RU2343928C1 - Method of obtaining of blasts from funic blood - Google Patents
Method of obtaining of blasts from funic blood Download PDFInfo
- Publication number
- RU2343928C1 RU2343928C1 RU2007112126/15A RU2007112126A RU2343928C1 RU 2343928 C1 RU2343928 C1 RU 2343928C1 RU 2007112126/15 A RU2007112126/15 A RU 2007112126/15A RU 2007112126 A RU2007112126 A RU 2007112126A RU 2343928 C1 RU2343928 C1 RU 2343928C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- blood
- container
- placenta
- anticoagulant
- blasts
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области медицины и криобиологии, а именно к способам получения из пуповинной крови ядросодержащих клеток для трансплантации при лечении тяжелых заболеваний крови.The invention relates to the field of medicine and cryobiology, and in particular to methods for producing nucleated cells from cord blood for transplantation in the treatment of severe blood diseases.
В настоящее время наиболее важным источником ядросодержащих клеток (ЯСК) является пуповинная кровь (ПК).Currently, the most important source of nucleated cells (UCS) is umbilical cord blood (PC).
По сравнению с другими источниками ЯСК - костным мозгом и периферической кровью - пуповинная кровь имеет ряд преимуществ. Она содержит гемопоэтические клетки-предшественники (ГСК) и стволовые клетки с более высоким потенциалом пролиферации и самообновления. Вместе с тем вследствие малого количества стволовых клеток значительно удлиняется время восстановления гранулоцитов и тромбоцитов. По данным информационных источников трансплантация ядросодержащих клеток пуповинной крови сопряжена с меньшей степенью вероятности и тяжести реакции «трансплантат против хозяина» (РТПХ) как в группе совместимых родственных, так и неродственных доноров и реципиентов.Compared to other sources of UCS - bone marrow and peripheral blood - umbilical cord blood has several advantages. It contains hematopoietic progenitor cells (HSCs) and stem cells with a higher potential for proliferation and self-renewal. However, due to the small number of stem cells, the recovery time of granulocytes and platelets is significantly extended. According to information sources, transplantation of nucleated umbilical cord blood cells is associated with a lesser degree of probability and severity of the graft versus host (GVHD) reaction in both compatible and unrelated donors and recipients.
Процесс забора пуповинной крови прост, занимает не более 10 минут, не вызывает никаких осложнений ни у матери, ни у ребенка.The umbilical cord blood sampling process is simple, takes no more than 10 minutes, does not cause any complications for either the mother or the child.
Получение из пуповинной крови ЯСК и их хранение в качестве аллогенного трансплантата является относительно недорогим способом биологического страхования жизни и здоровья человека.Obtaining UCS from cord blood and storing it as an allogeneic transplant is a relatively inexpensive way of biological insurance of human life and health.
Известны различные методы получения ядросодержащих клеток (К.М.Абдулкадыров и др. Получение и клиническое применение периферических гемопоэтических стволовых клеток из пуповинной крови. Вопросы онкологии 2000, т.46, №4, с.513-536; К.М.Абдулкадыров и др. Плацентарная кровь: альтернативный источник кроветворных стволовых клеток для трансплантаций. Создание банков пуповинной крови. Терапевтический архив, 2001, т.73, №7, с.76-78; К.М.Абдулкадыров. Гематология. Новейший справочник. М., 2004, с.890-901; Processing and cryopreservation of placental/umbilical cord blood for unrelated bone marrow reconstitution / P.Rubistein (et al.) // Froc. Nat. Acad. USA, 1995, V.92, p.1-119-10122; Optimal processing of human umbilical cord blood for clinical banking / P. Denning-Kendall (et fl.) // Exp. Hematol, 1996, V.24, №12, p.1349-1401).Various methods are known for producing nucleated cells (K. M. Abdulkadyrov et al. Obtaining and clinical use of peripheral hematopoietic stem cells from umbilical cord blood. Oncology 2000, vol. 46, No. 4, p. 513-536; K. M. Abdulkadyrov and etc. Placental blood: an alternative source of hematopoietic stem cells for transplantations. Creation of cord blood banks. Therapeutic archive, 2001, t. 73, No. 7, pp. 76-78; K.M. Abdulkadyrov. Hematology. The latest reference book. M., 2004, p. 890-901; Processing and cryopreservation of placental / umbilical cord blood for unrelated bone marrow reconstitution / P. Rubiste in (et al.) // Froc. Nat. Acad. USA, 1995, V.92, p.1-119-10122; Optimal processing of human umbilical cord blood for clinical banking / P. Denning-Kendall (et fl. ) // Exp. Hematol, 1996, V.24, No. 12, p. 1349-1401).
