RU2332247C1 - Method of immunoglobulin purification (versions) - Google Patents
Method of immunoglobulin purification (versions) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2332247C1 RU2332247C1 RU2007120439/15A RU2007120439A RU2332247C1 RU 2332247 C1 RU2332247 C1 RU 2332247C1 RU 2007120439/15 A RU2007120439/15 A RU 2007120439/15A RU 2007120439 A RU2007120439 A RU 2007120439A RU 2332247 C1 RU2332247 C1 RU 2332247C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- exchange resin
- column
- buffer solution
- cation exchange
- immunoglobulin
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области фармацевтической промышленности и может быть использовано для получения высокоочищенного иммуноглобулина, свободного от вирусов, методами хроматографии.The invention relates to the field of pharmaceutical industry and can be used to obtain highly purified virus-free immunoglobulin by chromatography methods.
Известен способ получения иммуноглобулина, включающий фракционирование плазмы крови человека с использованием каприлата натрия, очистку хроматографией на ДЕАЕ-целлюлозе, обработку аэросилом и лиофилизацию (SU 1693751, 20.03.1995).A known method of producing immunoglobulin, including fractionation of human blood plasma using sodium caprylate, purification by chromatography on DEAE cellulose, aerosil treatment and lyophilization (SU 1693751, 03.20.1995).
Известен способ очистки иммуноглобулина от пирогенных веществ с помощью сорбента - гидроксида алюминия (RU2110279, 10.05.1998).A known method of purification of immunoglobulin from pyrogenic substances using a sorbent - aluminum hydroxide (RU2110279, 05/10/1998).
Недостатком описанных выше способов является невысокая чистота получаемых продуктов.The disadvantage of the above methods is the low purity of the resulting products.
Известен способ получения раствора гамма-глобулина, по существу свободного от контаминирующих вирусов, который включает этапы тепловой обработки для инактивации вирусов при температуре от 50 до 70°С в течение 10-100 ч в присутствии стабилизатора и фракционирования полиэтиленгликолем неочищенного раствора гамма-глобулина, обработку раствора гамма-глобулина ионообменной смолой с последующей обработкой очищенного гамма-глобулина растворителем-детергентом для дальнейшей инактивации вирусов (RU 2198668, 20.02.2003).A known method of obtaining a solution of gamma globulin, essentially free of contaminating viruses, which includes the steps of heat treatment to inactivate viruses at a temperature of from 50 to 70 ° C for 10-100 hours in the presence of a stabilizer and fractionation of the crude gamma globulin solution with polyethylene glycol, processing a solution of gamma globulin with an ion-exchange resin, followed by treatment of purified gamma globulin with a solvent-detergent for further inactivation of viruses (RU 2198668, 02.20.2003).
Известен способ получения иммуноглобулина из плазмы для медицинских применений, содержащий следующие стадии: (1') удаляют альбумин, получая в результате фракцию IgG, далее проводят стадию, где концентрируют фракцию IgG, полученную на стадии (1'); (2') очищают эту фракцию IgG на анионите и собирают несвязанную фракцию IgG; (3') очищают эту несвязанную фракцию IgG путем адсорбции на катионите и собирают связанную фракцию IgG, при этом осуществляют процесс, где доводят рН фракции IgG, выделенной с катионита на стадии (3'), до значения 4±0,1 и предпочтительно поддерживают рН в течение остальных стадий способа меньше 6,0 и (4') осуществляют инактивацию вируса во фракции IgG, полученной из фракции IgG, собранной на стадии (3') путем использования химических продуктов при температуре 30°С±2°С в течение по меньшей мере 4 часов (RU 2266914, 27.12.2005).A known method for producing immunoglobulin from plasma for medical applications, comprising the following stages: (1 ') remove albumin, resulting in an IgG fraction, then carry out the stage where the IgG fraction obtained in stage (1') is concentrated; (2 ') purify this IgG fraction on anion exchange resin and collect an unbound IgG fraction; (3 ') purify this unbound IgG fraction by adsorption on cation exchange resin and collect the bound IgG fraction, and carry out a process where the pH of the IgG fraction extracted from the cation exchange resin in step (3') is adjusted to a value of 4 ± 0.1 and is preferably maintained the pH during the remaining stages of the method is less than 6.0 and (4 ') the virus is inactivated in the IgG fraction obtained from the IgG fraction collected in stage (3') by using chemical products at a temperature of 30 ° C ± 2 ° C during at least 4 hours (RU 2266914, 12/27/2005).
Недостатками этих способов являются невысокая чистота получаемого продукта (RU 2198668, 20.02.2003), отсутствие универсальности в отношении вирусной инактивации у используемых для вирусной инактивации продуктов (RU 2266914, 27.12.2005).The disadvantages of these methods are the low purity of the obtained product (RU 2198668, 02/20/2003), the lack of universality with respect to viral inactivation in products used for viral inactivation (RU 2266914, 12/27/2005).
