RU2330071C1 - Application of dna-diagnostics for presence of polymorphism r353q in gene of factor vii of blood coagulation for estimation of predisposition to development of habitual noncarrying of pregnancy and method of predisposition estimation to this disease by means of analysis of combination of polymorphisms c677t of gene mthfr and of gene r353q of factor vii - Google Patents
Application of dna-diagnostics for presence of polymorphism r353q in gene of factor vii of blood coagulation for estimation of predisposition to development of habitual noncarrying of pregnancy and method of predisposition estimation to this disease by means of analysis of combination of polymorphisms c677t of gene mthfr and of gene r353q of factor vii Download PDFInfo
- Publication number
- RU2330071C1 RU2330071C1 RU2006145533/13A RU2006145533A RU2330071C1 RU 2330071 C1 RU2330071 C1 RU 2330071C1 RU 2006145533/13 A RU2006145533/13 A RU 2006145533/13A RU 2006145533 A RU2006145533 A RU 2006145533A RU 2330071 C1 RU2330071 C1 RU 2330071C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- gene
- polymorphism
- factor vii
- development
- genotype
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Description
Настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии и медицинской генетики и может быть использовано при определении риска развития привычного невынашивания беременности (ПН). Предлагается способ, позволяющий установить предрасположенность к развитию привычного невынашивания по результатам ДНК-диагностики на носительство определенных полиморфизмов генов метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR) и фактора VII свертывания крови.The present invention relates to the field of molecular biology and medical genetics and can be used to determine the risk of developing habitual miscarriage (PN). A method is proposed that allows one to establish a predisposition to the development of habitual miscarriage according to the results of DNA diagnostics on the carriage of certain polymorphisms of the methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) and coagulation factor VII genes.
Одной из основных причин развития ПН являются гемодинамические микроциркуляторные изменения. Важную роль в регуляции гемодинамики играют процессы свертывания крови. Беременность является сама по себе тромбофилическим состоянием: при физиологическом течении беременности, с одной стороны, происходит активация факторов свертывания, а с другой - снижение активности системы фибринолиза. Указанные изменения направлены на защиту организма от возможного кровотечения при родах. Однако в случае «избыточной» гиперкоагуляции возникают тромботические изменения в материнско-плодовом кровотоке, что приводит к нарушению маточно-плацентарной гемодинамики и, как следствие, развитию таких осложнений, как гестоз, гипоксия плода, невынашивание беременности и др. В связи с этим при прогнозировании возможности развития ПН особое значение приобретает оценка состояния у беременных системы коагуляции крови, прежде всего выявление ее индивидуальных особенностей наследственного характера. Поскольку указанные особенности могут быть связаны с наличием определенных полиморфизмов в генах, участвующих в процессах свертывания крови, выявление носителей таких полиморфизмов среди женщин с клиническими признаками ПН представляется перспективным подходом для оценки предрасположенности к развитию данной патологии.One of the main causes of PN development is hemodynamic microcirculatory changes. An important role in the regulation of hemodynamics is played by blood coagulation processes. Pregnancy is itself a thrombophilic state: in the physiological course of pregnancy, on the one hand, coagulation factors are activated, and on the other, a decrease in the activity of the fibrinolysis system. These changes are aimed at protecting the body from possible bleeding during childbirth. However, in the case of "excessive" hypercoagulation, thrombotic changes occur in the maternal-fetal blood flow, which leads to a violation of the uteroplacental hemodynamics and, as a result, the development of complications such as gestosis, fetal hypoxia, miscarriage, etc. In this regard, when predicting assessment of the condition of pregnant women of the blood coagulation system, especially the identification of its individual characteristics of a hereditary nature, is of particular importance for the development of PN. Since these features may be associated with the presence of certain polymorphisms in the genes involved in blood coagulation, the identification of carriers of such polymorphisms among women with clinical signs of PN seems to be a promising approach for assessing a predisposition to the development of this pathology.
Уровень техникиState of the art
В последнее время появляется все больше работ, посвященных исследованию взаимосвязи между носительством полиморфизмов генов факторов, которые прямо или косвенно относятся к системе свертывания крови, и развитием ПН. В частности, имеются данные, свидетельствующие о наличии опосредованной (кодированием белков - участников процессов коагуляции и фибринолиза) связи с риском невынашивания беременности таких полиморфизмов, как G20210A гена протромбина (Hohlagschwandtner М. et all, 2003), С677Т гена метилентетрагидрофолатредуктазы (Schwahn В., Rozen R., 2001), C1565T гена гликопротеина IIIa, 4G/5G гена PAI-1 (Goodman C.S. et al., 2006).Recently, more and more works have been published devoted to the study of the relationship between the carriage of factor gene polymorphisms that directly or indirectly relate to the blood coagulation system and the development of PN. In particular, there is evidence that there is an indirect (coding of proteins participating in coagulation and fibrinolysis) association with a risk of miscarriage of polymorphisms such as the prothrombin G20210A gene (Hohlagschwandtner M. et all, 2003), the C677T gene of methylenetetrahydrofolate reductase (Schwahn B. Rozen R., 2001), C1565T of the glycoprotein IIIa gene, 4G / 5G of the PAI-1 gene (Goodman CS et al., 2006).