Все они включают в себя основные этапы: забор пуповинной крови, выделение из нее ядросодержащих клеток, их криоконсервирование с последующим хранением.All of them include the main stages: umbilical cord blood sampling, isolation of nucleated cells from it, their cryopreservation with subsequent storage.
Для выделения ядросодержащих клеток используют как различные седиментирующие средства: крахмал (ГЭК) и т.д., так и центрифугирование.To isolate nucleated cells, various sedimentation agents are used: starch (HES), etc., and centrifugation.
Криоконсервирование проводят с использованием программных замораживателей и различных криопротекторов: ДМСО или ДМСО в сочетании с ГЭК или с человеческим альбумином и другие.Cryopreservation is carried out using software freezers and various cryoprotectants: DMSO or DMSO in combination with HES or human albumin, and others.
Недостатком известных методов является длительность и трудоемкость криоконсервирования пуповинной крови, а также высокая стоимость и возможность сбоя программных электросхем.A disadvantage of the known methods is the duration and complexity of cryopreservation of umbilical cord blood, as well as the high cost and the possibility of failure of software circuits.
В качестве ближайшего аналога принят способ криоконсервирования пуповинной крови (Гришина В.В. Разработка оптимальных методов криоконсервирования кроветворных клеток пуповинной крови человека для трансплантаций. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия, №1(3), с.52-59), заключающийся в том, что после рождения ребенка производят забор крови из пупочной вены путем эксфузии непосредственно в контейнер. Свежесобранную пуповинную кровь разделяют на фракции, для чего добавляют равный объем полиглюкина, перемешивают, вертикально подвешивают контейнер с полученной смесью. Смесь выдерживают в течение 50-60 минут до появления четкой границы раздела, отделяют супернатант, центрифугируют его при 2000 об/мин в течение 10 минут при +18°С, плазму удаляют. К оставшемуся осадку, представляющему собой концентрат ядросодержащих клеток, добавляют равный объем 10-12% раствора диметилсульфоксида в полиглюкине при постоянном перемешивании. Затем смесь в запаянном криомешке помещают в термостатируемый объем - контейнер для замораживания, который помещают в пары жидкого азота. Скорость охлаждения составляет 1-2°С в минуту, время охлаждения - 1-2 часа. Затем криомешок из контейнера переносят в основное хранилище, где его хранят при ультранизких температурах до трансплантации.The method of cryopreservation of cord blood was adopted as the closest analogue (VV Grishina. Development of optimal methods for cryopreservation of hematopoietic cord blood cells of a person for transplantation. Cell transplantology and tissue engineering, No. 1 (3), pp. 52-59), which consists in that after the birth of a child, blood is drawn from the umbilical vein by exfusion directly into the container. Freshly collected umbilical cord blood is divided into fractions, for which an equal volume of polyglucin is added, mixed, a container with the resulting mixture is vertically suspended. The mixture is kept for 50-60 minutes until a clear interface appears, the supernatant is separated, centrifuged at 2000 rpm for 10 minutes at + 18 ° C, the plasma is removed. To the remaining precipitate, which is a concentrate of nucleated cells, add an equal volume of a 10-12% solution of dimethyl sulfoxide in polyglucin with constant stirring. Then the mixture in a sealed cryomask is placed in a thermostatically controlled volume - a container for freezing, which is placed in a pair of liquid nitrogen. The cooling rate is 1-2 ° C per minute, the cooling time is 1-2 hours. Then the cryobag from the container is transferred to the main storage, where it is stored at ultra-low temperatures until transplantation.
Недостатком способа, как и всех вышеуказанных, является малый объем пуповинной крови, получаемый при разовом сборе и невозможность ее повторного сбора.The disadvantage of this method, like all of the above, is the small amount of umbilical cord blood obtained with a single collection and the impossibility of re-collecting it.
Объема крови, находящегося в пупочном канатике, часто бывает недостаточно для выделения максимального количества ядросодержащих клеток, необходимого для успешного восстановления кроветворения при последующей трансплантации.The volume of blood in the umbilical cord is often not enough to isolate the maximum number of nucleated cells needed to successfully restore hematopoiesis during subsequent transplantation.
Кроме того, при замораживании материала отсутствует контроль за снижением температуры, что важно для подтверждения стабильности этих параметров и, следовательно, жизнеспособности материала (ЯСК).In addition, when freezing the material, there is no control over a decrease in temperature, which is important to confirm the stability of these parameters and, consequently, the viability of the material (NSC).