Наиболее близким по технической сущности и достигнутому результату является способ очистки иммуноглобулина, содержащегося в белковой фракции плазмы крови, включающий ее растворение в буферном растворе, вирусную сольвент-детергентную инактивацию при комнатной температуре и хроматографическую очистку, при которой надосадочная жидкость, содержащая IgG, подвергается, по меньшей мере, одной операции обработки, например, в два этапа, но при необходимости и нескольким этапам анионообменной и катионообменной хроматографии для удаления значительной доли оставшихся загрязняющих примесей. В предпочтительном варианте осуществления изобретения осветленная и, при необходимости, профильтрованная надосадочная жидкость, содержащая IgG, наносится на анионообменную смолу и затем на катионообменную смолу, которыми заполнены две последовательно установленные колонки, уравновешенные одним и тем же буферным раствором. После промывки колонку с анионитом отключают, а колонку с катионитом, на которой сорбирован иммуноглобулин, элюируют буферным раствором с рН и концентрацией, достаточными для эффективного выделения целевого продукта в градиенте хлорида натрия. Элюированную фракцию с IgG концентрируют и обессоливают с помощью ультрафильтрации и обрабатывают Tween-80 и трибутилфосфатом для разрушения вирусов. Полученный раствор снова пропускают через две последовательно соединенные колонки с анионитом и катионитом аналогично описанному выше. Колонку с анионитом отсоединяют и элюируют фракцию с IgG в градиенте хлорида натрия. Элюированную фракцию с IgG собирают в мальтозе, подвергают концентрированию и готовят лекарственную форму для внутривенного введения (RU 2197500, 27.01.2003).The closest in technical essence and the achieved result is a method of purification of immunoglobulin contained in the protein fraction of blood plasma, including its dissolution in a buffer solution, viral solvent-detergent inactivation at room temperature and chromatographic purification, in which the supernatant containing IgG is subjected to at least one processing operation, for example, in two stages, but if necessary, several stages of anion exchange and cation exchange chromatography to remove Yelnia fraction remaining contaminants. In a preferred embodiment of the invention, the clarified and, if necessary, filtered supernatant containing IgG is applied to the anion exchange resin and then to the cation exchange resin, which are used to fill two successively installed columns balanced by the same buffer solution. After washing, the column with anion exchange resin is turned off, and the column with cation exchange resin on which the immunoglobulin is adsorbed is eluted with a buffer solution with a pH and concentration sufficient to effectively isolate the target product in a gradient of sodium chloride. The eluted IgG fraction was concentrated and desalted by ultrafiltration and treated with Tween-80 and tributyl phosphate to destroy the viruses. The resulting solution was again passed through two series-connected columns with anion exchange resin and cation exchange resin as described above. The column with anion exchange resin is disconnected and the IgG fraction in the sodium chloride gradient is eluted. The eluted IgG fraction was collected in maltose, concentrated, and a dosage form was prepared for intravenous administration (RU 2197500, January 27, 2003).
Недостатками известного способа является его сложность и многостадийность, что приводит к низкому выходу целевого продукта (менее 73%), так как только на каждой из двух хроматографических стадий выход не превышает 85%.The disadvantages of this method is its complexity and multi-stage, which leads to a low yield of the target product (less than 73%), since only at each of the two chromatographic stages does not exceed 85%.
Задачей настоящего изобретения является увеличение производительности способа за счет его упрощения и повышение выхода высокоочищенного свободного от вирусов иммуноглобулина.The objective of the present invention is to increase the productivity of the method due to its simplification and increase the yield of highly purified virus-free immunoglobulin.
Поставленная задача решается тремя предлагаемыми вариантами способа очистки.The problem is solved by the three proposed options for the cleaning method.
Согласно первому варианту предложен способ очистки иммуноглобулина, содержащегося в белковой фракции плазмы крови, включающий ее растворение в буферном растворе, вирусную сольвент-детергентную инактивацию при комнатной температуре, пропускание раствора через систему из соединенных между собой хроматографических колонок, уравновешенных одним и тем же буферным раствором, при этом в системе колонок одна колонка заполнена анионитом, одна заполнена катионитом и одна гидрофобным сорбентом, промывку колонок и элюирование иммуноглобулина с катионита буферным раствором, имеющим рН и концентрацию, достаточные для эффективного выделения иммуноглобулина, при этом вначале раствор пропускают через последовательно соединенные колонки с анионитом и катионитом, осуществляют их промывку, колонку с анионитом отключают и направляют на регенерацию, затем вместо колонки с анионитом подключают колонку с гидрофобным сорбентом и через последовательно соединенные колонки с гидрофобным сорбентом и катионитом пропускают буферный раствор, содержащий детергент, колонки промывают буферным раствором, колонку с гидрофобным сорбентом отключают и направляют на регенерацию, а колонку с катионитом подвергают элюированию.According to the first embodiment, a method for purification of immunoglobulin contained in the protein fraction of blood plasma, including its dissolution in a buffer solution, viral solvent-detergent inactivation at room temperature, passing the solution through a system of interconnected chromatographic columns balanced by the same buffer solution, moreover, in the column system, one column is filled with anion exchange resin, one is filled with cation exchange resin and one is hydrophobic sorbent, washing the columns and eluting immunoglobulin with a cation exchanger with a buffer solution having a pH and concentration sufficient to efficiently isolate immunoglobulin, first the solution is passed through series-connected columns with anion exchange resin and cation exchange resin, they are washed, the column with anion exchange resin is turned off and sent for regeneration, then instead of the column with anion exchange resin is connected with a hydrophobic sorbent and through a series-connected column with a hydrophobic sorbent and cation exchanger, a buffer solution containing detergent is passed, the columns are washed with buffer solution, the column with the hydrophobic sorbent is turned off and sent for regeneration, and the column with cation exchange resin is eluted.
