RU2356033C2

RU2356033C2 - Method of measuring surface plasmon resonance (versions) noble metal compound used for this method

Info

Publication number: RU2356033C2
Application number: RU2006116577/28A
Authority: RU
Inventors: Тохру КОИКЕ (JP); Тохру КОИКЕ; Акихико КАВАСАКИ (JP); Акихико КАВАСАКИ; Тацухиро КОБАСИ (JP); Тацухиро КОБАСИ; Макото ТАКАХАГИ (JP); Макото ТАКАХАГИ
Original assignee: НАРД Инститьют, Лтд.
Priority date: 2003-10-16
Filing date: 2004-10-12
Publication date: 2009-05-20
Also published as: RU2006116577A

Abstract

FIELD: physics, measurements.

SUBSTANCE: invention relates to measurement of the surface plasmon resonance. The proposed method comprises placing the noble metal compound onto the prism lower face, irradiating aforesaid prism with the light to detect the reflected light. The said noble metal compound contains substituents on the side opposite to that in contact with the prism. Note that the specimen to be analysed is applied onto the side incorporating substituents in the noble metal compound.

EFFECT: ease of detecting phosphorylates peptide (protein) and verifying if peptide is phosphorylated or not.

8 cl, 8 dwg

Description

ОБЛАСТЬ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕFIELD OF THE INVENTION

Настоящее изобретение относится к способу измерения поверхностного плазмонного резонанса и к соединению благородного металла, используемому для данного способа.The present invention relates to a method for measuring surface plasmon resonance and to a noble metal compound used for this method.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND

Определенные виды ферментов в живом организме имеют сериновый, треониновый или тирозиновый остаток на специфическом участке, таком как активный центр или аллостерический участок. Активность данных ферментов контролируется фосфорилированием или дефосфорилированием гидроксильных групп энзимами, называемыми киназами. Кроме того, в некоторых ферментах их активность контролируется фосфорилированием или дефосфорилированием аминогрупп или иминогрупп лизина, аргинина или гистидина или карбоксильных групп аспарагиновой кислоты или глутаминовой кислоты.Certain types of enzymes in a living organism have a serine, threonine or tyrosine residue in a specific site, such as an active site or an allosteric site. The activity of these enzymes is controlled by phosphorylation or dephosphorylation of hydroxyl groups by enzymes called kinases. In addition, in some enzymes, their activity is controlled by phosphorylation or dephosphorylation of the amino groups or imino groups of lysine, arginine or histidine, or the carboxyl groups of aspartic acid or glutamic acid.

В качестве таких метаболических систем, контролируемых фосфорилированием-дефосфорилированием, хорошо известны система регулирования и система расщепления гликогенеза. Данные метаболические системы главным образом являются каскадно-контролируемыми и управляются фосфорилированием-дефосфорилированием.As such metabolic systems controlled by phosphorylation-dephosphorylation, a regulatory system and a glycogenesis cleavage system are well known. These metabolic systems are mainly cascaded and controlled by phosphorylation-dephosphorylation.

В последние годы стало ясно, что данное фосфорилирование-дефосфорилирование играет важную роль в метаболических системах, имеющих отношение к заболеваниям.In recent years, it has become clear that this phosphorylation-dephosphorylation plays an important role in metabolic systems related to diseases.

Например, отклонения в фосфорилировании-дефосфорилировании, как предполагают, вносят вклад в перерождение клеток в раковые клетки. То есть развитие и прерывание клеточных циклов контролируется фосфорилированием или дефосфорилированием различных ферментов (белков), причем циклин и циклинзависимая киназа (CDK) участвуют в данном фосфорилировании или дефосфорилировании. В случае, когда данный механизм поврежден, фосфорилирование или дефосфорилирование повреждено. В результате вызывается рост аберрантных клеток.For example, abnormalities in phosphorylation-dephosphorylation are thought to contribute to the degeneration of cells into cancer cells. That is, the development and interruption of cell cycles is controlled by phosphorylation or dephosphorylation of various enzymes (proteins), and cyclin and cyclin-dependent kinase (CDK) are involved in this phosphorylation or dephosphorylation. When this mechanism is damaged, phosphorylation or dephosphorylation is damaged. As a result, the growth of aberrant cells is caused.

Также было выяснено, что протеин киназы С участвует в дегрануляции гистамина, приводящего к аллергическим заболеваниям, таким как атопический дерматит и сенная лихорадка, и что фосфорилированный тау-протеин участвует в нейрофибриллярном клубке, возникающем в головном мозге пациента, страдающего болезнью Альцгеймера.It was also found that kinase C protein is involved in the degranulation of histamine, leading to allergic diseases such as atopic dermatitis and hay fever, and that phosphorylated tau protein is involved in the neurofibrillary tangle that occurs in the brain of a patient suffering from Alzheimer's disease.

Принимая во внимание вышеизложенное, понимание ситуации фосфорилирования-дефосфорилирования белков должно быть полезным не только для исследования экспрессии генов в клеточной ткани живого организма или оценки активности ферментов, но также для диагностирования и медицинского лечение заболеваний.Taking into account the foregoing, an understanding of the situation of protein phosphorylation-dephosphorylation should be useful not only for studying gene expression in the cellular tissue of a living organism or for evaluating enzyme activity, but also for the diagnosis and medical treatment of diseases.

Однако традиционно используемые способы определения фосфорилированных или дефосфорилированных белков имеют различные недостатки.However, conventionally used methods for determining phosphorylated or dephosphorylated proteins have various disadvantages.

Например, ферментный иммунологический анализ обладает преимуществом, состоящим в том, что им можно анализировать очень небольшое количество исследуемого образца белка, но трудно получить достаточное количество необходимых антител. Более того, когда молекулярная масса исследуемого протеина не превышает нескольких кДа, нельзя приготовить антитело, связывающееся с фосфорилированным участком в белке.For example, enzyme immunological analysis has the advantage that it can analyze a very small amount of the protein sample to be studied, but it is difficult to obtain a sufficient amount of the required antibodies. Moreover, when the molecular weight of the studied protein does not exceed several kDa, it is impossible to prepare an antibody that binds to the phosphorylated portion in the protein.

Кроме того, возможным способом является определение специфического связывания фосфорной кислоты с белком с использованием фосфорной кислоты, меченной радиоизотопом ³²P. Однако обращение с радиоизотопом заслуженно нуждается в особой осторожности, и использование радиоизотопа требует сбор и удаление жидких отходов.In addition, a possible method is to determine the specific binding of phosphoric acid to a protein using phosphoric acid labeled with a radioisotope ³² P. However, the handling of the radioisotope deservedly needs special care, and the use of a radioisotope requires the collection and disposal of liquid waste.

Более того, поскольку фосфорилированные белки и дефосфорилированные белки имеют соответственно различный электрический заряд, также можно использовать двухмерный электрофорез. Однако, особенно в анализе биологических материалов, различные виды белков, включенные в образец, будут сильно затруднять идентификацию пятен. Если радиоизотоп используют для идентификации данных пятен, то вышеуказанные проблемы возрастают.Moreover, since phosphorylated proteins and dephosphorylated proteins have correspondingly different electric charges, two-dimensional electrophoresis can also be used. However, especially in the analysis of biological materials, the various types of proteins included in the sample will greatly complicate the identification of spots. If the radioisotope is used to identify these spots, then the above problems increase.

Кроме вышеописанных способов определения фосфорилированных или дефосфорилированных белков был разработан метод, использующий Поверхностный Плазмонный Резонанс (в дальнейшем называемый ″ППР″), в качестве общего метода исследования соединений, таких как белки, специфически связывающихся с особыми соединениями, такими как лиганды (ссылка к фиг.1). В дальнейшем данный способ будет описан более детально.In addition to the above-described methods for determining phosphorylated or dephosphorylated proteins, a method was developed using Surface Plasmon Resonance (hereinafter referred to as “SPR") as a general method for studying compounds, such as proteins that specifically bind to specific compounds, such as ligands (reference to FIG. one). In the future, this method will be described in more detail.

Когда свет полностью отражается на поверхности раздела между материалами, имеющими различные коэффициенты преломления, на общей поверхности отражения генерируется свет, называемый нераспространяющейся волной. Кроме того, на поверхности металла генерируется вид волны сжатия электрона, возникающего на поверхности раздела металл - диэлектрическое вещество, которая называется поверхностным плазмоном. Когда угол падающего света контролируют так, что фазовые скорости как нераспространяющейся волны, так и поверхностного плазмона могут быть совпадающими, данный поверхностный резонанс будет резонансно возбуждаться, и, таким образом, данный поверхностный плазмон может значительно увеличить электромагнитное поле на поверхности металла. В данном случае, поскольку энергия падающего света поглощается возбуждением поверхностного плазмона, интенсивность отраженного света снижается.When light is completely reflected on the interface between materials with different refractive indices, light called a non-propagating wave is generated on the common reflection surface. In addition, a kind of electron compression wave is generated on the metal surface, which arises at the metal-dielectric substance interface, which is called the surface plasmon. When the angle of the incident light is controlled so that the phase velocities of both the non-propagating wave and the surface plasmon can be the same, this surface resonance will be resonantly excited, and thus this surface plasmon can significantly increase the electromagnetic field on the metal surface. In this case, since the energy of the incident light is absorbed by the excitation of the surface plasmon, the intensity of the reflected light decreases.

