RU2346279C2 - METHOD OF CATALYTIC TELOMERASE SUBUNIT (hTERT) ANALYSIS FOR mRNA LEVEL - Google Patents
METHOD OF CATALYTIC TELOMERASE SUBUNIT (hTERT) ANALYSIS FOR mRNA LEVEL Download PDFInfo
- Publication number
- RU2346279C2 RU2346279C2 RU2007114223/15A RU2007114223A RU2346279C2 RU 2346279 C2 RU2346279 C2 RU 2346279C2 RU 2007114223/15 A RU2007114223/15 A RU 2007114223/15A RU 2007114223 A RU2007114223 A RU 2007114223A RU 2346279 C2 RU2346279 C2 RU 2346279C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- htert
- mrna
- cells
- level
- telomerase
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к исследованиям биологического материала, в частности к определению относительного уровня мРНК hTERT - субъединицы теломеразы.The invention relates to studies of biological material, in particular to determining the relative level of hTERT mRNA, a telomerase subunit.
Теломераза - это фермент, который осуществляет наращивание теломерных районов хромосомной ДНК и является РНК-зависимой ДНК полимеразой [2]. Этот фермент активен в большинстве стволовых, раковых и половых клеток, чем предоставляет им возможность неограниченного деления. Активность теломеразы в совокупности с длиной теломер, таким образом, отражают пролиферативный потенциал клетки. Ранее считалось, что во всех дифференцированных соматических клетках теломераза не работает, но в последнее время показана ее активность в лейкоцитах периферической крови [10] и в активированных лимфоцитах [9], а также в слизистых клетках кишечника [3]. Основными субъединицами человеческой теломеразы являются: hTR (теломеразная РНК, фрагмент которой служит матрицей при синтезе теломерных повторов); hTERT (human telomerase reverse transcriptase) - каталитическая субъединица фермента теломеразы; а также еще ряд ассоциированных с теломеразой белков, которые обуславливают или регулируют деятельность фермента. Показано, что наличие именно hTERT является лимитирующим фактором в проявлении активности теломеразы [2].Telomerase is an enzyme that builds up telomere regions of chromosomal DNA and is an RNA-dependent DNA polymerase [2]. This enzyme is active in most stem, cancer and germ cells, which provides them with the possibility of unlimited division. Telomerase activity in combination with telomere length, thus reflect the proliferative potential of the cell. Previously, it was believed that telomerase did not work in all differentiated somatic cells, but its activity has recently been shown in peripheral blood leukocytes [10] and in activated lymphocytes [9], as well as in intestinal mucosa [3]. The main subunits of human telomerase are: hTR (telomerase RNA, a fragment of which serves as a matrix in the synthesis of telomeric repeats); hTERT (human telomerase reverse transcriptase) is a catalytic subunit of the telomerase enzyme; and also a number of proteins associated with telomerase, which determine or regulate the activity of the enzyme. It was shown that the presence of hTERT is the limiting factor in the manifestation of telomerase activity [2].
С использованием определения уровня мРНК hTERT теломеразы в настоящее время решается ряд исследовательских задач, направленных, в основном, на разработку новых методов диагностики, прогноза и оценки эффективности терапии онкологических заболеваний [1, 7]. Также существующие методы определения уровня мРНК hTERT теломеразы активно используются как в фундаментальных исследованиях, посвященных изучению периферического гомеостаза Т- и В-лимфоцитов, так и при исследованиях патогенеза ряда заболеваний, ассоциированных с нарушением Т-клеточного гомеостаза, таких как ревматоидный артрит, системная красная волчанка [5], рассеянный склероз и атонический дерматит [10], в связи с чем способы определения уровня мРНК hTERT теломеразы не теряют своей актуальности. Исходя из этого, определение статуса теломеразы в клетках оказывается значимым не только для диагностики злокачественного заболевания, но и во множестве других исследовательских задачах. К настоящему времени разработан целый ряд методов специфического определения нуклеиновых кислот. Уровень экспрессии мРНК hTERT теломеразы может быть определен при помощи нескольких способов.Using the determination of the level of hTERT telomerase mRNA, a number of research problems are currently being solved, aimed mainly at developing new methods for diagnosing, predicting, and evaluating the effectiveness of cancer therapy [1, 7]. Also, existing methods for determining the level of hTERT telomerase mRNA are actively used both in basic research on the peripheral homeostasis of T and B lymphocytes, and in studies of the pathogenesis of a number of diseases associated with impaired T-cell homeostasis, such as rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus [5], multiple sclerosis and atonic dermatitis [10], and therefore methods for determining the level of hTERT telomerase mRNA do not lose their relevance. Based on this, determining the status of telomerase in cells is significant not only for the diagnosis of malignant disease, but also in many other research tasks. To date, a number of methods for the specific determination of nucleic acids have been developed. The expression level of hTERT telomerase mRNA can be determined using several methods.