В этом варианте предпочтительны следующие условия.In this embodiment, the following conditions are preferred.
В качестве анионита используют полимерный сорбент на акриловой основе с диэтиламиноэтильными группами, в качестве катионита используют полимерный сорбент на акриловой основе с сульфопропильными группами, а в качестве гидрофобного сорбента используют пористый стиролдивинилбензол с размером пор менее 10 нм.As anion exchange resin, an acrylic-based polymer sorbent with diethylaminoethyl groups is used, an acrylic-based polymer sorbent with sulfopropyl groups is used as a cation exchange resin, and porous styrene-divinylbenzene with a pore size of less than 10 nm is used as a hydrophobic sorbent.
Вирусную инактивацию осуществляют в растворе, содержащем Tween-80 и трибутилфосфат.Viral inactivation is carried out in a solution containing Tween-80 and tributyl phosphate.
В качестве буферного раствора используют натрий-ацетатный буферный раствор с рН 5,65.As a buffer solution using sodium acetate buffer solution with a pH of 5.65.
Пропускание буферного раствора, содержащего детергент, через последовательно соединенные колонки с гидрофобным сорбентом и катионитом осуществляют в два этапа: на первом этапе пропускают раствор, содержащий 2% Tween-80, на втором - раствор, содержащий 1% Tween-80 и 20% этанола.Passing a buffer solution containing a detergent through a series-connected column with a hydrophobic sorbent and cation exchange resin is carried out in two stages: at the first stage, a solution containing 2% Tween-80 is passed, at the second a solution containing 1% Tween-80 and 20% ethanol is passed.
Элюирование иммуноглобулина с катионита осуществляют натрий-ацетатным буферным раствором, имеющим рН 5,65 и концентрацию 0,35 М.Elution of immunoglobulin with cation exchanger is carried out with sodium acetate buffer solution having a pH of 5.65 and a concentration of 0.35 M.
Согласно второму варианту предложен способ очистки иммуноглобулина, содержащегося в белковой фракции плазмы крови, включающий ее растворение в буферном растворе, вирусную сольвент-детергентную инактивацию при комнатной температуре, пропускание раствора через систему из соединенных между собой хроматографических колонок, уравновешенных одним и тем же буферным раствором, при этом в системе колонок одна колонка заполнена анионитом, одна заполнена катионитом и одна гидрофобным сорбентом, промывку колонок и элюирование иммуноглобулина с катионита буферным раствором, имеющим рН и концентрацию, достаточные для эффективного выделения иммуноглобулина, при этом раствор пропускают через три соединенных между собой колонки в последовательности анионит - гидрофобный сорбент - катионит, после промывки колонки с анионитом и гидрофобным сорбентом отключают и направляют на регенерацию, а через колонку с катионитом пропускают буферный раствор, содержащий детергент, подвергают ее промывке буферным раствором и подвергают элюированию.According to the second embodiment, a method is proposed for purifying an immunoglobulin contained in a protein fraction of blood plasma, including its dissolution in a buffer solution, viral solvent-detergent inactivation at room temperature, passing the solution through a system of interconnected chromatographic columns balanced by the same buffer solution, moreover, in the column system, one column is filled with anion exchange resin, one is filled with cation exchange resin and one is hydrophobic sorbent, washing the columns and eluting immunoglobulin with a cation exchange resin with a buffer solution having a pH and concentration sufficient for efficient isolation of immunoglobulin, the solution is passed through three interconnected columns in the sequence of anion exchange resin - hydrophobic sorbent - cation exchange resin, after washing the columns with anion exchange resin and a hydrophobic sorbent, they are turned off and sent for regeneration, and a buffer solution containing a detergent is passed through a column of cation exchange resin, it is washed with a buffer solution and subjected to elution.
Во втором варианте предпочтительны следующие условия.In a second embodiment, the following conditions are preferred.
В качестве анионита используют полимерный сорбент на акриловой основе с диэтиламиноэтильными группами, в качестве катионита используют полимерный сорбент на акриловой основе с сульфопропильными группами, а в качестве гидрофобного сорбента используют пористый стиролдивинилбензол с размером пор менее 10 нм.As anion exchange resin, an acrylic-based polymer sorbent with diethylaminoethyl groups is used, an acrylic-based polymer sorbent with sulfopropyl groups is used as a cation exchange resin, and porous styrene-divinylbenzene with a pore size of less than 10 nm is used as a hydrophobic sorbent.
Вирусную инактивацию осуществляют в растворе, содержащем Tween-80 и трибутил фосфат.Viral inactivation is carried out in a solution containing Tween-80 and tributyl phosphate.
