вакцины увеличивается время пребывания клеток в организме вакцинируемого пациента, поскольку не происходит трансплантационного отторжения, развивающегося в отношении клеток «чужого» HLA-фенотипа [26]. Однако такой эффект сохраняется только в течение нескольких первых введений вакцины, а при продолжении иммунизации вводимые клетки, напротив, быстро уничтожаются, поскольку экспрессируют антигены в контексте «своих» МНС, которые могут быть узнаны сформировавшимися после первых вакцинаций цитотоксическими Т-лимфоцитами. Другим аспектом такой вакцинации является тот факт, что многие варианты молекул гистосовместимости I класса служат лигандами ингибиторных рецепторов цитотоксических лимфоцитов [20]. Присутствие этих лигандов на клетках опухоли, а также вакцины ингибирует цитотоксическую активность CTL, γδТ-лимфоцитов, NK и NKT-клеток, что может отрицательно сказываться на формировании и осуществлении иммунного ответа [27]. Присутствие на лимфоцитах пациента соответствующих рецепторов служит существенным аргументом в пользу применения у такого пациента аллогенных вакцин, не несущих соответствующие HLA.When using tumor cells with a high degree of compatibility as a vaccine, allogeneic vaccination is similar in immunological effects to vaccination with the patient’s own tumor cells: the first time the vaccine is introduced, the time spent by the cells in the body of the vaccinated patient increases, since there is no transplant rejection that develops in relation to the “alien” cells HLA phenotype [26]. However, this effect persists only during the first few injections of the vaccine, and with continued immunization, the introduced cells, on the contrary, are quickly destroyed, since they express antigens in the context of “their own” MHC, which can be recognized by cytotoxic T-lymphocytes formed after the first vaccinations. Another aspect of such vaccination is the fact that many variants of class I histocompatibility molecules serve as ligands for inhibitory receptors of cytotoxic lymphocytes [20]. The presence of these ligands on the tumor cells, as well as the vaccine, inhibits the cytotoxic activity of CTL, γδT lymphocytes, NK and NKT cells, which can negatively affect the formation and implementation of the immune response [27]. The presence of appropriate receptors on the patient’s lymphocytes is a significant argument in favor of the use of allogeneic vaccines that do not carry the corresponding HLA in such a patient.

Применение вакцин, несущих молекулы HLA отличного от собственного гаплотипа, может приводить к тому, что на введение клеток развиваются реакции трансплантационного отторжения, опосредуемые CD8⁺Т-лимфоцитами, NK- и NKT-клетками. При развитии аллоиммунитета активируются цитотоксические клетки, способные распознавать отсутствие собственных молекул гистосовместимости (NK-клетки), либо же распознающие структуру чужеродных молекул МНС как грубые искажения собственных (Т-лимфоциты и NKT-клетки). Результатом активации эффекторов противотрансплантационного иммунитета является ускоренное отторжение клеток вакцины при повторном введении, приводящее к тому, что на 3-4 иммунизации аллогенные клетки полностью элиминируются в течение первых нескольких суток [28]. В то же время аллогенная стимуляция может оказывать позитивное действие на противоопухолевый иммунный ответ за счет стимуляции довольно редкого пула цитотоксических лимфоцитов с потенциально аутоспецифической активностью. Такие лимфоциты несут нетипичный для большинства Т-лимфоцитов Т-клеточный рецептор с отличиями в определяющей комплементарность области (CDR) 2 и 1, который позволяет распознавать как аллогенные МНС, так и видоизмененные молекулы гистосовместимости опухолевых клеток [29].The use of vaccines carrying HLA molecules other than their own haplotype can lead to transplant rejection reactions mediated by CD8 ⁺ T-lymphocytes, NK- and NKT-cells developing on the introduction of cells. With the development of alloimmunity, cytotoxic cells are activated that can recognize the absence of intrinsic histocompatibility molecules (NK cells), or that recognize the structure of foreign MHC molecules as gross distortions of intrinsic ones (T lymphocytes and NKT cells). The result of activation of anti-transplant immunity effectors is an accelerated rejection of vaccine cells upon repeated administration, which leads to the fact that by 3-4 immunizations allogeneic cells are completely eliminated within the first few days [28]. At the same time, allogeneic stimulation can have a positive effect on the antitumor immune response by stimulating a rather rare pool of cytotoxic lymphocytes with potentially autospecific activity. Such lymphocytes carry an atypical T-cell receptor, which is atypical for most T-lymphocytes, with differences in the complementarity determining region (CDR) 2 and 1, which makes it possible to recognize both allogeneic MHCs and altered histocompatibility molecules of tumor cells [29].

