RU2332449C2 - Method of extraction halophylic and halotolerant heterotrophic flagellates - Google Patents
Method of extraction halophylic and halotolerant heterotrophic flagellates Download PDFInfo
- Publication number
- RU2332449C2 RU2332449C2 RU2006143505/13A RU2006143505A RU2332449C2 RU 2332449 C2 RU2332449 C2 RU 2332449C2 RU 2006143505/13 A RU2006143505/13 A RU 2006143505/13A RU 2006143505 A RU2006143505 A RU 2006143505A RU 2332449 C2 RU2332449 C2 RU 2332449C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- halotolerant
- halophilic
- flagellates
- heterotrophic
- water
- Prior art date
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к микробиологии, в частности к выделению галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев из водоемов с различной минерализацией, и может быть использовано при проведении цитологических, физиолого-биохимических и генетических исследований.The invention relates to microbiology, in particular to the isolation of halophilic and halotolerant heterotrophic flagellates from reservoirs with different salinity, and can be used in cytological, physiological, biochemical and genetic studies.
Предварительное наращивание биомассы галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев является необходимым этапом в изучении их видового состава в природных водоемах и для получения культуры, так как некоторые виды галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев, присутствующие в незначительном количестве в пробе, могут быть не учтены при микроскопическом исследовании.The preliminary increase in the biomass of halophilic and halotolerant heterotrophic flagellates is a necessary step in studying their species composition in natural reservoirs and for obtaining culture, since some types of halophilic and halotolerant heterotrophic flagellates, which are present in small quantities in the sample, may not be taken into account during microscopic examination.
Разработаны и активно используются способы выделения пресноводных гетеротрофных жгутиконосцев. Они основаны на добавлении в пробы воды синтетических сред (Пратта, Лозина-Лозинского и др.), создающих благоприятные условия для размножения гетеротрофных жгутиконосцев с дополнительным внесением бактерий определенных видов в качестве «подкормки» [Жуков Б.Ф. Атлас пресноводных гетеротрофных жгутиконосцев (биология, экология, систематика). - Рыбинск, 1993. - 160 с.].Methods of isolating freshwater heterotrophic flagellates have been developed and are actively used. They are based on the addition of synthetic media (Pratt, Lozin-Lozinsky, etc.) to water samples that create favorable conditions for the propagation of heterotrophic flagellates with the addition of certain species of bacteria as a “top dressing” [Zhukov B.F. Atlas of freshwater heterotrophic flagellates (biology, ecology, systematics). - Rybinsk, 1993. - 160 p.].
Однако применение этих способов для изучения галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев соленых водоемов ограничивается определенными трудностями: гибель негалотолерантных бактерий в условиях повышенной солености делает «подкормку» неэффективной; добавление синтетических сред приводит к значительному опреснению исходной пробы воды, что создает неблагоприятные условия для галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев, приспособленных к повышенной минерализации; скорость наращивания биомассы галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев в таких условиях очень низкая, что делает исследование довольно длительным.However, the use of these methods for the study of halophilic and halotolerant heterotrophic flagellates of salt ponds is limited by certain difficulties: the death of non-galotolerant bacteria under conditions of increased salinity makes "feeding" ineffective; the addition of synthetic media leads to a significant desalination of the initial water sample, which creates unfavorable conditions for halophilic and halotolerant heterotrophic flagellates adapted for increased mineralization; the rate of biomass growth of halophilic and halotolerant heterotrophic flagellates under such conditions is very low, which makes the study quite long.
Известен способ выделения и культивирования пресноводных и морских гетеротрофных жгутиконосцев на предварительно профильтрованной и стерилизованной природной воде [Cowling A.J. Free-living heterotrophic flagellates: methods of isolation and maintenance, including sources of strains in culture // The Biology of Free-living Heterotrophic Flagellates. (Ed.) Patterson D.J., Larsen J. - Oxford, 1991. - p.477-492].A known method of isolation and cultivation of freshwater and marine heterotrophic flagellates on pre-filtered and sterilized natural water [Cowling A.J. Free-living heterotrophic flagellates: methods of isolation and maintenance, including sources of strains in culture // The Biology of Free-living Heterotrophic Flagellates. (Ed.) Patterson D.J., Larsen J. - Oxford, 1991. - p. 477-492].
Известный способ имеет ряд существенных недостатков, связанных с трудоемким многоэтапным методом предварительной подготовки: отбор воды, фильтрация через мембранный фильтр, автоклавирование. При большом количестве исследуемых водоемов с различной степенью минерализации этот способ значительно увеличивает количество применяемых вариантов сред и пролонгирует исследование. Другим значительным недостатком является непостоянство химического состава природной воды, который изменяется в зависимости от сезона года. Кроме того, этот способ не рассчитан на выделение гетеротрофных жгутиконосцев из местообитаний с экстремальной соленостью. Скорость размножения галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев в воде высокоминерализованных водоемов довольно низка, что затрудняет получение большого выхода их биомассы.The known method has a number of significant disadvantages associated with the laborious multi-stage method of preliminary preparation: water withdrawal, filtration through a membrane filter, autoclaving. With a large number of studied reservoirs with varying degrees of mineralization, this method significantly increases the number of applied media options and prolongs the study. Another significant drawback is the inconstancy of the chemical composition of natural water, which varies depending on the season of the year. In addition, this method is not designed to isolate heterotrophic flagellates from habitats with extreme salinity. The rate of propagation of halophilic and halotolerant heterotrophic flagellates in the water of highly mineralized reservoirs is rather low, which makes it difficult to obtain a large yield of their biomass.