Градус угла падения и длина волны падающего света, дающего данное поглощение, показывают значительное резкое изменение согласно состоянию поверхности металла, особенно в пределах нескольких сотен нанометров. Соответственно изменение состояния, например существование соединений на поверхности металла, чувствительно влияет на интенсивность отраженного света. Когда лиганды или аналогичные соединения связаны с поверхностью металла и затем исследуемый образец воздействует на металл, наличие соединений, взаимодействующих с лигандами или аналогичными соединениями, изменяет интенсивность отраженного света. Следовательно, когда лиганды или аналогичные соединения наносят на поверхность металла, как показано на фиг.1, и оценивают интенсивности отраженного света с добавлением и без добавления исследуемого образца, то можно добиться оценки существования соединений, взаимодействующих с лигандом или аналогичным соединением. Также можно использовать данный способ для биологической визуализации. То есть в клетках или тканях живого организма данный способ будет давать возможность изображения локализации соединения, взаимодействующего со специфическим соединением.The angle of incidence and the wavelength of the incident light giving this absorption show a significant sharp change according to the state of the metal surface, especially within a few hundred nanometers. Accordingly, a change in state, for example, the existence of compounds on a metal surface, sensitively affects the intensity of reflected light. When ligands or similar compounds are bonded to a metal surface and then the sample under investigation acts on the metal, the presence of compounds interacting with ligands or similar compounds changes the intensity of the reflected light. Therefore, when ligands or similar compounds are applied to a metal surface, as shown in FIG. 1, and the intensities of reflected light are evaluated with and without the addition of a test sample, it is possible to assess the existence of compounds interacting with a ligand or similar compound. You can also use this method for biological imaging. That is, in the cells or tissues of a living organism, this method will enable the image of the localization of a compound interacting with a specific compound.

В японском переводе международной публикации РСТ № Hei 11-512186 описан пример способа. Согласно данному документу, когда подвижный буфер → исследуемый образец → подвижный буфер последовательно воздействует на пленку благородного металла, как показано на фиг.1, градус угла падения, дающего ППР, показывает изменение со временем, как показано на фиг.2. Способ указанного документа измеряет данное изменение со временем и исследует минимальное и максимальное значение коэффициента отражения, а также связь между коэффициентом преломления и периодом времени. Данный документ также показывает, что можно определить константу диссоциации и константу ассоциации между соединением, нанесенным на пленку благородного металла, и соединением исследуемого образца и концентрацию соединения в образце.The Japanese translation of PCT International Publication No. Hei 11-512186 describes an example method. According to this document, when a movable buffer → a test sample → a movable buffer sequentially acts on a noble metal film, as shown in FIG. 1, the degree of incidence angle giving SPR shows a change with time, as shown in FIG. 2. The method of this document measures this change over time and examines the minimum and maximum values of the reflection coefficient, as well as the relationship between the refractive index and the time period. This document also shows that it is possible to determine the dissociation constant and the association constant between the compound deposited on the noble metal film and the compound of the test sample and the concentration of the compound in the sample.

Кроме того, японский перевод международной публикации РСТ № Hei 10-505910 описывает способ осуществления ППР измерения. В данном способе N-(5-амино-1-карбоксипентил)иминодиацетат связан с пленкой благородного металла посредством карбоксиметилированного декстрана, далее с ним координируют никель и измеряют ППР. Поскольку данный комплекс никеля показывает специфическое сродство к пептиду, имеющему два соседних гистидиновых остатка, его называют His-tag, и он позволяет определить пептид, содержащий дигистидиновый остаток в исследуемом образце.In addition, the Japanese translation of PCT International Publication No. Hei 10-505910 describes a method for performing PPR measurement. In this method, N- (5-amino-1-carboxypentyl) iminodiacetate is bonded to a noble metal film by carboxymethylated dextran, then nickel is coordinated with it and the SPR is measured. Since this nickel complex shows a specific affinity for a peptide having two adjacent histidine residues, it is called His-tag, and it allows the determination of a peptide containing a digistidine residue in the test sample.

Кроме того, для измерения поверхностного плазмонного резонанса можно использовать спектроскопию комбинационного рассеивания. Спектроскопия комбинационного рассеивания представляет собой метод получения информации о соединениях, где в рассеянном свете, генерированном облучением вещества монохроматическим светом с фиксированной частотой ν_О, измеряют рассеянный свет (свет комбинационного рассеивания) (ν_О±ν_i), отличный от вышеупомянутой частоты. Более детально, поскольку данная частота комбинационного рассеивания ν_I равна частоте между колебательными уровнями или энергии вращения молекулы, или кристаллической составляющей вещества, это обеспечивает источники информации для определения, идентификации и количественного анализа энергетических уровней вещества (ссылка на ″Dictionary for Chemistry (Kagaku Daijiten)" (Tokyo Kagaku Dojin).In addition, Raman spectroscopy can be used to measure surface plasmon resonance. Raman spectroscopy is a method for obtaining information about connections, where the scattered light generated by irradiating a substance with monochromatic light at a fixed frequency ν _O is measured scattered light (Raman scattering light) (ν _O ± ν _i), different from the above frequency. In more detail, since this Raman frequency ν _I is equal to the frequency between vibrational levels of either the rotation energy of a molecule or the crystalline component of a substance, this provides information sources for determining, identifying and quantifying the energy levels of a substance (link to ″ Dictionary for Chemistry (Kagaku Daijiten) "(Tokyo Kagaku Dojin).

Однако поскольку данный свет комбинационного рассеивания является очень слабым, его измерение обычно осуществляли, увеличивая свет, используя эффект поверхностного плазмонного резонанса (например, публикация нерассмотренной заявки на патент № Hei 9-257578). Хотя, в общем, свет не соединяется с электронной волной (плазмоном), он может соединяться на поверхности металлической частицы. В таком случае данный технический прием увеличивает интенсивность слабой полосы комбинационного рассеивания металлом, существующим в непосредственной близости к образцу, который необходимо измерить.However, since this Raman light is very weak, its measurement was usually carried out by increasing the light using the effect of surface plasmon resonance (for example, publication of the unexamined patent application No. Hei 9-257578). Although, in general, light does not connect to the electron wave (plasmon), it can connect to the surface of a metal particle. In this case, this technique increases the intensity of the weak Raman scattering band by a metal that exists in close proximity to the sample to be measured.

Однако эффект усиления интенсивности полосы комбинационного рассеивания посредством традиционной технологии не являлся непременно удовлетворительным. Причина заключается в том, что не все целевые молекулы могут контактировать с металлом, даже когда подложку (металл) 2 и образец 3 заставляют близко находиться друг к другу, как на фиг.1 № Hei 9-257578, хотя меньшее расстояние между целевой молекулой и металлом дает более сильный эффект поверхностного плазмонного резонанса. Такое же обстоятельство наблюдается, когда металл добавляют в водный раствор образца.However, the effect of enhancing the intensity of the Raman band by means of traditional technology was not necessarily satisfactory. The reason is that not all target molecules can come into contact with the metal, even when the substrate (metal) 2 and sample 3 are forced to be close to each other, as in figure 1 No. Hei 9-257578, although the smaller distance between the target molecule and metal gives a stronger effect of surface plasmon resonance. The same circumstance is observed when a metal is added to an aqueous solution of a sample.

Между прочим, Hironori Takeda et al., RAPID COMMUNICATIONS IN MASSSPECTROMETRY, vol.17, Issue 18, pp.2075-2081 (2003) описывает способ определения молекулярной массы фосфорилированного соединения с использованием соединения, специфически связанного с фосфатной группой, т.е. группой сложного моноэфира фосфорной кислоты. Однако данный документ не предоставляет ни описания, ни предложения технической идеи как заставить металл приблизиться к целевому соединению посредством данного специфического связывающего соединения или идеи применения данного соединения для измерения поверхностного плазмонного резонанса.Incidentally, Hironori Takeda et al., RAPID COMMUNICATIONS IN MASSSPECTROMETRY, vol.17, Issue 18, pp.2075-2081 (2003) describes a method for determining the molecular weight of a phosphorylated compound using a compound specifically bound to a phosphate group, i.e. phosphoric acid monoester group. However, this document provides neither a description nor a proposal for a technical idea how to make a metal approach the target compound using this specific binding compound or the idea of using this compound to measure surface plasmon resonance.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION

При вышеописанной ситуации цель настоящего изобретения состоит в предложении способа измерения поверхностного плазмонного резонанса для обнаружения фосфорилированного пептида (белка) в исследуемом образце и для оценки того, является ли пептид фосфорилированным или нет. Цель настоящего изобретения также заключается в предложении соединения благородного металла, применимого для данного способа, которое содержит заместители (Phos-tag) со специфической и высокой координационной способностью по отношению к группе сложного моноэфира фосфорной кислоты.In the situation described above, an object of the present invention is to provide a method for measuring surface plasmon resonance for detecting a phosphorylated peptide (protein) in a test sample and for evaluating whether the peptide is phosphorylated or not. An object of the present invention is also to provide a noble metal compound useful for the process that contains Phos-tag substituents with a specific and high coordination ability with respect to the phosphoric acid monoester group.

Кроме того, другая цель настоящего изобретения состоит в предложении предшественника для получения соединения благородного металла, содержащего на своей поверхности Phos-tag в качестве заместителей.In addition, another objective of the present invention is to provide a precursor for the preparation of a noble metal compound containing Phos-tag as substituents on its surface.

Чтобы решить описанные выше проблемы, авторы настоящего изобретения посвятили себя исследованию комплекса металла, способного координироваться с фосфатной группой (группой сложного моноэфира фосфорной кислоты), связанной с белком, и обнаружили, что заместитель по настоящему изобретению имеет чрезвычайно высокую способность координации с двумя гидроксильными группами в ионе фосфорной кислоты или в сложном моноэфире фосфорной кислоты, в результате заместитель может образовывать связь с пептидом или сильно координировать фосфатную группу (группу сложного моноэфира фосфорной кислоты), и он может специфически связываться с фосфорилированным пептидом с получением комплекса даже в смешанном образце, включающем множество пептидов. Таким образом, авторы настоящего изобретения обнаружили, что измерение ППР с использованием данного заместителя может решить вышеописанные проблемы, приведя к осуществлению настоящего изобретения.To solve the problems described above, the authors of the present invention devoted themselves to the study of a metal complex capable of coordinating with a phosphate group (phosphoric acid monoester group) bound to a protein, and found that the substituent of the present invention has an extremely high coordination capacity with two hydroxyl groups in phosphoric acid ion or phosphoric acid monoester, as a result, the substituent may form a bond with the peptide or coordinate phosphate strongly uppu (phosphoric acid monoester group), and it can specifically bind to a phosphorylated peptide to form a complex even in a mixed sample including many peptides. Thus, the authors of the present invention have found that the measurement of SPR using this substituent can solve the above problems, leading to the implementation of the present invention.