Наиболее часто мРНК hTERT теломеразы оценивают с использованием метода Real-time RT-PCR (обратного ПЦР в реальном времени), позволяющего, в отличие от обычной обратной полимеразной цепной реакции, количественно оценить содержание исследуемой РНК в образце. Real-time RT-PCR позволяет отслеживать ход реакции, что достигается путем определения выхода продукта после каждого цикла амплификации (для детекции PCR-продукта используются флуоресцентные красители, обеспечивающие флуоресценцию, прямо пропорциональную количеству продукта). Относительная концентрация субстрата определяется на основании кинетической кривой [11]. С помощью метода real-time RT-PCR возможно выявление даже транскрипта, представленного всего одной копией, соответственно этот метод требует меньшие количества материала, чем другие методы и, кроме того, не требует никаких манипуляций после амплификации.Most often, hTERT telomerase mRNAs are evaluated using the Real-time RT-PCR method (real-time reverse PCR), which allows, unlike the usual reverse polymerase chain reaction, to quantify the content of the studied RNA in the sample. Real-time RT-PCR allows you to track the progress of the reaction, which is achieved by determining the yield of the product after each amplification cycle (fluorescent dyes that provide fluorescence directly proportional to the amount of product are used to detect the PCR product). The relative concentration of the substrate is determined based on the kinetic curve [11]. Using the real-time RT-PCR method, it is possible to detect even a transcript represented by just one copy, respectively, this method requires less material than other methods and, in addition, does not require any manipulation after amplification.
Также для количественной оценки мРНК hTERT теломеразы часто используют Northern Blotting, когда выявление интересуемой мРНК достигается за счет ее гибридизации со специфичным олигонуклеотидным зондом, меченным радиоизотопом, либо с антителами к мРНК. После визуализации полученная картина отражает экспрессию РНК или белка в образце [8]. Этот метод позволяет определить внутриклеточную локализацию фермента путем разделения ядерной и цитоплазматической фракций.Northern Blotting is also often used to quantify hTERT telomerase mRNA, when the mRNA of interest is detected by hybridization with a specific oligonucleotide probe labeled with a radioisotope or with antibodies to mRNA. After visualization, the resulting picture reflects the expression of RNA or protein in the sample [8]. This method allows you to determine the intracellular localization of the enzyme by separating the nuclear and cytoplasmic fractions.
К недостаткам обоих этих методов можно отнести их ограниченную информативность, поскольку технологическая необходимость разрушения клеток для выделения мРНК не позволяет одновременно охарактеризовать исследуемый материал по другим параметрам (к примеру, таким, как субпопуляционная принадлежность или экспрессия интересуемых протеинов) без дополнительного использования методов их сепарации.The disadvantages of both of these methods include their limited information content, since the technological need for cell destruction to isolate mRNA does not allow us to simultaneously characterize the studied material by other parameters (for example, such as subpopulation affinity or expression of proteins of interest) without additional use of separation methods.