Еще одной существенной особенностью аллоиммунизации является свойство аллогенных клеток вызывать поликлональную активацию Т-лимфоцитов, в том числе ингибированных механизмами периферической толерантности. Вероятно, в результате не физиологически высокой частоты встреч Т-лимфоцитов с аллогенными молекулами гистосовместимости происходит не зависящая от костимуляции активация некоторой части Т-клеток без учета специфичности их Т-клеточного рецептора (TCR). Среди отвечающих на аллоантигены лимфоцитов могут оказаться и CD4⁺и CD8⁺Т-клетки, специфичные к опухолевым антигенам. Благодаря такой стимуляции опухолеспецифические лимфоциты приобретают активированный фенотип и могут в определенных условиях совершать несколько делений, увеличивая тем самым общее количество исходно редких клонов. Таким образом, аллогенная поликлональная стимуляция может подготавливать противоопухолевые Т-лимфоциты к специфическому ответу на опухолевые антигены, что практически невозможно при использовании сугубо моноклональной, специфической стимуляции.Another significant feature of alloimmunization is the property of allogeneic cells to induce polyclonal activation of T-lymphocytes, including those inhibited by mechanisms of peripheral tolerance. It is likely that, due to the non physiologically high frequency of encounters of T-lymphocytes with allogeneic histocompatibility molecules, costimulation-independent activation of some T-cells occurs without taking into account the specificity of their T-cell receptor (TCR). Among the lymphocytes responding to alloantigens, there may also be CD4 ⁺ and CD8 ⁺ T cells specific for tumor antigens. Thanks to such stimulation, tumor-specific lymphocytes acquire an activated phenotype and can undergo several divisions under certain conditions, thereby increasing the total number of initially rare clones. Thus, allogeneic polyclonal stimulation can prepare antitumor T-lymphocytes for a specific response to tumor antigens, which is almost impossible when using purely monoclonal, specific stimulation.

Одним из интересных аспектов аллогенной вакцинотерапии является возможность применять опухолевые клетки, экспрессирующие молекулы главного комплекса гистосовместимости II класса. В здоровом организме экспрессия HLA-DR, DQ и DP ограничена популяцией профессиональных антигенпрезентирующих клеток (АРС) (В-лимфоциты, макрофаги и DC) и активированных Т-лимфоцитов, эндотелиальных и эпителиальных клеток, фибробластов и др. В части опухолевых линий, полученных от пациентов с метастатической меланомой, также выявляется экспрессия HLA-DR, биологический смысл которой не вполне ясен. Показано, что сигналы, генерируемые при связывании HLA-DR с TCR, активируют антиапоптотические каскады, что может способствовать выживанию опухолевой клетки. Кроме того, присутствие МНС II класса на опухолевой клетке может иметь значение для формирования толерантности организма к опухолевым антигенам, поскольку презентация их эпитопов (в контексте МНС II класса) происходит не на АРС, а на опухолевых клетках, на которых отсутствуют молекулы, обеспечивающие костимулирующие сигналы. Согласно современным представлениям примирование такими опухолевыми клетками наивных Т-лимфоцитов в отсутствие сигнала 2 (костимуляции) и необходимой цитокиновой поддержки может приводить к апоптозу Т-лимфоцита и тем самым элиминировать Т-клетки, специфичные к опухолевым антигенам.One of the interesting aspects of allogeneic vaccine therapy is the ability to use tumor cells expressing the molecules of the main histocompatibility complex of class II. In a healthy organism, the expression of HLA-DR, DQ, and DP is limited to a population of professional antigen-presenting cells (APCs) (B-lymphocytes, macrophages and DC) and activated T-lymphocytes, endothelial and epithelial cells, fibroblasts, etc. In terms of tumor lines obtained from patients with metastatic melanoma, HLA-DR expression is also detected, the biological meaning of which is not entirely clear. It was shown that the signals generated by the binding of HLA-DR to TCR activate anti-apoptotic cascades, which can contribute to the survival of the tumor cell. In addition, the presence of MHC class II on a tumor cell may be important for the formation of an organism's tolerance to tumor antigens, since the presentation of their epitopes (in the context of MHC class II) does not occur on ARS, but on tumor cells that lack molecules that provide costimulatory signals . According to modern concepts, the priming of naive T lymphocytes by such tumor cells in the absence of signal 2 (costimulation) and the necessary cytokine support can lead to apoptosis of the T lymphocyte and thereby eliminate T cells specific for tumor antigens.

