RU2339036C2 - Method of estimation of vaccine quality - Google Patents
Method of estimation of vaccine quality Download PDFInfo
- Publication number
- RU2339036C2 RU2339036C2 RU2005133587/15A RU2005133587A RU2339036C2 RU 2339036 C2 RU2339036 C2 RU 2339036C2 RU 2005133587/15 A RU2005133587/15 A RU 2005133587/15A RU 2005133587 A RU2005133587 A RU 2005133587A RU 2339036 C2 RU2339036 C2 RU 2339036C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- vaccine
- quality
- scanning
- substrate
- components
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Предлагаемое изобретение относится к области биологии и медицины и может быть использовано в качестве дополнительной процедуры при проведении стандартных мероприятий по надзору за качеством производства живых вирусных вакцин.The present invention relates to the field of biology and medicine and can be used as an additional procedure in carrying out standard measures to monitor the quality of production of live viral vaccines.
Способ основан на измерении размеров биологических объектов с помощью сканирующей зондовой микроскопии.The method is based on measuring the size of biological objects using scanning probe microscopy.
Вакцинация - самое эффективное и экономически выгодное средство предупреждения инфекционных болезней в современной медицине. Основной принцип вакцинации заключается в том, что пациенту дается ослабленный или убитый болезнетворный агент для стимуляции иммунного ответа против истинного возбудителя заболевания. Вакцины отличаются от других иммунобиологических препаратов сложностью состава, наличием патогенного материала, технологией изготовления, разнообразием механизмов действия на организм и необходимостью особого контроля за их безопасностью. Качество вакцины во многом определяется количеством специфического антигенного материала, способного активировать иммунную систему вакцинируемого [1, 2].Vaccination is the most effective and cost-effective means of preventing infectious diseases in modern medicine. The basic principle of vaccination is that the patient is given a weakened or killed pathogen to stimulate the immune response against the true causative agent of the disease. Vaccines differ from other immunobiological preparations in the complexity of the composition, the presence of pathogenic material, manufacturing technology, a variety of mechanisms of action on the body and the need for special control over their safety. The quality of the vaccine is largely determined by the amount of specific antigenic material that can activate the immune system of the vaccinee [1, 2].
В целом производство вакцины состоит из следующих стадий: 1) промышленное производство партии вакцинного препарата; 2) проверка биологической активности новой партии; 3) лиофильная сушка и расфасовка по ампулам; 4) доставка в медицинские учреждения.In general, vaccine production consists of the following stages: 1) industrial production of a batch of vaccine preparation; 2) verification of the biological activity of the new batch; 3) freeze drying and packaging in ampoules; 4) delivery to medical institutions.
В ходе промышленного получения вакцин может происходить деградация «живых» (то есть полностью сформированных и готовых к воспроизведению) вирусных частиц. Именно они, при введении в организм вакцинируемого, ответственны за размножение вирусов и, в конечном итоге, активацию иммунного ответа. Поэтому перед использованием в медицинских учреждениях все партии вакцины проходят обязательную комплексную проверку на биологическую активность [3].During the industrial production of vaccines, degradation of “living” (that is, fully formed and ready for reproduction) virus particles can occur. It is they who, when introduced into the body of the vaccinee, are responsible for the multiplication of viruses and, ultimately, the activation of the immune response. Therefore, before using in medical institutions, all batches of vaccine undergo mandatory comprehensive testing for biological activity [3].
Известен и широко применяется способ оценки качества вакцины на основе определения титра цитопатогенного действия ТЦД50 вирусов культуральным методом [4]. Принцип метода пробы вакцины готовят в виде 10-кратных разведении на поддерживающей питательной среде и вносят в лунки содержащие чувствительные к данному вирусу клетки. Адсорбцию на клетках проводят в течение 1 часа при комнатной температуре или 30 минут при +37°С, после чего в пробирки вносят поддерживающую среду. После инкубации при комнатной температуре в течение 20 минут инфицированные культуры помещали в термостат для последующего культивирования при 37°С в атмосфере с 5% CO2. Результаты титрования учитывали в период между начиная с 3-его дня после инфицирования, когда появлялись отчетливые цитопатические изменения в монослое клеток инфицированных культур при отсутствии цитопатических явлений в контрольных неинфицированных культурах. Для подсчета титра вируса используют формулу Рида и Менча [4]. За титр вируса принимают вычисленное по статистической формуле Рида и Менча наибольшее его разведение, которое вызывает дегенерацию 50% зараженных этим разведением вируса культур клеток. Значение титра вируса выражается в условных единицах (ЦПД50/мл).Known and widely used is a method for assessing the quality of a vaccine based on determining the titer of the cytopathogenic effect of TCD50 viruses by the cultural method [4]. The principle of the vaccine sample method is prepared in the form of 10-fold dilutions in a supportive nutrient medium and the cells containing cells sensitive to this virus are introduced into the wells. Adsorption on the cells is carried out for 1 hour at room temperature or 30 minutes at + 37 ° C, after which a support medium is introduced into the tubes. After incubation at room temperature for 20 minutes, the infected cultures were placed in a thermostat for subsequent cultivation at 37 ° C in an atmosphere with 5% CO2. Titration results were taken into account between the 3rd day after infection, when distinct cytopathic changes appeared in the monolayer of cells of infected cultures in the absence of cytopathic phenomena in control uninfected cultures. To calculate the titer of the virus using the formula of Reed and Mench [4]. For the titer of the virus, the largest dilution calculated according to the statistical formula of Reed and Mench is taken, which causes the degeneration of 50% of the cell cultures infected with this dilution of the virus. The value of the titer of the virus is expressed in arbitrary units (CPD50 / ml).
Определение специфической активности производимой вакцины с помощью титрования цитопатогенного действия вируса является достаточно трудоемким и продолжительным процессом. Этот метод занимает более 1 недели и не позволяет проводить дифференцировку серий вакцины с недопустимо низкими ТЦД50 до проведения дорогостоящих заключительных этапов производства - лиофильной сушки и упаковки вакцины в ампулы. При этом после обнаружения низкой биологической активности выбраковывается огромное количество вакцинного препарата. Экономические потери составляют миллионы рублей. В связи с этим разработка экспресс метода для оценки - состояния вирусных частиц в вакцине весьма актуальна.Determining the specific activity of the vaccine produced by titrating the cytopathogenic effect of the virus is a rather laborious and lengthy process. This method takes more than 1 week and does not allow the differentiation of vaccine series with unacceptably low TCD50 until the costly final stages of production are carried out - freeze drying and packaging of the vaccine in ampoules. Moreover, after the discovery of low biological activity, a huge amount of the vaccine preparation is rejected. Economic losses amount to millions of rubles. In this regard, the development of the express method for assessing the state of viral particles in the vaccine is very relevant.