Этот недостаток отсутствует в методе гибридизации in situ (FISH - Fluorescein In Situ Hybridization), который взят в качестве прототипа. Данный метод позволяет обнаруживать содержание мРНК в отдельных клетках и даже выявлять ее внутриклеточную локализацию. Визуализация интересуемой РНК достигается за счет внутриклеточной гибридизации олигонуклеотидного зонда, меченного флуорохромом [4]. Процедуру проводят на тканевых срезах или мазках крови, а анализ проводится либо визуально, либо с использованием цифровой флуоресцентной микроскопии. К преимуществу данного метода можно отнести возможность оценки экспрессии исследуемой РНК на уровне единичной клетки, а к недостаткам - потребность в дорогостоящем оборудовании и низкую производительность метода.This disadvantage is absent in the in situ hybridization method (FISH - Fluorescein In Situ Hybridization), which is taken as a prototype. This method allows you to detect the content of mRNA in individual cells and even detect its intracellular localization. Visualization of the RNA of interest is achieved through intracellular hybridization of the oligonucleotide probe labeled with fluorochrome [4]. The procedure is performed on tissue sections or blood smears, and the analysis is carried out either visually or using digital fluorescence microscopy. The advantages of this method include the ability to evaluate the expression of the studied RNA at the level of a single cell, and the disadvantages are the need for expensive equipment and low productivity of the method.
Целью изобретения является создание способа определения уровня мРНК каталитической субъединицы теломеразы (hTERT), обладающего высокой производительностью.The aim of the invention is to provide a method for determining the level of mRNA of the catalytic subunit of telomerase (hTERT) with high performance.
Способ позволяет выявлять мРНК hTERT на уровне единичной клетки с помощью гибридизации in situ, с последующим анализом на проточном цитофлуориметре (FlowFISH). По уровню флуоресценции клеток, прошедших гибридизацию с флуоресцентным зондом, комплементарным мРНК hTERT, определяют относительное количество искомой мРНК в каждой клетке, причем уровень мРНК hTERT в клетках определяют как средний уровень их флуоресценции после гибридизации за вычетом аутофлуоресценции клеток, прошедших те же условия в отсутствии зонда. В качестве стандарта гибридизации параллельно определяют относительное количество мРНК hTERT в клетках человеческой опухолевой линии, в которой этот фермент постоянно активен, и мРНК hTERT стабильно присутствует в определенном количестве. Отношение этого показателя к показателю относительного количества мРНК hTERT в клетках исследуемого материала наглядно отражает количественный уровень мРНК каталитической субъединицы теломеразы в исследуемом материале, по которому можно судить об активности этого фермента в клетках.The method allows to detect hTERT mRNA at the level of a single cell using in situ hybridization, followed by analysis on a flow cytometer (FlowFISH). Using the fluorescence level of cells hybridized with a fluorescent probe complementary to hTERT mRNA, the relative amount of desired mRNA in each cell is determined, and the level of hTERT mRNA in cells is determined as the average level of their fluorescence after hybridization minus autofluorescence of cells in the absence of the same conditions . As a hybridization standard, the relative amount of hTERT mRNA is determined in parallel in cells of the human tumor line in which this enzyme is constantly active, and hTERT mRNA is stably present in a certain amount. The ratio of this indicator to the indicator of the relative amount of hTERT mRNA in the cells of the studied material clearly reflects the quantitative level of the mRNA of the telomerase catalytic subunit in the studied material, which can be used to judge the activity of this enzyme in cells.
Способ позволяет исследовать большее количество образцов с меньшими временными и финансовыми затратами.The method allows you to explore a larger number of samples with less time and financial costs.
Описание способа с примерами конкретной реализации.Description of the method with examples of specific implementation.
5 мл периферической крови, стабилизированной с гепарином, центрифугируют в градиенте фиколл-верографин в течение 20 минут при 2,7 тыс. об/мин в медицинской лабораторной центрифуге, после чего кольцо мононуклеарных клеток собирают и отмывают дважды с 5 мл забуференного физиологического раствора с ЭДТА и азидом Na (ЗФР-ЭА) по 5 минут при 1 тыс. об/мин. Осадок ресуспендируют в 1 мл ЗФР-ЭА и подсчитывают количество клеток в камере Горяева.5 ml of peripheral blood stabilized with heparin is centrifuged in a ficoll-verographin gradient for 20 minutes at 2.7 thousand rpm in a medical laboratory centrifuge, after which the ring of mononuclear cells is collected and washed twice with 5 ml of buffered saline with EDTA and Na azide (PBS-EA) for 5 minutes at 1 thousand rpm. The pellet was resuspended in 1 ml PBS-EA and the number of cells in the Goryaev chamber was counted.