Наиболее близким к заявляемому способу по назначению и совокупности существенных признаков является способ выделения и культивирования морских слабогалофильных жгутиконосцев с использованием среды Шмальца-Пратта: NaCl - 28,15 г; KCl - 0,67 г; MgCl2×6H2O - 5,51 г; MgSO4×7H2O - 6,92 г; CaCl2×6Н2O - 1,45 г; KNO3 - 0,025 г; К2HPO4 - 0,013 г, дистиллированной воды до 1000 мл. Минерализация среды равна 36‰. Среду разливают в чашки Петри и вносят образцы концентрированной или неконцентрированной воды из исследуемых водоемов. Для питания гетеротрофных жгутиконосцев необходимо добавлять какую-либо культуру живых или мертвых бактерий из видов Escherichia coli, Aerobacter aerogenes, Corynebacterium sp., Mycobacterium sp., Arthrobacter sp., Pseudomonas fluorescens и др. в зависимости от вида. Разные виды гетеротрофных жгутиконосцев имеют пищевые предпочтения по отношению к различным видам бактерий. Культивирование жгутиконосцев проводят при 25-28°С. Для контроля видового состава и состояния жгутиконосцев проводят микроскопическое исследование с использованием водной иммерсии и фазового контраста в динамике. Чистые культуры гетеротрофных жгутиконосцев получают с помощью микроманипулятора с микропипеткой. Полученные чистые культуры в дальнейшем культивируют на свежей среде Шмальца-Пратта с подкормкой определенным видом бактерий [Жуков Б.Ф., Мыльников А.П. Культивирование свободноживущих бесцветных жгутиконосцев из сооружений биологической очистки. // Протозоология. - Л.: Наука, 1983. Вып.8. - С.142-152] (прототип).Closest to the claimed method for the purpose and combination of essential features is a method for the isolation and cultivation of marine weakly halophilic flagellates using Schmalz-Pratt medium: NaCl - 28.15 g; KCl - 0.67 g; MgCl 2 × 6H 2 O — 5.51 g; MgSO 4 × 7H 2 O - 6.92 g; CaCl 2 × 6H 2 O — 1.45 g; KNO 3 - 0.025 g; To 2 HPO 4 - 0.013 g, distilled water up to 1000 ml. The mineralization of the medium is 36 ‰. The medium is poured into Petri dishes and samples of concentrated or non-concentrated water from the studied reservoirs are introduced. To feed heterotrophic flagellates, it is necessary to add some culture of live or dead bacteria from the species Escherichia coli, Aerobacter aerogenes, Corynebacterium sp., Mycobacterium sp., Arthrobacter sp., Pseudomonas fluorescens, etc., depending on the species. Different types of heterotrophic flagellates have food preferences for different types of bacteria. Cultivation of flagellates is carried out at 25-28 ° C. To control the species composition and condition of flagellates, a microscopic examination is carried out using water immersion and phase contrast in dynamics. Pure cultures of heterotrophic flagellates are obtained using a micromanipulator with a micropipette. The resulting pure cultures are further cultivated on fresh Schmalz-Pratt medium with top dressing with a specific type of bacteria [Zhukov B.F., Mylnikov A.P. Cultivation of free-living colorless flagella from biological treatment facilities. // Protozoology. - L .: Nauka, 1983. Issue 8. - S.142-152] (prototype).
Недостатком прототипа, на взгляд авторов, является то, что минерализация среды Шмальца-Пратта равна 36‰, что в 2-10 раз ниже, чем минерализация многих континентальных водоемов с повышенным содержанием солей. Поэтому на среде Шмальца-Пратта развиваются только слабогалофильные и галотолерантные виды гетеротрофных жгутиконосцев, адаптированные к морской среде (Cafeteria roenbergensis, Cafeteria marsupialis, Monosiga ovata, Pendulomonas adriperis, Bodo designis и др.), которые зачастую не являются доминирующими в галофильном биоценозе. В то же время представители галофильных видов (Pleurostomum salinum, Pleurostomum turgidum, Palustrimonas yorkeensis и др.) погибают на среде Шмальца-Пратта в связи с их неприспособленностью к низкой минерализации. Это объясняется узким диапазоном их галотолерантности, не соответствующим минерализации среды Шмальца-Пратта.The disadvantage of the prototype, in the opinion of the authors, is that the mineralization of the Schmalz-Pratt environment is 36 ‰, which is 2-10 times lower than the mineralization of many continental reservoirs with a high salt content. Therefore, only weakly halophilic and halotolerant species of heterotrophic flagellates adapted to the marine environment (Cafeteria roenbergensis, Cafeteria marsupialis, Monosiga ovata, Pendulomonas adriperis, Bodo designis and others) develop in Schmalz-Pratt environment, which are often not dominant. At the same time, representatives of halophilic species (Pleurostomum salinum, Pleurostomum turgidum, Palustrimonas yorkeensis, etc.) die on the Schmalz-Pratt environment due to their inability to low mineralization. This is explained by the narrow range of their halotolerance, which does not correspond to the mineralization of the Schmalz-Pratt environment.
Также недостатком данного способа является то, что для длительного культивирования галофильных и гетеротрофных жгутиконосцев их необходимо регулярно подкармливать, так как бактерии быстро «выедаются» галофильными и галотолерантными гетеротрофными жгутиконосцами. А обычно используемые для подкормки бактерии не являются характерными для микрофлоры соленых водоемов и поэтому практически не размножаются. А многие галофильные и галотолерантные гетеротрофные жгутиконосцы, в свою очередь, не приспособлены употреблять их в пищу.Another disadvantage of this method is that for long-term cultivation of halophilic and heterotrophic flagellates, they need to be fed regularly, since bacteria are quickly "eaten up" by halophilic and halotolerant heterotrophic flagella. And the bacteria usually used for feeding are not characteristic of the microflora of salt bodies of water and therefore practically do not multiply. And many halophilic and halotolerant heterotrophic flagellates, in turn, are not adapted to eat them.