Известен также способ оценки качества вакцины на основе метода полимеразной цепной реакции (ПЦР), направленный на детекцию генетического материала вируса в образцах вакцины до проведения дорогостоящих процедур производства [5]. Этот метод занимает относительно небольшое время для анализа - сутки, обладает высокой чувствительностью и селективностью, а также имеет возможность проведения полуколичественного анализа.There is also a method for evaluating the quality of a vaccine based on the polymerase chain reaction (PCR) method, aimed at detecting the genetic material of the virus in vaccine samples before carrying out expensive production procedures [5]. This method takes a relatively short time for analysis - a day, has high sensitivity and selectivity, and also has the ability to conduct semi-quantitative analysis.
Однако к основным недостаткам данного метода относится невозможность оценить состояние вирусных частиц и деградацию вирусного материала в вакцине, поскольку оценивается только наличие генетического материала вируса. Как уже отмечалось выше, одним из показателей наличия иммунологического активного материала в вакцине является наличие сформированных вирусных частиц, способных к размножению в организме вакцинируемого и в которых сохранены в неизменном виде антигенные детерминанты вируса.However, the main disadvantages of this method include the inability to assess the state of viral particles and the degradation of viral material in the vaccine, since only the presence of the genetic material of the virus is evaluated. As already noted above, one of the indicators of the presence of an immunological active material in a vaccine is the presence of formed viral particles capable of multiplying in the body of the vaccinee and in which the antigenic determinants of the virus are preserved unchanged.
Возможно также применение электронной микроскопии (ЭМ), позволяющей непосредственно визуализировать вирусные частицы в биологических препаратах [6, 7]. Однако метод ЭМ дорогостоящ, требует длительное время на приготовление и анализ образцов. Кроме того, при подготовке образцы подвергаются специальной обработке, фиксации, что вносит ряд ошибок в исследуемые структуры.It is also possible to use electron microscopy (EM), which allows direct visualization of viral particles in biological preparations [6, 7]. However, the EM method is expensive, it takes a long time to prepare and analyze samples. In addition, during preparation, the samples are subjected to special processing and fixation, which introduces a number of errors in the structures under study.
Известен способ детекции растворов с биологическими объектами, в частности токсичных белков [8], на основе сканирующей зондовой микроскопии, включающий взаимодействие антитоксичного моноклонального антитела с токсичным белком, образование и анализ размеров кластеров, а также выявление токсинных белков при превышении размеров кластеров над размерами токсичных белков, при этом как минимум на одной подложке иммобилизируют молекулы, по меньшей мере, одного антитоксичного моноклонального или поликлонального антитела с расстоянием между молекулами, превышающими их размеры, образуя при этом четыре тестовых поля, после этого первое тестовое поле оставляют в качестве эталонного, на второе тестовое поле наносят нейтральный раствор, на третье тестовое поле наносят раствор с молекулами, по меньшей мере, одного токсичного белка, а на четвертое тестовое поле наносят исследуемый раствор, инкубируют, после чего устанавливают, как минимум, одну подложку в сканирующий зондовый микроскоп и проводят последовательный анализ четырех тестовых полей, сканируя их и определяя размеры образовавшихся кластеров. При этом анализ четырех тестовых полей можно проводить в жидкой фазе, после удаления жидкости, в замороженном состоянии или после нанесения на них металлического покрытия. Существует также вариант, в котором поверхность подложек обрабатывают веществами, обеспечивающими ковалентную связь, повышающими адсорбцию или создающими поверхностный заряд. Возможно также воздействие ультразвука на подложки как перед иммобилизацией молекул, так и перед их анализом.A known method for the detection of solutions with biological objects, in particular toxic proteins [8], based on scanning probe microscopy, including the interaction of an antitoxic monoclonal antibody with a toxic protein, the formation and analysis of cluster sizes, as well as the detection of toxin proteins when cluster sizes exceed the size of toxic proteins , while at least one substrate immobilize the molecules of at least one antitoxic monoclonal or polyclonal antibody with a distance between molecules exceeding their size, forming four test fields, after which the first test field is left as a reference, a neutral solution is applied to the second test field, a solution with molecules of at least one toxic protein is applied to the third test field, and the fourth test field is applied to the test solution, incubated, after which at least one substrate is installed in a scanning probe microscope and a sequential analysis of the four test fields is performed, scanning them and determining the size of the image oversized clusters. In this case, the analysis of the four test fields can be carried out in the liquid phase, after removing the liquid, in the frozen state, or after applying a metal coating to them. There is also an option in which the surface of the substrates is treated with substances that provide covalent bonding, increase adsorption or create a surface charge. The effect of ultrasound on the substrates is also possible both before the immobilization of molecules and before their analysis.
Недостаток указанного способа детекции растворов с биологическими компонентами заключается в недостаточной достоверности измерений, связанной с ограниченным набором приемов подготовки полей исследуемых объектов и ограниченных режимах исследований.The disadvantage of this method of detecting solutions with biological components is the lack of reliability of measurements associated with a limited set of methods for preparing the fields of the studied objects and limited research modes.
Задачей, решаемой предлагаемым изобретением, является создание эффективного способа оценки качества вакцин. Технический результат предложенного изобретения заключается в повышении достоверности определения эффективности вакцины за счет повышения достоверности детекции вирусных частиц.The problem solved by the invention is the creation of an effective way to assess the quality of vaccines. The technical result of the proposed invention is to increase the reliability of determining the effectiveness of the vaccine by increasing the reliability of detection of viral particles.
Указанный технический результат достигается тем, что в способе оценки качества вакцины, включающем подготовку поверхности подложки, нанесение раствора с биологическими объектами на поверхность подложки, фиксацию биологических объектов на поверхности подложки, сканирование зондом в режиме сканирующего зондового микроскопа зоны измерения с биологическими объектами на поверхности подложки и анализ полученного изображения, при этом в качестве раствора с биологическими объектами используют раствор вакцины с вирусами и фрагментами их деления, при нанесении раствора вакцины на поверхность подложки проводят кратковременную инкубацию и сорбцию с сохранением нативной структуры компонентов вакцины, анализ полученного изображения происходит следующим образом: разделяют изображения компонентов вакцины на две группы, содержащие в первой вирусы, а во второй - фрагменты их разрушения, подсчитывают количество компонентов в каждой группе и по отношению их количества в группах определяют качество вакцины.The specified technical result is achieved by the fact that in the method for evaluating the quality of the vaccine, including preparing the surface of the substrate, applying a solution with biological objects to the surface of the substrate, fixing biological objects on the surface of the substrate, scanning with a probe in the scanning probe microscope mode the measurement zone with biological objects on the surface of the substrate and analysis of the obtained image, while a solution of the vaccine with viruses and their fragments is used as a solution with biological objects When applying the vaccine solution on the surface of the substrate, short-term incubation and sorption are carried out while maintaining the native structure of the vaccine components, the analysis of the obtained image is as follows: the images of the vaccine components are divided into two groups containing viruses in the first, and fragments of their destruction in the second, are counted the number of components in each group and in relation to their number in the groups determine the quality of the vaccine.