Для гибридизации используют 106 клеток на одну пробу. Исходя из этого, необходимое количество клеток снова осаждают центрифугированием и ресуспендируют осадок в гибридизационном растворе, содержащем 50% формамид, 20 мМ Tris и 1% BSA, и доведенный до конечного объема ЗФР-ЭА. Гибридизацию каждой пробы проводят в объеме 300 мкл. Контрольная проба содержит только клетки, ресуспендированные в гибридизационном растворе. К опытной пробе добавляют пептидонуклеиновый (PNA) зонд, меченный флуорохромом FITC (Bio-Synthesis), комплементарный участку мРНК hTERT, в конечной концентрации 0,9 мкг/мл. Все пробы денатурируют в течение 10 минут при 80°С, периодически перемешивая. Гибридизация проводится в темноте при комнатной температуре в течение 2-х часов при постоянном перемешивании.For hybridization use 10 6 cells per sample. Based on this, the required number of cells is again pelleted by centrifugation and the pellet is resuspended in a hybridization solution containing 50% formamide, 20 mM Tris and 1% BSA, and brought to the final volume of PBS-EA. Hybridization of each sample is carried out in a volume of 300 μl. The control sample contains only cells resuspended in the hybridization solution. A peptidonucleic (PNA) probe labeled with FITC fluorochrome (Bio-Synthesis), complementary to the hTERT mRNA site, was added to the test sample at a final concentration of 0.9 μg / ml. All samples were denatured for 10 minutes at 80 ° C, stirring occasionally. Hybridization is carried out in the dark at room temperature for 2 hours with constant stirring.
После этого клетки переносят в цитометрические пробирки (Falcon 2058) с 3 мл ЗФР-ЭА и осаждают в медицинской центрифуге в течение 5 минут при 1500 об/мин. Осадок ресуспендируют в 3 мл ЗФР-ЭА, инкубируют 30 минут в термостате при 37°С и снова осаждают аналогичным образом. К осадку добавляют 500 мкл ЗФР-ЭА.After that, the cells are transferred into cytometric tubes (Falcon 2058) with 3 ml of PBS-EA and precipitated in a medical centrifuge for 5 minutes at 1500 rpm. The precipitate was resuspended in 3 ml PBS-EA, incubated for 30 minutes in an incubator at 37 ° C and again precipitated in a similar manner. 500 μl of PBS-EA was added to the pellet.
Опухолевые клетки, используемые в качестве стандарта гибридизации, хранятся при -80°С в FCS с 10% DMSO. Для гибридизации 2х106 клеток размораживают и осаждают в течение 5 минут при 1000 об/мин с 5 мл ЗФР-ЭДТА. Далее гибридизацию и анализ данных проводят параллельно с исследуемыми мононуклеарными клетками.Tumor cells used as a hybridization standard are stored at -80 ° C in FCS with 10% DMSO. For hybridization, 2x10 6 cells are thawed and pelleted for 5 minutes at 1000 rpm with 5 ml PBS-EDTA. Further, hybridization and data analysis are carried out in parallel with the mononuclear cells under study.
Анализ проб проводят на проточном цитофлуориметре FACS Calibur (Becton Dickinson, США) с помощью программного обеспечения Cell QuestPRO (Becton Dickinson, США). По параметрам прямого и бокового светорассеяния выделяют регион, в котором затем определяют сигнал флуорохрома FITC с использованием канала FL1. Наличие мРНК hTERT в клетках определяют как средний уровень их флуоресценции (mean fluorescence intensity, MFI) по каналу FL1 после гибридизации в присутствии PNA зонда (фиг.2) за вычетом фоновой (аутофлуоресценции) клеток, прошедших те же условия в отсутствии PNA зонда (фиг.1). Отношение полученного показателя в клетках опухолевой линии к аналогичному показателю в исследуемых клетках соответствует степени активности в них фермента теломеразы.Samples were analyzed using a FACS Calibur flow cytometer (Becton Dickinson, USA) using Cell Quest PRO software (Becton Dickinson, USA). The region is distinguished by the parameters of direct and lateral light scattering, in which the FITC fluorochrome signal is then determined using the FL1 channel. The presence of hTERT mRNA in cells is determined as the average level of their fluorescence (mean fluorescence intensity, MFI) via the FL1 channel after hybridization in the presence of a PNA probe (Fig. 2) minus the background (autofluorescence) of cells that underwent the same conditions in the absence of a PNA probe (Fig. .one). The ratio of the obtained indicator in the cells of the tumor line to a similar indicator in the studied cells corresponds to the degree of activity of the telomerase enzyme in them.