Результаты, полученные разными авторами при изучении одних и тех же полиморфизмов, во многих случаях достаточно противоречивы, однако большинство исследователей сходится во мнении о том, что носительство мутантного аллеля 677Т гена MTHFR определенно является наиболее частым среди других полиморфизмов фактором риска развития ПН.The results obtained by different authors when studying the same polymorphisms are, in many cases, quite contradictory, but most researchers agree that the carriage of the mutant 677T allele of the MTHFR gene is definitely the most frequent risk factor for PN development among other polymorphisms.
Метилентетрагидрофолат редуктаза (MTHFR) - один из ключевых ферментов метаболизма гомоцистеина, который опосредует превращение последнего в метионин с помощью активной формы фолиевой кислоты. При нормальном уровне гомоцистеина в крови продуцируемый эндотелием оксид азота полностью связывает его в присутствии кислорода с образованием мощного вазодилататора и антиагреганта - S-нитрозогомоцистеина, имеющего период полужизни около 15 минут. В случае гипергомоцистеинемии «избыток» гомоцистеина остается не инактивированным, что вызывает оксидативное повреждение эндотелия и способствует развитию эндотелиальной дисфункции. Это, в свою очередь, приводит к активации тканевого фактора и «запуску» каскада тромбообразования с участием фактора VII (Welch G.N., Loscalzo J., 1998).Methylene tetrahydrofolate reductase (MTHFR) is one of the key enzymes of homocysteine metabolism, which mediates the conversion of the latter to methionine using the active form of folic acid. At a normal level of homocysteine in the blood, nitric oxide produced by endothelium completely binds it in the presence of oxygen with the formation of a powerful vasodilator and antiplatelet agent, S-nitrosohomocysteine, with a half-life of about 15 minutes. In the case of hyperhomocysteinemia, the "excess" of homocysteine remains unactivated, which causes oxidative damage to the endothelium and contributes to the development of endothelial dysfunction. This, in turn, leads to the activation of tissue factor and the "start" of the thrombosis cascade involving factor VII (Welch G.N., Loscalzo J., 1998).
В 1995 году Fross и соавт. описали часто встречающийся полиморфизм, который заключается в замене цитозина на тимин в 677-м положении гена, кодирующего MTHFR (Frosst Р., Blom H.J., et al., 1995). Данный полиморфизм обнаруживается у 5-15% белого населения и приблизительно с той же частотой среди населения Японии (Deloughery T.G. et al., 1996). В популяции Санкт-Петербурга, согласно данным Ельчанинова А.П. и соавт. (2000), гомозиготы по данному полиморфизму встречаются с частотой 3,6%, а в Северо-Западном регионе РФ частота встречаемости гомозиготного носительства Т аллеля (ТТ генотип) и гетерозиготного (СТ генотип) составляет 8,4% и 33,6%, соответственно (Ельчанинов А.П. и соавт, 2000). В результате точечной мутации в гене происходит замена Glu на Ala в первичной структуре ферментного белка, что приводит к образованию термолабильного и менее активного варианта фермента (Frosst P. et al., 1995) и последующему повышению концентрации гомоцистеина в плазме крови (гипергомоцистеинемии).In 1995, Fross et al. described a frequently occurring polymorphism, which consists in replacing cytosine with thymine at the 677th position of the gene encoding MTHFR (Frosst P., Blom H.J., et al., 1995). This polymorphism is found in 5-15% of the white population and with approximately the same frequency among the population of Japan (Deloughery T.G. et al., 1996). In the population of St. Petersburg, according to Yelchaninov A.P. et al. (2000), homozygotes for this polymorphism occur with a frequency of 3.6%, and in the Northwestern region of the Russian Federation, the frequency of homozygous carriage of the T allele (TT genotype) and heterozygous (CT genotype) is 8.4% and 33.6%, respectively (Elchaninov A.P. et al., 2000). As a result of a point mutation in the gene, Glu is replaced by Ala in the primary structure of the enzyme protein, which leads to the formation of a thermolabile and less active variant of the enzyme (Frosst P. et al., 1995) and a subsequent increase in the concentration of homocysteine in blood plasma (hyperhomocysteinemia).