Существуют варианты, в которых инкубацию проводят при повышенной температуре или при воздействии ультразвука. Возможен вариант, где сканирование зондом осуществляют в режиме атомно-силового микроскопа с переменными полями сканирования. Существуют также варианты, в которых после фиксации компонентов вакцины на поверхности подложки производят ее сушку, покрытие по меньшей мере одним тонким слоем проводящего материала и сканирование в режиме туннельного микроскопа или покрытие люминесцентным материалом и сканирование в режиме близкопольного оптического микроскопа. Кроме того, возможно осуществление сканирования в режиме измерения твердости, в режиме измерения модуля Юнга, в режиме измерения трения или в режиме измерения усилия сдвига компонентов вакцины на поверхности подложки.There are options in which the incubation is carried out at elevated temperature or when exposed to ultrasound. A variant is possible where the probe scanning is carried out in the atomic force microscope mode with variable scanning fields. There are also options in which after fixing the components of the vaccine on the surface of the substrate, it is dried, coated with at least one thin layer of conductive material and scanned in a tunnel microscope mode or coated with a luminescent material and scanned in a near-field optical microscope. In addition, it is possible to perform scanning in the mode of measuring hardness, in the mode of measuring Young's modulus, in the mode of measuring friction or in the mode of measuring the shear stress of the vaccine components on the surface of the substrate.
Реализация предложенного способа осуществляется следующим образом. На свежеочищенную слюдяную подложку (определенного размера, например, 7×7 мм2) непосредственно наносят препарат вакцины в объеме примерно 10 мкл и проводят кратковременную инкубацию в течение 5 минут при комнатной температуре. В исследованиях был использован препарат живой коревой вакцины (ЖКВ), которая используется для профилактики кори в России. ЖКВ готовится методом культивирования аттенуированного штамма вируса кори Ленинград-16 (Л-16) на первичной культуре фибробластов эмбрионов японских перепелов [9]. ЖКВ готовится в соответствии с Фармакопейной статьей - ФС42-3092-94. При кратковременной инкубации происходит самопроизвольная сорбция вирусных частиц и вирусных фрагментов на подложку за счет ряда взаимодействий между белковым материалом вируса и гидрофильной, слабозаряженной поверхностью слюды. Для удаления несвязавшихся компонентов вакцины и остатков солей, затрудняющих последующий анализ, используют двухкратную отмывку деоионизованной водой. Наиболее общий случай исследований заключается в удалении жидкости с помощью очищенного сжатого воздуха или жидкого азота и последующего анализа поверхности подложки с помощью наиболее широко распространенного воздушного сканирующего зондового микроскопа (СЗМ) [10, 11]. Возможно проведение анализа в жидкой фазе с помощью жидкостных ячеек [12, 13].Implementation of the proposed method is as follows. A vaccine preparation in a volume of about 10 μl is directly applied to a freshly cleaned mica substrate (of a certain size, for example, 7 × 7 mm 2 ) and a short incubation is carried out for 5 minutes at room temperature. In the studies, a live measles vaccine (LCV) preparation was used, which is used to prevent measles in Russia. ZhKV is prepared by cultivating an attenuated strain of measles virus Leningrad-16 (L-16) in a primary culture of Japanese quail embryo fibroblasts [9]. ZhKV is prepared in accordance with the Pharmacopoeia article - FS42-3092-94. During short-term incubation, spontaneous sorption of viral particles and viral fragments onto a substrate occurs due to a series of interactions between the protein material of the virus and the hydrophilic, lightly charged mica surface. To remove unbound components of the vaccine and residues of salts that impede the subsequent analysis, double washing with deionized water is used. The most common case of research is the removal of liquid using purified compressed air or liquid nitrogen and the subsequent analysis of the surface of the substrate using the most widespread air scanning probe microscope (SPM) [10, 11]. It is possible to carry out analysis in the liquid phase using liquid cells [12, 13].
Для анализа свойств компонентов вакцины для каждой серии вакцины подбирается концентрация таким образом, чтобы компоненты вакцины, а именно вирусные частицы и их фрагменты, располагались изолировано. Для этого используют несколько разведении в интервале от 1:1000 до 1:10 000 вакцинного материала.To analyze the properties of the components of the vaccine for each series of vaccines, a concentration is selected so that the components of the vaccine, namely the viral particles and their fragments, are isolated. To do this, use several dilutions in the range from 1: 1000 to 1:10 000 vaccine material.
После этого устанавливают подложку (подложки) с биологическими объектами в сканирующий зондовый микроскоп и, проводят последовательно сканирование площадей по известной методике [14]. Для сканирования выбирают центральную область подложки, чтобы избежать краевых эффектов при инкубации раствора вакцины на подложке.After that, a substrate (s) with biological objects is installed in a scanning probe microscope and the areas are scanned sequentially by a known method [14]. The center region of the substrate is selected for scanning in order to avoid edge effects when the vaccine solution is incubated on the substrate.
Для определения размера выборки частиц, необходимых для проведения анализа, использовали вероятностный подход, который предполагает, что каждая частица имеет ненулевую вероятность включения в выборку [15]. В целом, для получения достоверных результатов по выборке необходимо провести измерения не менее 350 частиц. Для проведения измерений размеров частиц используют площади, порядка 1000×1000 нм2. Такой размер площади позволяет оценивать размеры исследуемых частиц, находящихся в интервале от 15 до 200 нм с высокой степенью достоверности. Количество площадей, необходимых для анализа, определяется в каждом случае экспериментально на основе подсчета севших на слюду частиц. Площади для анализа выбираются случайным образом при исключении рядом расположенных площадей. Последнее проводится для того, чтобы исключить двойной обсчет одних и тех же частиц. При анализе размеров частиц первой группы (соответствующих размерам цельных вирусов) учитываются следующие факторы: 1) не подлежат обсчету частицы, слившиеся друг с другом; 2) не подлежат обсчету частицы, находящиеся на границе сканируемой площади. Трудности, вызванные наличием слившихся частиц, можно преодолеть, используя различные варианты инкубации вакцины на подложке, как-то: ковалентную модификацию, обработку ультразвуком, использованием гидрофобных агентов (см. ниже). Для того чтобы учесть частицы, находящиеся на границе сканируемой площади, предлагается использовать для повторного сканирования площадь большого размера, например, 1200×1200 нм2.To determine the size of the sample of particles necessary for the analysis, a probabilistic approach was used, which assumes that each particle has a nonzero probability of inclusion in the sample [15]. In general, to obtain reliable sampling results, it is necessary to measure at least 350 particles. For measurements of particle sizes using areas of the order of 1000 × 1000 nm 2 . This size of the area allows you to evaluate the size of the investigated particles in the range from 15 to 200 nm with a high degree of reliability. The number of areas required for analysis is determined in each case experimentally on the basis of counting particles settled on mica. Areas for analysis are randomly selected when excluding adjacent areas. The latter is carried out in order to exclude double counting of the same particles. When analyzing the particle sizes of the first group (corresponding to the sizes of whole viruses), the following factors are taken into account: 1) particles merged with each other are not subject to calculation; 2) particles located on the border of the scanned area are not subject to calculation. The difficulties caused by the presence of fused particles can be overcome by using various options for incubating the vaccine on a substrate, such as covalent modification, sonication, and the use of hydrophobic agents (see below). In order to take into account particles located at the boundary of the scanned area, it is proposed to use for re-scanning a large area, for example, 1200 × 1200 nm 2 .