Ниже приведены результаты, поясняющие данный способ определения уровня мРНК hTERT как показателя уровня активности фермента.Below are the results that explain this method for determining the level of hTERT mRNA as an indicator of the level of enzyme activity.
Пример 1. Определение продукции мРНК hTERT теломеразы в лимфоцитах периферической крови донора по сравнению с таковой в опухолевой линии МТ4, Было установлено содержание мРНК hTERT в лимфоцитах и опухолевых клетках путем определения уровня флуоресценции по первому каналу в регионах лимфоцитарного облака и опухолевых клеток соответственно (фиг.3). Средняя интенсивность флюоресценции (СИФ) исследуемых клеток определялась как СИФ с PNA минус СИФ без PNA и аналогично для клеток МТ4. Принимая за единицу количество мРНК hTERT клеток опухолевой линии, установлено, что относительное количество мРНК hTERT в лимфоцитах составляет 0,27 от заданного стандарта экспрессии мРНК каталитической субъединицы теломеразы.Example 1. Determination of the production of hTERT telomerase mRNA in peripheral blood lymphocytes of a donor compared to that in the MT4 tumor line. The content of hTERT mRNA in lymphocytes and tumor cells was established by determining the fluorescence level of the first channel in the regions of the lymphocyte cloud and tumor cells, respectively (Fig. 3). The mean fluorescence intensity (CIF) of the studied cells was determined as CIF with PNA minus CIF without PNA and similarly for MT4 cells. Taking the amount of tumor cell line hTERT mRNA as a unit, it was found that the relative amount of hTERT mRNA in lymphocytes is 0.27 of a given standard for mRNA expression of the telomerase catalytic subunit.
Пример 2. Определено повышение уровня мРНК hTERT теломеразы лимфоцитов в ответ на активацию анти-CD3 моноклональными антителами в культуре. Стабилизированную гепарином периферическую кровь двух доноров центрифугировали в градиенте фиколл-верографин 20 минут при 2,7 тыс. об/мин, после чего кольцо мононуклеарных клеток собрали и отмыли дважды с 5 мл ЗФР с ЭДТА по 5 минут при 1 тыс. об/мин. После подсчета количества клеток в камере Горяева часть клеток заморозили в FCS с 10% DMSO, а часть посадили в лунки 24-луночного планшета в концентрации 2 млн на 1 мл питательной среды RPMI 1640 с 10% FCS и с IL2 в количестве 100 ед./мл. В половину лунок были добавлены также анти-CD3 антитела. В течение семи суток с начала культивирования каждые 24 часа часть клеток замораживали в FCS с 10% DMSO. Затем был определен уровень мРНК hTERT как в активированных, так и в исходных клетках, а также в клетках опухолевой линии МТ4 с помощью вышеописанного метода. Из фиг.4 видно, что в МНК, культивированных только с IL2, количество мРНК hTERT не меняется значительно по сравнению с исходным и с количеством мРНК в опухолевой линии, в то время как МНК, активированные дополнительно анти-CD3 антителами, с первых же суток экспрессируют мРНК hTERT в количествах, в несколько раз превышающих исходный уровень. При этом пик экспрессии приходится на третьи сутки, после чего количество мРНК hTERT начинает снижаться. Полученные данные свидетельствуют об адекватном ответе клеток на стимуляцию анти-CD3 антителами, который заключается в повышении продукции мРНК hTERT с пиком на 3 сутки культивирования.Example 2. An increase in the level of hTERT mRNA of telomerase of lymphocytes in response to activation of anti-CD3 monoclonal antibodies in culture was determined. The heparin-stabilized peripheral blood of two donors was centrifuged in a ficoll-verographin gradient for 20 minutes at 2.7 thousand rpm, after which the ring of mononuclear cells was collected and washed twice with 5 ml of PBS with EDTA for 5 minutes at 1 thousand rpm. After counting the number of cells in the Goryaev’s chamber, some of the cells were frozen in FCS with 10% DMSO, and some were put into the wells of a 24-well plate at a concentration of 2 million per 1 ml of RPMI 1640 medium with 10% FCS and with