Технический результат, на достижение которого направлено изобретение, заключается в сокращении трудоемкости и повышении эффективности выделения из планктонных и бентосных проб минерализованных водоемов галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев, что выражается в увеличении количества обнаруживаемых видов в пробе и в возрастании скорости их размножения.The technical result to which the invention is directed is to reduce the complexity and increase the efficiency of isolating halophilic and halotolerant heterotrophic flagellates from planktonic and benthic samples of mineralized water bodies, which is expressed in an increase in the number of detected species in the sample and in an increase in the rate of their reproduction.
Для достижения названного технического результата в заявляемом способе осуществляют подготовку питательной среды, содержащей NaCl, MgSO4×7H2O, KCl, CaCl2×2Н2O, KNO3, К2НРО4×3Н2O, автолизат дрожжей и дистиллированную воду при следующем содержании компонентов, г/л:To achieve the technical result in the present method, a nutrient medium containing NaCl, MgSO 4 × 7H 2 O, KCl, CaCl 2 × 2H 2 O, KNO 3 , K 2 NRA 4 × 3H 2 O, yeast autolysate and distilled water is prepared at the following components, g / l:
Дистиллированная вода до 1,0 л, внесение в нее исследуемой пробы бентоса или воды, инкубацию проб, выделение чистой культуры жгутиконосцев с последующим, в случае необходимости, культивированием на среде того же состава и периодическим пересевом чистой культуры.Distilled water up to 1.0 l, making a test sample of benthos or water in it, incubating the samples, isolating a pure culture of flagellates, followed by, if necessary, culturing in an environment of the same composition and periodic reseeding of pure culture.
В предлагаемом способе в качестве основы питательной среды используются осмотически активные соли: хлорид натрия, сульфат магния, хлорид калия и хлорид кальция, входящие в состав наиболее широко используемых сред для галофильных микроорганизмов [Масюк Н.П. Морфология, систематика, экология, географическое распространение рода Dunaliella Teod. и перспективы его практического использования. - Киев: Наукова думка, 1973. - 244 с]. В результате минерализация среды, составляющая 68‰, является оптимальной для большинства умеренно галофильных видов микроорганизмов, обитающих при 3-15% содержания солей, и галотолерантных видов, устойчивых к широкому диапазону солености. Используются простые доступные соли MgSO4×7H2O, KNO3, К2НРО4×3Н2O, которые обычно входят в состав минеральных сред и являются источником биогенных элементов.In the proposed method, osmotically active salts are used as the basis of the nutrient medium: sodium chloride, magnesium sulfate, potassium chloride and calcium chloride, which are part of the most widely used media for halophilic microorganisms [N. Masyuk Morphology, systematics, ecology, geographical distribution of the genus Dunaliella Teod. and prospects for its practical use. - Kiev: Naukova Dumka, 1973. - 244]. As a result, a mineralization of 68 ‰ is optimal for most moderately halophilic species of microorganisms living at 3-15% salt content and halotolerant species that are resistant to a wide range of salinity. Simple available salts are used: MgSO 4 × 7H 2 O, KNO 3 , K 2 НРО 4 × 3Н 2 O, which are usually part of mineral media and are a source of nutrients.
Автолизат дрожжей вносится при приготовлении среды в количестве 1,5 г на 1 л жидкой среды. Автолизат дрожжей является основным питательным субстратом, содержит азотистые вещества и ряд ферментов, обеспечивает интенсивный рост бактерий [Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. / Под ред. М.О.Биргера. - М.: Медицина, 1982. - 464 с.].The yeast autolysate is introduced in the preparation of the medium in an amount of 1.5 g per 1 liter of liquid medium. The yeast autolysate is the main nutrient substrate, contains nitrogenous substances and a number of enzymes, provides intensive bacterial growth [Handbook of microbiological and virological research methods. / Ed. M.O. Birger. - M .: Medicine, 1982. - 464 p.].
Авторами экспериментально установлено, что добавление в минеральную среду автолизата дрожжей способствует активному размножению бактерий, которые изначально присутствовали в природной воде. Численность бактерий в среде через сутки достигает 108-109 КОЕ/мл. Галофильные и галотолерантные гетеротрофные жгутиконосцы при обилии пищи размножаются с высокой скоростью, и исключается необходимость в дополнительной подкормке аллохтонными бактериями.The authors experimentally established that the addition of a yeast autolysate to the mineral medium promotes the active reproduction of bacteria that were originally present in natural water. The number of bacteria in the medium in a day reaches 10 8 -10 9 CFU / ml. Halophilic and halotolerant heterotrophic flagellates with an abundance of food reproduce at high speed, and the need for additional feeding with allochthonous bacteria is eliminated.
Соли и автолизат дрожжей смешивают и растворяют в дистиллированной воде. Затем питательную среду стерилизуют путем автоклавирования в течение 15 минут при температуре 121°С (1,1 атм).The salts and yeast autolysate are mixed and dissolved in distilled water. Then the nutrient medium is sterilized by autoclaving for 15 minutes at a temperature of 121 ° C (1.1 ATM).