Затем проводят анализ полученных данных. На основе геометрических размеров частицы разделяют на две группы. Первая соответствует популяции зрелых полностью сформированных вирусных частиц. Во вторую группу объединяют все остальные изображения, которые соответствуют различным фрагментарным обломкам вирусных частиц. Подсчитывают количество компонентов в первой группе с помощью программы "Grain analysis", проводящий количественный анализ изображений [13]. Именно данная группа в первую очередь является иммунологически активной и определяет качество вакцины. Было проведено сравнение нескольких серий вакцин. Все исследованные вакцины имели по данным ПЦР высокий титр 10-4-10-5, ЦТД50 находилось в пределах 4,37-5,04lg0,5 [5]. По результатам анализа с помощью СЗМ было показано, что количество цельных вирусных частиц в вакцинных препаратах должно составлять не менее 42±7 частиц на площади сканирования размером 1000×1000 нм2. Количество частиц во второй группе является показателем повреждений или разборки вирусных частиц, а также наличия примесных белков. Поскольку эта группа представляет собой гетерогенную смесь частиц, отличающихся по размерам и формам, и, кроме того, нередко агрегированных друг с другом, обсчет этой группы частиц проводили другим образом: С помощью программы "Grain analysis" исключали из обсчета популяцию целых вирусных частиц и подсчитывали процентное соотношение площади, которую занимала популяция вторых частиц к общей площади сканирования. Оптимальной считалось площадь, которую занимают разрушенные фрагменты вируса, не более 45±5%. По отношению компонентов каждой группы проводили предварительную оценку качества вакцины.Then carry out the analysis of the data. Based on the geometric dimensions, the particles are divided into two groups. The first corresponds to a population of mature fully formed viral particles. The second group combines all other images that correspond to various fragmentary fragments of viral particles. Count the number of components in the first group using the program "Grain analysis", conducting a quantitative analysis of images [13]. It is this group that is primarily immunologically active and determines the quality of the vaccine. Several series of vaccines were compared. All studied vaccines had a high titer of 10 -4 -10 -5 according to PCR, and the CTD50 was in the range 4.37-5.04 log0.5 [5]. According to the results of the analysis using SPM, it was shown that the number of whole viral particles in vaccine preparations should be at least 42 ± 7 particles in the scan area of 1000 × 1000 nm 2 . The number of particles in the second group is an indicator of damage or disassembly of viral particles, as well as the presence of impurity proteins. Since this group is a heterogeneous mixture of particles of different sizes and shapes, and, in addition, often aggregated with each other, the calculation of this group of particles was carried out in another way: Using the Grain analysis program, the population of whole virus particles was excluded from the calculation and counted percentage of the area occupied by the population of second particles to the total scanning area. The optimal area was considered, which is occupied by the destroyed fragments of the virus, not more than 45 ± 5%. In relation to the components of each group, a preliminary assessment of the quality of the vaccine was performed.
Данный способ оценки качества вакцин применим также и для других живых вирусных вакцин, например паротитной, краснушной, полиомиелитной и др. Зная параметры вирусных частиц, можно путем измерений СЗМ оценить наличие сформированных цельных частиц вирусов и разрушенных фрагментов вирусов. Далее, сопоставив информацию о биологической активности данной вакцины, полученную другими методами (определение ЦТД 50, ПЦР анализ и др.), можно выработать критерий оценки вакцины с помощью СЗМ.This method of evaluating the quality of vaccines is also applicable to other live viral vaccines, for example, mumps, rubella, polio, etc. Knowing the parameters of viral particles, it is possible to measure the presence of formed whole particles of viruses and destroyed virus fragments by SPM measurements. Further, by comparing the information on the biological activity of this vaccine obtained by other methods (determination of CTD 50, PCR analysis, etc.), it is possible to develop a criterion for evaluating the vaccine using SPM.
Существуют также варианты, в которых анализ качества вакцины осуществляют, как и в прототипе, с предварительной модификацией поверхности с созданием возможности ковалентной пришивки компонентов вакцины. Для этого используют вещества, которые создают на подложке слой вещества с активными группами. При внесении вакцины активные группы белков вирусных частиц связываются с активными группами на подложке и образуют прочные связи. Широко используемая методика химической модификации для стабилизации молекул на поверхности - это силанизация подложек [16]. Процесс силанизации существенно не изменяет топографических особенностей поверхности - она остается достаточно гладкой, в то же время улучшается связь макромолекулы с модифицированной подложкой. Процедура осуществляется следующим образом: образцы свежеочищенной слюды помещают в эксикатор в присутствии APTES (3-aminopropyl-triethoxysilane, FLUKA,) и DIPEA (N,N-Disopropylethylamine ACROS) и инкубируют в атмосфере аргона в течение 2 часов при комнатной температуре. При необходимости (если обнаружено значительная шероховатость, перепад высот) выравнивают слой APTES путем нагревания образцов при 120°С в течение часа. Для индукции активных связей обрабатывают силанизированные положки 1% глутаровым альдегидом в течение 15 минут при комнатной температуре и затем отмывают 3 раза деионизованной водой. Затем вносят исследуемый раствор в фосфатно-солевом буфере на 15 минут, при этом аминогруппы белковых молекул связываются с активными группами подложки, образуя ковалентные связи. Для ковалентной модификации можно использовать методы тиол-дисульфидного обмена, введения спейсерных остатков, более подробно описанных в работах [17].There are also options in which the analysis of the quality of the vaccine is carried out, as in the prototype, with a preliminary modification of the surface with the creation of the possibility of covalent sewing of the components of the vaccine. To do this, use substances that create a layer of a substance with active groups on the substrate. When a vaccine is introduced, the active groups of the proteins of the viral particles bind to the active groups on the substrate and form strong bonds. A widely used technique of chemical modification for stabilization of molecules on the surface is the silanization of substrates [16]. The process of silanization does not significantly change the topographic features of the surface — it remains fairly smooth, while the bond of the macromolecule with the modified substrate is improved. The procedure is as follows: freshly purified mica samples are placed in a desiccator in the presence of APTES (3-aminopropyl-triethoxysilane, FLUKA,) and DIPEA (N, N-Disopropylethylamine ACROS) and incubated in an argon atmosphere for 2 hours at room temperature. If necessary (if significant roughness, height difference) is detected, the APTES layer is leveled by heating the samples at 120 ° C for an hour. To induce active bonds, the silanized sites are treated with 1% glutaraldehyde for 15 minutes at room temperature and then washed 3 times with deionized water. Then, the test solution is added in phosphate-buffered saline for 15 minutes, while the amino groups of the protein molecules bind to the active groups of the substrate, forming covalent bonds. For covalent modification, thiol-disulfide exchange methods and the introduction of spacer residues, described in more detail in [17], can be used.