Применение в составе аллогенной вакцины опухолевых клеток, экспрессирующих варианты МНС II класса, совпадающие с гаплотипом пациента, и не экспрессирующих молекул семейства В7, может приводить к формированию толерантности по отношению к опухолевым антигенам в ответ на введение вакцины [30]. Кроме того, существенно повышается риск развития аутоиммунных осложнений и других иммунопатий, поскольку создаются условия для стимуляции специфической субпопуляции CD8⁺клеток, способных распознавать МНС II класса [31].The use of tumor cells in the allogeneic vaccine expressing MHC class II variants that match the patient’s haplotype and not expressing B7 family molecules can lead to the formation of tolerance to tumor antigens in response to the vaccine [30]. In addition, the risk of developing autoimmune complications and other immunopathies is significantly increased, since conditions are created for stimulating a specific subpopulation of CD8 ⁺ cells capable of recognizing MHC class II [31].

Еще одним вариантом вакцины на основе аллогенных вакцинных клеток является применение опухолевых линий, утративших поверхностную экспрессию молекул главного комплекса гистосовместимости в результате различных нарушений. Многие из таких линий при введении в организм экспериментальных животных сравнительно быстро уничтожаются NK-клетками, которые способны к осуществлению цитотоксичности в отсутствие сдерживающих сигналов со стороны молекул МНС I на клетке-мишени [32]. По разным подсчетам срок пребывания жизнеспособных клеток вакцины, не экспрессирующих молекул HLA в организме пациента, составляет от 3 до 6 суток, что, в общем, достаточно для осуществления необходимой иммуностимуляции. Кроме того, срок пребывания таких вакцинных клеток в организме пациента практически не изменяется при многократных вакцинациях. Не ясно, существуют ли какие-либо иммунологические особенности действия аллогенных вакцин на основе клеток, не экспрессирующих антигены гистосовместимости. С одной стороны, клетки, не подвергающиеся TCR-MHC-зависимой цитотоксичности, представляют собой более стабильные источники паракринного GM-CSF, что позволяет предполагать большую эффективность вакцины при многократных иммунизациях. Кроме того, отсутствие молекул HLA снимает ингибирующее воздействие опухолевых клеток на цитотоксичность NK-клеток и создает условия для вовлечения этих лимфоцитов в индуктивную фазу иммунного ответа. С другой стороны, сам факт получения подобных клеточных линий из метастазов агрессивных опухолей свидетельствует в пользу того, что у МНС-негативных линий формируются определенные механизмы избегания цитотоксического действия как NK-клеток, так и Т-лимфоцитов. Многие аспекты применения вакцин на основе таких клеток требуют дальнейшего изучения, особенно с учетом того, что факторы, обусловливающие устойчивость МНС-негативных опухолевых клеток к действию NK-клеток, могут оказывать негативное действие на формирование иммунного ответа.Another vaccine based on allogeneic vaccine cells is the use of tumor lines that have lost the surface expression of the molecules of the main histocompatibility complex as a result of various disorders. When introduced into experimental animals, many of these lines are relatively quickly destroyed by NK cells, which are capable of cytotoxicity in the absence of inhibitory signals from MHC I molecules on the target cell [32]. According to various estimates, the residence time of viable vaccine cells that do not express HLA molecules in the patient’s body is from 3 to 6 days, which, in general, is sufficient for the necessary immunostimulation. In addition, the residence time of such vaccine cells in the patient’s body remains virtually unchanged with repeated vaccinations. It is not clear whether there are any immunological features of the action of allogeneic vaccines based on cells that do not express histocompatibility antigens. On the one hand, cells that do not undergo TCR-MHC-dependent cytotoxicity are more stable sources of paracrine GM-CSF, suggesting greater efficacy of the vaccine in multiple immunizations. In addition, the absence of HLA molecules removes the inhibitory effect of tumor cells on the cytotoxicity of NK cells and creates the conditions for the involvement of these lymphocytes in the inductive phase of the immune response. On the other hand, the very fact of obtaining such cell lines from metastases of aggressive tumors suggests that MHC-negative lines form certain mechanisms to avoid the cytotoxic effect of both NK cells and T lymphocytes. Many aspects of the use of vaccines based on such cells require further study, especially given the factors that determine the resistance of MHC-negative tumor cells to the action of NK cells, can have a negative effect on the formation of the immune response.