Первый способ измерения поверхностного плазмонного резонанса включаетA first method for measuring surface plasmon resonance involves

помещение соединения благородного металла на нижнюю грань призмы, облучение призмы светом для обнаружения отраженного света, гдеplacing the noble metal compound on the lower face of the prism, irradiating the prism with light to detect reflected light, where

соединение благородного металла содержит заместители следующей ниже формулы (I) на стороне, противоположной стороне, контактирующей с призмой, иthe noble metal compound contains substituents of the following formula (I) on the side opposite to the side in contact with the prism, and

исследуемый образец добавляют к стороне, содержащей заместители (I) в соединении благородного металлаthe test sample is added to the side containing the substituents (I) in the noble metal compound

где Х представляет связующую группу.where X represents a linking group.

Кроме того, второй способ измерения поверхностного плазмонного резонанса по настоящему изобретению включает добавление соединения благородного металла, содержащего заместители вышеуказанной формулы (I) на своей поверхности, к исследуемому образцу и использование спектроскопии комбинационного рассеивания.In addition, the second method for measuring surface plasmon resonance of the present invention includes adding a noble metal compound containing substituents of the above formula (I) on its surface to the test sample and using Raman spectroscopy.

Соединение благородного металла по настоящему изобретению используют для вышеуказанного способа измерения поверхностного плазмонного резонанса, и оно имеет заместители, представленные формулой (I), на своей поверхности. Когда соединение благородного металла используют первым способом, оно предпочтительно имеет форму пленки, а когда его используют вторым способом, оно предпочтительно имеет форму частиц.The noble metal compound of the present invention is used for the above method for measuring surface plasmon resonance, and it has substituents represented by formula (I) on its surface. When the noble metal compound is used in the first way, it is preferably in the form of a film, and when it is used in the second way, it is preferably in the form of particles.

Соединение-предшественник в качестве промежуточного продукта соединения благородного металла легко превращается в соединение благородного металла обработкой солями цинка или аналогичными соединениями, и оно имеет заместители, представленные формулой (VII), на поверхности благородного металла. Поскольку форму соединения-предшественника определяют в соответствии с формой соединения благородного металла в качестве получаемого целевого соединения, предпочтительно оно имеет форму пленки металла или форму частицы металлаThe precursor compound as an intermediate of the noble metal compound is readily converted to the noble metal compound by treatment with zinc salts or the like, and it has substituents represented by formula (VII) on the surface of the noble metal. Since the shape of the precursor compound is determined according to the shape of the noble metal compound as the resulting target compound, it is preferably in the form of a metal film or the shape of a metal particle

где X представляет связующую группу.where X represents a linking group.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

Фиг.1 схематически иллюстрирует одну процедуру измерения ППР. После регулирования длины волны падающего света и угла падения для измерения ППР, то есть для уменьшения интенсивности отраженного света, к пленке благородного металла, содержащей связанный лиганд, добавляют исследуемый образец и наблюдают изменение интенсивности падающего света. На данной фигуре номер позиции 1 представляет призму, 2 представляет пленку благородного металла, 3 представляет лиганд и 4 представляет белок, включенный в исследуемый образец, который взаимодействует с лигандом.Figure 1 schematically illustrates one procedure for measuring SPR. After adjusting the wavelength of the incident light and the angle of incidence to measure the SPR, that is, to reduce the intensity of the reflected light, the test sample is added to the noble metal film containing the bound ligand and a change in the intensity of the incident light is observed. In this figure, reference number 1 represents a prism, 2 represents a noble metal film, 3 represents a ligand, and 4 represents a protein included in a test sample that interacts with a ligand.

Фиг.2 схематически иллюстрирует изменение со временем угла ППР при непрерывном использовании в порядке подвижный буфер → исследуемый образец → подвижный буфер, при измерении ППР на фиг.1. Данный чертеж иллюстрирует, что связывание соединения в исследуемом образце с пленкой благородного металла дает изменение в угле падения в измерении ППР.Figure 2 schematically illustrates the change over time of the SPR angle when continuously used in the order of a movable buffer → a test sample → a movable buffer, when measuring the SPR in figure 1. This drawing illustrates that the binding of the compound in the test sample to a noble metal film gives a change in the angle of incidence in the SPR measurement.

Фиг.3 иллюстрирует результат ППР измерения образца, включающего фосфорилированный β-казеин.Figure 3 illustrates the result of the SPR measurement of a sample comprising phosphorylated β-casein.

Фиг.4 иллюстрирует результат ППР измерения образца, включающего дефосфорилированный β-казеин.Figure 4 illustrates the result of the SPR measurement of a sample comprising dephosphorylated β-casein.

Фиг.5 иллюстрирует результат ППР измерения образца, включающего нефосфорилированный бычий сывороточный альбумин (BSA) в качестве обычного белка.FIG. 5 illustrates an SPR measurement of a sample comprising non-phosphorylated bovine serum albumin (BSA) as a normal protein.

Фиг.6 иллюстрирует разницу, полученную вычитанием RU значений проточной ячейки B из RU значений проточной ячейки A в результатах тестов, проиллюстрированных на фиг.3-5.FIG. 6 illustrates the difference obtained by subtracting RU values of flow cell B from RU values of flow cell A in the test results illustrated in FIGS. 3-5.

Фиг.7 иллюстрирует результат ППР измерений образцов, включающих фосфорилированный пептид (P-p60csrc) или нефосфорилированный пептид (p60csrc).Fig. 7 illustrates an SPR measurement of samples comprising a phosphorylated peptide (P-p60csrc) or a non-phosphorylated peptide (p60csrc).

Фиг.8 иллюстрирует результат ППР измерений образца, включающего фосфорилированный β-казеин.Fig. 8 illustrates an SPR measurement of a sample comprising phosphorylated β-casein.

НАИЛУЧШИЙ СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯBEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION

В дальнейшем, прежде всего, будет описан способ измерения ППР по настоящему изобретению.In the future, first of all, a method for measuring the SPR of the present invention will be described.

Измерение ППР в первом способе по настоящему изобретению можно осуществить, используя широко известные приборы. Например, можно использовать прибор, описанный в подробном описании патента США №5313264. Данный способ измерения ППР чрезвычайно подходит для определения фосфорилированного пептида, основываясь на преимуществах, что:The SPR measurement in the first method of the present invention can be carried out using well-known instruments. For example, you can use the device described in the detailed description of US patent No. 5313264. This method of measuring SPR is extremely suitable for determining a phosphorylated peptide based on the advantages that:

1) операция введения метки, например введение флуоресцентной окрашивающей группы, не является необходимой,1) the operation of the introduction of the label, for example the introduction of a fluorescent staining group, is not necessary,

2) способ обладает высокой чувствительностью по отношению к молекулам со сравнительно высокой молекулярной массой, и2) the method has a high sensitivity with respect to molecules with a relatively high molecular weight, and

3) легкое образование связи молекул, содержащих тиольную группу или дисульфидную группу, с поверхностью соединения благородного металла, такого как золото, дает возможность введения заместителей на поверхность с высокой плотностью.3) the easy formation of bonds of molecules containing a thiol group or a disulfide group with the surface of the compound of a noble metal, such as gold, makes it possible to introduce substituents on the surface with a high density.

Принцип измерения уже был описан выше с использованием фиг.1 и 2, а описание, касающееся прибора, измеряющего ППР, будет конкретно дано в дальнейшем. На фиг.1, когда светом облучают пленку благородного металла со стороны призмы, так что задают общее отражение, интенсивность отраженного света будет падать при определенном угле, основанном на генерировании ППР. Поскольку данный угол резко различается на основе изменения количества соединения, т.е. изменения массы, связанного с пленкой благородного металла, то прибор, измеряющий ППР, может показать данное изменение массы в виде данных измерения (Резонансных единиц, 1 RU - 1 пг/мм²) от интенсивности отраженного света.The measurement principle has already been described above using FIGS. 1 and 2, and a description regarding the instrument measuring the SPR will be specifically given hereinafter. In Fig. 1, when a noble metal film is irradiated from the prism side so that the overall reflection is set, the intensity of the reflected light will fall at a certain angle based on the generation of SPR. Since this angle differs sharply based on a change in the amount of compound, i.e. changes in the mass associated with the film of a noble metal, the device measuring the SPR can show this change in mass in the form of measurement data (Resonance units, 1 RU - 1 pg / mm ² ) from the intensity of the reflected light.

Затем после введения заместителей, показывающих специфическую связывающую способность по отношению к фосфорилированному пептиду, в пленку благородного металла, на пленку воздействуют исследуемым образцом для получения данных.Then, after the introduction of substituents showing a specific binding ability with respect to the phosphorylated peptide into the noble metal film, the test sample is exposed to the film to obtain data.

Затем сравнение полученных данных и данных в стационарном состоянии дает возможность понять существование или количество фосфорилированного пептида в исследуемом образце.Then, a comparison of the obtained data and the data in a stationary state makes it possible to understand the existence or amount of phosphorylated peptide in the test sample.