Возможна также модификация поверхности подложки, аналогично прототипу, поверхностно-активными гидрофобными веществами (ПАВ). В качестве ПАВ широко используют октодецил - аминофенилазобензосульфамид, который наслаивают на подложку методом формирования ленгмюровских пленок. Определенную дозу ПАВ растворяют в легколетучем растворителе (например, бензолгексане), впрыскивают смесь на водную поверхность, образуя разряженный мономолекулярный слой. Перенос пленки осуществляют обычно вертикальным способом (метод Ленгмюра-Блоджетт), пропуская подложку сквозь монослой, причем давление в пленке поддерживают постоянным путем сокращения площади пленки на водной поверхности подвижным барьером в процессе переноса монослоя. Более подробно указанный процесс описан в [18].It is also possible to modify the surface of the substrate, similar to the prototype, surface-active hydrophobic substances (surfactants). Octo-decyl-aminophenylazobenzosulfamide, which is layered on a substrate by the method of forming Langmuir films, is widely used as a surfactant. A certain dose of surfactant is dissolved in a volatile solvent (for example, benzenehexane), the mixture is injected onto the water surface, forming a discharged monomolecular layer. Film transfer is usually carried out in a vertical way (Langmuir-Blodgett method), passing the substrate through the monolayer, and the pressure in the film is kept constant by reducing the film area on the water surface by the moving barrier during the transfer of the monolayer. The specified process is described in more detail in [18].
Возможен вариант инкубации вакцины на подложке при повышенной температуре -37°С. Это достигается подогревом предметного столика СЗМ, на котором размещены подложки с биологическими объектами.A variant of the incubation of the vaccine on a substrate at an elevated temperature of -37 ° C is possible. This is achieved by heating the SPM stage, on which substrates with biological objects are placed.
Существует также вариант, в котором инкубация вакцины на подложке проводится при воздействии ультразвука путем возбуждения ультразвуковых колебаний пьезокерамическим элементом, сопряженным с измеряемым объектом [13].There is also an option in which the incubation of the vaccine on a substrate is carried out under the influence of ultrasound by exciting ultrasonic vibrations with a piezoceramic element coupled to the measured object [13].
Для проведения измерений можно использовать несколько режимов сканирующей зондовой микроскопии. Сканирование можно осуществлять в режиме атомно-силовой микроскопии с переменными полями сканирования, позволяющими более достоверно оценить количество компонентов второй группы. Осуществляется анализ следующим образом, при номинальном поле сканирования 1000×1000 нм2, проводят предварительное сканирование поля 5000×5000 нм2. С помощью программы "Grain analysis" определяют количество цельных вирусных частиц на поле 5000×5000 нм2, затем выделяют поля 1000×1000 нм2, содержащие минимальное количество вирусных частиц, и переходят к их сканированию. После сканирования подсчитывают по описанному выше алгоритму количество компонентов второй группы, а за количество компонентов первой группы принимают среднее количество частиц первой группы, подсчитанное на 5000×5000 нм2 и разделенное на 25 (число площадей 1000×1000 нм2 на площади 5000×5000 нм2).For measurements, you can use several modes of scanning probe microscopy. Scanning can be carried out in the atomic force microscopy mode with variable scanning fields, allowing more reliable estimation of the number of components of the second group. The analysis is carried out as follows, with a nominal scanning field of 1000 × 1000 nm 2 , a preliminary scanning of the field of 5000 × 5000 nm 2 is carried out. Using the program "Grain analysis" determine the number of whole virus particles in the field of 5000 × 5000 nm 2 , then select the field of 1000 × 1000 nm 2 containing the minimum number of viral particles, and proceed to scan them. After scanning, the number of components of the second group is calculated according to the above-described algorithm, and the average number of particles of the first group, calculated by 5000 × 5000 nm 2 and divided by 25 (the number of areas 1000 × 1000 nm 2 on the area 5000 × 5000 nm, is taken as the number of components of the first group 2 ).
Туннельный режим сканирования может отличаться от прототипа тем, что после фиксации компонентов вакцины на поверхности подложки производят ее сушку, покрытие несколькими слоями проводящего материала и последовательное сканирование в режиме туннельной микроскопии. Оптимальным режимом подготовки нанесенных на подложку вируссодержащих препаратов для наблюдения является покрытие препаратов пленкой электропроводящего материала (например, вольфрама, углерода или золота), придающей поверхности препаратов жесткость и электропроводность. Данная процедура позволяет скрыть мелкие фрагменты (привнесенную примесь) при покрытии первой пленкой и фрагменты вирусов при покрытии второй пленкой. После первого покрытия можно считать вирусы и фрагменты их деления, а после второго только вирусы.The tunnel scanning mode may differ from the prototype in that after fixing the vaccine components on the surface of the substrate, it is dried, coated with several layers of conductive material and sequential scanning in tunnel microscopy mode. The optimal mode of preparation of virus-containing preparations deposited on a substrate for observation is coating the preparations with a film of electrically conductive material (for example, tungsten, carbon or gold), which gives the surface of the preparations rigidity and electrical conductivity. This procedure allows you to hide small fragments (introduced impurity) when coated with a first film and virus fragments when coated with a second film. After the first coating, viruses and fragments of their division can be considered, and after the second, only viruses.