Не предусматривается наличие паспорта хранящегося образца с характеристиками важнейших показателей, необходимых для решения вопроса о возможности его трансплантации.It does not provide for a passport of a stored sample with the characteristics of the most important indicators necessary to resolve the issue of the possibility of its transplantation.
Задачей изобретения является создание способа получения ядросодержащих клеток из пуповинной крови, позволяющего заготовить и сохранить для успешной трансплантации максимально возможное количество ядросодержащих клеток, повысить надежность и гарантию сохранения их жизнеспособности.The objective of the invention is to provide a method for producing nucleated cells from umbilical cord blood, which allows to prepare and save for the successful transplantation of the maximum possible number of nucleated cells, to increase reliability and guarantee the preservation of their viability.
Сущность изобретения состоит в том, что способ получения ядросодержащих клеток из пуповинной крови характеризуется тем, что разовый забор пуповинной крови от одного донора выполняют в два этапа в непрерывном режиме, на первом этапе проводят эксфузию крови из дистального отдела пупочной вены в контейнер №1, на втором этапе, после рождения плаценты, производят забор оставшейся в ней крови путем перфузии, для чего плаценту помещают в лоток корневой частью вверх, выполняют пункцию прилегающего к ней проксимального отдела пупочной вены, нагнетают в нее из контейнера №2 антикоагулянт до набухания, затем плаценту поднимают таким образом, чтобы находящаяся в ней кровь вместе с антикоагулянтом вытекала в контейнер, после спадения вены плаценту пальпируют, извлекая остатки крови, свежесобранные эксфузат и перфузат крови смешивают, используя двухпортовую систему с двумя полипропиленовыми иглами, путем перевода перфузата, находящегося в контейнере №2, в основной мешок с кровью - контейнер №1, затем из пуповинной крови выделяют концентрат ядросодержащих клеток, перед проведением его последующего замораживания на криомешок с находящимся в нем концентратом накладывают термопару TXA-O-L с диапазоном измеряемых температур от -200°С до +500°С, подключенную к многоканальному измерителю-регулятору температур ИРТ-4/16, с помощью которого на протяжении всего периода охлаждения производят измерение температуры, осуществляют подачу на компьютер информации в виде графической кривой, производят сохранение заданных параметров в энергонезависимой памяти, затем к полученному образцу биоматериала, предназначенному для хранения в замороженном виде, прилагают полученную графическую кривую снижения температуры и паспорт, содержащий все необходимые для последующей трансплантации качественные и количественные характеристики, включая количество жизнеспособных ядросодержащих клеток.The essence of the invention lies in the fact that the method of obtaining nucleated cells from umbilical cord blood is characterized in that a single sampling of cord blood from one donor is performed in two stages in a continuous mode, at the first stage, blood is exfused from the distal umbilical vein into container No. 1, the second stage, after the birth of the placenta, the remaining blood is taken by perfusion, for which the placenta is placed in the tray with the root part up, and the proximal umbilical vein adjacent to it is punctured, the anticoagulant is melt into it from container No. 2 until it swells, then the placenta is raised so that the blood in it together with the anticoagulant flows into the container, after the veins have fallen, the placenta is palpated, removing the remaining blood, freshly collected exfusate and blood perfusate are mixed using a two-port system with with two polypropylene needles, by transferring the perfusate located in container No. 2 to the main blood bag, container No. 1, then a nucleated cell concentrate is isolated from the umbilical cord blood before e of the subsequent freezing, a TXA-OL thermocouple with a range of measured temperatures from -200 ° С to + 500 ° С, connected to a multi-channel temperature meter-regulator ИРТ-4/16, is applied to the cryobag with the concentrate in it, with which it throughout the entire period cooling, measure the temperature, supply information to the computer in the form of a graphical curve, save the specified parameters in non-volatile memory, then to the resulting sample of biomaterial intended for storage in ice cream, apply the obtained graphical curve of temperature reduction and a passport containing all the qualitative and quantitative characteristics necessary for subsequent transplantation, including the number of viable nucleated cells.
Использование изобретения позволяет получить следующий технический результат.Using the invention allows to obtain the following technical result.