В качестве буферного раствора используют натрий-ацетатный буферный раствор с рН 5,65.As a buffer solution using sodium acetate buffer solution with a pH of 5.65.
Пропускание буферного раствора, содержащего детергент, через колонку с катионитом осуществляют в два этапа: на первом этапе пропускают раствор, содержащий 2% Tween-80, на втором - раствор, содержащий 1% Tween-80 и 20% этанола.The buffer solution containing the detergent is passed through the cation exchange resin column in two stages: at the first stage, a solution containing 2% Tween-80 is passed, at the second, a solution containing 1% Tween-80 and 20% ethanol.
Элюирование иммуноглобулина с катионита осуществляют натрий-ацетатным буферным раствором, имеющим рН 5,65 и концентрацию 0,35 М.Elution of immunoglobulin with cation exchanger is carried out with sodium acetate buffer solution having a pH of 5.65 and a concentration of 0.35 M.
Согласно третьему варианту задача решается способом очистки иммуноглобулина, содержащегося в белковой фракции плазмы крови, включающим ее растворение в буферном растворе, вирусную сольвент-детергентную инактивацию при комнатной температуре, пропускание раствора через систему из соединенных между собой хроматографических колонок, уравновешенных одним и тем же буферным раствором, при этом в системе колонок одна колонка заполнена анионитом, одна заполнена катионитом и одна гидрофобным сорбентом, промывку колонок, и элюирование иммуноглобулина с катионита буферным раствором, имеющим рН и концентрацию, достаточные для эффективного выделения иммуноглобулина, при этом раствор пропускают через три соединенных между собой колонки в последовательности анионит - гидрофобный сорбент - катионит, после промывки, колонку с анионитом отключают и направляют на регенерацию, а через последовательно соединенные колонки с гидрофобным сорбентом и катионитом пропускают буферный раствор, содержащий детергент, подвергают промывке буферным раствором, затем колонку с гидрофобным сорбентом отключают и направляют на регенерацию, а колонку с катионитом на элюирование.According to the third option, the problem is solved by the method of purification of immunoglobulin contained in the protein fraction of blood plasma, including its dissolution in a buffer solution, viral solvent-detergent inactivation at room temperature, passing the solution through a system of interconnected chromatographic columns balanced by the same buffer solution while in the column system one column is filled with anion exchange resin, one is filled with cation exchange resin and one is hydrophobic sorbent, washing the columns, and eluting the immuno lobulin with cation exchanger with a buffer solution having a pH and concentration sufficient for efficient isolation of immunoglobulin, while the solution is passed through three interconnected columns in the sequence of anion exchange resin - hydrophobic sorbent - cation exchange resin, after washing, the column with anion exchange resin is turned off and sent for regeneration, and after serially connected columns with a hydrophobic sorbent and cation exchange resin pass a buffer solution containing detergent, they are washed with a buffer solution, then a column with a hydrophobic sorbent is cut off and directed to regeneration, and a column of cation exchange resin for elution.
В третьем варианте способа предпочтительными являются те же условия, что и в описанном выше втором варианте.In the third embodiment of the method, the same conditions are preferred as in the second embodiment described above.
Общим существенным отличительным признаком заявленных вариантов предложенного способа очистки от способа-прототипа является то, что система соединенных между собой хроматографических колонок дополнительно содержит колонку с гидрофобным сорбентом.A common significant distinguishing feature of the claimed variants of the proposed method of purification from the prototype method is that the system of interconnected chromatographic columns further comprises a column with a hydrophobic sorbent.
Наличие колонки с гидрофобным сорбентом обеспечивает повышение степени очистки, снижает содержание ПАВ и других примесей и позволяет реализовать процесс за один хроматографический цикл без рехроматографии.The presence of a column with a hydrophobic sorbent provides an increase in the degree of purification, reduces the content of surfactants and other impurities, and allows the process to be implemented in one chromatographic cycle without rechromatography.
Ниже приведены конкретные примеры осуществления способа.The following are specific examples of the method.
Вариант 1.Option 1.
3 кг белковой фракции плазмы крови, содержащей 1000 г иммуноглобулина растворяют в 100 л 0,02 М натрий-ацетатного буфера, рН 5,65 (буфер А). К раствору иммуноглобулина добавляют Tween-80 и трибутилфосфат до концентрации 1% каждого. Инкубируют 6 часов при перемешивании при комнатной температуре.3 kg of the protein fraction of blood plasma containing 1000 g of immunoglobulin is dissolved in 100 l of 0.02 M sodium acetate buffer, pH 5.65 (buffer A). Tween-80 and tributyl phosphate are added to the immunoglobulin solution to a concentration of 1% each. Incubated for 6 hours with stirring at room temperature.