Второй способ по настоящему изобретению может непосредственно использовать обычные приборы для спектроскопии комбинационного рассеивания. Однако необходимо заставить соединение благородного металла (частицы благородного металла) по настоящему изобретению подвергнуться воздействию исследуемого образца. В результате не только пик фосфорилированного пептида сдвигается, но также интенсивность пика увеличивается эффектом поверхностного плазмонного резонанса, основанным на связывании соединения благородного металла, по сравнению со случаем без действия соединения благородного металла по изобретению. Таким образом, сравнение данных с данными спектра комбинационного рассеивания в случае без действия соединения благородного металла по настоящему изобретению дает возможность оценить, фосфорилирован ли пептид или нет.The second method of the present invention can directly use conventional Raman spectroscopy instruments. However, it is necessary to make the noble metal compound (noble metal particles) of the present invention be exposed to the test sample. As a result, not only the peak of the phosphorylated peptide is shifted, but also the peak intensity is increased by the effect of surface plasmon resonance based on binding of the noble metal compound, as compared to the case without the action of the noble metal compound of the invention. Thus, comparing the data with Raman spectra in the case of no action of the noble metal compound of the present invention makes it possible to assess whether the peptide is phosphorylated or not.

Исследуемый образец, используемый во втором способе по настоящему изобретению, имеет форму водного раствора или водной дисперсии. Причиной является то, что соединение благородного металла по настоящему изобретению необходимо связать с фосфорилированным пептидом. Исследуемый образец может, например, представлять собой необработанные биологические материалы, и предпочтительно он представляет собой образец, полученный очисткой пептида, который необходимо оценить на существование фосфорилирования. Причина заключается в том, что удовлетворительный спектр не может быть получен из-за существования примесей в спектроскопии комбинационного рассеивания.The test sample used in the second method of the present invention is in the form of an aqueous solution or an aqueous dispersion. The reason is that the noble metal compound of the present invention needs to be coupled to a phosphorylated peptide. The test sample may, for example, be unprocessed biological materials, and preferably it is a sample obtained by purification of the peptide, which must be assessed for the existence of phosphorylation. The reason is that a satisfactory spectrum cannot be obtained due to the existence of impurities in Raman spectroscopy.

Заместитель, используемый в соединении благородного металла по настоящему изобретению, является чрезвычайно превосходным с точки зрения специфической связывающей способности по отношению к фосфорилированному пептиду и имеет следующие структуры:The substituent used in the noble metal compound of the present invention is extremely excellent in terms of specific binding ability to the phosphorylated peptide and has the following structures:

Причина выбора Zn в качестве координационного металла в формуле (I) заключается в том, что он обладает чрезвычайно высокой координационной способностью по отношению к фосфатной группе (группе сложного моноэфира фосфорной кислоты) фосфорилированного белка.The reason for choosing Zn as the coordination metal in formula (I) is that it has an extremely high coordination ability with respect to the phosphate group (phosphoric acid monoester group) of the phosphorylated protein.

В соединении благородного металла по настоящему изобретению ″связующая группа представляет собой группу для связывания части, представляющей собой благородный металл, и вышеуказанной основной структуры, то есть основной части, имеющей способность взаимодействия с фосфорилированным протеином, в дальнейшем называемой ″Phos-tag″. Связующая группа обладает функциями, дающими возможность легкого получения соединения благородного металла по настоящему изобретению и увеличения степени свободы заместителя (I) для реализации легкой координации с фосфатной группой, связанной с пептидом. Вид ″связующей группы″ особым образом не ограничивается, пока она обладает вышеуказанной функцией, и она включает, например, цепь сахарозы, С₁-С₆ алкиленовую группу, аминогруппу (-NH-), группу простого эфира (-O-), тиоэфирную группу (-S-), карбонильную группу (-C(=O)-), тионильную группу (-C(=S)-), группу сложного эфира, амидогруппу, группу мочевины (-NHC(=O)NH-), группу тиомочевины (-NHC(=S)NH-), комплекс биотин-стрептавидин, комплекс биотин-авидин; цепь сахарозы, содержащую на своем конце группу, выбранную из группы, состоящей из аминогруппы, группы простого эфира, тиоэфирной группы, карбонильной группы, тионильной группы, группы сложного эфира, амидогруппы, группы мочевины, группы тиомочевины; и С₁-С₆ алкиленовую группу, содержащую на своем конце группу, выбранную из группы, состоящей из аминогруппы, группы простого эфира, тиоэфирной группы, карбонильной группы, тионильной группы, группы сложного эфира, амидогруппы, группы мочевины, группы тиомочевины, комплекса биотин-стрептавидин, комплекса биотин-авидин; С₁-С₆ алкиленовую группу, содержащую на своих обоих концах группы, идентичные друг другу или отличные друг от друга, выбранные из группы, состоящей из аминогруппы, группы простого эфира, тиоэфирной группы, карбонильной группы, тионильной группы, группы сложного эфира, амидогруппы, группы мочевины, группы тиомочевины; и группы, полученной линейным связыванием двух или более групп, выбранных из группы, состоящей из вышеуказанных групп.In the noble metal compound of the present invention, the “linking group is a group for linking the noble metal part and the above basic structure, that is, the main part having the ability to interact with the phosphorylated protein, hereinafter referred to as“ Phos-tag ″. The linking group has functions that make it easy to obtain the noble metal compound of the present invention and increase the degree of freedom of the substituent (I) to achieve easy coordination with the phosphate group associated with the peptide. The appearance of the “linking group” is not particularly limited as long as it has the above function, and it includes, for example, a sucrose chain, a C ₁ -C ₆ alkylene group, an amino group (-NH-), an ether group (-O-), a thioether a group (-S-), a carbonyl group (-C (= O) -), a thionyl group (-C (= S) -), an ester group, an amido group, a urea group (-NHC (= O) NH-), thiourea group (-NHC (= S) NH-), biotin-streptavidin complex, biotin-avidin complex; a sucrose chain containing at its end a group selected from the group consisting of an amino group, an ether group, a thioether group, a carbonyl group, a thionyl group, an ester group, an amido group, a urea group, a thiourea group; and a C ₁ -C ₆ alkylene group containing at its end a group selected from the group consisting of an amino group, an ether group, a thioether group, a carbonyl group, a thionyl group, an ester group, an amido group, a urea group, a thiourea group, a biotin complex -streptavidin, a complex of biotin-avidin; C ₁ -C ₆ alkylene group containing, at its both ends, groups identical to each other or different from each other, selected from the group consisting of an amino group, an ether group, a thioether group, a carbonyl group, a thionyl group, an ester group, an amido group urea groups; thiourea groups; and a group obtained by linearly linking two or more groups selected from the group consisting of the above groups.

Концевой группой на стороне, связанной с частью благородного металла связующей группы, предпочтительно является тиоэфирная группа. Причиной является то, что данное соединение благородного металла можно легко получить, используя тиольное соединение или дисульфидное соединение.The end group on the side bonded to the noble metal portion of the binder group is preferably a thioether group. The reason is that this noble metal compound can be easily prepared using a thiol compound or a disulfide compound.

В настоящем изобретении ″цепь сахарозы" показывает обычный связанный линейный или разветвленный сахарид, и, например, в качестве примера можно привести декстран, полученный полимеризацией гликозидной связи D-глюкозы. Кроме функции вышеописанной связующей группы данная цепь сахарозы обладает высокой гидрофильностью и превосходным сродством к биологическим материалам. Кроме того, поскольку данную цепь сахарозы, имеющую разветвленную цепь, можно легко синтезировать, то можно преимущественно связать большее количество основных каркасов замещающей группы (I).In the present invention, the “sucrose chain” shows a conventional, linear or branched saccharide, and, for example, dextran obtained by polymerization of a D-glucose glycosidic bond can be exemplified. In addition to the function of the above-described linking group, this sucrose chain has high hydrophilicity and excellent biological affinity. In addition, since this branched chain sucrose chain can be easily synthesized, it is possible to predominantly bind more basic carcasses substituent group (I).

В настоящем описании ″С₁-С₆ алкиленовая группа" представляет линейную или разветвленную двухвалентную алифатическую углеводородную группу с числом атомов углерода от 1 до 6 и включает, например, метилен, этилен, пропилен, тетраметилен, гексаметилен, метилэтилен, метилпропилен, диметилпропилен и аналогичные. Предпочтительной является С₁-С₄ алкиленовая группа, и особенно предпочтительной является С₁-С₂ алкиленовая группа.As used herein, a “C ₁ -C ₆ alkylene group” represents a linear or branched divalent aliphatic hydrocarbon group having from 1 to 6 carbon atoms and includes, for example, methylene, ethylene, propylene, tetramethylene, hexamethylene, methylene, methylpropylene, dimethylpropylene and the like. A C ₁ -C ₄ alkylene group is preferred, and a C ₁ -C ₂ alkylene group is particularly preferred.

Длина вышеуказанной связующей группы особым образом не ограничивается, и предпочтительно она не превышает 200 нм, более предпочтительно не превышает 100 нм. Это потому, что связующая группа, имеющая меньшую длину, дает возможность более отчетливо обнаружить фосфорилированный пептид.The length of the above linking group is not particularly limited, and preferably it does not exceed 200 nm, more preferably does not exceed 100 nm. This is because a binding group having a shorter length makes it possible to more clearly detect the phosphorylated peptide.

В пиридиновое кольцо заместителя (I) можно ввести метильную группу или аналогичную, пока полученный в результате заместитель имеет то же функциональное действие на заместитель (I). Такой эквивалент также будет включен в объем настоящего изобретения.A methyl group or the like can be introduced into the pyridine ring of substituent (I), as long as the resulting substituent has the same functional effect on substituent (I). Such an equivalent will also be included in the scope of the present invention.

Кроме того, положение связующей группы в заместителе (I) по настоящему изобретению особым образом не ограничивается, и связующая группа может существовать в положении, иллюстрируемом следующим ниже заместителем (I').In addition, the position of the linking group in the substituent (I) of the present invention is not particularly limited, and the linking group may exist in the position illustrated by the following substituent (I ').