Предлагаемый способ позволяет собрать от одного донора при разовом сборе максимальное количество пуповинной крови и выделить максимально возможное количество ядросодержащих клеток, необходимое для проведения успешной трансплантации. Объем получаемой пуповинной крови примерно на 1/3 больше, чем при использовании известного способа. Дополнительный объем крови, полученный за счет перфузии, составляет в среднем 30 мл, а количество выделенных ЯСК увеличивается на 30,2+5,6%. Повышается гарантия и надежность максимального сохранения жизнеспособности ядросодержащих клеток за счет оптимизации процесса их замораживания.The proposed method allows you to collect from one donor with a single collection of the maximum amount of umbilical cord blood and select the maximum possible number of nucleated cells necessary for a successful transplantation. The volume of cord blood obtained is approximately 1/3 greater than when using the known method. The additional volume of blood obtained due to perfusion is on average 30 ml, and the number of allocated YSC increases by 30.2 + 5.6%. The guarantee and reliability of the maximum preservation of the viability of nucleated cells increases due to the optimization of the process of their freezing.
Измерение температуры на протяжении всего периода ее снижения с получением графической кривой позволяет подтвердить качество хранящихся образцов и гарантировать их жизнеспособность.Temperature measurement over the entire period of its decrease with obtaining a graphical curve allows you to confirm the quality of the stored samples and guarantee their viability.
Предусмотренное в способе наличие качественной и количественной характеристик образца не только гарантирует и подтверждает жизнеспособность ЯСК, но и дает всю необходимую информацию специалисту для принятия решения перед проведением трансплантации.The presence in the method of the qualitative and quantitative characteristics of the sample not only guarantees and confirms the viability of the NSC, but also gives all the necessary information to the specialist for making a decision before the transplantation.
Способ дает возможность целевого использования образца и обеспечивает эффективность трансплантации и соответственно проводимого лечения при тяжелых заболеваниях крови, в том числе онкологических.The method enables the targeted use of the sample and ensures the effectiveness of transplantation and, accordingly, treatment in severe blood diseases, including cancer.
Технический результат достигается за счет разработанных авторами новой технологии забора пуповинной крови, оптимизации процесса замораживания ЯСК и обеспечения возможности подтверждения качества полученного биоматериала, предназначенного для трансплантации.The technical result is achieved due to the development of a new cord blood sampling technology developed by the authors, optimization of the NSC freezing process and the possibility of confirming the quality of the obtained biomaterial intended for transplantation.
Технология забора пуповинной крови по предлагаемому способу предусматривает максимальный разовый забор от одного донора в два этапа в непрерывном режиме. Она включает проведение эксфузии крови из пупочной вены на этапе, когда плацента еще находится в полости матки, и предложенный авторами дополнительный забор крови, оставшейся в плаценте, после ее рождения.The umbilical cord blood sampling technology according to the proposed method provides for a maximum one-time sampling from one donor in two stages in a continuous mode. It includes an exfusion of blood from the umbilical vein at the stage when the placenta is still in the uterine cavity, and the authors proposed an additional sampling of the blood remaining in the placenta after its birth.
При этом авторы исходили из того факта, что в плаценте остается достаточный для дополнительного забора объем крови, и разработали способ ее максимального забора путем перфузии. Хотя объем пуповинной крови, оставшейся в плаценте после родов, относительно мал - примерно 30 мл, высокая концентрация клеток-предшественников обеспечивает успешное приживление трансплантата и восстановление кроветворения у пациентов, масса тела которых не превышает 40-50 кг.At the same time, the authors proceeded from the fact that enough blood volume remained in the placenta for an additional intake, and developed a method for its maximum intake by perfusion. Although the volume of umbilical cord blood remaining in the placenta after childbirth is relatively small - approximately 30 ml, a high concentration of progenitor cells ensures successful graft engraftment and restoration of hematopoiesis in patients whose body weight does not exceed 40-50 kg.
В процессе замораживания образцов проводят непрерывное измерение температуры в течение всего периода охлаждения на протяжении 1-2 часов, осуществляют контроль за ее снижением, получают точную графическую кривую снижения температуры, наличие которой позволяет повысить надежность и гарантию сохранения жизнеспособности ЯСК. С этой целью авторами впервые использован микроконтроллерный многоканальный измеритель-регулятор температур ИРТ-4/16, предназначенный для построения автоматических систем контроля и управления температурой производственных и технологических процессов (ТФАП. 421455.006 РЭ и ПС), (ТФАП. 422455.006-01, ТФАП. 421455.006-02), позволяющий сохранить и накопить измеренные параметры.In the process of freezing samples, a continuous temperature measurement is carried out during the entire cooling period for 1-2 hours, it is monitored for its decrease, and an accurate graph of the temperature decrease is obtained, the presence of which allows to increase the reliability and guarantee the preservation of the viability of the NSC. For this purpose, the authors first used the IRT-4/16 microcontroller multichannel temperature meter-controller, designed to build automatic systems for monitoring and controlling the temperature of production and technological processes (TFAP. 421455.006 RE and PS), (TFAP. 422455.006-01, TFAP. 421455.006 -02), allowing you to save and accumulate the measured parameters.