IL2 in the amount of 100 units / ml Anti-CD3 antibodies were also added to half of the wells. Within seven days from the start of cultivation, every 24 hours, part of the cells were frozen in FCS with 10% DMSO. Then, the level of hTERT mRNA was determined both in activated and in the original cells, as well as in cells of the MT4 tumor line using the method described above. Figure 4 shows that in MNCs cultured only with IL2, the amount of hTERT mRNA does not change significantly compared to the original and the amount of mRNA in the tumor line, while MNCs additionally activated with anti-CD3 antibodies from the very first day Express hTERT mRNA in amounts several times higher than the initial level. In this case, the expression peak occurs on the third day, after which the amount of hTERT mRNA begins to decrease. The data obtained indicate an adequate response of cells to stimulation with anti-CD3 antibodies, which consists in increasing the production of hTERT mRNA with a peak on the 3rd day of cultivation.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о возможности применения метода для количественной оценки уровня мРНК теломеразы в различных клетках относительно стандарта - количества мРНК hTERT в клетках опухолевой линии. Значительным преимуществом этого метода по сравнению с другими является возможность исследовать большее количество образцов с меньшими временными затратами.Thus, the obtained results indicate the possibility of using the method for the quantitative assessment of the telomerase mRNA level in various cells relative to the standard - the amount of hTERT mRNA in tumor cell lines. A significant advantage of this method compared to others is the ability to study a larger number of samples with less time.
Источники информацииInformation sources
1. Amioka Т., Kitadai Y., Hiyama T. et al. Expression of human telomerase reverse transcriptase mRNA in esophageal cancers and precancerous lesions // Oncology Reports. - 2004. - Vol.11. - P.51-55.1. Amioka T., Kitadai Y., Hiyama T. et al. Expression of human telomerase reverse transcriptase mRNA in esophageal cancers and precancerous lesions // Oncology Reports. - 2004 .-- Vol.11. - P.51-55.
2. Cong Y., Wright W.E., Shay J.W. Human telomerase and its regulation // Microbiology and molecular biology reviews. - 2002. - Vol.66, №3. - Р.407-425.2. Cong Y., Wright W.E., Shay J.W. Human telomerase and its regulation // Microbiology and molecular biology reviews. - 2002. - Vol.66, No. 3. - P.407-425.
3. Eiso H., Keiko H., Naokuni T. et al. Telomerase activity in human intestine // International Journal of Oncology. - 1996. - Vol.9, №3. - Р.453-458.3. Eiso H., Keiko H., Naokuni T. et al. Telomerase activity in human intestine // International Journal of Oncology. - 1996. - Vol. 9, No. 3. - R. 453-458.
4. Kammori M., Kanauchi H., Nakamura K. et al. Demonstration of human telomerase reverse transcriptase in human colorectal carcinomas by in situ hybridization // International Journal of Oncology. - 2002. - Vol.20. - P.15-21.4. Kammori M., Kanauchi H., Nakamura K. et al. Demonstration of human telomerase reverse transcriptase in human colorectal carcinomas by in situ hybridization // International Journal of Oncology. - 2002 .-- Vol.20. - P.15-21.
5. Klapper W., Moosig F., Sotnikova A. et al. Telomerase activity in В and Т lymphocytes of patients with systemic lupus erythematosus // Ann. Rheum. Dis. - 2004. - Vol.63. - 1681-1683.5. Klapper W., Moosig F., Sotnikova A. et al. Telomerase activity in B and T lymphocytes of patients with systemic lupus erythematosus // Ann. Rheum. Dis. - 2004 .-- Vol.63. - 1681-1683.
6. Ray A., Norden B. Peptide nucleic acid (PNA): its medical and biotechnical applications and promise for the future // FASEB J. - 2000. - Vol.l4. - 1041-1060.6. Ray A., Norden B. Peptide nucleic acid (PNA): its medical and biotechnical applications and promise for the future // FASEB J. - 2000. - Vol.l4. - 1041-1060.