В приготовленную питательную среду, разлитую в стерильные чашки, вносят исследуемые образцы. Достоинством предлагаемого способа является возможность исследования как планктонных, так и бентосных проб (ил, грунт), отобранных из природных водоемов. Инкубацию образцов проводят в термостате при оптимальной температуре 25-28°С, используемой для наращивания биомассы при выделении гетеротрофных жгутиконосцев из природных водоемов [Жуков Б.Ф., Мыльников А.П. Культивирование свобод-ноживущих бесцветных жгутиконосцев из сооружений биологической очистки. // Протозоология. - Л.: Наука, 1983. Вып.8. - С.142-152].In the prepared nutrient medium, poured into sterile cups, make the test samples. The advantage of the proposed method is the ability to study both planktonic and benthic samples (silt, soil), selected from natural reservoirs. The incubation of samples is carried out in a thermostat at an optimal temperature of 25-28 ° C, used to build up biomass when isolating heterotrophic flagellates from natural reservoirs [Zhukov B.F., Mylnikov A.P. The cultivation of free-knifeless colorless flagella from biological treatment facilities. // Protozoology. - L .: Nauka, 1983. Issue 8. - S.142-152].
За развитием галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев наблюдают в динамике с использованием световой фазово-контрастной микроскопии с водной иммерсией в течение 30 дней от момента внесения проб в среду.The development of halophilic and halotolerant heterotrophic flagellates is observed in dynamics using light phase contrast microscopy with water immersion for 30 days from the moment the samples are introduced into the medium.
Периодически проводят выделение чистых культур галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев методом получения клонов с помощью микроманипулятора с микропипеткой или методом серийных разведений. В последующем выделенные чистые культуры культивируются в лабораторных условиях и могут использоваться для наращивания биомассы, изучения физиологических свойств и ультраструктуры, экспериментальных исследований, определения систематического положения и т.д.Pure cultures of halophilic and halotolerant heterotrophic flagellates are periodically isolated using clone preparation using a micromanipulator with a micropipette or serial dilution method. Subsequently, isolated pure cultures are cultivated in laboratory conditions and can be used to increase biomass, study physiological properties and ultrastructure, experimental studies, determine the systematic position, etc.
Для роста чистых культур галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев полученные с помощью микроманипулятора с микропипеткой или методом серийных разведений отдельные клетки помещают в чашки Петри с жидкой питательной средой того же состава. Инкубацию проводят в термостате при оптимальной температуре 25-28°С. За развитием галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев наблюдают в динамике с использованием световой фазово-контрастной микроскопии с водной иммерсией в течение 30 дней от момента внесения проб в среду. В дальнейшем для каждой культуры галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев подбирается оптимальный режим пересева 1-2 раза в месяц. Пересев осуществляется путем внесения образца выросшей культуры галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев объемом 1 мл в свежую жидкую питательную среду того же состава объемом 15 мл.For the growth of pure cultures of halophilic and halotolerant heterotrophic flagellates obtained using a micromanipulator with a micropipette or by the method of serial dilutions, individual cells are placed in Petri dishes with a liquid nutrient medium of the same composition. Incubation is carried out in a thermostat at an optimal temperature of 25-28 ° C. The development of halophilic and halotolerant heterotrophic flagellates is observed in dynamics using light phase contrast microscopy with water immersion for 30 days from the moment the samples are introduced into the medium. In the future, for each culture of halophilic and halotolerant heterotrophic flagellates, the optimal regime of reseeding is selected 1-2 times a month. Reseeding is carried out by introducing a sample of the grown culture of halophilic and halotolerant heterotrophic flagellates with a volume of 1 ml into a fresh liquid nutrient medium of the same composition with a volume of 15 ml.
При пересевах культуры галофильных и галотолерантных жгутиконосцев не очищаются от сопровождающих их автохтонных галофильных бактерий, которые интенсивно размножаются в свежей культуральной среде. Это приводит к тому, что культивируемые галофильные и галотолерантные гетеротрофные жгутиконосцы, питающиеся сопутствующими бактериями, в короткие сроки (2-3 суток) достигают максимальной численности (105-106 клеток/мл). Отсутствие дополнительной подкормки бактериями является одним из преимуществ предлагаемого способа.When reseeding cultures of halophilic and halotolerant flagellates are not cleared of the indigenous halophilic bacteria that accompany them, which multiply intensively in a fresh culture medium. This leads to the fact that cultivated halophilic and halotolerant heterotrophic flagellates, feeding on concomitant bacteria, in a short time (2-3 days) reach their maximum number (10 5 -10 6 cells / ml). The absence of additional feeding with bacteria is one of the advantages of the proposed method.
Для осуществления способа используются минеральные соли марки «хч» отечественного или импортного производства и автолизат пекарных дрожжей производства ГНЦ прикладной микробиологии МЗ РФ (Отделение «Питательные среды», г.Оболенск).To implement the method, mineral salts of the brand "hch" are used, domestic or imported, and an autolysate of baking yeast produced by the SSC of Applied Microbiology of the Ministry of Health of the Russian Federation (Nutrient Media Division, Obolensk).
Авторами были проведены исследования, позволившие оценить эффективность предлагаемого способа по сравнению со способом-прототипом. В озере Тузлучное (Оренбургская область) с минерализацией воды 100‰ выделяли галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев для определения их биологического разнообразия. Неконцентрированные и концентрированные пробы воды объемом по 5 мл были посеяны на питательные среды, приготовленные согласно предлагаемому способу и способу-прототипу. Концентрирование проб воды осуществляли путем фильтрования их через мембранный фильтр.The authors conducted studies to evaluate the effectiveness of the proposed method in comparison with the prototype method. Halophilic and halotolerant heterotrophic flagellates were isolated in Lake Tuzluchnoye (Orenburg Region) with a water salinity of 100 для to determine their biological diversity. Unconcentrated and concentrated water samples with a volume of 5 ml were seeded on nutrient media prepared according to the proposed method and the prototype method. Concentration of water samples was carried out by filtering them through a membrane filter.