Возможно, также после фиксации компонентов вакцины на поверхности подложки покрыть ее фотоактивным материалом и сканировать в режиме близкопольной оптической, микроскопии (БОМ). В качестве фотоактивных агентов можно использовать ряд флуоресцентных красителей: флуоресцеин 5 изотиоцианат (ФИТЦ), фикоэритрин, техасский красный, цианин 5.1. Они возбуждаются аргоновым лазером с длинной волны 488 нм, а излучают флуоресценцию в разных диапазонах волн: ФИТЦ - в зеленом, фикоэритрин - желто-оранжевом, техасский красный - красном, цианин 5.1-фиолетовом. Концентрацию веществ для обработки вакцины необходимо подбирать экспериментально по отношению полезного сигнала (связывания вирусного материала с красителем) к фоновому сигналу (неспецифическая окраска поверхности подложки). Селективность измерений в режиме БОМ можно существенно повысить, используя фотоактивные красители, аффинно взаимодействующие с компонентами вакцины. В качестве аффинных маркеров можно использовать конъюгаты антител с флуоресцентными красителями. Целесообразно использовать антитела к поверхностным белкам вируса кори: F-белку, Н-белку. В качестве маркеров, селективно связывающих с генетическим материалом вируса, можно использовать бромистый этидий.It is also possible, after fixing the components of the vaccine on the surface of the substrate, to cover it with photoactive material and scan it in near field optical microscopy (BOM). A number of fluorescent dyes can be used as photoactive agents: fluorescein 5 isothiocyanate (FITC), phycoerythrin, Texas red, cyanine 5.1. They are excited by an argon laser with a wavelength of 488 nm, and emit fluorescence in different wavelength ranges: FITC - in green, phycoerythrin - yellow-orange, Texas red - red, cyanine 5.1-violet. The concentration of substances for treating the vaccine must be selected experimentally with respect to the ratio of the useful signal (binding of the viral material to a dye) to the background signal (non-specific coloring of the surface of the substrate). The selectivity of measurements in the BOM mode can be significantly increased using photoactive dyes that affinity interact with the components of the vaccine. Conjugates of antibodies with fluorescent dyes can be used as affinity markers. It is advisable to use antibodies to surface proteins of measles virus: F-protein, H-protein. Ethidium bromide can be used as markers that selectively bind to the genetic material of the virus.
Все вышеописанные методы оценки качества вакцин основывались на морфологических критериях, а именно на разнице в размерах, которые меняются в зависимости от степени «деградированности» вирусного материала в пробе вакцины. Преимущество использования зондовой сканирующей микроскопии в том, что помимо топографии образца, имеется возможность проводить измерения механических свойств образца за счет воздействия сканирующей иглой на образец. В зависимости от плотности упаковки вирусных частиц механические свойства частиц могут изменяться. Вирусная частица, как правило, представляет собой генетический материал, заключенный в защитный нуклеокапсид, окруженный в свою очередь внешней оболочкой. Наиболее плотными являются полностью сформированные «зрелые» вирусные частицы. В результате производства вирусных вакцин возможно нарушение целостности частиц и соответственно изменение их механических свойств. Таким образом, определяя механические свойства компонентов вакцины, можно проводить оценку качества вакцины. Режимы измерения твердости, измерения модуля Юнга, режимы трения и усилия сдвига компонентов вакцины на поверхности подложки проводят с использованием стандартных режимов зондовой микроскопии [19-22].All of the above methods for assessing the quality of vaccines were based on morphological criteria, namely, the difference in size, which varies depending on the degree of "degradation" of the viral material in the vaccine sample. The advantage of using probe scanning microscopy is that in addition to the topography of the sample, it is possible to measure the mechanical properties of the sample by exposing the sample to a scanning needle. Depending on the packing density of the viral particles, the mechanical properties of the particles may vary. A viral particle, as a rule, is a genetic material enclosed in a protective nucleocapsid, surrounded in turn by an outer shell. The most dense are fully formed "mature" viral particles. As a result of the production of viral vaccines, a violation of the integrity of the particles and, accordingly, a change in their mechanical properties is possible. Thus, determining the mechanical properties of the components of the vaccine, it is possible to assess the quality of the vaccine. Modes of measuring hardness, measuring Young's modulus, friction and shear forces of the vaccine components on the surface of the substrate are carried out using standard probe microscopy modes [19-22].
Предлагаемый патентом способ оценки позволяет быстро и эффективно определять наличие сформированных вирусных частиц в вакцинных препаратах и может быть рекомендован для использования в качестве дополнительной процедуры при прохождении стандартных мероприятий по оценке качестве живых вакцин. Целесообразно использовать для проверки методом СЗМ вакцинный препарат на стадии, предшествующей проверке биологической активности. Это будет способствовать значительной экономии, поскольку позволяет избежать дорогостоящих этапов производства вакцины. Дополнительными аспектами применения данного патента могут быть проверки качества вакцины не только во время производства, но и при длительном хранении. Отличительной особенностью живых вакцин является то, что они легкочувствительны к действию высоких температур и требуют неукоснительного соблюдения холодовой цепи. При неправильном хранении может происходить деградация иммунологического активного материала.The evaluation method proposed by the patent makes it possible to quickly and efficiently determine the presence of formed virus particles in vaccine preparations and can be recommended for use as an additional procedure in standard procedures for assessing the quality of live vaccines. It is advisable to use a vaccine preparation for SPM testing at the stage preceding the verification of biological activity. This will contribute to significant savings because it avoids the expensive stages of vaccine production. Additional aspects of the application of this patent may be checking the quality of the vaccine, not only during production, but also during long-term storage. A distinctive feature of live vaccines is that they are readily sensitive to high temperatures and require strict adherence to the cold chain. If stored improperly, degradation of the immunological active material may occur.
Кратковременная инкубация и сорбция с сохранением нативной структуры компонентов вакцины за счет повышенного сохранения компонентов вакцины повышает достоверность оценки качества вакцины.Short-term incubation and sorption with the preservation of the native structure of the vaccine components due to the increased preservation of the vaccine components increases the reliability of evaluating the quality of the vaccine.
Инкубация вакцины при повышенной температуре повышает скорость движения компонентов вакцины в инкубационной смеси, способствует сокращению времени инкубации вирусных частиц на подложку, повышает вероятность инкубации и достоверность измерений.Incubation of the vaccine at elevated temperature increases the speed of movement of the components of the vaccine in the incubation mixture, helps to reduce the time of incubation of viral particles on the substrate, increases the likelihood of incubation and the reliability of measurements.
Обработка ультразвуком вакцины позволяет избавляться от агрегатов вирусных частиц, которые могут образовываться при приготовлении вакцины. Такие агрегаты, содержащие вирусные частицы и их фрагменты, на подложке выглядят как слившиеся частицы большого размера и это делает невозможным визуализацию отдельных частиц. Таким образом, обработка ультразвуком при инкубации вакцины на подложке в значительной степени влияет на качество получаемого препарата для анализа частиц, пригодного для анализа, и повышает достоверность полученных данных.Ultrasonic treatment of the vaccine allows you to get rid of the aggregates of viral particles that can form during the preparation of the vaccine. Such aggregates containing viral particles and their fragments on the substrate look like coalesced large particles and this makes it impossible to visualize individual particles. Thus, the ultrasonic treatment during incubation of the vaccine on the substrate significantly affects the quality of the obtained preparation for analysis of particles suitable for analysis, and increases the reliability of the data.
Использование режима АСМ будет отличаться от прототипа использованием различных полей, что позволяет проводить измерения мелких фрагментов на полях с минимальным количеством крупных частиц (вирусов). Это также повышает достоверность полученных данных.The use of the AFM mode will differ from the prototype in the use of various fields, which allows the measurement of small fragments in the fields with a minimum number of large particles (viruses). It also increases the reliability of the data.