К настоящему времени в литературе представлены многочисленные экспериментальные данные, свидетельствующие в пользу взаимосвязи носительства этого полиморфизма с предрасположенностью к развитию ПН (Unfried G. et al., 2002 - прототип настоящего изобретения, Lissak A., 1999, Wang X.P. et al., 2004, Mtiraoui N. et al., 2006). Однако нельзя не отметить, что авторы ряда работ этой связи все же не обнаруживают (Holmes Z.R., Regan L., 1999, Pauer H.U. et al., 2003, Makino A., 2004). С целью повышения надежности прогноза, касающегося наследственной предрасположенности к заболеванию, многие исследователи обращаются к поиску новых полиморфизмов, а также анализу комбинаций полиморфизмов различных генов, относящихся к системе свертывания крови, включающей и полиморфизм С677Т MTHFR (Raziel А. et al., 2001, Goodman C.S. et al., 2006).To date, numerous experimental data are presented in the literature, supporting a relationship between the carriage of this polymorphism and a predisposition to the development of PN (Unfried G. et al., 2002 - prototype of the present invention, Lissak A., 1999, Wang XP et al., 2004, Mtiraoui N. et al., 2006). However, it should be noted that the authors of a number of works of this connection still do not find (Holmes Z.R., Regan L., 1999, Pauer H.U. et al., 2003, Makino A., 2004). In order to increase the reliability of the prognosis regarding the hereditary predisposition to the disease, many researchers turn to the search for new polymorphisms, as well as the analysis of combinations of polymorphisms of various genes related to the blood coagulation system, including C677T MTHFR polymorphism (Raziel A. et al., 2001, Goodman CS et al., 2006).
Общим недостатком большинства предлагаемых для оценки риска развития ПН комбинаций можно считать недостаточно корректный принцип составления анализируемой группы полиморфизмов. В подавляющем большинстве случаев в такую группу включаются полиморфизмы генов, имеющих однонаправленный эффект на систему коагуляции, которые объединяются по признаку предполагаемой или экспериментально установленной связи с риском развития ПН (как правило, все это полиморфизмы прокоагулянтного действия). Между тем, логично предположить, что исключение из рассмотрения полиморфизмов, ответственных за подавление активности системы свертывания крови, может искажать реальную ситуацию и, соответственно, приводить к ошибкам в прогнозе развития заболевания. Более корректным представляется принцип формирования комбинации полиморфизмов, подлежащих анализу с целью оценки предрасположенности к ПН, предусматривающий включение в анализ полиморфизмов генов факторов системы гемомтаза, имеющих разнонаправленный эффект (как промоторный, так и протективный) на развитие заболевания.A common drawback of the majority of the combinations proposed for assessing the risk of developing PN can be considered the insufficiently correct principle of compiling the analyzed group of polymorphisms. In the overwhelming majority of cases, this group includes polymorphisms of genes that have a unidirectional effect on the coagulation system, which are combined on the basis of an assumed or experimentally established connection with the risk of PN development (as a rule, these are polymorphisms of a procoagulant effect). Meanwhile, it is logical to assume that the exclusion from consideration of the polymorphisms responsible for suppressing the activity of the blood coagulation system can distort the real situation and, accordingly, lead to errors in the prognosis of the development of the disease. More correct seems to be the principle of the formation of a combination of polymorphisms to be analyzed in order to assess a predisposition to PN, which includes the inclusion of hemomtase factors that have a multidirectional effect (both promoter and protective) on the development of the disease in the analysis of gene polymorphisms.
Попытка реализовать указанный принцип была положена в основу настоящего изобретения.An attempt to implement this principle was the basis of the present invention.
Раскрытие изобретения.Disclosure of the invention.
Общая задача данного исследования - создание адекватной модели для прогнозирования развития ПН, основанной на анализе комбинации одновременно промоторных и протективных значимых для развития ПН полиморфизмов, относящихся к генам, которые кодируют функционально связанные между собой белки свертывания крови, участвующих в запуске каскада тромбообразования по внешнему пути свертывания.The overall objective of this study is to create an adequate model for predicting the development of ST, based on an analysis of a combination of both promoter and protective, important for the development of ST, polymorphisms related to genes that encode functionally related blood coagulation proteins involved in triggering a blood clotting cascade along an external coagulation pathway .
В рамках настоящего изобретения поставленная задача нашла конкретное воплощение в разработке способа оценки предрасположенности к развитию ПН, осуществляемого путем одновременного ДНК-тестирования образцов крови на носительство полиморфизма С677Т гена MTHFR и полиморфизма R353Q гена фактора VII, первый из которых характеризуется прокоагулянтным эффектом, а второй - ингибирующим действием в отношении процессов свертывания крови, и составления заключения с учетом суммарного влияния выявленных генотипов на развитие заболевания.In the framework of the present invention, the stated task was specifically embodied in the development of a method for assessing a predisposition to the development of PN, carried out by simultaneous DNA testing of blood samples for carriage of the C677T polymorphism of the MTHFR gene and R353Q polymorphism of the factor VII gene, the first of which is characterized by a procoagulant effect, and the second by inhibitory action in relation to blood coagulation processes, and drawing up conclusions taking into account the total effect of the identified genotypes on the development of the disease.