Раскрытие настоящего изобретенияDisclosure of the present invention

Сущностью настоящего изобретения является создание новой уникальной клеточной линии меланомы человека KG, обладающей способностью секретировать иммуноактивирующий цитокин - гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор. Уникальность данной клеточной линии обусловливается использованием в качестве материала для генной модификации уникальной клеточной линии меланомы человека Mel Kor (патент РФ №2287578). Способность клеток линии KG секретировать рекомбинантный GM-CSF достигается при помощи генной модификации клеток меланомы Mel Kor генной конструкцией, содержащей комплементарную ДНК GM-CSF человека (SEQ ID NO:1), встроенную в вектор, предназначенный для экспрессии в клетках млекопитающих.The essence of the present invention is the creation of a new unique cell line of human melanoma KG, with the ability to secrete an immunoactivating cytokine - granulocyte-macrophage colony stimulating factor. The uniqueness of this cell line is due to the use of Mel Kor, a unique human melanoma cell line, as material for gene modification (RF patent No. 2287578). The ability of KG cells to secrete recombinant GM-CSF is achieved by genetically modifying Mel Kor melanoma cells with a gene construct containing complementary human GM-CSF DNA (SEQ ID NO: 1) embedded in a vector designed for expression in mammalian cells.

Технический результат заключается в получении линии клеток меланомы человека KG, стабильно трансфицированных геном GM-CSF и секретирующих данный цитокин во внеклеточное пространство при культивировании in vitro, а также при использовании инактивированных клеток для введения пациентам. Секретируемый клетками KG GM-CSF обусловливает активацию иммунного ответа в отношении опухолевых антигенов, экспрессируемых клетками KG, при введении инактивированных клеток пациентам.The technical result consists in obtaining a cell line of human melanoma KG stably transfected with the GM-CSF gene and secreting this cytokine into the extracellular space during in vitro cultivation, as well as using inactivated cells for administration to patients. GM-CSF secreted by KG cells activates the immune response against tumor antigens expressed by KG cells when inactivated cells are administered to patients.

Целью настоящего изобретения является расширение коллекции уникальных клеточных линий, которые можно использовать для иммунотерапии злокачественных новообразований. Эта задача является актуальной для современной практики лечения злокачественных новообразований, поскольку спектр антигенов индивидуальных опухолей является уникальным в то время, как максимальная эффективность иммунотерапии достигается при помощи подбора для пациента вакцины с наиболее полным соответствием набора опухолевых антигенов в клетках вакцины и опухоли.The aim of the present invention is to expand the collection of unique cell lines that can be used for immunotherapy of malignant neoplasms. This task is relevant for the modern practice of treating malignant neoplasms, since the spectrum of antigens of individual tumors is unique while the maximum effectiveness of immunotherapy is achieved by selecting a vaccine for the patient with the most complete correspondence between the set of tumor antigens in the vaccine and tumor cells.

Технический результат, достигаемый при использовании изобретения, заключается в возможности применения инактивированных клеток линии меланомы человека KG для введения пациентам, страдающим онкологическими заболеваниями, с целью стимуляции противоопухолевого иммунитета, что дает возможность повысить эффективность лечения и увеличить продолжительность жизни при лечении злокачественных новообразований, а также проводить иммунопрофилактику злокачественных новообразований.The technical result achieved by using the invention is the possibility of using inactivated cells of the human melanoma line KG for administration to patients suffering from cancer, in order to stimulate antitumor immunity, which makes it possible to increase the effectiveness of treatment and increase the life expectancy in the treatment of malignant neoplasms, as well as immunoprophylaxis of malignant neoplasms.

Дополнительный технический результат, достигаемый при использовании клеток KG, заключается в том, что клетки KG, культивируемые in vitro, могут являться источником биологически активного GM-CSF, который может быть использован для культивирования клеток, которым требуется присутствие GM-CSF в культуральной среде. Рекомбинантный GM-CSF человека, продуцируемый клетками KG, может быть использован как в качестве изолированного, высокоочищенного белка, так и в составе культуральной среды или ее дериватов.An additional technical result achieved using KG cells is that KG cells cultured in vitro can be a source of biologically active GM-CSF, which can be used to cultivate cells that require the presence of GM-CSF in the culture medium. Recombinant human GM-CSF produced by KG cells can be used both as an isolated, highly purified protein, and as part of the culture medium or its derivatives.