Заместитель (I') и заместитель (I) полностью эквивалентны друг другу, и нет необходимости разъяснять, какой заместитель можно получить в реакции синтеза. Возможно, что их фактически получают в виде смеси, и естественно заместитель (I') также будет включен в объем настоящего изобретения.Deputy (I ') and Deputy (I) are completely equivalent to each other, and there is no need to explain which Deputy can be obtained in the synthesis reaction. It is possible that they are actually obtained in the form of a mixture, and naturally the substituent (I ') will also be included in the scope of the present invention.

В настоящем изобретении ″благородные металлы" представляют собой золото, серебро, платину, родий, рутений, палладий, осмий или иридий. В настоящем изобретении предпочтительно используют любой из металлов, выбранный из группы, включающей золото, серебро, платину или родий, особенно предпочтительно используют золото. Причина заключается в том, что золото, как доказано, демонстрирует удовлетворительный эффект поверхностного плазмонного резонанса.In the present invention, "noble metals" are gold, silver, platinum, rhodium, ruthenium, palladium, osmium or iridium. Any of the metals selected from the group consisting of gold, silver, platinum or rhodium is preferably used in the present invention, particularly preferably gold The reason is that gold has been shown to exhibit a satisfactory surface plasmon resonance effect.

В первом способе форма пленки является предпочтительной формой соединения благородного металла по настоящему изобретению. Причина состоит в том, что пленочные материалы можно применить в измерительной аппаратуре поверхностного плазмона без какой-либо обработки. Толщина данной пленки благородного металла особым образом не ограничивается, и предпочтительно она составляет от 10 до 100 нм и обычно примерно 50 нм.In the first method, the film shape is the preferred form of the noble metal compound of the present invention. The reason is that the film materials can be used in the measuring equipment of a surface plasmon without any processing. The thickness of this noble metal film is not particularly limited, and preferably it is from 10 to 100 nm and usually about 50 nm.

Во втором способе предпочтительной является форма частицы. Причина состоит в том, что поскольку настоящее изобретение заставляет соединение благородного металла связываться с фосфорилированным пептидом, включенным в исследуемый образец, растворенный или диспергированный, то соединение благородного металла необходимо диспергировать в исследуемом образце. Средний размер частицы предпочтительно находится в диапазоне от 30 до 50 нм. Диаметр частицы менее 30 нм иногда может не предоставить достаточный эффект увеличения света комбинационного рассеивания, а диаметр частицы более 50 нм делает возможным избыточное агрегирование частиц в течение измерений. Однако поскольку данный диапазон представляет средний размер частиц, то частицы вне данного диапазона могут существовать.In a second method, a particle shape is preferred. The reason is that since the present invention causes the noble metal compound to bind to the phosphorylated peptide included in the test sample, dissolved or dispersed, the noble metal compound must be dispersed in the test sample. The average particle size is preferably in the range from 30 to 50 nm. A particle diameter of less than 30 nm may sometimes not provide a sufficient effect of increasing Raman scattering light, and a particle diameter of more than 50 nm makes possible excessive aggregation of particles during measurements. However, since this range represents the average particle size, particles outside this range may exist.

Способы измерения среднего размера частиц особым образом не ограничиваются. Поскольку размеры частиц, которые необходимо измерить, вероятно, находятся в диапазоне от нескольких нм до десятков нм, то распределение размера частиц можно измерить прибором, применимым для метода лазерного рассеяния, подходящим для измерения диаметра микрочастиц (фотометр для измерения рассеивания лазерного света), и можно вычислить средний диаметр частиц.Methods for measuring the average particle size are not particularly limited. Since the particle sizes that need to be measured are likely to be in the range from several nm to tens of nm, the particle size distribution can be measured with a device suitable for the laser scattering method, suitable for measuring the diameter of microparticles (photometer for measuring the scattering of laser light), and calculate the average particle diameter.

Хотя соединение благородного металла по настоящему изобретению можно легко получить способом, включающим схему 1, способ получения не ограничивается способами, иллюстрируемыми в дальнейшем.Although the noble metal compound of the present invention can be easily obtained by a method including Scheme 1, the production method is not limited to the methods illustrated hereinafter.

Схема 1Scheme 1

где X представляет вышеуказанную связующую группу, R¹ и R² представляют реакционноспособные группы для получения -X-Phos-tag группы на поверхности пленки благородного металла.where X represents the above linking group, R ¹ and R ² represent reactive groups to obtain -X-Phos-tag groups on the surface of the noble metal film.

В схеме 1 сначала получают R¹ в качестве реакционноспособной группы для образования связующей группы X, вводя замещением на благородный металл. Здесь виды связи между реакционноспособной группой R¹ и благородным металлом не является необходимым разъяснять, и типы связывания особым образом не обсуждаются. Например, известно, что тиольное соединение и дисульфидное соединение самопроизвольно адсорбируется на поверхности благородного металла, образуя мономолекулярную пленку, называемую самоорганизованным монослоем. Затем, когда существует связывание между реакционноспособной группой R¹ и благородным металлом через атом серы, типы связывания между благородным металлом и атомом серы в вышеприведенной схеме особым образом не ограничиваются, и они должны быть просто связаны определенным взаимодействием.In Scheme 1, R ¹ is first prepared as a reactive group to form a linking group X, introducing substitution on a noble metal. Here, the types of bonds between the reactive group R ¹ and the noble metal are not necessary to explain, and the types of binding are not specifically discussed. For example, it is known that a thiol compound and a disulfide compound spontaneously adsorb on the surface of a noble metal, forming a monomolecular film called a self-organized monolayer. Then, when there is a binding between the reactive group R ¹ and the noble metal via a sulfur atom, the types of binding between the noble metal and the sulfur atom in the above scheme are not particularly limited, and they should simply be connected by a specific interaction.

Когда конечное целевое соединение представляет собой пленку благородного металла, пленку благородного металла, замещенную реакционноспособной группой R¹, следует просто разрезать с получением подходящей формы для используемого прибора ППР, после того как материал благородного металла выковывают в подходящую толщину. Когда конечное целевое соединение представляет собой частицу, после получения частицы с использованием широко известных методов получения металлических частиц избыточно маленькие или избыточно большие частицы следует просто удалить, используя мембранный фильтр или аналогичное устройство, соответствующие желаемому диаметру частиц.When the final target compound is a noble metal film, the noble metal film substituted with the reactive group R ¹ should simply be cut to obtain a suitable shape for the SPR device used after the noble metal material is forged into a suitable thickness. When the final target compound is a particle, after producing a particle using well-known methods for producing metal particles, excessively small or excessively large particles should simply be removed using a membrane filter or similar device corresponding to the desired particle diameter.

Из схемы 1 ясно, что, когда реакционноспособную группу R¹ заставляют связываться с поверхностью благородного металла посредством атома серы, взаимодействие между тиольным соединением (например, R¹-SH) и благородным металлом продвигается легко, и реакционные условия или аналогичное просто должны следовать традиционным методам. Например, просто контакт поверхности благородного металла с раствором тиольного соединение может начать конденсацию между ними.From Scheme 1, it is clear that when the reactive group R ^{1 is} forced to bind to the surface of the noble metal via a sulfur atom, the interaction between the thiol compound (e.g., R ¹ -SH) and the noble metal proceeds easily, and reaction conditions or the like simply have to follow traditional methods . For example, simply contacting the surface of a noble metal with a solution of a thiol compound may initiate condensation between them.

Затем, чтобы связать предшественник Phos-tag посредством связующей группы X, заставляют взаимодействовать производное тетракис(пиридин-2-илметил)-1,3-диаминопропан-2-ола (соединение (VI), содержащее заместитель R². В схеме 1 типы R¹ и R², растворители, реакционные температуры, другие реагенты, методы очистки или аналогичное в процессе взаимодействия R¹ и R² в основном определяются видом X. Например, когда R¹ и R² необходимо связать амидо связью, чтобы получить X, то в качестве примера пары R¹ и R² можно привести пару из группы, содержащей аминогруппу (первичную аминогруппу), и активированной карбоксильной группы. В качестве реакционных условий в данном случае следует просто использовать обычные условия в области синтетической химии. Таким образом, на поверхности можно получить соединение благородного металла (VII), содержащее заместители.Then, to bind the Phos-tag precursor via linker group X, the tetrakis (pyridin-2-ylmethyl) -1,3-diaminopropan-2-ol derivative (compound (VI) containing the substituent R ^{2 is} forced to react. In Scheme 1, the types of R ¹ and R ² , solvents, reaction temperatures, other reagents, purification methods or the like during the interaction of R ¹ and R ² are mainly determined by the type X. For example, when R ¹ and R ² it is necessary to bind the amido bond to obtain X, then as an example, a pair of R ¹ and R ² can lead pair from the group consisting of amino (trans ary amine) and an activated carboxyl group. As the reaction conditions in this case, simply use conventional conditions in the field of synthetic chemistry. Thus, on the surface can receive a noble metal compound (VII), containing substituents.

Кроме того, соединения благородного металла, содержащие заместители (VII), также можно получить следующими способами.In addition, noble metal compounds containing substituents (VII) can also be obtained by the following methods.

где X” представляет группу, содержащую атом серы со стороны благородного металла среди вышеуказанных связующих групп, и X' представляет часть, отличную от концевого атома серы среди X” (когда X” просто представляет собой атом серы, X' просто представляет собой ковалентную связь).where X "represents a group containing a noble metal sulfur atom among the above linking groups, and X 'represents a part other than the terminal sulfur atom among X" (when X "is just a sulfur atom, X' is just a covalent bond) .