Выбор данной пары полиморфизмов был обусловлен следующими причинами.The choice of this pair of polymorphisms was due to the following reasons.
Как уже указывалось, полиморфизм С677Т гена MTHFR является одним из наиболее исследованных и частых полиморфизмов в отношении его связи с ПН, причем для гомозиготного состояния этого полиморфизма (ТТ) большинством исследователей показано выраженное прокоагулянтное действие, повышающее риск развития заболевания.As already mentioned, the C677T polymorphism of the MTHFR gene is one of the most studied and frequent polymorphisms in relation to its association with PN, and for the homozygous state of this polymorphism (TT), most researchers have shown a pronounced procoagulant effect that increases the risk of developing the disease.
Что касается полиморфизма R353Q гена фактора VII, то, во-первых, кодируемый этим геном белок рассматривался нами как участвующий наравне с MTHFR в тромбообразовании путем активации тканевого фактора, а во-вторых, предположительно имеющий обратное по отношению к 677Т действие на процессы свертывания крови.As for the R353Q polymorphism of the factor VII gene, first, the protein encoded by this gene was considered by us as participating along with MTHFR in thrombus formation by activation of tissue factor, and secondly, presumably having an opposite effect on blood coagulation with respect to 677T.
Фактор VII - неактивный витамин К-зависимый профермент, синтезируемый в печени и секретируемый в виде одноцепочечного гликопротеина молекулярной массой 50 кДа. При связывании с тканевым фактором он превращается в двухцепочечную активную форму и далее включается в процесс коагуляции в качестве активаторов факторов Х и XI.Factor VII is an inactive vitamin K-dependent proenzyme synthesized in the liver and secreted as a single-chain glycoprotein with a molecular weight of 50 kDa. When bound to a tissue factor, it turns into a double-stranded active form and is further included in the coagulation process as activators of factors X and XI.
К началу 90-х годов накопилось много экспериментальных данных о наличии корреляции между содержанием в плазме активного фактора VII и тромбообразованием, в частности при некоторых кардиологических заболеваниях (Orlando M. et al., 1987; Hoffman С. et al., 1988; de Sousa J.C. et al., 1988). Что касается работ по изучению роли фактора VII в развитии ПН, то в ряде из них также получены данные, свидетельствующие о том, что повышение его концентрации в крови является фактором риска спонтанного прерывания беременности (Miller С. et al., 2005). В 1991 году Green и соавт. обнаружили связь между концентрацией фактора VII в крови и полиморфизмом кодирующего его гена, характеризующимся заменой гуанина (G) на аденин (А) в 353-м кодоне, результатом которой является замена аргинина глутамином в последовательности белка (Green F. et al., 1991). При этом согласно данным Lane D.A., 2000 мутантный аллель ассоциирован примерно с 20-30% снижением уровня белка в плазме (Lane D.A. et al., 2000). В более позднем исследовании, включавшем более 2500 пациентов с кардиоваскулярной патологией, было установлено, что RQ (Arg/Gln)-генотип четко коррелирует со снижением риска ишемической болезни сердца (Wu А.Н., Tsongalis G.J., 2001). Аналогичные результаты получены в работе Girelli D. и соавт. (2000), которые показали, что наличие RQ и QQ генотипа может отчасти объяснить отсутствие инфаркта миокарда у лиц с выраженным атеросклерозом (Girelli D. et al., 2000).By the beginning of the 90s, a lot of experimental data had accumulated on the presence of a correlation between the content of active factor VII in the plasma and thrombosis, in particular with certain cardiac diseases (Orlando M. et al., 1987; Hoffman C. et al., 1988; de Sousa JC et al., 1988). As for the studies on the role of factor VII in the development of PN, some of them also obtained data indicating that an increase in its concentration in the blood is a risk factor for spontaneous abortion (Miller C. et al., 2005). In 1991, Green et al. found a relationship between the concentration of factor VII in the blood and the polymorphism of the gene encoding it, characterized by the replacement of guanine (G) with adenine (A) in the 353rd codon, the result of which is the replacement of arginine with glutamine in the protein sequence (Green F. et al., 1991) . Moreover, according to the data of Lane D.A., 2000, the mutant allele is associated with approximately a 20-30% decrease in plasma protein levels (Lane D.A. et al., 2000). In a later study, which included more than 2500 patients with cardiovascular pathology, it was found that the RQ (Arg / Gln) genotype clearly correlates with a reduced risk of coronary heart disease (Wu A.N., Tsongalis G.J., 2001). Similar results were obtained by Girelli D. et al. (2000), which showed that the presence of the RQ and QQ genotype can partially explain the absence of myocardial infarction in individuals with severe atherosclerosis (Girelli D. et al., 2000).