Поставленная задача решается тем, что получена новая клеточная линия меланомы человека KG, секретирующая рекомбинантный GM-CSF в количестве не менее 500 нг/10⁶ клеток за 24 часа. Полученная клеточная линия обладает стабильными культуральными, морфологическими и иммунологическими свойствами и обладает способностью секретировать рекомбинантный гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор человека в результате генной модификации. Все клетки линии KG характеризуются стабильной секрецией GM-CSF, сохраняющейся после инактивации клеток ионизирующим облучением в дозе 100 Грей, надежно предотвращающей пролиферацию инактивируемых клеток. Линия клеток KG депонирована в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под номером РККК (П) 699Д.The problem is solved in that a new cell line of human melanoma KG was obtained, secreting recombinant GM-CSF in an amount of at least 500 ng / 10 ⁶ cells in 24 hours. The resulting cell line has stable cultural, morphological and immunological properties and has the ability to secrete recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor as a result of gene modification. All cells of the KG line are characterized by stable secretion of GM-CSF, which remains after inactivation of the cells by ionizing radiation at a dose of 100 Gray, which reliably prevents the proliferation of inactivated cells. The KG cell line was deposited in the Specialized Collection of Vertebrate Cell Cultures of the Russian Cell Culture Collection under the number RKKK (P) 699D.

Осуществление настоящего изобретенияThe implementation of the present invention

Процедура получения генно-модифицированных клеток меланомы человека KG, секретирующих ГМ-КСФThe procedure for producing genetically modified human KG melanoma cells secreting GM-CSF

Получение клоновGetting Clones

Для трансфекции использовали очищенную плазмидную ДНК генной конструкции, кодирующей последовательность кДНК GM-CSF человека, встроенную в вектор, предназначенный для экспрессии в клетках млекопитающих, с геном устойчивости к селективному антибиотику генетицину (G418) (SEQ ID NO:1).For transfection, we used purified plasmid DNA of a gene construct encoding a human GM-CSF cDNA sequence, inserted into a vector designed for expression in mammalian cells, with the genetic antibiotic resistance gene geneticin (G418) (SEQ ID NO: 1).

Клетки линии Mel Kor высевали на чашки диаметром 35 мм и культивировали в течение 24 часов до достижения плотности 16000 клеток/см².Mel Kor cells were plated on plates with a diameter of 35 mm and cultured for 24 hours until a density of 16,000 cells / cm ^{2 was} reached.

После 24 часов культивирования (после прикрепления и адаптации) к клеткам добавляли растворенный в связывающем буфере трансфекционный комплекс, состоящий из липида и ДНК, связанной с энхансером. Для линии Mel Kor использовали липид и энхансер из набора Unifectin-M (Maxifectin), количество ДНК, использованной на 1,5×10⁶ клеток, составляло 5,6 мкг. Приготовление и внесение трансфекционного комплекса в чашки с клетками осуществляли в соответствии с инструкцией производителя набора для трансфекции (Unifectin Group, Россия).After 24 hours of cultivation (after attachment and adaptation), a transfection complex consisting of a lipid and DNA bound to an enhancer, dissolved in binding buffer, was added to the cells. For the Mel Kor line, a lipid and enhancer from the Unifectin-M kit (Maxifectin) were used; the amount of DNA used per 1.5 × 10 ⁶ cells was 5.6 μg. The preparation and introduction of the transfection complex into plates with cells was carried out in accordance with the instructions of the manufacturer of the transfection kit (Unifectin Group, Russia).

Через 24 часа после инкубации с трансфекционной смесью среду в чашках заменяли на новую, а клетки после непродолжительной адаптации пересевали на чашки диаметром 100 мм.24 hours after incubation with the transfection mixture, the medium in the dishes was replaced with a new one, and the cells, after a short adaptation, were transferred to plates with a diameter of 100 mm.

Через 24 часа после инкубации клеток в культуральную среду добавляли селективный антибиотик G418 (Sigma, США) в концентрации LD₁₀₀ (800 мкг/мл).24 hours after the cells were incubated, a selective antibiotic G418 (Sigma, USA) was added to the culture medium at a concentration of LD ₁₀₀ (800 μg / ml).