7. Terasaki Т., Kyo S., Takakura M. et al. Analysis of telomerase activity and telomere length in bone and soft tissue tumors // Oncology Reports. - 2004. - Vol.11. - P.1307-1311.7. Terasaki T., Kyo S., Takakura M. et al. Analysis of telomerase activity and telomere length in bone and soft tissue tumors // Oncology Reports. - 2004 .-- Vol.11. - P.1307-1311.
8. Tesmer V.M., Ford L.P., Holt S.E. et al. Two Inactive Fragments of the Integral RNA Cooperate To Assemble Active Telomerase with the Human Protein Catalytic Subunit (hTERT) In Vitro // Molecular and Cellular Biology. - 1999. - Vol.l9, №9. - P.6207-6216.8. Tesmer V.M., Ford L.P., Holt S.E. et al. Two Inactive Fragments of the Integral RNA Cooperate To Assemble Active Telomerase with the Human Protein Catalytic Subunit (hTERT) In Vitro // Molecular and Cellular Biology. - 1999. - Vol.l9, No. 9. - P.6207-6216.
9. Weng N.P., Levine B.L., June C.H., Hodes R.J. Regulated expression of telomerase activity in human Т lymphocyte development and activation // The Journal of Experimental Medicine. - 1996. - Vol.183. - P.2471-2479.9. Weng N.P., Levine B.L., June C.H., Hodes R.J. Regulated expression of telomerase activity in human T lymphocyte development and activation // The Journal of Experimental Medicine. - 1996. - Vol. 183. - P.2471-2479.
10. Wu К., Higashi N., Hansen E.R. et al. Telomerase activity is increased and telomere length shortened in Т cells from blood of patients with atopic dermatitis and psoriasis // The Journal of Immunology. - 2000. - Vol.165. - P.4742-4747.10. Wu K., Higashi N., Hansen E.R. et al. Telomerase activity is increased and telomere length shortened in T cells from blood of patients with atopic dermatitis and psoriasis // The Journal of Immunology. - 2000 .-- Vol. 165. - P. 4742-4747.
11. Yajima Т., Yagihashi A., Kameshima H. et al. Quantitative reverse transcription-PCR assay of RNA components of human telomerase using the TaqMan fluoogenic detection system // Clinical Chemistry. - 1998. - Vol.44, №12. - Р.2441-2445.11. Yajima T., Yagihashi A., Kameshima H. et al. Quantitative reverse transcription-PCR assay of RNA components of human telomerase using the TaqMan fluoogenic detection system // Clinical Chemistry. - 1998. - Vol. 44, No. 12. - R.2441-2445.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2007114223/15A RU2346279C2 (en) | 2007-04-16 | 2007-04-16 | METHOD OF CATALYTIC TELOMERASE SUBUNIT (hTERT) ANALYSIS FOR mRNA LEVEL |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2007114223/15A RU2346279C2 (en) | 2007-04-16 | 2007-04-16 | METHOD OF CATALYTIC TELOMERASE SUBUNIT (hTERT) ANALYSIS FOR mRNA LEVEL |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2007114223A RU2007114223A (en) | 2008-10-27 |
| RU2346279C2 true RU2346279C2 (en) | 2009-02-10 |
Family
ID=40546939
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2007114223/15A RU2346279C2 (en) | 2007-04-16 | 2007-04-16 | METHOD OF CATALYTIC TELOMERASE SUBUNIT (hTERT) ANALYSIS FOR mRNA LEVEL |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2346279C2 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2490635C1 (en) * | 2012-04-12 | 2013-08-20 | Федеральное государственное учреждение "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства" | Improved method for producing dead cell preparations for fluorescent in situ hybridisation |
| EP4116434A1 (en) * | 2021-07-07 | 2023-01-11 | Universidad Autónoma de Madrid | In vitro method for quantifying the cellular content of specific rnas |
-
2007