Использование проводящих покрытий позволяет исследовать в туннельном режиме крупные структуры, исключая мелкие структуры и привнесенную примесь. Это достигается за счет сравнивания мелких объектов под слоем проводящего материала, что невозможно в прототипе, в котором размеры исследуемых частиц на порядок ниже и соответственно более толстое покрытие будет скрывать мелкие фрагменты. Кроме того, покрытие слоем проводящего материала придает дополнительную жесткость и позволяет избежать возможной деформации биомолекул, которая может проходить в результате взаимодействия образца с острием.The use of conductive coatings allows the study of large structures in a tunneling mode, excluding small structures and introduced impurity. This is achieved by comparing small objects under a layer of conductive material, which is not possible in the prototype, in which the dimensions of the particles under study are an order of magnitude lower and, accordingly, a thicker coating will hide small fragments. In addition, coating with a layer of conductive material gives additional rigidity and avoids the possible deformation of biomolecules, which can occur as a result of the interaction of the sample with the tip.
Использование режима БОМ за счет возможности исследования плоских объектов повышает достоверность и чувствительность измерений. Более того, с использованием селективных флуоресцентных красителей можно проводить количественные измерения определенных вирусных белков, генетического материала вирусов.Using the BOM mode due to the possibility of studying flat objects increases the reliability and sensitivity of measurements. Moreover, using selective fluorescent dyes, it is possible to carry out quantitative measurements of certain viral proteins, the genetic material of viruses.
Режимы измерения твердости, измерения модуля Юнга, силы трения и усилия сдвига позволяют распознавать среди частиц с размерами вирусов привнесенную примесь, повышая при этом достоверность измерений.Modes of measuring hardness, measuring Young's modulus, frictional forces, and shear forces make it possible to recognize an introduced impurity among particles with the size of viruses, while increasing the reliability of measurements.
ЛИТЕРАТУРАLITERATURE
1. Н.В.Медуницын, "Вакцинология". - М.: Триада, 1998.1. N.V. Medunitsyn, "Vaccinology." - M .: Triad, 1998.
2. Роит «Иммунология». - Мир, 2000.2. Roy "Immunology." - World, 2000.
3. Постановление от 18 апреля 2003 г. №60 Министерства Здравоохранения Российской Федерации // О введении в действие санитарно-эпидемиологических правил СП 3.3.2.1288-033. Decree of April 18, 2003 No. 60 of the Ministry of Health of the Russian Federation // On the enactment of the sanitary and epidemiological rules of SP 3.3.2.1288-03
4. Пшеничнов В.А., Б.Ф.Семенов, Е.Г.Зезеров. В кн.: Стандартизация методов вирусологических исследований. - М.: Медицина, 1974, 123-1284. Pshenichnov V. A., B. F. Semenov, E. G. Zezerov. In: Standardization of Methods of Virological Research. - M .: Medicine, 1974, 123-128
5. Зайцев И.З, Колышкин В.М., Юминова Н.В., Ведяков А.М., Потехин О.Е., Сидоренко Е.С., Тоневицкий А.Г. // Детекция РНК вируса кори в образцах коревой вакцины методом полимеразной цепной реакции. // Биотехнология, 2001, 1, С.76-82.5. Zaitsev I.Z., Kolyshkin V.M., Yuminova N.V., Vedyakov A.M., Potekhin O.E., Sidorenko E.S., Tonevitsky A.G. // Detection of measles virus RNA in measles vaccine samples by polymerase chain reaction. // Biotechnology, 2001, 1, P.76-82.
6. Chiu W., Baker M.L., Jiang W., Dougherty M., Schmid M.F. // Electron cryomicroscopy of biological machines at subnanometer resolution. // Structure (Camb). 2005 Mar; 13(3): 363-72. Review.6. Chiu W., Baker M.L., Jiang W., Dougherty M., Schmid M.F. // Electron cryomicroscopy of biological machines at subnanometer resolution. // Structure (Camb). 2005 Mar; 13 (3): 363-72. Review
7. Chiu W., Rixon FJ. // High resolution structural studies of complex icosahedral viruses: a brief overview. // Virus Res. 2002, Jan, 30; 82(1-2): 9-17.7. Chiu W., Rixon FJ. // High resolution structural studies of complex icosahedral viruses: a brief overview. // Virus Res. 2002 Jan 30; 82 (1-2): 9-17.
8. Положительное решение по заявке №2003121587 от 16.07.03 на патент «Способ детекции токсичных белков на основе сканирующей зондовой микроскопии»8. A positive decision on the application No. 2003121587 of July 16, 2003 for the patent “Method for the detection of toxic proteins based on scanning probe microscopy”
9. http://www.bio.ru/vcor.htm.9.http: //www.bio.ru/vcor.htm.
10. В.А. Быков и др. // Зондовая сканирующая микроскопия для биологии и медицины // Сенсорные системы, 1998 т.12, стр.99-121.10. V.A. Bykov et al. // Probe Scanning Microscopy for Biology and Medicine // Sensory Systems, 1998 vol. 12, pp. 99-121.
11. А.И.Данилов // Сканирующая туннельная и атомно-силовая микроскопия в электрохимии поверхности. // Успехи химии, 1995, т.64, стр.818-83311. A.I. Danilov // Scanning tunneling and atomic force microscopy in surface electrochemistry. // Advances in Chemistry, 1995, vol. 64, pp. 818-833
12. патент RU 2210818 от 20.08.03.12. patent RU 2210818 from 08.20.03.
13. http://www.ntmdt.ru.13. http://www.ntmdt.ru.
14. Maliuchenko N.V., Agapov I.I., Tonevitskii A.G., Moisenovich M.M., Savvateev M.N., Tonevitskii E.A., Bykov V.A., Kirpichnikov M.P.. // Detection of immune complexes using atomic force microscopy. // Biofizika. 2004 Nov-Dec; 49(6): 1008-14. Russian.14. Maliuchenko N.V., Agapov I.I., Tonevitskii A.G., Moisenovich M.M., Savvateev M.N., Tonevitskii E.A., Bykov V.A., Kirpichnikov M.P. // Detection of immune compounds using atomic force microscopy. // Biofizika. 2004 Nov-Dec; 49 (6): 1008-14. Russian
15. С.Гланц // Медико-биологическая статистика. // М.: Практика, 1999.15. S. Glants // Biomedical statistics. // M .: Practice, 1999.
16. Hu, М.Wang, H.-U.G.Weier, P.Frantz, W.Kolbe, D.F.Ogletree and M.Salmeron, Imaging of single extended DNA molecules on flat (aminopropyl)triethoxysilanemica by atomic force microscopy. // Langmuir, - 1996, - v.12, - No 7, - pp.1697-1700.16. Hu, M. Wang, H.-U. G. Weier, P. Franz, W. Kolbe, D. F. Ogletree and M. Salmeron, Imaging of single extended DNA molecules on flat (aminopropyl) triethoxysilanemica by atomic force microscopy. // Langmuir, - 1996, - v.12, - No 7, - pp. 1697-1700.