Через 1 неделю после инкубации с антибиотиком (при необходимости среду заменяли с добавлением новой порции антибиотика) резистентные к препарату клетки формировали клоны по 75-150 клеток в каждом.1 week after incubation with the antibiotic (if necessary, the medium was replaced with the addition of a new portion of the antibiotic), drug-resistant cells formed clones of 75-150 cells each.

Клоны клеток переносили в 96-луночный планшет при помощи микродозатора, для этого после удаления среды и промывания поверхности чашки PBS на клон под микроскопом наносили 10-15 мкл раствора трипсина. Через 30 секунд открепившиеся клетки захватывали микродозатором и переносили в заранее подготовленные лунки 96-луночного планшета с 200 мкл полной среды RPMI-1640.Clones of the cells were transferred to a 96-well plate using a microdoser; for this, after removing the medium and washing the surface of the PBS plate, 10-15 μl of trypsin solution was applied to the clone under the microscope. After 30 seconds, detached cells were captured with a microdoser and transferred to pre-prepared wells of a 96-well plate with 200 μl of complete RPMI-1640 medium.

Через 3-6 суток удачно отобранные клоны формировали монослой, и их переносили в 24-луночный планшет. После формирования монослоя в нем клетки переносили в 6-луночный планшет.After 3-6 days, successfully selected clones formed a monolayer, and they were transferred to a 24-well plate. After the formation of a monolayer in it, cells were transferred to a 6-well plate.

Из 6-луночного планшета отбирали супернатант для анализа концентрации GM-CSF методом иммуноферментного анализа, а клетки пересевали на 4-луночный планшет, в котором клоны замораживали при -135°С.A supernatant was taken from a 6-well plate for analysis of GM-CSF concentration by enzyme-linked immunosorbent assay, and the cells were transferred to a 4-well plate in which clones were frozen at -135 ° C.

Определение концентрации GM-CSF методом иммуноферментного анализа (ИФА)Determination of GM-CSF concentration by enzyme immunoassay (ELISA)

После формирования клетками трансфицированных клонов плотности монослоя на 6-луночном планшете (1,2×10⁶ клеток в лунке) культуральную среду полностью удаляли из лунки, поверхность монослоя промывали однократно 2 мл стерильного PBS и в лунку добавляли по 2 мл полной среды RPMI-1640.After the cells formed transfected clones of the density of a monolayer on a 6-well plate (1.2 × 10 ⁶ cells per well), the culture medium was completely removed from the well, the surface of the monolayer was washed once with 2 ml of sterile PBS, and 2 ml of complete RPMI-1640 medium was added to the well .

Через 24 часа образцы супернатанта из каждой лунки собирали в криопробирки и замораживали при -20°С до накопления оптимального для постановки анализа числа образцов.After 24 hours, supernatant samples from each well were collected in cryovials and frozen at -20 ° C until the optimal number of samples for analysis was accumulated.

После накопления 40 или более различных образцов при помощи коммерческого набора для ИФА GM-CSF человека производства Diaclone (США) проводили анализ супернатантов методом ИФА в следующей последовательности.After the accumulation of 40 or more different samples using a commercial kit for human ELISA GM-CSF manufactured by Diaclone (USA), the analysis of supernatants by ELISA was performed in the following sequence.

Образцы супернатанта размораживали при комнатной температуре, перемешивали на вортексе в течение 10 секунд и центрифугировали при 13400 об/мин в течение 30 секунд. В каждую лунку планшета для постановки реакции добавляли по 50 мкл аналитического буфера. В заранее размеченные лунки добавляли по 50 мкл стандарта GM-CSF в лунки для калибровки, по 50 мкл аналитического буфера в контрольные лунки и по 50 мкл образцов в оставшиеся лунки. Заполненный планшет инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре на ротаторе со скоростью 111 об/мин. Через 2 часа из лунок удаляли жидкость, каждую лунку четырехкратно промывали 400 мкл отмывочного буфера. Далее в лунки добавляли по 100 мкл вторичных антител (конъюгата антител против hGM-CSF и биотина) и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре на ротаторе при 111 об/мин. Через 1 час из лунок удаляли жидкость, каждую лунку четырехкратно промывали 400 мкл отмывочного буфера.Samples of the supernatant were thawed at room temperature, vortexed for 10 seconds, and centrifuged at 13,400 rpm for 30 seconds. 50 μl of assay buffer was added to each well of the reaction plate. 50 μl of GM-CSF standard was added to pre-labeled wells for calibration, 50 μl of assay buffer to control wells and 50 μl of samples to the remaining wells. The filled plate was incubated for 2 hours at room temperature on a rotator at a speed of 111 rpm. After 2 hours, liquid was removed from the wells, each well was washed four times with 400 μl washing buffer. Then, 100 μl of secondary antibodies (conjugate of antibodies against hGM-CSF and biotin) were added to the wells and incubated for 1 hour at room temperature on a rotator at 111 rpm. After 1 hour, liquid was removed from the wells, each well was washed four times with 400 μl washing buffer.