Подготовленную таким образом пробу пропускают последовательно через соединенные между собой колонны. Первая - диаметром 140 мм и длиной 400 мм заполнена DEAE-полимерным сорбентом на основе акрилового полимера с диэтиламиноэтильными группами размером частиц 100-250 мкм, вторая - заполнена сульфокатионитом на основе акрилового полимера с сульфопропильными группами размером частиц 50 мкм, емкостью не менее 2 мэкв/г сухого сорбента и имеет размеры: диаметр 300 мм, длина 500 мм. Обе колонны предварительно уравновешены тем же буфером А.A sample thus prepared is passed sequentially through interconnected columns. The first one is filled with a diameter of 140 mm and a length of 400 mm, filled with a DEAE-polymer sorbent based on acrylic polymer with diethylaminoethyl groups with a particle size of 100-250 microns, the second is filled with sulfocathionite based on an acrylic polymer with sulfopropyl groups with a particle size of 50 microns, with a capacity of at least 2 meq / g of dry sorbent and has dimensions: diameter 300 mm, length 500 mm. Both columns are pre-balanced by the same buffer A.
На колонне с анионитом происходит удаление из пробы пирогенов, ДНК-, РНК-примесей, агрегированных частиц.On a column with anion exchange resin, pyrogens, DNA, RNA impurities, aggregated particles are removed from the sample.
На второй колонне осуществляется сорбция иммуноглобулинов.The second column is the sorption of immunoglobulins.
После окончания процесса сорбции для промывки через обе колонны пропускают 10 литров буфера А. Затем колонку с анионитом отключают и подвергают регенерации.After the end of the sorption process, 10 liters of buffer A are passed through both columns for washing. Then, the column with anion exchange resin is turned off and regenerated.
На место колонки с анионитом подключают колонну 140×200 мм, заполненную гидрофобным сорбентом на основе стиролдивинилбензола с размером пор менее 10 нм и размером частиц 100-250 мкм и начинают процесс удаления ПАВ и других загрязнений. Для этой цели последовательно через обе колонны пропускают 40 л 2%-ного Tween-80 в буфере А, затем 40 л 1%-ного Tween-80, 20% этанола в буфере А. Затем колонны промывают 80 л буфера А. После этого колонна с гидрофобным сорбентом направляется на регенерацию, а с колонны с катионитом осуществляется элюирование иммуноглобулина 20 литрами 0,35 М натрий-ацетатного буфера с рН 5,65 (буфер Б).A 140 × 200 mm column filled with a hydrophobic sorbent based on styrene-divinylbenzene with a pore size of less than 10 nm and a particle size of 100-250 μm is connected to the place of the column with anion exchange resin and the process of removing surfactants and other contaminants begins. For this purpose, 40 L of 2% Tween-80 in buffer A are passed through both columns successively, then 40 L of 1% Tween-80, 20% ethanol in buffer A. Then the columns are washed with 80 L of buffer A. After this, the column with a hydrophobic sorbent it is sent for regeneration, and immunoglobulin is eluted from a cationic column with 20 liters of 0.35 M sodium acetate buffer with a pH of 5.65 (buffer B).
Пропускание растворов при элюировании и сорбции осуществляют со скоростью 0,6 л/мин, процессы отмывки и регенерации ведут со скоростью 1,1 л/мин.The passage of solutions during elution and sorption is carried out at a rate of 0.6 l / min, the washing and regeneration processes are carried out at a speed of 1.1 l / min.
В результате получают 900 г иммуноглобулина (20 литров раствора с концентрацией иммуноглобулина 50 г/л).The result is 900 g of immunoglobulin (20 liters of a solution with an immunoglobulin concentration of 50 g / l).
Выход - 90%, чистота по ВЭЖХ (гель-фильтрация) - 98%.Yield 90%; HPLC purity (gel filtration) 98%.
Вариант 2.Option 2
3 кг белковой фракции плазмы крови, содержащей 1000 г иммуноглобулина, растворяют в 100 л 0,02 натрий-ацетатного буфера, рН 5,65 (буфер А). К раствору иммуноглобулина добавляют Tween-80 и трибутилфосфат до концентрации 1% каждого. Инкубируют 6 час при перемешивании при комнатной температуре.3 kg of the protein fraction of blood plasma containing 1000 g of immunoglobulin is dissolved in 100 l of 0.02 sodium acetate buffer, pH 5.65 (buffer A). Tween-80 and tributyl phosphate are added to the immunoglobulin solution to a concentration of 1% each. Incubated for 6 hours with stirring at room temperature.
Подготовленную таким образом пробу пропускают последовательно через три соединенные между собой колонны. Первая - диаметром 140 мм и длиной 400 мм - заполнена ДЕАЕ сорбентом на основе акрилового полимера с диэтиламиноэтильными группами, размер частиц 100-250 мкм, вторая колонна диаметром 140 мм и длиной 300 мм заполнена гидрофобным сорбентом на основе стиролдивинилбензола с размером пор менее 10 нм и размером частиц 100-250 мкм, третья колонна диаметром 300 мм и длиной 500 мм заполнена сульфокатионитом на основе акрилового полимера с сульфопропильными группами размером частиц 50 мкм, емкостью не менее 2 мэкв/г сухого сорбента. Все колонны предварительно уравновешены тем же буфером А.A sample thus prepared is passed sequentially through three interconnected columns. The first - 140 mm in diameter and 400 mm long - is filled with DEAE sorbent based on an acrylic polymer with diethylaminoethyl groups, particle size 100-250 μm, the second column with a diameter of 140 mm and 300 mm in length is filled with a hydrophobic sorbent based on styrene-divinylbenzene with pore sizes less than 10 nm and particle size 100-250 microns, the third column with a diameter of 300 mm and a length of 500 mm is filled with sulfocationionite based on acrylic polymer with sulfopropyl groups with a particle size of 50 microns, a capacity of at least 2 meq / g of dry sorbent. All columns are pre-balanced with the same buffer A.