В результате использования предлагаемого способа на второй день инкубации в неконцентрированной пробе воды из озера было обнаружено 6 видов галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев (табл.). На пятый день они достигли большой численности и были использованы для получения чистых культур с применением микроманипулятора с микропипеткой. Достоверные результаты получены на второй день инкубации даже без предварительного концентрирования пробы воды.As a result of using the proposed method on the second day of incubation in an unconcentrated sample of water from the lake, 6 species of halophilic and halotolerant heterotrophic flagellates were discovered (table). On the fifth day, they reached a large number and were used to obtain pure cultures using a micromanipulator with a micropipette. Reliable results were obtained on the second day of incubation, even without preliminary concentration of the water sample.
Согласно способу-прототипу выделение галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев осуществляли также в двух вариантах - без предварительного концентрирования пробы воды и с ее концентрированием.According to the prototype method, the isolation of halophilic and halotolerant heterotrophic flagellates was also carried out in two versions - without preliminary concentration of the water sample and with its concentration.
В неконцентрированной пробе воды на второй день наблюдения обнаружены только единичные клетки Percolomonas cosmopolitus, а на пятые сутки появились еще 2 вида галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев.In a non-concentrated water sample on the second day of observation, only single cells of Percolomonas cosmopolitus were found, and on the fifth day another 2 species of halophilic and halotolerant heterotrophic flagellates appeared.
В концентрированной пробе воды на второй день наблюдения обнаружены 3 вида галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев, а на пятый день - 6 видов.In the concentrated water sample on the second day of observation, 3 species of halophilic and halotolerant heterotrophic flagellates were found, and on the fifth day, 6 species.
В отличие от предлагаемого способа способ-прототип позволил выявить 6 видов галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев на пятый день наблюдения, причем только в концентрированной пробе. Галофильные и галотолерантные гетеротрофные жгутиконосцы достигали большей численности в среде заявляемого состава по сравнению со средой Шмальца-Пратта (способ-прототип).In contrast to the proposed method, the prototype method allowed to identify 6 species of halophilic and halotolerant heterotrophic flagellates on the fifth day of observation, and only in a concentrated sample. Halophilic and halotolerant heterotrophic flagellates reached a greater number in the medium of the claimed composition compared with the Schmalz-Pratt environment (prototype method).
Из исследуемых проб с помощью микроманипулятора был выделен в чистой культуре один вид галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев - Percolomonas cosmopolites. Выделенные отдельные клетки Percolomonas cosmopolites поместили в чашку Петри со свежей жидкой питательной средой заявляемого состава объемом 15 мл. Инкубацию проводили в термостате при температуре 25°С, за развитием наблюдали в динамике с использованием световой фазово-контрастной микроскопии с водной иммерсией в течение 30 дней с момента внесения пробы в среду.Using a micromanipulator, one species of halophilic and halotolerant heterotrophic flagellates - Percolomonas cosmopolites - was isolated from the samples under study in a pure culture. The isolated individual cells of Percolomonas cosmopolites were placed in a Petri dish with fresh liquid nutrient medium of the claimed composition with a volume of 15 ml. Incubation was carried out in a thermostat at a temperature of 25 ° С, the development was observed in dynamics using light phase contrast microscopy with water immersion for 30 days from the moment the sample was introduced into the medium.
Рост Percolomonas cosmopolites после инокуляции в среду отмечался на 3 сутки, максимальной численности достигал на 6 сутки, затем численность начинала плавно снижаться. При использовании среды заявляемого состава Percolomonas cosmopolites сохранял свою жизнеспособность в течение 1 месяца. Для поддержания культуры Percolomonas cosmopolites в лабораторных условиях пересев производили 1 раз в 14 дней. С использованием этого режима пересева культура успешно сохраняется в лаборатории в течение 24 месяцев.The growth of Percolomonas cosmopolites after inoculation on Wednesday was observed on the 3rd day, reached its maximum number on the 6th day, then the number began to gradually decrease. When using the medium of the claimed composition, Percolomonas cosmopolites retained its viability for 1 month. To maintain the culture of Percolomonas cosmopolites in the laboratory, reseeding was performed once every 14 days. Using this regime of reseeding, the culture is successfully stored in the laboratory for 24 months.
При использовании для культивирования выделенной культуры Percolomonas cosmopolites среды Шмальца-Пратта (согласно способу-прототипу) их рост начинался на 5 сутки, к 8 суткам численность достигала максимального значения, которое было значительно меньше, чем при использовании для культивирования среды заявляемого состава. После 8 суток наблюдалось резкое падение численности галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев. Percolomonas cosmopolitus сохранялся в активном состоянии на среде Шмальца-Пратта менее двух недель.When used for the cultivation of the selected culture of Percolomonas cosmopolites, the Schmalz-Pratt medium (according to the prototype method), their growth began on the 5th day, by 8 days the number reached the maximum value, which was significantly less than when using the claimed composition for culturing the medium. After 8 days, there was a sharp drop in the number of halophilic and halotolerant heterotrophic flagellates. Percolomonas cosmopolitus remained active in the Schmalz-Pratt environment for less than two weeks.