Далее в лунки добавляли по 100 мкл конъюгированного со стрептавидином фермента (HRP-стрептавидин) и инкубировали 30 минут при комнатной температуре на ротаторе при 111 об/мин.Next, 100 μl of streptavidin conjugated enzyme (HRP-streptavidin) was added to the wells and incubated for 30 minutes at room temperature on a rotator at 111 rpm.

Через 30 минут из лунок удаляли жидкость, четырехкратно промывали каждую лунку 400 мкл отмывочного буфера.After 30 minutes, the liquid was removed from the wells, four wells were washed four times with 400 μl washing buffer.

Далее в лунки добавляли по 100 мкл цветообразующего субстрата (стабилизированного хромогена ТМВ) и инкубировали 30 минут при комнатной температуре в темноте на ротаторе при 111 об/мин.Then, 100 μl of a color-forming substrate (stabilized TMB chromogen) was added to the wells and incubated for 30 minutes at room temperature in the dark on a rotator at 111 rpm.

Через 30 минут в лунки добавляли по 100 мкл стоп-раствора и определяли оптическую плотность на ридере LabSystem (длина волны 450 нм).After 30 minutes, 100 μl of stop solution was added to the wells and the absorbance was determined on a LabSystem reader (wavelength 450 nm).

На основании полученных результатов строили калибровочную кривую и определяли концентрацию GM-CSF в образцах.Based on the results obtained, a calibration curve was constructed and the concentration of GM-CSF in the samples was determined.

В результате методом трансфекции и последующей селекции была получена линия KG, продуцирующая не менее 500 нг GM-CSF (секретируется 1 млн клеток за 24 часа).As a result, a KG line was produced by transfection and subsequent selection, producing at least 500 ng GM-CSF (1 million cells are secreted in 24 hours).

Основные характеристики клеток линии KGKey Features of KG Cells

Родословная клеточной линии:Cell lineage lineage:

Линия клеток получена из образца опухолевой ткани пациентки К.Г.А., и/б 96/10389, находившейся на лечении в РОНЦ РАМН в 2001 г. по поводу диссеминированной меланомы кожи. Материал получен из образца метастаза в зоне бедренного треугольника. Стабильная трансфекция выполнена в Институте биологии гена РАН в 2004 году.The cell line was obtained from a sample of the tumor tissue of the patient K.G.A., and / b 96/10389, who was treated at the Russian Oncology Center RAMS in 2001 about disseminated skin melanoma. The material was obtained from a metastasis sample in the area of the femoral triangle. Stable transfection was performed at the Institute of Gene Biology of the Russian Academy of Sciences in 2004.

Число пассажей:Passages:

К моменту составления паспорта клеточная линия прошла 40 пассажей.By the time the passport was drawn up, the cell line had passed 40 passages.

Стандартные условия культивирования:Standard cultivation conditions:

Питательная среда RPMI (90%), эмбриональная телячья сыворотка 10%, содержащая антибиотики (пенициллин со стрептомицином в концентрации 100 ед/мл и 100 мкг/мл соответственно)RPMI culture medium (90%), 10% fetal calf serum containing antibiotics (penicillin with streptomycin at a concentration of 100 u / ml and 100 μg / ml, respectively)

Метод снятия: 0,25% раствор трипсина и 0,02% раствор версена в соотношении 1:1.Removal method: 0.25% trypsin solution and 0.02% solution versen in a 1: 1 ratio.

Культуральные свойства:Cultural properties:

Для выращивания культуры можно использовать культуральные флаконы. Во флаконы с площадью роста 25 см² в 5 мл среды засевают 1×10⁶ клеток. Пассаж 1 раз в 3-4 суток. Культивирование при 37°С и 5% СO₂. Клетки имеют адгезионный, монослойный характер роста.For cultivation, culture bottles can be used. In vials with a growth area of 25 cm ² in 5 ml of medium sow 1 × 10 ⁶ cells. Passage once every 3-4 days. Cultivation at 37 ° C and 5% CO ₂ . Cells have an adhesive, monolayer growth pattern.