Таким образом, имеющиеся в литературе данные свидетельствуют о связи мутантного аллеля 353Q со снижением уровня фактора VII, а следовательно, и с возможным снижением активности свертывающей системы крови, результатом чего можно считать его протективное действие при некоторых кардиологических заболеваниях. Что касается попыток исследования связи с ПН, то влияние на развитие заболевания полиморфизма R353Q VII фактора до настоящего времени не изучалось. В то же время имеются данные о том, что патогенез ПН связан с повышением концентрации VII фактора в плазме крови (Miller et al., 2005).Thus, the data available in the literature indicate the relationship of the mutant allele 353Q with a decrease in the level of factor VII, and, consequently, with a possible decrease in the activity of the blood coagulation system, as a result of which its protective effect in certain cardiac diseases can be considered. As for attempts to study the relationship with PN, the influence on the development of the disease of the polymorphism of R353Q VII factor has not yet been studied. At the same time, there is evidence that the pathogenesis of PN is associated with an increase in the concentration of factor VII in plasma (Miller et al., 2005).
Осуществление изобретения включало следующие этапы.The implementation of the invention included the following steps.
а) Экспериментальная проверка сведений о взаимосвязи полиморфизма С677Т гена MTHFR с развитием ПН.a) Experimental verification of the relationship of the C677T polymorphism of the MTHFR gene with the development of PN.
б) Установление наличия и характера влияния полиморфизма R353Q на развитие ПН.b) Establishing the presence and nature of the effect of R353Q polymorphism on the development of PN.
в) Анализ суммарного эффекта двух исследуемых полиморфных состояний генов MTHFR и фактора VII относительно риска развития ПН и использование полученных результатов для оценки предрасположенности к развитию заболевания.c) Analysis of the total effect of the two studied polymorphic states of the MTHFR and factor VII genes with respect to the risk of PN development and the use of the results to assess the susceptibility to the development of the disease.
Проведение ДНК-диагностики пациенток с целью определения аллельных вариантов двух анализируемых генов проводилось нами, главным образом, с помощью метода полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, однако следует иметь в виду, что при осуществлении предлагаемого способа может быть применен любой из известных ныне методов, обеспечивающий надежное детектирование точечных замен в последовательности ДНК, в частности аллель-специфичная ПЦР, масс-спектрометрия, метод гибридизации, ПЦР в реальном времени и т.д.DNA diagnostics of patients in order to determine allelic variants of the two analyzed genes was carried out by us, mainly using the method of polymorphism of the lengths of restriction fragments, however, it should be borne in mind that when implementing the proposed method, any of the currently known methods can be used to ensure reliable detection point substitutions in the DNA sequence, in particular allele-specific PCR, mass spectrometry, hybridization method, real-time PCR, etc.
Проведенный анализ ДНК у 120 женщин с клиникой угрозы прерывания беременности показал, чтоA DNA analysis of 120 women with a pregnancy termination clinic showed that
а) в случае полиморфизма С677Т в гене MTHFR гомозиготный генотип ТТ в несколько раз чаще выявляется у женщин с неблагоприятными исходами в анамнезе (выкидыши, неразвивающаяся беременность) по сравнению с группой женщин, не имевших неблагоприятных исходов в анамнезе. Причем данные различия сохраняются вне зависимости от наличия или отсутствия у них воспалительных заболеваний репродуктивной сферы, которые могут также способствовать формированию ПН. Генотипы СС и СТ не обнаруживают достоверной связи с развитием ПН (пример 2, фиг.2, 3);a) in the case of C677T polymorphism in the MTHFR gene, the TT homozygous genotype is several times more likely to be detected in women with a history of miscarriages (miscarriages, undeveloped pregnancy) compared with a group of women who did not have a history of adverse outcomes. Moreover, these differences persist regardless of the presence or absence of inflammatory diseases of the reproductive sphere, which can also contribute to the formation of PN. The genotypes of SS and CT do not show a reliable connection with the development of PN (example 2, figure 2, 3);
б) В случае полиморфизма R353Q в гене фактора VII частота встречаемости гетерозиготного генотипа RQ у женщин с неблагоприятными исходами в анамнезе значительно (примерно в 5 раз) ниже, чем в группе пациенток с отсутствием таких исходов. Соответственно при отсутствии Q-аллеля гомозиготный генотип RR проявляет себя как неблагоприятный наследственный признак. Генотип QQ характеризуется низкой частотой встречаемости (2,4% в норме и 2,5% в исследуемых группах), что в рамках данного исследования препятствует составлению однозначного мнения относительно его взаимосвязи с ПН (пример 3, фиг.4 и 5).b) In the case of R353Q polymorphism in the factor VII gene, the frequency of occurrence of the RQ heterozygous genotype in women with an unfavorable outcome is significantly (about 5 times) lower than in the group of patients with no such outcomes. Accordingly, in the absence of the Q allele, the homozygous RR genotype manifests itself as an unfavorable hereditary trait. The QQ genotype is characterized by a low frequency of occurrence (2.4% normal and 2.5% in the studied groups), which in the framework of this study prevents the formation of an unambiguous opinion regarding its relationship with PN (example 3, figures 4 and 5).