Поскольку взаимодействие тиольного соединения и благородного металла протекает чрезвычайно легко, как указано выше, производное тетракис(пиридин-2-илметил)-1,3-диаминопропан-2-ола, замещенное группой, содержащей тиольную группу на своем конце, дает возможность синтеза предшественника соединения благородного металла, содержащего на своей поверхности Phos-tag.Since the interaction of a thiol compound and a noble metal proceeds extremely easily, as described above, the tetrakis (pyridin-2-ylmethyl) -1,3-diaminopropan-2-ol derivative substituted by a group containing a thiol group at its end allows the synthesis of a compound precursor noble metal containing Phos-tag on its surface.

Наконец, добавление соли металла к соединению благородного металла, содержащему заместитель (VII), дает соединение благородного металла, содержащее на своей поверхности Phos-tag. Например, в данном случае можно добавить нитрат цинка (II) или ацетат цинка (II), и в случае добавления ацетата цинка (II) сразу получают следующее ниже соединение, содержащее координированную с ним уксусную кислоту.Finally, the addition of a metal salt to a noble metal compound containing a substituent (VII) yields a noble metal compound containing a Phos-tag on its surface. For example, in this case, zinc (II) nitrate or zinc (II) acetate can be added, and in the case of zinc (II) acetate added, the following compound immediately containing the acetic acid coordinated with it is immediately obtained.

Данное соединение более стабильно, чем заместитель (I), и его можно удобно хранить. Данное соединение является эквивалентом заместителя (I), и его можно использовать таким же образом, как заместитель (I). То есть, поскольку группа сложного моноэфира фосфорной кислоты обратимо координируется с уксусной кислотой при измерениях ППР, то можно обнаружить фосфорилированные пептиды.This compound is more stable than substituent (I) and can be conveniently stored. This compound is equivalent to substituent (I) and can be used in the same manner as substituent (I). That is, since the phosphoric acid monoester group is reversibly coordinated with acetic acid in SPR measurements, phosphorylated peptides can be detected.

Исходное соединение (соединение (VI)) в схеме 1 для присоединения Phos-tag к благородному металлу можно получить следующей ниже схемой 2.The starting compound (compound (VI)) in Scheme 1 for attaching a Phos-tag to a noble metal can be prepared by the following Scheme 2 below.

Схема 2Scheme 2

где R² имеет такое же обозначение, как указано ранее. ″Hal″ представляет собой атом галогена и предпочтительно представляет собой атом брома.where R ² has the same designation as previously indicated. ″ Hal ″ represents a halogen atom and preferably represents a bromine atom.

Соединение (II) (1,3-диамино-2-пропанол) в качестве исходного соединения имеется в продаже. Кроме того, поскольку соединение (III) и соединение (IV) имеют сравнительно простые структуры, они имеются в продаже или их можно синтезировать обычными методами, известными специалисту в данной области.Compound (II) (1,3-diamino-2-propanol) as a starting compound is commercially available. In addition, since compound (III) and compound (IV) have relatively simple structures, they are commercially available or can be synthesized by conventional methods known to a person skilled in the art.

В схеме 2 соединение (IV) сначала получают реакцией конденсации соединения (II) и (III) в присутствии катализатора. Хотя в данной реакции возможно последующее введение соединения (III), использование соединения (III) в количестве 3 эквивалентов или более дает возможность синтеза соединения (IV) в одностадийной реакции.In Scheme 2, compound (IV) is first prepared by a condensation reaction of compound (II) and (III) in the presence of a catalyst. Although subsequent administration of compound (III) is possible in this reaction, the use of compound (III) in an amount of 3 equivalents or more enables the synthesis of compound (IV) in a one-step reaction.

В схеме 2 реакцию восстановительного аминирования осуществляют в качестве реакции конденсации. В данном случае в качестве растворителя можно использовать любые растворители без особенных ограничений, пока растворитель может по существу растворять соединение (II) и (III) и не подавлять реакцию. Например, можно использовать спирты, такие как метанол, этанол и изопропанол; простые эфиры, такие как диэтиловый эфир, тетрагидрофуран и диоксан; воду и смеси вышеуказанных растворителей.In Scheme 2, the reductive amination reaction is carried out as a condensation reaction. In this case, any solvent can be used as a solvent without particular restrictions, as long as the solvent can essentially dissolve compound (II) and (III) and not suppress the reaction. For example, alcohols such as methanol, ethanol and isopropanol can be used; ethers, such as diethyl ether, tetrahydrofuran and dioxane; water and mixtures of the above solvents.

В реакции восстановительного аминирования после конденсации соединения (II) и (III) в присутствии концентрированной хлористоводородной кислоты в качестве катализатора восстановление осуществляют обычным восстановителем.In the reductive amination reaction, after the condensation of compounds (II) and (III) in the presence of concentrated hydrochloric acid, the reduction is carried out using a conventional reducing agent as a catalyst.

В качестве реакционной температуры предпочтительные условия могут просто основываться на виде сырья или аналогичном. Например, взаимодействие можно осуществлять при температуре от 20 до 80°C и в течение периода времени от 12 до 100 часов.As the reaction temperature, the preferred conditions may simply be based on the type of feed or the like. For example, the interaction can be carried out at a temperature of from 20 to 80 ° C and for a period of time from 12 to 100 hours.

После завершения реакции растворитель или аналогичное выпаривают под вакуумом и затем к реакционной смеси добавляют воду. Затем, после экстракции неводным растворителем, полученную органическую фазу сушат безводным сульфатом магния или аналогичным и используемый растворитель выпаривают под вакуумом. Затем полученный остаток очищают обычными известными методами, такими как колоночная хроматография на силикагеле, получая соединение (IV).After completion of the reaction, the solvent or the like is evaporated in vacuo and then water is added to the reaction mixture. Then, after extraction with a non-aqueous solvent, the resulting organic phase is dried with anhydrous magnesium sulfate or the like, and the solvent used is evaporated in vacuo. Then, the resulting residue was purified by conventional known methods, such as silica gel column chromatography, to give compound (IV).

Способ получения соединения (IV) не ограничивается способом, представленным схемой 2, и, например, соединение (IV) также можно синтезировать из соединения (II) и галогенированных соединений.The method for producing compound (IV) is not limited to the method represented by Scheme 2, and, for example, compound (IV) can also be synthesized from compound (II) and halogenated compounds.

Последующее взаимодействие с соединением (V) может дать соединение (VI). В качестве данной реакции используют реакцию синтеза обычных третичных аминов. Например, можно использовать реакцию конденсации в присутствии оснований в растворителях. Кроме того, введение защитной группы и отщепление защитной группы можно соответствующе осуществить согласно виду R² в данной стадии. Или соединение (VI) можно синтезировать обменом неактивного заместителя в R² посредством конверсии функциональной группы после стадии, использующей соединение, содержащее группу неактивного заместителя вместо R² в соединении (V). Например, после стадии, использующей соединение, содержащее нитрогруппу в качестве неактивного заместителя, нитрогруппу можно конвертировать в аминогруппу в качестве реакционноспособной группы.Subsequent reaction with compound (V) can give compound (VI). The reaction used is the synthesis of conventional tertiary amines. For example, you can use the condensation reaction in the presence of bases in solvents. In addition, the introduction of the protective group and the removal of the protective group can be suitably carried out according to the form of R ² in this stage. Or, compound (VI) can be synthesized by exchanging an inactive substituent in R ² by converting a functional group after a step using a compound containing an inactive substituent group instead of R ² in compound (V). For example, after a step using a compound containing a nitro group as an inactive substituent, the nitro group can be converted to an amino group as a reactive group.

В качестве заместителя, который можно использовать для способа по настоящему изобретению, также вместо заместителя (I) можно использовать следующее ниже комплексное соединение (VIII).As a substituent that can be used for the method of the present invention, the following complex compound (VIII) can also be used instead of substituent (I).

где X имеет такое же обозначение, как указано выше. R³-R⁵ представляют электронодонорный заместитель в 4 позиции или 6 позиции пиридинового кольца.where X has the same designation as above. R ³ -R ⁵ represent an electron donating substituent at 4 positions or 6 positions of the pyridine ring.

Заместитель (VIII), используемый в способе по настоящему изобретению, имеет пиридиновый азот в электронно-обогащенном состоянии из-за электронодонорного заместителя, введенного в подходящую позицию замещения, и, следовательно, он имеет выдающееся координационное свойство по отношению к цинку, давая более легкую продуктивность и устойчивость. Данный заместитель можно использовать в качестве соответствующего заместителю (I).The substituent (VIII) used in the method of the present invention has pyridine nitrogen in an electron-enriched state due to an electron-donating substituent introduced in a suitable substitution position, and therefore has an outstanding coordination property with respect to zinc, resulting in lighter productivity and sustainability. This substituent may be used as corresponding to substituent (I).

Хотя настоящее изобретение в дальнейшем будет более детально описано со ссылкой к Примерам получения и Тестовым примерам, объем настоящего изобретения ими не ограничивается.Although the present invention will hereinafter be described in more detail with reference to Production Examples and Test Examples, the scope of the present invention is not limited to them.

ПРИМЕРЫEXAMPLES

Пример получения 1Production Example 1

Получение Phos-tag сенсорного чипа для ППР анализаObtaining a Phos-tag sensor chip for PPR analysis

Сенсорный чип (изготовлен BIOCRE, Sensor Chip CMS), покрытый карбоксиметилдекстраном, устанавливают в приборе для измерения ППР (изготовленном BIOCRE, BIOCORE J).A sensor chip (manufactured by BIOCRE, Sensor Chip CMS) coated with carboxymethyldextran is installed in an SPR meter (manufactured by BIOCRE, BIOCORE J).