Кариологическая характеристика штамма:Karyological characteristics of the strain:

Культура равномерна по диаметрам ядер, плотности окраски и состоянию хроматина. Проанализировано 26 метафаз. Число хромосом колеблется от 64 до 84. Модальное число хромосом соответствует триплоидному набору (3n).The culture is uniform in core diameters, color density and chromatin state. 26 metaphases were analyzed. The number of chromosomes ranges from 64 to 84. The modal number of chromosomes corresponds to the triploid set (3n).

Хорошо идентифицируемые хромосомы групп А, В, D - без признаков транслокаций. Кариотип данной культуры можно рассматривать как стабильный. Хромосомных аберраций не обнаружено.Well identified chromosomes of groups A, B, D - without signs of translocation. The karyotype of this culture can be considered stable. No chromosomal aberrations were detected.

Цитограмма культуры клеток:Cell culture cytogram:

KG характеризуется наличием множественных плотных центров роста опухолевых клеток полиморфных меланомных клеток вытянутой, округлой и неправильной формы. В клетках обнаруживаются нормо- и гиперхромные ядра округлой и овальной формы, содержащие одиночные нуклеолы, и базофильная негомогенная, иногда вакуолизированная цитоплазма. Имеются гигантские многоядерные клетки, митозы.KG is characterized by the presence of multiple dense growth centers of tumor cells of polymorphic melanoma cells of elongated, round and irregular shape. Normo- and hyperchromic nuclei of a round and oval shape containing single nucleols and a basophilic inhomogeneous, sometimes vacuolated cytoplasm are found in the cells. There are giant multinucleated cells, mitoses.

Маркерные признаки:Marker signs:

Поверхностная экспрессия антигенов: CD63+; НМВ45+; MelanA+; Tyrosinase+; HMW+; HLA-A,B,C(-); HLA-DR(-). У клеток KG отсутствует экспрессия гена бета-2-микроглобулина. Секретируют GM-CSF человека в количестве не менее 10 нг/10⁶клеток за 24 часа.Surface antigen expression: CD63 +; NMB45 +; MelanA +; Tyrosinase +; HMW +; HLA-A, B, C (-); HLA-DR (-). KG cells lack beta-2-microglobulin gene expression. Human GM-CSF is secreted in an amount of at least 10 ng / 10 ⁶ cells in 24 hours.

Контаминация:Contamination:

Бактерии и грибы в культуре не обнаружены. Тест на микоплазму отрицателен.Bacteria and fungi were not found in the culture. Mycoplasma test is negative.

Условия криоконсервации:Cryopreservation conditions:

Клетки клеточной линии ресуспендируют в среде для замораживания: питательная среда RPMI 70%, эмбриональная телячья сыворотка 20%, ДМСО 10%. Режим замораживания: жидкий азот, снижение температуры на 1°С в минуту до -25°С, затем быстрое замораживание до -70°С. Хранение в жидком азоте при температуре -196°С. Размораживание быстрое, при 37°С. Клетки разводят в 10 мл бессывороточной среды и осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 5 мл той же среды, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, и переносят в культуральный флакон с площадью роста 25 см². Жизнеспособность клеток оценивают по включению трипанового синего. Жизнеспособность клеток после размораживания составляет 90%.Cell line cells are resuspended in freezing medium: RPMI culture medium 70%, fetal calf serum 20%, DMSO 10%. Freezing mode: liquid nitrogen, temperature decrease by 1 ° С per minute to -25 ° С, then quick freezing to -70 ° С. Storage in liquid nitrogen at a temperature of -196 ° C. Defrosting is quick at 37 ° C. Cells are diluted in 10 ml of serum-free medium and precipitated by centrifugation, resuspended in 5 ml of the same medium containing 10% fetal calf serum, and transferred to a culture vial with a growth area of 25 cm ² . Cell viability is assessed by the inclusion of trypan blue. Cell viability after thawing is 90%.

Claims

The human melanoma cell line KG secreting a recombinant human granulocyte macrophage colony stimulating factor encoded by the DNA sequence SEQ ID NO: 1, deposited in the Specialized Collection of Vertebrate Cell Cultures of the Russian Cell Culture Collection under the number RKKK (P) 699D.