в) Влияние конкретной комбинации двух генотипов на развитие ПН представляет собой результат суммирования эффектов составляющих ее генотипов (пример 4, фиг.6 и 7). Генотипы СТ и СС проявляют себя как «нейтральные» в комбинации с любым генотипом, относящиеся к полиморфизму R353Q, в данном случае благоприятный/неблагоприятный эффект зависит от наличия протективного генотипа RQ. Генотип ТТ при отсутствии протективного генотипа RQ усиливает неблагоприятный эффект на формирование ПН. К сожалению, из-за отсутствия пациенток с генотипом RQ/TT мы не можем сказать о влиянии данного сочетания генотипов.c) The effect of a particular combination of two genotypes on the development of PN is the result of summing up the effects of its constituent genotypes (Example 4, FIGS. 6 and 7). The CT and SS genotypes manifest themselves as “neutral” in combination with any genotype related to R353Q polymorphism, in this case the favorable / unfavorable effect depends on the presence of the protective RQ genotype. The TT genotype in the absence of the protective RQ genotype enhances the adverse effect on PN formation. Unfortunately, due to the lack of patients with the RQ / TT genotype, we cannot say about the effect of this combination of genotypes.
На основании полученных данных оба взятые в анализ полиморфизма были признаны значимыми для развития ПН; при этом для гомозиготного состония мутантного аллеля 677Т гена MTHFR был подтвержден выраженный неблагоприятный эффект, коррелирующий с угрозой прерывания беременности, а для аллеля 353 Q гена VII фактора впервые показано явное протективное влияние в отношении развития ПН. По результатам исследования определяемых у пациенток конкретных генотипов сделан вывод о суммировании эффектов, наблюдаемых для полиморфизма С677Т MTHFR и полиморфизма R353Q фактора VII в отдельности и, соответственно, о том, что корректное прогнозирование риска невынашивания требует одновременного исследования образцов ДНК на носительство обоих названных полиморфизмов. В связи с этим для оценки предрасположенности женщин к развитию ПН предлагается проводить ДНК-диагностику на носительство полиморфизма С677Т в гене MTHFR и полиморфизма R353Q в гене фактора VII с целью установления генотипа пациентки для определения прогноза заболевания (см. таблицу 1).Based on the data obtained, both polymorphisms taken in the analysis were recognized as significant for the development of PN; at the same time, a pronounced adverse effect was confirmed for the homozygous state of the mutant allele 677T of the MTHFR gene that correlates with the threat of termination of pregnancy, and for the 353 Q allele of the factor VII gene, a clear protective effect was shown for the first time in relation to the development of PN. Based on the results of the study of specific genotypes determined in patients, it was concluded that the effects observed for C677T MTHFR polymorphism and R353Q polymorphism of factor VII separately are summarized and, accordingly, that the correct prediction of the risk of miscarriage requires the simultaneous study of DNA samples for the carriage of both of these polymorphisms. In this regard, to assess the predisposition of women to the development of PN, it is proposed to conduct DNA diagnostics on the carriage of C677T polymorphism in the MTHFR gene and R353Q polymorphism in the factor VII gene in order to establish the patient’s genotype to determine the prognosis of the disease (see table 1).
Таким образом, первым аспектом изобретения является применение ДНК-диагностики на наличие полиморфизма R353Q гена фактора VII свертывания крови для оценки предрасположенности к развитию привычного невынашивания беременности, а вторым - новый способ оценки предрасположенности к развитию привычного невынашивания беременности, предусматривающий проведение ДНК-диагностики на наличие полиморфизма С677Т гена метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR) и полиморфизма R353Q гена фактора VII свертывания крови и составление заключения по результатам определения генотипов с использованием таблицы №1.Thus, the first aspect of the invention is the use of DNA diagnostics for the presence of the R353Q polymorphism of the coagulation factor VII gene for assessing a predisposition to the development of habitual miscarriage, and the second is a new method for assessing the susceptibility to the development of habitual miscarriage, involving DNA diagnostics for the presence of polymorphism C677T of the gene of methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) and polymorphism R353Q of the gene of factor VII coagulation of blood and the conclusion on the results of determination division of genotypes using table No. 1.
Краткое описание графических материалов.A brief description of the graphic materials.
Фиг.1Figure 1
А. Специфические фрагменты, наблюдаемые при электрофоретическом разделении рестрицированного ПЦР-продукта области полиморфизма С677Т MTHFR.A. Specific fragments observed upon electrophoretic separation of the restricted PCR product of the C677T MTHFR polymorphism region.
СС - генотип, гомозиготный по аллелю дикого типа, СТ - гетерозиготный генотип и ТТ - гомозиготный генотип по мутантному аллелю.SS is the genotype homozygous for the wild-type allele, CT is the heterozygous genotype, and TT is the homozygous genotype for the mutant allele.