- 2007-04-16 RU RU2007114223/15A patent/RU2346279C2/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| . KAMMORI M. et al. Demonstration of human telomerase reverse transcriptase in human colorectal carcinomas by in situ hybridization. International Journal of Oncology. 2002 Jan; 20 (1): 15-21. PMID: 11743637. Lu Gan et al. Inhibitory effects of thioredoxin reductase antisense RNA on the growth of human hepatocellular carcinoma cells. Journal of biochemistry. 96: 653-664 (2005). Amioka Т. et al. Expression of human telomerase reverse transcriptase mRNA in esophageal cancers and precancerous lesions. Oncol. Rep. 2004 Jan; 11 (1): 51-5, PMID: 14654902. Ali A.S. et al. Detection of hTERT protein by flow cytometry. Leukemia. 2000 Dec; 14 (12): 2176-81. PMID: 11187908. Gu X. et al. Effect of RNA interference on CD80 and CD86 expression in bone marrow-delived murine dendritic cells. Scand. J. Immunol. 2006 Dec; 64 (6): 588-94, PMID: 17083614. Tominaga T. et al. Telomerase activity and expression of human telomerase catalytic subunit gene in esophageal tissues. J. Gastroenterol. 2002; 37 (6): * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2490635C1 (en) * | 2012-04-12 | 2013-08-20 | Федеральное государственное учреждение "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства" | Improved method for producing dead cell preparations for fluorescent in situ hybridisation |
| EP4116434A1 (en) * | 2021-07-07 | 2023-01-11 | Universidad Autónoma de Madrid | In vitro method for quantifying the cellular content of specific rnas |
| WO2023280944A1 (en) * | 2021-07-07 | 2023-01-12 | Universidad Autónoma de Madrid | In vitro method for quantifying the cellular content of specific rnas |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2007114223A (en) | 2008-10-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Giladi et al. | Dissecting cellular crosstalk by sequencing physically interacting cells | |
| Truong et al. | Killer-like receptors and GPR56 progressive expression defines cytokine production of human CD4+ memory T cells | |
| Gur et al. | LGR5 expressing skin fibroblasts define a major cellular hub perturbed in scleroderma | |
| Kinjyo et al. | Real-time tracking of cell cycle progression during CD8+ effector and memory T-cell differentiation | |
| Mair et al. | Extricating human tumour immune alterations from tissue inflammation | |
| Venner et al. | Molecular landscape of T cell–mediated rejection in human kidney transplants: prominence of CTLA4 and PD ligands | |
| Kim et al. | Analysis of the paired TCR α-and β-chains of single human T cells | |
| CN109777872B (en) | T cell subsets in lung cancer and genes characteristic thereof | |
| Povinelli et al. | Single cell analysis of normal and leukemic hematopoiesis | |
| US20160312302A1 (en) | Single cell gene expression for diagnosis, prognosis and identification of drug targets | |
| Rancan et al. | Exhausted intratumoral Vδ2− γδ T cells in human kidney cancer retain effector function | |
| Welty et al. | Single cell transcriptomic analysis of prostate cancer cells | |
| McClellan et al. | mRNA detection in living cells: A next generation cancer stem cell identification technique | |
| Peters et al. | Clinical potential of DNA methylation in organ transplantation | |
| Bonaguro et al. | CRELD1 modulates homeostasis of the immune system in mice and humans | |
| Globig et al. | Exhaustion of CD39-expressing CD8+ T cells in Crohn’s disease is linked to clinical outcome | |
| Sandoz et al. | Modulation of lytic molecules restrain serial killing in γδ T lymphocytes | |
| RU2346279C2 (en) | METHOD OF CATALYTIC TELOMERASE SUBUNIT (hTERT) ANALYSIS FOR mRNA LEVEL | |
| Ko et al. | Diagnostic methods to assess the numbers, phenotype, and function of primary and engineered NK cells: Methods to predict prognosis and treatment outcome | |
| KR20200143308A (en) | Markers for predicting the response of lymphocytes to a tumor and use thereof | |
| Wang et al. | Single-cell map of diverse immune phenotypes in the metastatic brain tumor microenvironment of non small cell lung cancer | |
| Sullivan et al. | An innovative single-cell approach for phenotyping and functional genotyping of CAR NK Cells | |
| Wada et al. | Requirement of CXCL12-CXCR7 signaling for CD20− CD138− double-negative population in lymphoplasmacytic lymphoma | |
| Li | Clinical Genomic Analysis and Diagnosis--Genomic Analysis Ex Vivo, in Vitro and in Silico | |
| Hou et al. | Multiplexed analysis of gene expression and chromatin accessibility of human umbilical cord blood using scRNA-Seq and scATAC-Seq |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20130417 |