Наличие паспорта хранящегося образца, содержащего важную информацию: регистрационный номер, дату и время начала и окончания работ, перечисление материалов, использованных в работе, описание методики выделения, концентрирования, криоконсервирования, объем биоматериала, способ хранения, количество ядросодержащих клеток в конечном биоматериале, дату и время помещения концентрата в условия плавного и щадящего замораживания, количество жизнеспособных клеток после замораживания и размораживания, количество CD34+ - клеток, «чистоту» материала, дату и время помещения материала на длительное хранение в биохранилище в жидкий азот, а также наличие точной графической кривой снижения температуры на 1-2°С в минуту до -70°С - дает специалисту всю необходимую информацию для принятия решения перед использованием, подтверждает и гарантирует качество биоматериала, обеспечивая таким образом успешное проведение трансплантации.The presence of a passport of a stored sample containing important information: registration number, date and time of the beginning and end of work, a list of materials used in the work, a description of the methods of isolation, concentration, cryopreservation, the amount of biomaterial, storage method, the number of nucleated cells in the final biomaterial, date and time concentrate placements in a smooth and gentle freezing, the number of viable cells after freezing and thawing, the number of CD34 + - cells, the "purity" of matter a, the date and time of placing the material for long-term storage in the bio-storage in liquid nitrogen, as well as the presence of an accurate graph of the temperature drop by 1-2 ° C per minute to -70 ° C - gives the specialist all the necessary information for making a decision before use, confirms and guarantees the quality of biomaterial, thus ensuring successful transplantation.
Способ осуществляется следующим образом.The method is as follows.
Производят разовый забор пуповинной крови от одного донора в два этапа в непрерывном режиме.A single cord blood is taken from one donor in two stages in a continuous mode.
Медсестра готовит рабочее место - стол для манипуляций, на который укладывают в стерильных условиях пластиковые контейнеры с антикоагулянтом.The nurse is preparing a workplace - a manipulation table, on which plastic containers with an anticoagulant are placed in sterile conditions.
На первом этапе забор пуповинной крови производят путем эксфузии из дистального отдела пупочной вены, расположенной в пупочном канатике, следующим образом.At the first stage, umbilical cord blood is taken by exfusion from the distal umbilical vein located in the umbilical cord, as follows.
После рождения головки (кожный разрез в случае кесарева сечения) врач берет в руку мешок, снимает колпачок с иглы, надавливает на мешок до появления капли антикоагулянта. После рождения ребенка убеждаются в целостности пуповины и отсутствии видимых повреждений, после чего накладывают два стерильных зажима на расстоянии 2 см друг от друга параллельно на пуповину на расстоянии 10 см от ребенка. Пуповину между зажимами пересекают, у места зажима ее берут левой рукой с марлевой салфеткой. Место планируемой пункции пуповины на протяжении не менее 10 см обрабатывают 70% спиртом, а затем иодонатом. Время экспозиции действия антисептика составляет 30 сек. Затем вену пунктируют (эту манипуляцию осуществляет врач) максимально близко к зажиму, срез иглы при этом направлен вверх.After the birth of the head (skin incision in case of cesarean section), the doctor takes a bag in his hand, removes the cap from the needle, presses the bag until a drop of anticoagulant appears. After the birth of the baby, they are convinced of the integrity of the umbilical cord and the absence of visible damage, after which two sterile clamps are applied at a distance of 2 cm from each other in parallel on the umbilical cord at a distance of 10 cm from the baby. The umbilical cord between the clamps is crossed, at the clamping point it is taken with the left hand with a gauze napkin. The place of the planned umbilical cord puncture for at least 10 cm is treated with 70% alcohol and then iodonate. The exposure time of the antiseptic is 30 seconds. Then the vein is punctured (the doctor performs this manipulation) as close to the clamp as possible, with the needle section being directed upwards.
Медсестра располагает контейнер для забора крови ниже уровня нахождения роженицы. При тенденции спадения вены врач поглаживающими движениями по пуповине максимально отживает остатки крови. Получаемую кровь перемешивают с антикоагулянтом, находящимся в контейнере №1, путем его плавного покачивания в течение всей процедуры сбора и непосредственно после в течение 10 секунд во избежание образования сгустков. Признаками окончания забора является запустевание пуповинной вены и ее спадение. Время забора варьирует в пределах от 5 до 8 минут.The nurse has a container for collecting blood below the level of the woman in labor. With a tendency for veins to fall, the doctor strokes the remains of the blood as much as possible with stroking movements along the umbilical cord. The resulting blood is mixed with an anticoagulant located in container No. 1 by smoothly swaying it throughout the collection process and immediately after for 10 seconds to avoid clot formation. Signs of the end of the fence is the desolation of the umbilical cord vein and its decline. Sampling time varies from 5 to 8 minutes.