Таким образом, заявляемый способ выделения галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев позволяет сократить сроки выделения галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев из водоемов с различной минерализацией, повысить эффективность оценки их биоразнообразия, сократить трудоемкость и сроки культивирования галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев.Thus, the inventive method for isolating halophilic and halotolerant heterotrophic flagellates allows to reduce the time for isolating halophilic and halotolerant heterotrophic flagellates from reservoirs with different salinity, increase the efficiency of their biodiversity, reduce the complexity and time of cultivation of halophilic and halotolerant heterotrophs.
Способ осуществляется следующим образом.The method is as follows.
1) Готовят жидкую питательную среду следующего состава, г/л:1) Prepare a liquid nutrient medium of the following composition, g / l:
Минерализация среды 68‰.Mineralization 68 68.
Соли и автолизат дрожжей смешивают и растворяют в дистиллированной воде и стерилизуют путем автоклавирования в течение 15 минут при температуре 121°С (1,1 атм).The salts and yeast autolysate are mixed and dissolved in distilled water and sterilized by autoclaving for 15 minutes at a temperature of 121 ° C (1.1 atm).
2) Затем в приготовленную жидкую питательную среду, разлитую объемом 10 мл в стерильные чашки Петри диаметром 9,5 см, вносят образцы исследуемой природной воды объемом 5 мл или бентоса (грунт, ил) объемом 0,5 мл.2) Then, samples of the studied natural water with a volume of 5 ml or benthos (soil, silt) with a volume of 0.5 ml are introduced into the prepared liquid nutrient medium, poured in a volume of 10 ml into sterile Petri dishes with a diameter of 9.5 cm.
3) Инкубацию засеянных проб проводят в термостате при оптимальной температуре 25-28°С. За развитием галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев наблюдают в динамике с использованием световой фазово-контрастной микроскопии с водной иммерсией в течение 30 дней от момента внесения проб в среду.3) Incubation of seeded samples is carried out in a thermostat at an optimal temperature of 25-28 ° C. The development of halophilic and halotolerant heterotrophic flagellates is observed in dynamics using light phase contrast microscopy with water immersion for 30 days from the moment the samples are introduced into the medium.
4) Периодически проводят выделение чистых культур галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев методом получения клонов с помощью микроманипулятора с микропипеткой или методом серийных разведений. Полученные отдельные клетки галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев помещают в чашку Петри диаметром 9,5 см со свежей жидкой питательной средой того же состава объемом 15 мл.4) Periodically carry out the selection of pure cultures of halophilic and halotolerant heterotrophic flagellates by the method of obtaining clones using a micromanipulator with a micropipette or by the method of serial dilutions. The obtained individual cells of halophilic and halotolerant heterotrophic flagellates are placed in a Petri dish with a diameter of 9.5 cm with fresh liquid nutrient medium of the same composition with a volume of 15 ml.
5) Инкубацию проводят в термостате при оптимальной температуре 25-28°С. За развитием галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев наблюдают в динамике с использованием световой фазово-контрастной микроскопии с водной иммерсией в течение 30 дней от момента внесения проб в среду.5) Incubation is carried out in a thermostat at an optimal temperature of 25-28 ° C. The development of halophilic and halotolerant heterotrophic flagellates is observed in dynamics using light phase contrast microscopy with water immersion for 30 days from the moment the samples are introduced into the medium.
6) В случае необходимости дальнейшего поддержания полученных чистых культур галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев в лабораторных условиях используют приготовленную жидкую питательную среду вышеуказанного состава. Периодически (1-2 раза в месяц) производят пересев жгутиконосцев путем добавления 1 мл старой культуры в чашку Петри со свежей питательной средой объемом 15 мл.6) If it is necessary to further maintain the obtained pure cultures of halophilic and halotolerant heterotrophic flagellates under laboratory conditions, use the prepared liquid nutrient medium of the above composition. From time to time (1-2 times per month), flagellates are reseeded by adding 1 ml of the old culture to a Petri dish with fresh nutrient medium with a volume of 15 ml.
Примеры конкретного выполнения.Examples of specific performance.
Пример 1Example 1
В гипергалинном озере Развал (Оренбургская область) с минерализацией воды 300‰ необходимо оценить видовой состав галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев и получить их в чистой культуре. С этой целью отобраны пробы природной рапы 30 сентября 2004 г.In the hyperhaline lake Razval (Orenburg Region) with a water salinity of 300 ‰, it is necessary to evaluate the species composition of halophilic and halotolerant heterotrophic flagellates and obtain them in a pure culture. For this purpose, natural brine samples were taken on September 30, 2004.
Для выделения галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев из образца воды использовали жидкую питательную среду. Для ее приготовления были отвешены минеральные соли: NaCl - 60 г; MgSO4×7H2O - 10 г; KCl - 1,5 г; CaCl2×2Н2O - 2,0 г; KNO3 - 0,2 г; К2НРО4×3Н20 - 0,002 г. Соли смешивали и растворяли в дистиллированной воде, доводя конечный объем до 1 л. Таким образом, общая минерализация среды составила 68‰. Затем в среду добавляли автолизат пекарских дрожжей в количестве 1,5 г/л. После тщательного перемешивания и растворения всех компонентов среду разливали в стерильные флаконы и стерилизовали путем автоклавирования в течение 15 минут при температуре 121°С (1,1 атм).A liquid nutrient medium was used to isolate halophilic and halotolerant heterotrophic flagellates from a water sample. For its preparation, mineral salts were weighed: NaCl - 60 g; MgSO 4 × 7H 2 O - 10 g; KCl - 1.5 g; CaCl 2 × 2H 2 O - 2.0 g; KNO 3 - 0.2 g; To 2 NRA 4 × 3H 2 0 - 0.002 g. The salts were mixed and dissolved in distilled water, bringing the final volume to 1 liter. Thus, the total mineralization of the medium was 68 ‰. Then, an autolysate of baker's yeast was added to the medium in an amount of 1.5 g / L. After thoroughly mixing and dissolving all the components, the medium was poured into sterile vials and sterilized by autoclaving for 15 minutes at a temperature of 121 ° C (1.1 atm).