17. E.Pavlovic // Spatially Controlled Covalent Immobilization of Biomolecules on Silicon Surfaces. // Comprehensive Summaries of Uppsala Dissertations from the Faculty of Science and Technology, ISSN 1104-232X; 867.17. E. Pavlovic // Spatially Controlled Covalent Immobilization of Biomolecules on Silicon Surfaces. // Comprehensive Summaries of Uppsala Dissertations from the Faculty of Science and Technology, ISSN 1104-232X; 867.
18. Блинов Л.М. Успехи химии, 1983, 52, 1263.18. Blinov L.M. Advances in Chemistry, 1983, 52, 1263.
19. Jandt K.D. // Atomic Force Microscopy of Biomaterials Surfaces and Interfaces // Surface Science, Volume 491, Issue 3, 1 October 2001, p 303-33219. Jandt K.D. // Atomic Force Microscopy of Biomaterials Surfaces and Interfaces // Surface Science, Volume 491, Issue 3, 1 October 2001, p 303-332
20. Caron A.; Rabe U.; Reinsädtler M.; Turner J.; Arnold W. // Imaging using lateral bending modes of atomic force microscope cantilevers. // Applied physics letters 85 (2004), Nr.26, P.6398-640020. Caron A .; Rabe U .; Reinsädtler M .; Turner J .; Arnold W. // Imaging using lateral bending modes of atomic force microscope cantilevers. // Applied physics letters 85 (2004), Nr. 26, P.6398-6400
21. Reinstaedtler M.; Rabe U.; Scherer V.; Hartmann U.; Goldade A.; Bhushan В.; Arnold, W. // On the nanoscale measurement of friction using atomic-force microscope cantilever torsional resonances // Applied physics letters 82 (2003), Nr.16, S.2604-2606.21. Reinstaedtler M .; Rabe U .; Scherer V .; Hartmann U .; Goldade A .; Bhushan B .; Arnold, W. // On the nanoscale measurement of friction using atomic-force microscope cantilever torsional resonances // Applied physics letters 82 (2003), Nr. 16, S.2604-2606.
22. Rabe U.; Amelio S.; Kopycinska M.; Hirsekom S.; Kempf M.; Güken M.; Arnold W., // Imaging and measurement of local mechanical material properties by atomic force acoustic microscopy. // Surface and Interface Analysis 33 (2002), p.65-70.22. Rabe U .; Amelio S .; Kopycinska M .; Hirsekom S .; Kempf M .; Güken M .; Arnold W., // Imaging and measurement of local mechanical material properties by atomic force acoustic microscopy. // Surface and Interface Analysis 33 (2002), p. 65-70.
Claims (10)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2005133587/15A RU2339036C2 (en) | 2005-11-01 | 2005-11-01 | Method of estimation of vaccine quality |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2005133587/15A RU2339036C2 (en) | 2005-11-01 | 2005-11-01 | Method of estimation of vaccine quality |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2005133587A RU2005133587A (en) | 2007-05-10 |
| RU2339036C2 true RU2339036C2 (en) | 2008-11-20 |
Family
ID=38107641
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2005133587/15A RU2339036C2 (en) | 2005-11-01 | 2005-11-01 | Method of estimation of vaccine quality |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2339036C2 (en) |
-
2005
- 2005-11-01 RU RU2005133587/15A patent/RU2339036C2/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ГОРДОН А. и др. Вакцины, вакцинация и иммунный ответ. - М.: Медицина 2002, с.13-16. JONES С. NMR assays for carbohydrate-based vaccines. J. Pharm. Biomed. Anal. 2005, Aug, 38(5), p.840-850, Epub. 2005, Apr. 13, PMID: 16087046, реф., [он-лайн], [найдено 05.07.2006], найдено из базы данных PubMed. ANDRE F.E. Development and clinical application of new polyvalent combined paediatric vaccines. 1999, 17(13-14), p.1620-1627, PMID: 10194814, реф., [он-лайн], [найдено 05.07.2006], найдено из базы данных PubMed. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2005133587A (en) | 2007-05-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6897015B2 (en) | Device and method of use for detection and characterization of pathogens and biological materials | |
| US20230103369A1 (en) | The use of molecularly imprinted polymers for the rapid detection of emerging viral outbreaks | |
| Qi et al. | Detection of avian influenza virus subtype H5 using a biosensor based on imaging ellipsometry | |
| Hassanzadeh | Nanotheranostics against COVID-19: From multivalent to immune-targeted materials | |
| JP2006349690A (en) | Broad specificity affinity array, and qualitative approach to complex sample discrimination | |
| Zheng et al. | A rapid blood test to determine the active status and duration of acute viral infection | |
| Hussein et al. | Designing and fabrication of new VIP biosensor for the rapid and selective detection of foot-and-mouth disease virus (FMDV) | |
| US9034638B2 (en) | Arrayed detector system for measurement of anti-viral immune response | |
| Klangprapan et al. | Sensing the classical swine fever virus with molecularly imprinted polymer on quartz crystal microbalance | |
| Gupta et al. | Epitope imprinting of iron binding protein of Neisseria meningitidis bacteria through multiple monomers imprinting approach | |
| Li et al. | Versatile nanorobot hand biosensor for specific capture and ultrasensitive quantification of viral nanoparticles | |
| RU2339036C2 (en) | Method of estimation of vaccine quality | |
| JP2020500307A (en) | Ultrasonic detection of virus and virus-like particles | |
| JP2020523554A (en) | Method for detecting biotherapeutic substance aggregates in a sample | |
| CN109337894B (en) | Preparation method of yeast functional microspheres and application of yeast functional microspheres in immunoassay | |
| Rafique et al. | Ellipsometric-based novel DNA biosensor for label-free, real-time detection of Bordetella parapertussis | |
| Ivanov et al. | Atomic force microscopy detection of serological markers of viral hepatites B and C | |
| BR102013033868B1 (en) | FUNCTIONALIZED GOLD NANOROBES, USE AND KIT FOR IMMUNODIAGNOSIS OF DENGUE | |
| RU2267787C2 (en) | Method for detecting toxic proteins by means of scanning probe microscope investigation | |
| RU2649763C1 (en) | Method for rendering influenza virus | |
| RU168546U1 (en) | Macromolecule Registration Device for Medical Diagnostics | |
| US20230098149A1 (en) | Methods for detecting neutralizing antibodies | |
| Prilutskiy et al. | Evaluation of Efficiency of SPR-Based Biosensor and ZnO Photoluminescent Biosensor ib the Anlysys of Biogenic Polyamines | |
| Morozov et al. | Ultrafiltration membrane for electrophoretic capturing of pathogens for AFM imaging | |
| Idil et al. | Molecular imprinting on the nanoscale rapid detection of cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20081102 |