В качестве подвижного буфера используют 10 мМ водный раствор HEPES, 2-[4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинил]этансульфоновую кислоту, - гидроксида натрия (рН 7,4), включающий 5х10^-3% (об./об.) Tween 20, 0,20 М нитрата натрия и 10 мкМ нитрата цинка. Температуру сенсорного чипа устанавливают при 25°C и расход подвижного буфера устанавливают при 30 мкл/мин. После проверки стабильного значения поверхностного плазмонного резонанса смесь водных растворов EDC (1-этил-3,4-диметиламинопропилкарбодиимида, 200 мМ) в качестве активатора карбоксильной группы и NHS (N-гидроксисукцинамида, 50 мМ) добавляют в течение 6 минут для активации карбоксильной группы сенсорного чипа.A 10 mM aqueous solution of HEPES, 2- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid, sodium hydroxide (pH 7.4), including 5x10 ^-3 % (v / v), is used as a moving buffer. ) Tween 20, 0.20 M sodium nitrate and 10 μM zinc nitrate. The temperature of the sensor chip is set at 25 ° C and the flow rate of the movable buffer is set at 30 μl / min. After checking the stable surface plasmon resonance, a mixture of aqueous solutions of EDC (1-ethyl-3,4-dimethylaminopropylcarbodiimide, 200 mM) as an activator of the carboxyl group and NHS (N-hydroxysuccinamide, 50 mM) is added over 6 minutes to activate the sensory carboxyl group chip.

Затем, чтобы нанести Phos-tag на сенсорный чип в течение 6 минут добавляют 50% (об./об.) ацетонитрильный раствор (10 мМ) N,N,N'-три(2-пиридилметил)-N'-[5-N″-(2-аминоэтил)карбамоил-2-пиридилметил]-1,3-диаминопропан-2-ола. Затем для блокирования оставшихся активированных карбоксильных групп в течение 6 минут добавляют 1,0 М водный раствор моноэтаноламина.Then, to apply a Phos-tag to the sensor chip, 50% (v / v) acetonitrile solution (10 mM) N, N, N′-tri (2-pyridylmethyl) -N ′ - [5- N ″ - (2-aminoethyl) carbamoyl-2-pyridylmethyl] -1,3-diaminopropan-2-ol. Then, to block the remaining activated carboxyl groups, a 1.0 M aqueous solution of monoethanolamine is added over 6 minutes.

Вышеприведенной операцией получают канал для образца, то есть проточную ячейку A, имеющую сенсорную секцию со связанным с ней Phos-tag.In the above operation, a channel for the sample, i.e., flow cell A, having a sensor section with a associated Phos-tag, is obtained.

Сравнительный пример получения 1Comparative example of obtaining 1

Канал для образца, то есть проточную ячейку B, имеющую эталонную секцию без связанного с ней Phos-tag, изготавливают параллельно проточной ячейке A, используя процедуру, аналогичную процедуре приведенного выше примера получения 1, включая активирование карбоксильной группы и ее блокирование, за исключением того, что Phos-tag не наносят.A channel for the sample, i.e., flow cell B, having a reference section without a Phos-tag connected to it, is made parallel to flow cell A using a procedure similar to that of Production Example 1 above, including activating and blocking the carboxyl group, except that Phos-tag is not applied.

Тестовый пример 1Test case 1

В качестве аналитических образцов используют (i) β-казеин (пентафосфорилированный белок, изготовленный SIGMA), (ii) дефосфорилированный β-казеин и (iii) бычий сывороточный альбумин (BSA, изготовленный New England BioLabs). Дефосфорилированный β-казеин получают, инкубируя смешанный раствор β-казеина 10 мг/мл (50 мкл), кислую фосфотазу из картофеля (SIGMA) и 0,20 М MES-NaOH (рН 6,8, 50 мкл) при 38°C в течение 12 часов. Каждый образец растворяют в подвижном буфере, используемом в примере получения 1, чтобы получить раствор образца с концентрацией образца 1,5 мкМ.As analytical samples, (i) β-casein (pentaphosphorylated protein manufactured by SIGMA), (ii) dephosphorylated β-casein and (iii) bovine serum albumin (BSA manufactured by New England BioLabs) are used. Dephosphorylated β-casein is prepared by incubating a mixed solution of β-casein 10 mg / ml (50 μl), potato acid phosphatase (SIGMA) and 0.20 M MES-NaOH (pH 6.8, 50 μl) at 38 ° C within 12 hours. Each sample was dissolved in a movable buffer used in Production Example 1 to obtain a sample solution with a sample concentration of 1.5 μM.

Измерение ППР осуществляют для раствора образца. Более детально, проточные ячейки A и B, изготовленные в примере получения 1 и сравнительном примере получения 1 соответственно, стабилизируют подвижным буфером. Каждый раствор образца подают в ячейки при температуре 25°C и с расходом 30 мкл/мин и ассоциацию осуществляют в течение 15 минут. Затем подают только подвижный буфер в течение 15 минут для диссоциации. После измерения для каждого раствора образца пропускают водный раствор 25 мМ однозамещенного фосфата калия - 25 мМ двузамещенного фосфата натрия (рН 6,86) в течение 6 минут, 0,20 М водный раствор двузамещенного этилендиаминтетраацетата натрия (рН 7,4) в течение 6 минут и подвижный буфер в течение 5 минут, чтобы реактивировать сенсорный чип, то есть удалить остаточное связанное вещество.The SPR measurement is carried out for the sample solution. In more detail, the flow cells A and B made in Production Example 1 and Production Comparative Example 1, respectively, are stabilized with a movable buffer. Each sample solution is fed into the cells at a temperature of 25 ° C and with a flow rate of 30 μl / min and the association is carried out for 15 minutes. Then only a movable buffer is fed for 15 minutes to dissociate. After measuring, for each sample solution, an aqueous solution of 25 mM potassium phosphate monosubstituted - 25 mM sodium phosphate disubstituted (pH 6.86) for 6 minutes, a 0.20 M sodium disodium ethylenediaminetetraacetate solution (pH 7.4) for 6 minutes are passed through and a movable buffer for 5 minutes to reactivate the sensor chip, that is, remove residual bound material.

Фиг.3-5 показывают каждый из результатов ППР теста соответствующего образца (i)-(iii), и фиг.6 показывает разницу, полученную вычитанием значения RU проточной ячейки B из значения RU проточной ячейки A в результатах теста каждого образца. Согласно результатам фиг.4-6 изменение проточных ячеек A и B является почти одинаковым, показывая, что дефосфорилированный β-казеин и BSA не дают специфического связывания. С другой стороны, результаты фиг.3 и 6 делают понятным, что фосфорилированный β-казеин дает специфическое связывание с сенсорной частью, содержащей связанный с ней Phos-tag (количество максимального связывания = 3150 RU). Следовательно, доказано, что способом по настоящему изобретению можно определить только фосфорилированный пептид.FIGS. 3-5 show each of the results of the SPR test of the corresponding sample (i) to (iii), and FIG. 6 shows the difference obtained by subtracting the RU value of the flow cell B from the RU value of the flow cell A in the test results of each sample. According to the results of FIGS. 4-6, the change in flow cells A and B is almost the same, showing that dephosphorylated β-casein and BSA do not give specific binding. On the other hand, the results of FIGS. 3 and 6 make it clear that phosphorylated β-casein gives specific binding to the sensory portion containing the associated Phos-tag (maximum binding amount = 3150 RU). Therefore, it has been proven that only the phosphorylated peptide can be determined by the method of the present invention.

Тестовый пример 2Test example 2

В качестве аналитического образца используют (iv) фосфорилированный SRC пептид (монофосфорилированный пептид, изготовленный ANA SPEC Inc.) и (v) SRC пептид (нефосфорилированный пептид, изготовленный ANA SPEC Inc.). Каждый образец растворяют в подвижном буфере, используемом в примере получения 1, чтобы получить растворы образца с концентрациями образца от 1 до 15 мкМ.As the analytical sample, (iv) phosphorylated SRC peptide (monophosphorylated peptide manufactured by ANA SPEC Inc.) and (v) SRC peptide (non-phosphorylated peptide manufactured by ANA SPEC Inc.) are used. Each sample was dissolved in a movable buffer used in Production Example 1 to obtain sample solutions with sample concentrations of 1 to 15 μM.

Измерения ППР для растворов образцов осуществляют, используя проточные ячейки A и B, изготовленные в примере получения 1 и сравнительном примере получения 1. Более детально, измерения ППР осуществляют при тех же условиях, как в тестовом примере 1, за исключением того, что ассоциацию и диссоциацию образцов осуществляют в течение 5 минут соответственно, и реактивацию сенсорного чипа (удаление остаточного связанного вещества) осуществляют 0,40 М фосфатным буфером (рН 7,0) в течение 5 минут, 0,20 М водным раствором двузамещенного этилендиаминтетраацетата натрия (рН 7,4) в течение 5 минут и подвижным буфером из примера получения 1 в течение 5 минут в тестовом примере 1. Фиг.7 показывает результаты.SPR measurements for sample solutions are carried out using flow cells A and B made in Production Example 1 and Comparative Production Example 1. In more detail, SPR measurements are carried out under the same conditions as in Test Example 1, except that the association and dissociation samples are carried out for 5 minutes, respectively, and the reactivation of the sensor chip (removal of residual bound substance) is carried out with 0.40 M phosphate buffer (pH 7.0) for 5 minutes, with a 0.20 M aqueous solution of disubstituted ethylenediamine tetraace sodium atm (pH 7.4) for 5 minutes and the movable receiving buffer of Example 1 for 5 minutes in Test Example 1. Figure 7 shows the results.

Результаты показывают, что нефосфорилированный пептид почти не показывает изменение даже при концентрации 15 мкМ. С другой стороны, данные результаты показывают, что фосфорилированный пептид дает возможность четко распознать свое существование не только при концентрации 15 мкМ, но также при концентрациях 1 мкМ и 5 мкМ. Следовательно, четко доказано, что настоящим изобретением можно четко определить существование связывания фосфорной кислоты в пептидах, имеющих идентичную последовательность аминокислот.The results show that the non-phosphorylated peptide shows almost no change even at a concentration of 15 μM. On the other hand, these results show that the phosphorylated peptide makes it possible to clearly recognize its existence not only at a concentration of 15 μM, but also at concentrations of 1 μM and 5 μM. Therefore, it has been clearly proven that the present invention can clearly determine the existence of phosphoric acid binding in peptides having an identical amino acid sequence.