Б. Специфические фрагменты, наблюдаемые при электрофоретическом разделении рестрицированного ПЦР-продукта области полиморфизма R353Q фактора VII. RR - генотип, гомозиготный по аллелю дикого типа, RQ - гетерозиготный генотип и QQ - гомозиготный генотип по мутантному аллелю.B. Specific Fragments Observed During Electrophoretic Separation of the Restricted PCR Product of the Factor VII R353Q Polymorphism Region RR is the genotype homozygous for the wild-type allele, RQ is the heterozygous genotype and QQ is the homozygous genotype for the mutant allele.
Фиг.2 - Полиморфизм MTHFR С677Т. Распределение частот встречаемости различных генотипов в популяции и в группах пациенток с наличием и с отсутствием неблагоприятных исходов в анамнезе. По оси ординат - процент от общего количества в данной группе. Белые столбцы - контрольная группа; серые столбцы - подгруппа пациенток без неблагоприятных исходов в анамнезе; черные столбцы - подгруппа пациенток с неблагоприятными исходами в анамнезе.Figure 2 - Polymorphism MTHFR C677T. Frequency distribution of the occurrence of various genotypes in the population and in groups of patients with and without a history of adverse outcomes. The ordinate axis is the percentage of the total in this group. White columns - control group; gray columns - a subgroup of patients with no history of adverse outcomes; black columns are a subgroup of patients with a history of adverse outcomes.
Фиг.3 - Полиморфизм MTHFR С677Т. Распределение частот полиморфизмов в группе пациенток без сопутствующих воспалительных заболеваний органов малого таза в зависимости от наличия/отсутствия неблагоприятных исходов и в популяции. По оси ординат - процент от общего количества в данной группе. Белые столбцы - контрольная группа; серые столбцы - подгруппа пациенток без неблагоприятных исходов в анамнезе; черные столбцы - подгруппа пациенток с неблагоприятными исходами в анамнезе.Figure 3 - Polymorphism MTHFR C677T. Frequency distribution of polymorphisms in a group of patients without concomitant inflammatory diseases of the pelvic organs, depending on the presence / absence of adverse outcomes and in the population. The ordinate axis is the percentage of the total in this group. White columns - control group; gray columns - a subgroup of patients with no history of adverse outcomes; black columns are a subgroup of patients with a history of adverse outcomes.
Фиг.4 - Полиморфизм R353Q фактора VII. Распределение частот встречаемости различных генотипов в популяции и в группах пациенток с наличием и с отсутствием неблагоприятных исходов в анамнезе. По оси ординат - процент от общего количества в данной группе. Белые столбцы - контрольная группа; серые столбцы - подгруппа пациенток без неблагоприятных исходов в анамнезе; черные столбцы - подгруппа пациенток с неблагоприятными исходами в анамнезе.Figure 4 - Polymorphism R353Q of factor VII. Frequency distribution of the occurrence of various genotypes in the population and in groups of patients with and without a history of adverse outcomes. The ordinate axis is the percentage of the total in this group. White columns - control group; gray columns - a subgroup of patients with no history of adverse outcomes; black columns are a subgroup of patients with a history of adverse outcomes.
Фиг.5 - Полиморфизм R353Q фактора VII. Распределение частот полиморфизмов в группе пациенток без сопутствующих воспалительных заболеваний органов малого таза в зависимости от наличия/отсутствия неблагоприятных исходов и в популяции. По оси ординат - процент от общего количества в данной группе. Белые столбцы - контрольная группа; серые столбцы - подгруппа пациенток без неблагоприятных исходов в анамнезе; черные столбцы - подгруппа пациенток с неблагоприятными исходами в анамнезе.Figure 5 - Polymorphism R353Q of factor VII. Frequency distribution of polymorphisms in a group of patients without concomitant inflammatory diseases of the pelvic organs, depending on the presence / absence of adverse outcomes and in the population. The ordinate axis is the percentage of the total in this group. White columns - control group; gray columns - a subgroup of patients with no history of adverse outcomes; black columns are a subgroup of patients with a history of adverse outcomes.
Фиг.6 - Соотношение неблагоприятных и благоприятных исходов для генотипов MTHFR и фактора VII, определяемых как 677ТТ-/R353Q+ и 677ТТ+/R353Q -. По оси ординат - процент от общего количества в данной группе. Белые столбцы - подгруппа пациенток без неблагоприятных исходов в анамнезе; серые столбцы - подгруппа пациенток с неблагоприятными исходами в анамнезе.6 - The ratio of unfavorable and favorable outcomes for the genotypes of MTHFR and factor VII, defined as 677TT- / R353Q + and 677TT + / R353Q -. The ordinate axis is the percentage of the total in this group. White columns are a subgroup of patients with no history of adverse outcomes; gray columns are a subgroup of patients with a history of adverse outcomes.