Проба рапы объемом 5 мл была внесена в чашку Петри с приготовленной средой объемом 10 мл. Инкубацию проб проводили в термостате при температуре 25°С. За развитием галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев наблюдали в динамике с использованием световой фазово-контрастной микроскопии с водной иммерсией в течение 30 дней от момента внесения проб в среду.A sample of brine with a volume of 5 ml was introduced into a Petri dish with prepared medium with a volume of 10 ml. Samples were incubated in a thermostat at a temperature of 25 ° С. The development of halophilic and halotolerant heterotrophic flagellates was observed in dynamics using light phase contrast microscopy with water immersion for 30 days from the moment the samples were introduced into the medium.
Через 2 суток инкубации в среде отмечено массовое развитие Macropharyngomonas halophila.After 2 days of incubation in the medium, massive development of Macropharyngomonas halophila was noted.
С помощью микроманипулятора Macropharyngomonas halophila был выделен в чистой культуре. Полученную культуру помещали в чашку Петри со свежей жидкой питательной средой того же состава объемом 15 мл и инкубировали при температуре 25°С. Рост Macropharyngomonas halophila после инокуляции в среду отмечался на 3 сутки, максимальной численности достигал на 7 сутки, затем численность начинала плавно снижаться. При использовании среды заявляемого состава Macropharyngomonas halophila сохранял свою жизнеспособность в течение более 2 месяцев. Для поддержания культуры Macropharyngomonas halophila в лабораторных условиях пересев производили 1 раз в месяц путем добавления 1 мл культуры в чашку Петри со свежей питательной средой объемом 15 мл. С использованием этого режима пересева культура успешно сохраняется в лаборатории в течение 24 месяцев.Using a micromanipulator, Macropharyngomonas halophila was isolated in a pure culture. The resulting culture was placed in a Petri dish with fresh liquid nutrient medium of the same composition with a volume of 15 ml and incubated at a temperature of 25 ° C. The growth of Macropharyngomonas halophila after inoculation on Wednesday was observed on the 3rd day, reached the maximum number on the 7th day, then the number began to gradually decrease. When using the medium of the claimed composition Macropharyngomonas halophila remained viable for more than 2 months. To maintain the culture of Macropharyngomonas halophila under laboratory conditions, reseeding was carried out once a month by adding 1 ml of culture to a Petri dish with fresh nutrient medium with a volume of 15 ml. Using this regime of reseeding, the culture is successfully stored in the laboratory for 24 months.
Пример 2Example 2
Из озера Дунино (Оренбургская область) с минерализацией воды 150‰ были отобраны образцы грунта для определения видового состава галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев. Комочки грунта объемом 5 мл вносили в жидкую питательную среду, приготовленную аналогично примеру 1, и инкубировали в термостате при температуре 28°С. За развитием галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев наблюдали в динамике с использованием световой фазово-контрастной микроскопии с водной иммерсией в течение 30 дней от момента посева.Soil samples were taken from Lake Dunino (Orenburg Region) with water salinity of 150 для to determine the species composition of halophilic and halotolerant heterotrophic flagellates. Lumps of soil with a volume of 5 ml were introduced into a liquid nutrient medium prepared analogously to example 1, and incubated in a thermostat at a temperature of 28 ° C. The development of halophilic and halotolerant heterotrophic flagellates was observed in dynamics using light phase contrast microscopy with water immersion for 30 days from the time of sowing.
Через три дня появились единичные клетки Rhynchomonas nasuta, Percolomonas cosmopolitus, а через неделю инкубации в среде отмечено их массовое развитие.Three days later, single cells of Rhynchomonas nasuta, Percolomonas cosmopolitus appeared, and after a week of incubation in the medium, their mass development was noted.
Для изучения биологических свойств Rhynchomonas nasuta он был выделен в чистой культуре и в дальнейшем культивировался аналогично примеру 1.To study the biological properties of Rhynchomonas nasuta, he was isolated in a pure culture and subsequently cultivated analogously to example 1.
Пример 3.Example 3
Из грязе-рапного озера Тузлучное (Оренбургская область) с минерализацией воды 100‰ для определения биологического разнообразия галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев были взяты пробы ила. Образцы ила объемом 5 мл вносили в жидкую питательную среду, приготовленную аналогично примеру 1, и инкубировали в термостате при температуре 26°С, а затем пробы наблюдали в динамике, что позволило к 6-м суткам выявить 5 видов: Caecitellus parvulus, Cafeteria roenbergensis, Monosiga ovata, Bodo sp., Percolomonas cosmopolitus. К 10 суткам численность галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев достигла максимальных значений.Sludge samples were taken from mud-lake Tuzluchnoe (Orenburg Region) with a water salinity of 100 ‰ to determine the biological diversity of halophilic and halotolerant heterotrophic flagellates. Sludge samples with a volume of 5 ml were introduced into a liquid nutrient medium prepared analogously to Example 1 and incubated in a thermostat at a temperature of 26 ° C, and then the samples were observed in dynamics, which allowed to identify 5 species by the 6th day: Caecitellus parvulus, Cafeteria roenbergensis, Monosiga ovata, Bodo sp., Percolomonas cosmopolitus. By 10 days, the number of halophilic and halotolerant heterotrophic flagellates reached maximum values.