Извлекают иглу из вены и закрывают колпачком. После максимального оттока крови из магистрали в контейнер на магистрали завязывают три узла с интервалом 5 см и затягивают их.Remove the needle from the vein and close the cap. After the maximum outflow of blood from the highway to the container, three nodes are tied at the highway with an interval of 5 cm and tighten them.
После рождения плаценты (или ее отделения от стенок матки) производят забор оставшейся в ней крови путем перфузии. Плаценту помещают в лоток корневой частью вверх, накладывают зажим на пуповину на расстоянии 5-10 см от плаценты, дезинфицируют место пункции вены. Берут контейнер №2 для забора крови, содержащий антикоагулянт. Выполняют пункцию прилегающего к плаценте проксимального отдела пупочной вены, нагнетают в нее из контейнера антикоагулянт в объеме 30-60 мл до набухания. Затем плаценту поднимают таким образом, чтобы находящаяся в ней кровь вместе с антикоагулянтом вытекала в контейнер, постоянно его покачивая. После спадения вены плаценту пальпируют, извлекая остатки крови.After the birth of the placenta (or its separation from the walls of the uterus), the remaining blood is taken by perfusion. The placenta is placed in the tray with the root part up, a clamp is placed on the umbilical cord at a distance of 5-10 cm from the placenta, the site of the puncture of the vein is disinfected. Take a container No. 2 for blood sampling containing an anticoagulant. A puncture of the proximal umbilical vein adjacent to the placenta is performed, an anticoagulant is injected into it from a container in a volume of 30-60 ml until swelling. Then the placenta is raised in such a way that the blood inside it, together with the anticoagulant, flows into the container, constantly shaking it. After vein collapse, the placenta is palpated, removing the remaining blood.
После окончания процедуры извлекают иглу из вены и закрывают ее колпачком.After the procedure, remove the needle from the vein and close it with a cap.
Свежесобранные эксфузат и перфузат пуповинной крови смешивают, используя двухпортовую систему с двумя полипропиленовыми иглами. Смешивание осуществляют путем перевода перфузата, находящегося в контейнере №1, в основной мешок с кровью - контейнер №2, после чего пустую систему с мешком, где содержался перфузат, отпаивают.Freshly collected exfusate and cord blood perfusate are mixed using a two-port system with two polypropylene needles. Mixing is carried out by transferring the perfusate, which is in the container No. 1, into the main bag with blood - container No. 2, after which the empty system with the bag containing the perfusate is soldered.
Из пуповинной крови выделяют концентрат ядросодержащих клеток общеизвестным способом (Гришина В.В. Разработка оптимальных методов криоконсервирования кроветворных клеток пуповинной крови человека для трансплантаций. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. №1(3), с.52-59). Пуповинную кровь разделяют на фракции путем добавления равного объема полиглюкина. Смесь тщательно перемешивают и выдерживают в течение 50-60 минут, отделяют супернатант, центрифугируют его при 2000 об/мин, плазму удаляют, к полученному осадку - концентрату ядросодержащих клеток - добавляют равный объем 10-12% раствора диметилсульфоксида в полиглюкине.From cord blood, a concentrate of nucleated cells is isolated by a well-known method (Grishina VV Development of optimal methods for cryopreservation of human umbilical cord blood cells for transplantation. Cell transplantology and tissue engineering. No. 1 (3), pp. 52-59). Cord blood is divided into fractions by adding an equal volume of polyglucin. The mixture is thoroughly mixed and kept for 50-60 minutes, the supernatant is separated, centrifuged at 2000 rpm, the plasma is removed, and an equal volume of a 10-12% solution of dimethyl sulfoxide in polyglucin is added to the obtained precipitate, a concentrate of nucleated cells.