После окончания процесса сорбции все колонны промывают, пропуская 10 литров буфера А. Затем колонки с анионитом и с гидрофобным сорбентом отключают и подвергают их регенерацииAfter the end of the sorption process, all columns are washed, passing 10 liters of buffer A. Then the columns with anion exchange resin and with a hydrophobic sorbent are turned off and regenerated.
Через колонну с катионитом последовательно пропускают 40 л 2%-ного Tween-80 в буфере А, затем 40 л 1%-ного Tween-80, 20% этанола в буфере А, затем 80 л буфера А. После этого осуществляют элюирование иммуноглобулина с колонки с катионитом 18 литрами 0,35 М натрий-ацетатного буфера с рН 5,65 (буфер Б).40 L of 2% Tween-80 in buffer A are successively passed through the cation exchange column, then 40 L of 1% Tween-80, 20% ethanol in buffer A, then 80 L of buffer A. Then, immunoglobulin is eluted from the column with cation exchanger 18 liters of 0.35 M sodium acetate buffer with a pH of 5.65 (buffer B).
Пропускание растворов при элюировании и сорбции осуществляют со скоростью 0,6 л/мин, процессы отмывки и регенерации ведут со скоростью 1,1 л/мин.The passage of solutions during elution and sorption is carried out at a rate of 0.6 l / min, the washing and regeneration processes are carried out at a speed of 1.1 l / min.
В результате получают 910 г иммуноглобулина (18 литров раствора с концентрацией иммуноглобулина 50 г/л).The result is 910 g of immunoglobulin (18 liters of a solution with an immunoglobulin concentration of 50 g / l).
Выход - 91%, чистота по ВЭЖХ (гель-фильтрация) - 98,6%.Yield 91%, HPLC purity (gel filtration) 98.6%.
Вариант 3.Option 3
3 кг белковой фракции плазмы крови, содержащей 1000 г иммуноглобулина, растворяют в 100 л 0,02 натрий-ацетатного буфера, рН 5,65 (буфер А). К раствору иммуноглобулина добавляют Tween-80 и трибутилфосфат до концентрации 1% каждого. Инкубируют 6 час при перемешивании при комнатной температуре.3 kg of the protein fraction of blood plasma containing 1000 g of immunoglobulin is dissolved in 100 l of 0.02 sodium acetate buffer, pH 5.65 (buffer A). Tween-80 and tributyl phosphate are added to the immunoglobulin solution to a concentration of 1% each. Incubated for 6 hours with stirring at room temperature.
Подготовленную таким образом пробу пропускают последовательно через три соединенные между собой колонны. Первая - диаметром 140 мм и длиной 400 мм - заполнена ДЕАЕ сорбентом на основе акрилового полимера с диэтиламиноэтильными группами, размер частиц 100-250 мкм, вторая колонна диаметром 140 мм и длиной 300 мм заполнена гидрофобным сорбентом на основе стиролдивинилбензола с размером пор менее 10 нм и размером частиц 100-250 мкм, третья колонна диаметром 300 мм и длиной 500 мм заполнена сульфокатионитом на основе акрилового полимера с сульфопропильными группами размером частиц 50 мкм, емкостью не менее 2 мэкв/г сухого сорбента. Все колонны предварительно уравновешены тем же буфером А.A sample thus prepared is passed sequentially through three interconnected columns. The first - 140 mm in diameter and 400 mm long - is filled with DEAE sorbent based on an acrylic polymer with diethylaminoethyl groups, particle size 100-250 μm, the second column with a diameter of 140 mm and 300 mm in length is filled with a hydrophobic sorbent based on styrene-divinylbenzene with pore sizes less than 10 nm and particle size 100-250 microns, the third column with a diameter of 300 mm and a length of 500 mm is filled with sulfocationionite based on acrylic polymer with sulfopropyl groups with a particle size of 50 microns, a capacity of at least 2 meq / g of dry sorbent. All columns are pre-balanced with the same buffer A.
После окончания процесса сорбции все колонны промывают, пропуская 10 литров буфера А. Затем колонку с анионитом отключают и подвергают ее регенерации.After the end of the sorption process, all columns are washed, passing 10 liters of buffer A. Then the column with anion exchange resin is turned off and subjected to its regeneration.