Для дальнейших исследований с помощью микроманипулятора была выделена чистая культура Monosiga ovata, которая развилась в среде в массовом количестве. Monosiga ovata культивировали на жидкой питательной среде заявляемого состава. Рост Monosiga ovata после инокуляции в среду отмечался на 5 сутки, максимальной численности культура достигала на 10 сутки, затем численность начинала плавно снижаться. Для поддержания культуры в лабораторных условиях пересев производили 1 раз в месяц.For further studies, a pure culture of Monosiga ovata was isolated using a micromanipulator, which developed in the medium in bulk. Monosiga ovata was cultured on a liquid nutrient medium of the claimed composition. The growth of Monosiga ovata after inoculation on Wednesday was observed on the 5th day, the culture reached its maximum abundance on the 10th day, then the abundance began to gradually decrease. To maintain the culture in the laboratory, reseeding was performed 1 time per month.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2006143505/13A RU2332449C2 (en) | 2006-12-07 | 2006-12-07 | Method of extraction halophylic and halotolerant heterotrophic flagellates |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2006143505/13A RU2332449C2 (en) | 2006-12-07 | 2006-12-07 | Method of extraction halophylic and halotolerant heterotrophic flagellates |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2006143505A RU2006143505A (en) | 2007-03-27 |
| RU2332449C2 true RU2332449C2 (en) | 2008-08-27 |
Family
ID=37999004
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2006143505/13A RU2332449C2 (en) | 2006-12-07 | 2006-12-07 | Method of extraction halophylic and halotolerant heterotrophic flagellates |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2332449C2 (en) |
-
2006
- 2006-12-07 RU RU2006143505/13A patent/RU2332449C2/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ЖУКОВ Б.Ф., МЫЛЬНИКОВ А.П. Культивирование свободноживущих бесцветных жгутиконосцев из сооружений биологической очистки // Протозоология. - Л.: Наука, 1983, вып.8, с.142-152. АЛЬ ХАМАДИ ХАСАН АХМЕД. Влияние условий культивирования на рост и состав жирных кислот жгутиконосца Astasia longa. Автореф. на соискание ученой степени кандидата биолог. наук. - М., 1994. FROLOV A.O., KARPOV S.A. and MYLNIKOV A.P., The ultrastructure of procryptobia sorokini (Zhukov) comb. nov. and rootlet homology in kinetoplastids. Protistology 2(2), 85-95 (2001). * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2006143505A (en) | 2007-03-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Schippers et al. | Cultivation of sponges, sponge cells and symbionts: achievements and future prospects | |
| CN104388356B (en) | Sang Puxun streptomycete bacterial strains, its separation method and application | |
| Temraleeva et al. | Modern methods for isolation, purification, and cultivation of soil cyanobacteria | |
| Gibor | Some ecological relationships between phyto-and zooplankton | |
| Sakami et al. | Effects of epiphytic bacteria on the growth of the toxic dinoflagellate Gambierdiscus toxicus (Dinophyceae) | |
| Rao | Cultivation, growth media, division rates and applications of Dunaliella species | |
| Dorofeev et al. | Approaches to cultivation of “nonculturable” bacteria: Cyclic cultures | |
| Wang et al. | Effects of nitrogen and phosphorus on the growth of Levanderina fissa: How it blooms in Pearl River Estuary | |
| Terekhova et al. | Influence of extrametabolites of marine microalgae on the reproduction of the bacterium Listeria monocytogenes | |
| Mizerakis et al. | Bacterial diversity of the outflows of a Polichnitos (Lesvos, Greece) hot spring, laboratory studies of a Cyanobacterium sp. strain and potential medical applications | |
| RU2332449C2 (en) | Method of extraction halophylic and halotolerant heterotrophic flagellates | |
| Mitsui et al. | [7] Isolation and culture of marine nitrogen-fixing unicellular cyanobacteria Synechococcus | |
| RU2751487C1 (en) | Method for producing liquid nutrition medium and method for obtaining liguid microbiological agent based on strains mixture of spore-forming bacteria-antagonists of phytopathogenic fungi of g. fusarium | |
| Patterson et al. | Regulation of scytophycin accumulation in cultures of Scytonema ocellatum. II. Nutrient requirements | |
| US20160376543A1 (en) | Method of culturing algae | |
| Meseck | Controlling the growth of a cyanobacterial contaminant, Synechoccus sp., in a culture of Tetraselmis chui (PLY429) by varying pH: Implications for outdoor aquaculture production | |
| Del Socorro et al. | Purple nonsulfur bacteria (PNSB) isolated from aquatic sediments and rice paddy in Iligan city, Philippines | |
| Baldanta Callejo et al. | Growth characterization and biostimulant potential of Coelastrella sp. D14 a green microalga isolated from a solar panel. | |
| Tighiri et al. | Effect of aeration flow rate on the growth of microalgae as a biofuel feedstock and wastewater treatment | |
| KR101563054B1 (en) | The device for in situ cultivation of microorganism and a method for isolation of microorganisms using the same | |
| RU2676850C1 (en) | Lisinibacillus species vkm b-2814d bacteria strain - oil and petroleum product decomposer | |
| RU2675941C1 (en) | Bacillus simplex vkm b-2817d bacteria strain - oil and petroleum product decomposer | |
| RU2575804C1 (en) | STRAIN OF YEAST Candida parapsilosis - PRODUCER OF LIPASE | |
| RU2675938C1 (en) | Lisinibacillus fusiformis vkm b-2816d bacteria strain - oil and petroleum product decomposer | |
| Mukriani et al. | Production and characterization of L-Asparaginase enzyme from symbiont bacteria of red algae Eucheuma spinosum |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20141208 |