Пример получения 2Production Example 2

Получение сенсорного чипа Phos-tag для ППР анализаObtaining a Phos-tag sensor chip for PPR analysis

Стрептавидинсодержащий сенсорный чип, имеющий связанный на своей поверхности стрептавидин (изготовленный BIOCRE, Sensor Chip SA), устанавливают в прибор для измерения ППР (изготовленный BIOCRE, BIOCORE J).A streptavidin-containing sensor chip having streptavidin bonded on its surface (manufactured by BIOCRE, Sensor Chip SA) is installed in an SPR measurement device (manufactured by BIOCRE, BIOCORE J).

В качестве подвижного буфера используют 10 мМ водный раствор HEPES, 2-[4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинил]этансульфоната, - гидроксида натрия (рН 7,4), включающий 5×10^-3% (об./об.) Tween 20, 0,20 М нитрата натрия и 10 мкМ нитрата цинка. Температуру сенсорного чипа устанавливают при 25°C и подвижный буфер пропускают с расходом 30 мкл/мин, пока значение поверхностного плазмонного резонанса не покажет стабильное состояние.A 10 mM aqueous solution of HEPES, 2- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonate, sodium hydroxide (pH 7.4), including 5 × 10 ^-3 % (v / v), is used as a moving buffer .) Tween 20, 0.20 M sodium nitrate and 10 μM zinc nitrate. The temperature of the sensor chip is set at 25 ° C and the movable buffer is passed at a flow rate of 30 μl / min until the surface plasmon resonance value shows a stable state.

Затем, чтобы заставить Phos-tag закрепиться к сенсорному чипу, пропускают раствор подвижного буфера, содержащий 1,0 мМ N,N,N'-три(2-пиридилметил)-N'-[5-N″-2-(6-D-биотинамидогексакарбоксиамидэтил)карбамоил-2-пиридилметил]-1,3-диаминопропан-2-ола, имеющего структуру биотина на своем конце, причем соединение имеет следующую ниже структуру. Используемые условия представляют собой: температура 25°C, расход 30 мкл/мин и период времени для ассоциации 6 минут.Then, to force the Phos-tag to attach to the sensor chip, a rolling buffer solution containing 1.0 mM N, N, N′-tri (2-pyridylmethyl) -N ′ - [5-N ″ -2- (6- D-biotinamidohexacarboxyamideethyl) carbamoyl-2-pyridylmethyl] -1,3-diaminopropan-2-ol having a biotin structure at its end, the compound having the following structure. The conditions used are: temperature 25 ° C, flow rate 30 μl / min and association time period of 6 minutes.

Поскольку вышеуказанное соединение координируется с ионом цинка в подвижном буфере с образованием Phos-tag, и биотин на конце показывает чрезвычайно высокое сродство к стрептавидину, Phos-tag будет нанесен на сенсорный чип.Since the above compound coordinates with the zinc ion in a movable buffer to form a Phos-tag, and the biotin at the end shows an extremely high affinity for streptavidin, the Phos-tag will be applied to the sensor chip.

Сравнительный пример получения 2Comparative example of obtaining 2

Сенсорный чип, не содержащий связанный с ним Phos-tag, получают, используя такую же процедуру, как в примере получения 2, за исключением того, что Phos-tag не наносят.A sensor chip not containing an associated Phos-tag is obtained using the same procedure as in Production Example 2, except that the Phos-tag is not applied.

Тестовый пример 3Test case 3

В качестве аналитического образца используют β-казеин (пентафосфорилированный белок, SIGMA), растворенный в подвижном буфере, представляющем собой 10 мМ водный раствор HEPES - гидроксид натрия (рН 7,4), включающий 5×10^-3% (об./об.) Tween 20, 0,20 М нитрата натрия и 10 мкМ нитрата цинка. Концентрацию образца устанавливают равной 1,5 мкМ.As an analytical sample, β-casein (pentaphosphorylated protein, SIGMA) is used, dissolved in a movable buffer, which is a 10 mM aqueous solution of HEPES - sodium hydroxide (pH 7.4), including 5 × 10 ^-3 % (vol./vol. ) Tween 20, 0.20 M sodium nitrate and 10 μM zinc nitrate. The concentration of the sample is set equal to 1.5 μm.

ППР измерения для анализа образца осуществляют при следующих условиях: температура 25°C, расход 30 мкл/мин, период времени для ассоциации 15 минут и период для диссоциации 10 минут. После измерения пропускают 0,40 М водный раствор фосфората в течение 6 минут, 0,20 М раствор двузамещенного этилендиаминтетраацетата натрия (рН 8,0) в течение 6 минут и подвижный буфер в течение 5 минут для реактивации сенсорного чипа, то есть удаления остаточного связанного вещества.PPR measurements for analysis of the sample are carried out under the following conditions: temperature 25 ° C, flow rate 30 μl / min, a period of time for association 15 minutes and a period for dissociation 10 minutes. After the measurement, a 0.40 M aqueous solution of phosphate is passed for 6 minutes, a 0.20 M solution of disubstituted sodium ethylene diamine tetraacetate (pH 8.0) for 6 minutes and a movable buffer for 5 minutes to reactivate the sensor chip, i.e. to remove residual bound substances.

Фиг.8 показывает результаты теста. Данные результаты показывают, что значение RU увеличивается на 2056 благодаря потоку анализируемого образца, давая возможность идентификации связывания фосфорилированного белка к пленке благородного металла по настоящему изобретению, то есть сенсорному чипу на основе благородного металла, содержащего связанный с ним Phos-tag. Кроме того, эксперимент, проводимый при идентичных условиях, как описано выше, с использованием бычьего сывороточного альбумина вместо фосфорилированного белка, потерпел неудачу, не давая изменение значения RU. Следовательно, четко показано, что пленка благородного металла по настоящему изобретению дает возможность определить только белок, содержащий связанную с ним фосфорную кислоту.Fig. 8 shows the test results. These results show that the RU value increases by 2056 due to the flow of the analyzed sample, making it possible to identify the binding of the phosphorylated protein to the noble metal film of the present invention, i.e., a noble metal sensor chip containing a associated Phos-tag. In addition, an experiment conducted under identical conditions, as described above, using bovine serum albumin instead of phosphorylated protein, failed to produce a change in the RU value. Therefore, it is clearly shown that the noble metal film of the present invention makes it possible to determine only a protein containing phosphoric acid bound thereto.

Кроме того, эксперимент, осуществленный при идентичных условиях с использованием сенсорного чипа, изготовленного сравнительным примером получения 2, не дает никакого изменения значения RU.In addition, an experiment carried out under identical conditions using a sensor chip manufactured by comparative example of obtaining 2, does not give any change in the value of RU.

ПРИМЕНИМОСТЬ В ПРОМЫШЛЕННОСТИAPPLICABILITY IN INDUSTRY

Способ измерения поверхностного плазмонного резонанса (ППР) по настоящему изобретению позволяет определить существование фосфорилированного пептида (белка) даже в исследуемом образце, таком как биологические материалы, включающем разнообразные соединения. Кроме того, способ также будет определять количество и концентрацию фосфорилированного пептида. Более того, способ также может определить, является ли пептид фосфорилированным или нет. Поэтому использование способа по настоящему изобретению для биологических материалов или аналогичного является очень полезным с точки зрения возможности применения для диагностирования заболеваний.The method for measuring surface plasmon resonance (SPR) of the present invention allows to determine the existence of a phosphorylated peptide (protein) even in a test sample, such as biological materials, including a variety of compounds. In addition, the method will also determine the amount and concentration of the phosphorylated peptide. Moreover, the method can also determine whether the peptide is phosphorylated or not. Therefore, the use of the method of the present invention for biological materials or the like is very useful from the point of view of its applicability for diagnosing diseases.

Более того, поскольку соединение благородного металла по настоящему изобретению показывает превосходные координационные связывающие свойства по отношению к фосфорилированным пептидам по сравнению с обычными благородными металлами, соединение благородного металла применимо в качестве вещества, используемого в вышеописанных способах. Применимым также является промежуточное соединение.Moreover, since the noble metal compound of the present invention exhibits excellent coordination binding properties with respect to phosphorylated peptides compared to conventional noble metals, the noble metal compound is useful as a substance used in the above methods. An intermediate is also applicable.

Claims

1. The method of measuring surface plasmon resonance, including
placing the noble metal compound on the lower face of the prism, irradiating the prism with light to detect reflected light, where the noble metal compound contains substituents of the following formula (I) on the side opposite the side in contact with the prism, the test sample is added to the side having substituents (I) in the combination of noble metal

where X represents a linking group, and
measuring the intensity of reflected light with the ability to determine phosphorylated peptide.

2. A method for measuring surface plasmon resonance, comprising
adding a noble metal compound containing substituents of formula (I) on its surface to the test sample,

where X represents a linking group,
the use of Raman spectroscopy and
measuring the peak intensity of a phosphorylated peptide with the possibility of evaluating whether the peptide is phosphorylated or not.

3. A noble metal compound containing substituents of the following formula (I) on its surface

where X represents a linking group that provides the connection of the substituents with the surface of the noble metal.

4. The noble metal compound of claim 3, wherein the noble metal compound is in the form of a film.

5. The noble metal compound of claim 3, wherein the noble metal compound is in the form of particles.

6. An intermediate to obtain a compound of formula (I) according to claim 3, containing substituents of the following formula (VII) on the surface of a noble metal

7. The intermediate compound of claim 6, wherein the noble metal compound is in the form of a film.

8. The intermediate compound of claim 6, wherein the noble metal compound is in the form of particles.