Перед проведением последующего замораживания на криомешок с находящимся в нем концентратом ЯСК накладывают термопару TXA-O-L с диапазоном измеряемых температур от -200°С до +500°С, подключенную к многоканальному измерителю-регулятору температур ИРТ-4/16 (ТФАП. 421455.006 РЭ и ПС), (ТФАП. 422455.006-01, ТФАП. 421455.006-02). Затем концентрат клеток в запаянном криомешке помещают в контейнер для замораживания, который, в свою очередь, помещают в пары жидкого азота. Скорость охлаждения материала составляет 1-2°С в минуту, время охлаждения 1-2 часа.Before carrying out the subsequent freezing, a TXA-OL thermocouple with a range of measured temperatures from -200 ° С to + 500 ° С connected to a multi-channel temperature measuring instrument-regulator ИРТ-4/16 (ТФАП. 421455.006 РЭ and PS), (TFAP. 422455.006-01, TFAP. 421455.006-02). Then, the cell concentrate in a sealed cryogen bag is placed in a container for freezing, which, in turn, is placed in a pair of liquid nitrogen. The cooling rate of the material is 1-2 ° C per minute, the cooling time is 1-2 hours.
На протяжении всего периода охлаждения производят измерение температуры, осуществляя подачу на компьютер информации в виде графической кривой снижения температуры, производят сохранение заданных параметров в энергонезависимой памяти с указанием даты и времени, в том числе при отключении напряжения питания.Throughout the entire cooling period, the temperature is measured by supplying information to the computer in the form of a graphical curve of the temperature decrease, the set parameters are saved in non-volatile memory with the date and time, including when the power supply is turned off.
К полученному образцу биоматериала, предназначенному для хранения в замороженном виде, прилагают полученную графическую кривую снижения температуры и паспорт. Его наличие является обязательным условием для последующего решения о возможности трансплантации образца.To the obtained sample of biomaterial intended for storage in a frozen form, the obtained graph of the temperature reduction curve and passport are applied. Its presence is a prerequisite for a subsequent decision on the possibility of transplantation of a sample.
Паспорт содержит все необходимые для последующей трансплантации качественные и количественные характеристики: присвоенный образцу регистрационный номер, дату и время начала и окончания работ, перечень использованных в работе материалов, описание методики выделения ЯСК, концентрирования, криоконсервирования, объем биоматериала, который будет храниться, способ хранения, количество ядросодержащих клеток в конечном биоматериале, дату и время помещения концентрата в условия плавного и щадящего замораживания, количество жизнеспособных ЯСК после замораживания и размораживания, количество CD34+, характеристику «чистоты» материала, дату и время помещения материала на длительное хранение в биохранилище в жидкий азот.The passport contains all the qualitative and quantitative characteristics necessary for the subsequent transplantation: the registration number assigned to the sample, the date and time of the beginning and end of work, the list of materials used in the work, a description of the method for isolating NSC, concentration, cryopreservation, the amount of biomaterial that will be stored, storage method, the number of nucleated cells in the final biomaterial, the date and time the concentrate was placed under conditions of smooth and gentle freezing, the number of viable SC after freezing and thawing, the number of CD34 +, characteristic of the "purity" of the material, the date and time when the material for long-term storage in liquid nitrogen biohranilische.
Криомешок из контейнера переносят в основное хранилище с жидким азотом, где он сохраняется до трансплантации.The cryosack from the container is transferred to the main storage with liquid nitrogen, where it is stored until transplantation.
Предлагаемый способ использован для получения более 100 образцов ядросодержащих клеток. Объем разового забора пуповинной крови для получения одного образца составил 90±10 мл. Количество выделенных ядросодержащих клеток составило в среднем 93,2±6,3% от исходного. Все образцы характеризовались высокой жизнеспособностью до замораживания и после размораживания - более 90%.The proposed method was used to obtain more than 100 samples of nucleated cells. The volume of a single cord blood sampling to obtain one sample was 90 ± 10 ml. The number of selected nucleated cells averaged 93.2 ± 6.3% of the original. All samples were characterized by high viability before freezing and after thawing - more than 90%.