Через колонну с гидрофобным сорбентом и катионитом последовательно пропускают 40 л 2%-ного Tween-80 в буфере А, затем 40 л 1%-ного Tween-80, 20% этанола в буфере А, затем 80 л буфера А. После этого гидрофобная колонна направляется на регенерацию, а с колонны с катионитом осуществляют элюирование иммуноглобулина 18 литрами 0,35 М натрий-ацетатного буфера с рН 5,65 (буфер Б).40 l of 2% Tween-80 in buffer A are successively passed through a column with a hydrophobic sorbent and cation exchanger, then 40 l of 1% Tween-80, 20% ethanol in buffer A, then 80 l of buffer A. After this, the hydrophobic column sent for regeneration, and from the column with cation exchange resin, immunoglobulin is eluted with 18 liters of 0.35 M sodium acetate buffer with a pH of 5.65 (buffer B).
Пропускание растворов при элюировании и сорбции осуществляют со скоростью 0,6 л/мин, процессы отмывки и регенерации ведут со скоростью 1,1 л/мин.The passage of solutions during elution and sorption is carried out at a rate of 0.6 l / min, the washing and regeneration processes are carried out at a speed of 1.1 l / min.
В результате получают 920 г иммуноглобулина (19 литров раствора с концентрацией иммуноглобулина 50 г/л).The result is 920 g of immunoglobulin (19 liters of a solution with an immunoglobulin concentration of 50 g / l).
Выход - 92%, чистота по ВЭЖХ (гель-фильтрация) - 98,8%.Yield 92%, HPLC purity (gel filtration) 98.8%.
Заявленный способ был осуществлен и с другими анионообменниками и катионообменниками достаточной емкости и соответствующей белкам пористой структуры. Предпочтительным гидрофобным сорбентом является сорбент с диаметром пор менее 10 нм. В заявленном способе можно использовать любые неденатурирующие кислотные буферные растворы, однако предпочтительно использовать ацетатный с рН от 5 до 6 и концентрацией 0,01-0,5 М.The claimed method was carried out with other anion exchangers and cation exchangers of sufficient capacity and the corresponding porous structure of the proteins. A preferred hydrophobic sorbent is a sorbent with a pore diameter of less than 10 nm. In the inventive method, you can use any non-denaturing acidic buffer solutions, however, it is preferable to use acetate with a pH of from 5 to 6 and a concentration of 0.01-0.5 M.
Сущность заявленного способа заключается в том, что после вирусной сольвент-детергентной инактивации необходимо отделить ПАВ, а заодно и другие примеси от иммуноглобулина и не внести при этом пирогенов, что зачастую бывает при ионообменной хроматографии при недостаточном качестве солей.The essence of the claimed method lies in the fact that after the viral solvent-detergent inactivation, it is necessary to separate the surfactant, and at the same time other impurities from the immunoglobulin and not to add pyrogens, which is often the case with ion exchange chromatography with insufficient salt quality.
Очистку осуществляют в системе из трех колонок с анионитом, гидрофобным сорбентом и катионитом, где на первой и второй колонке удерживаются примеси и не удерживается иммуноглобулин, а на третьей сорбируется иммуноглобулин и отделяются дополнительные примеси.The purification is carried out in a system of three columns with anion exchange resin, hydrophobic sorbent and cation exchange resin, where impurities are retained on the first and second columns and immunoglobulin is not retained, and immunoglobulin is adsorbed on the third and additional impurities are separated.
На первой колонке (анионит) происходит удаление из пробы пирогенов, ДНК-, РНК-примесей, белковых агрегатов.On the first column (anion exchange resin), pyrogens, DNA, RNA impurities, and protein aggregates are removed from the sample.
На второй колонке (гидрофобный сорбент) происходит удаление пирогенов и связывание трибутилфосфата.On the second column (hydrophobic sorbent), pyrogens are removed and tributyl phosphate is bound.
На третьей колонке (катионит) осуществляется сорбция иммуноглобулина и его очистка от дополнительных примесей.On the third column (cation exchange resin), sorption of immunoglobulin and its purification from additional impurities are carried out.
Сорбция и тонкий процесс очистки иммуноглобулина происходит на сульфокатионите, а использование перед сульфокатионитной колонкой вначале ДЕАЕ-анионита, а затем гидрофобной колонки обеспечивает дополнительную очистку от привнесенных (трибутилфосфат) и имеющихся в сырье примесей. Иммуноглобулин на анионите не удерживается в заявленных условиях. На гидрофобном сорбенте он также не сорбируется из-за малого размера пор, препятствующего его проникновению в поры, тогда как низкомолекулярные примеси, включая трибутилфосфат свободно проникают внутрь пор, сорбируясь на всей его поверхности (удельная поверхность гидрофобного сорбента превышает 700 кв.метров на грамм).Sorption and a subtle purification process of immunoglobulin takes place on sulfocationite, and the use of a DEAE anionite and then a hydrophobic column before the sulfation column first provides additional purification of impurities (tributyl phosphate) and the impurities present in the feed. Immunoglobulin on anion exchange resin is not retained under the stated conditions. It is also not adsorbed on a hydrophobic sorbent due to the small pore size, which prevents its penetration into the pores, while low molecular weight impurities, including tributyl phosphate, freely penetrate into the pores, adsorbing on its entire surface (the specific surface of the hydrophobic sorbent exceeds 700 square meters per gram) .
Использование в системе соединенных между собой хроматографических колонок колонки с гидрофобным сорбентом позволяет эффективно отделять трибутилфосфат и провести им обработку исходного неочищенного раствора иммуноглобулина, реализовав хроматографическую очистку в одну стадию на трех колонках без проведения повторной хроматографии (рехроматографии). Использование единого буферного раствора в качестве элюента для всех трех колонок существенно упрощает процесс. Оптимизированный по характеристикам сорбент с катионобменными группами позволяет элюировать высокоочищенный иммуноглобулин без градиента хлорида натрия с высокой концентрацией иммуноглобулина (50 г/л). Это исключает стадию концентрирования, упрощает процесс и повышает выход очищенного продукта.The use of a column with a hydrophobic sorbent in a system of interconnected chromatographic columns enables efficient separation of tributyl phosphate and its processing of the initial crude immunoglobulin solution by chromatographic purification in one step on three columns without repeated chromatography (rechromatography). The use of a single buffer solution as an eluent for all three columns greatly simplifies the process. The sorbent with cation-exchange groups optimized according to its characteristics allows elution of highly purified immunoglobulin without a sodium chloride gradient with a high concentration of immunoglobulin (50 g / l). This eliminates the concentration step, simplifies the process and increases the yield of the purified product.
Claims (18)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2007120439/15A RU2332247C1 (en) | 2007-06-01 | 2007-06-01 | Method of immunoglobulin purification (versions) |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2007120439/15A RU2332247C1 (en) | 2007-06-01 | 2007-06-01 | Method of immunoglobulin purification (versions) |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2332247C1 true RU2332247C1 (en) | 2008-08-27 |
Family
ID=46274418
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2007120439/15A RU2332247C1 (en) | 2007-06-01 | 2007-06-01 | Method of immunoglobulin purification (versions) |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2332247C1 (en) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2467783C2 (en) * | 2010-07-30 | 2012-11-27 | Закрытое акционерное общество "БиоХимМак СТ" | Method for chromatographic extraction of immunoglobulin |
RU2694620C1 (en) * | 2018-10-17 | 2019-07-16 | Закрытое акционерное общество "БиоХимМак СТ" | Method for chromatographic extraction and purification of immunoglobulins |
CN110785427A (en) * | 2018-05-30 | 2020-02-11 | 深圳翰宇药业股份有限公司 | Purification method of long-chain polypeptide |
RU2792819C1 (en) * | 2022-12-06 | 2023-03-24 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "48 Центральный научно-исследовательский институт" Министерства обороны Российской Федерации | Method for obtaining homologous immunoglobulin against covid-19 |
-
2007
- 2007-06-01 RU RU2007120439/15A patent/RU2332247C1/en active
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2467783C2 (en) * | 2010-07-30 | 2012-11-27 | Закрытое акционерное общество "БиоХимМак СТ" | Method for chromatographic extraction of immunoglobulin |
CN110785427A (en) * | 2018-05-30 | 2020-02-11 | 深圳翰宇药业股份有限公司 | Purification method of long-chain polypeptide |
CN110785427B (en) * | 2018-05-30 | 2023-09-05 | 深圳翰宇药业股份有限公司 | Purification method of long-chain polypeptide |
RU2694620C1 (en) * | 2018-10-17 | 2019-07-16 | Закрытое акционерное общество "БиоХимМак СТ" | Method for chromatographic extraction and purification of immunoglobulins |
RU2792819C1 (en) * | 2022-12-06 | 2023-03-24 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "48 Центральный научно-исследовательский институт" Министерства обороны Российской Федерации | Method for obtaining homologous immunoglobulin against covid-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6039550B2 (en) | Protein purification apparatus and method | |
JP6471183B2 (en) | Purification of biomolecules | |
JP6023715B2 (en) | Protein purification method | |
US7431842B2 (en) | Method of using silicon carbide for removal of adventitious agents | |
RU2332247C1 (en) | Method of immunoglobulin purification (versions) | |
JP2018512416A (en) | Method for chromatography | |
WO2013102822A1 (en) | Filtration method | |
US20210363179A1 (en) | Method for removing fxi when purifying plasma proteins | |
JP2024501025A (en) | Systems and methods for process-scale isolation of immunoglobulin G | |
RU2467783C2 (en) | Method for chromatographic extraction of immunoglobulin | |
RU2694620C1 (en) | Method for chromatographic extraction and purification of immunoglobulins | |
JP2002505674A (en) | Method for removing viruses and molecular pathogens in biological material | |
CA2570956C (en) | Method of using silicon carbide for removal of adventitious agents | |
WO2019149693A1 (en) | Protein purification process and platform | |
AU2021355325A1 (en) | Compositions and methods for simplified high efficiency isolation of proteins | |
AU2015255316A1 (en) | Apparatus and process of purification of proteins | |
JPS62267236A (en) | Production of blood type antibody from blood pharmaceutical | |
Wahab | Membrane Adsorbers-Introduction and Technical Specifications |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20141028 |
|
PC43 | Official registration of the transfer of the exclusive right without contract for inventions |
Effective date: 20180716 |
|
PD4A | Correction of name of patent owner | ||
QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20210917 Effective date: 20210917 |