Биоматериал, полученный предложенным способом, успешно применен в НИИ Детской онкологии и гематологии ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН г.Москвы при проведении первой в России последовательной трансплантации ЯСК из пуповинной крови и стволовых клеток из периферической крови от двух родственных, частично совместимых доноров больному с нейробластомой IV степени.The biomaterial obtained by the proposed method has been successfully applied at the Research Institute of Pediatric Oncology and Hematology, GU RONTs im. NN Blokhina RAMS of Moscow during the first in Russia sequential transplantation of NSC from umbilical cord blood and stem cells from peripheral blood from two related, partially compatible donors to a patient with grade IV neuroblastoma.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2007112126/15A RU2343928C1 (en) | 2007-04-03 | 2007-04-03 | Method of obtaining of blasts from funic blood |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2007112126/15A RU2343928C1 (en) | 2007-04-03 | 2007-04-03 | Method of obtaining of blasts from funic blood |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2007112126A RU2007112126A (en) | 2008-10-10 |
| RU2343928C1 true RU2343928C1 (en) | 2009-01-20 |
Family
ID=39927407
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2007112126/15A RU2343928C1 (en) | 2007-04-03 | 2007-04-03 | Method of obtaining of blasts from funic blood |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2343928C1 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2511417C2 (en) * | 2009-03-20 | 2014-04-10 | СНУ Ар энд ДиБи ФАУНДЕЙШН | Method for isolation of pluripotent stem cells from umbilical blood expressing znf281 |
| RU2590688C2 (en) * | 2014-11-19 | 2016-07-10 | Публичное акционерное общество "Институт Стволовых Клеток Человека" | Method of producing suspension of nuclear cells of umbilical blood with standard concentration |
| US9730959B2 (en) | 2011-12-29 | 2017-08-15 | “Nextgen” Company Limited | Biocomposite for regeneration of injured tissue and organs, a kit for making the biocomposite, a method of making the biocomposite and a method of treating injuries |
-
2007
- 2007-04-03 RU RU2007112126/15A patent/RU2343928C1/en active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ГРИШИНА В.В. Разработка оптимальных методов криоконсервирования кроветворных клеток пуповинной крови человека для трансплантаций. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия, №1(3), 2006, с.52-59. * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2511417C2 (en) * | 2009-03-20 | 2014-04-10 | СНУ Ар энд ДиБи ФАУНДЕЙШН | Method for isolation of pluripotent stem cells from umbilical blood expressing znf281 |
| US9730959B2 (en) | 2011-12-29 | 2017-08-15 | “Nextgen” Company Limited | Biocomposite for regeneration of injured tissue and organs, a kit for making the biocomposite, a method of making the biocomposite and a method of treating injuries |
| RU2590688C2 (en) * | 2014-11-19 | 2016-07-10 | Публичное акционерное общество "Институт Стволовых Клеток Человека" | Method of producing suspension of nuclear cells of umbilical blood with standard concentration |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2007112126A (en) | 2008-10-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Toupadakis et al. | Comparison of the osteogenic potential of equine mesenchymal stem cells from bone marrow, adipose tissue, umbilical cord blood, and umbilical cord tissue | |
| KR100779812B1 (en) | Preservation of non embryonic cells from non hematopoietic tissues | |
| US8481253B2 (en) | Cryopreservation of adipose tissue for the isolation of mesenchymal stem cells | |
| US20180015128A1 (en) | Amniotic Fluid-Derived Preparation with a Standardized Biologic Activity | |
| US20180000870A1 (en) | Methods of forming amniotic fluid-derived preparations | |
| JP6531256B2 (en) | Method for cryopreservation of cord blood and peripheral blood and solution for cryopreservation | |
| US20140031772A1 (en) | System and method for collecting stem cells | |
| ES2970156T3 (en) | Methods to prepare a platelet release | |
| CN112451544B (en) | Composition for improving thin endometrium, preparation method and application thereof | |
| CN101889079A (en) | A method for constructing human placental mesenchymal cells library which is suitable for clinical applicationc | |
| EP2467149A2 (en) | Apparatus and process for generating and harvesting adult stem cells and fluid associated with it from skin and omentum for medical, cosmetic, and veterinary use | |
| CN109497041A (en) | A kind of cryopreservation methods of adipose tissue | |
| JP2023123767A (en) | Method and kit for preservation of adipose tissue grafts | |
| RU2343928C1 (en) | Method of obtaining of blasts from funic blood | |
| US20100172951A1 (en) | Enhanced Medical Implant | |
| CN112244008B (en) | Preparation of concentrated growth factor kit from umbilical cord blood | |
| US20160287751A1 (en) | Injectable amniotic membrane tissue graft | |
| CN108812642B (en) | Systematic method for preparing placenta tissue according to structural hierarchy and cryopreserving and application | |
| Dhot et al. | Cord blood stem cell banking and transplantation | |
| RU2631642C1 (en) | Method for treating nonscarring alopecia | |
| CN105695401A (en) | Method for preparing and preserving umbilical arterial and vein vascular peripheral stem cells | |
| US20160287749A1 (en) | Reconstituted amniotic membrane-amniotic fluid combination tissue graft | |
| US20160287752A1 (en) | Reconstituted amniotic membrane-amniotic fluid combination tissue graft with standardized stem cell component and method of forming same | |
| Haidar | Platelet-rich plasma therapy in the management and treatment of male infertility—an update of state-of-art | |
| Kumari | Stem Cell |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20111018 |
|
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE Effective date: 20111226 |
|
| HE4A | Change of address of a patent owner |