Фиг.7 - Соотношение неблагоприятных и благоприятных исходов для различных генотипов MTHFR C677T/VIIF R353Q. По оси ординат - процент от общего количества в данной группе. Белые столбцы - подгруппа пациенток без неблагоприятных исходов в анамнезе; серые столбцы - подгруппа пациенток с неблагоприятными исходами в анамнезе.7 - The ratio of adverse and favorable outcomes for different genotypes of MTHFR C677T / VIIF R353Q. The ordinate axis is the percentage of the total in this group. White columns are a subgroup of patients with no history of adverse outcomes; gray columns are a subgroup of patients with a history of adverse outcomes.
Осуществление изобретения.The implementation of the invention.
I. Материалы и методы.I. Materials and methods.
1. Критерии отбора пациенток с ПН для проведения анализа.1. Criteria for the selection of patients with PN for analysis.
В исследуемую группу отбирались женщины российской популяции с клиническими признаками угрозы прерывания беременности на ранних сроках (до 16 недель): кровянистые выделения из половых путей, тянущие боли внизу живота.Women of the Russian population with clinical signs of the threat of termination of pregnancy in the early stages (up to 16 weeks) were selected in the study group: bloody discharge from the genital tract, pulling pains in the lower abdomen.
При этом в анализируемую группу не включали пациенток с наличием хромосомной патологии, АФС, Rh-конфликта, анатомических аномалий репродуктивных органов.In this case, the analyzed group did not include patients with the presence of chromosomal pathology, APS, Rh conflict, anatomical abnormalities of the reproductive organs.
Контрольная группа формировалась из здоровых доноров российской популяции.The control group was formed from healthy donors of the Russian population.
2. Отбор образцов крови и выделение ДНК.2. Blood sampling and DNA isolation.
Венозная кровь в объеме 10 мл забиралась в пробирки, содержащие ЭДТА в качестве антикоагулянта (1 объем раствора 0,5 М Na2-ЭДТА, рН 8,0+9 объемов крови). После тщательного перемешивания образцы помещались в морозильную камеру и хранились при -20°С. Выделение геномной ДНК проводили с помощью модифицированного метода с протеиназой К и экстракцией фенол-хлороформом. Для этого в 1,5 мл пробирку (Eppendorf) вносили 700 мкл анализируемого образца крови и 700 мкл ТЕ-буфера (10 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА) для гемолиза эритроцитов. Процедуру повторяли 2 раза, а затем к клеточному осадку добавляли 400 мкл буфера для протеиназы К, содержащего 200 мкг/мл протеиназы К, после чего инкубировали 4 часа при 60°С на термошейкере с постоянным перемешиванием (850 об/мин). Далее проводили фенол-хлороформную экстракцию ДНК с последующим осаждением 96% этанолом и центрифугированием в течение 10 мин при 10000 об/мин. После серии промывок ДНК элюировали ТЕ буфером (200 мкл). Концентрация выделенной ДНК составляла от 30 до 50 нг/мкл.Venous blood in a volume of 10 ml was collected in tubes containing EDTA as an anticoagulant (1 volume of a solution of 0.5 M Na 2 -EDTA, pH 8.0 + 9 volumes of blood). After thorough mixing, the samples were placed in a freezer and stored at -20 ° C. Genomic DNA was isolated using a modified method with proteinase K and phenol-chloroform extraction. To do this, 700 μl of the analyzed blood sample and 700 μl of TE buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA) were added to a 1.5 ml tube (Eppendorf) for erythrocyte hemolysis. The procedure was repeated 2 times, and then 400 μl of Proteinase K buffer containing 200 μg / ml Proteinase K was added to the cell pellet, and then incubated for 4 hours at 60 ° C with a constant temperature shaker (850 rpm). Then phenol-chloroform DNA extraction was carried out, followed by precipitation with 96% ethanol and centrifugation for 10 minutes at 10,000 rpm. After a series of washes, DNA was eluted with TE buffer (200 μl). The concentration of extracted DNA ranged from 30 to 50 ng / μl.
3. ПЦР-амплификация и анализ ПЦР-продуктов.3. PCR amplification and analysis of PCR products.
Для определения полиморфизмов в исследуемых генах применялся метод ПДРФ (полиморфизма длины рестрикционных фрагментов). ПЦР проводили в термоциклере Master Cycler Gradient фирмы Eppendorf. При этом для каждого из генов использовали специфические праймеры и условия реакции.To determine the polymorphisms in the studied genes, the RFLP method (restriction fragment length polymorphism) was used. PCR was performed in a Master Cycler Gradient thermal cycler from Eppendorf. Moreover, specific primers and reaction conditions were used for each of the genes.
ПЦР проводили в объеме 25 мкл в растворе следующего состава: по 6 пмоль каждого праймера, четыре дезоксинуклеозидтрифосфата (каждый в концентрации 0,2 мМ), 1 мкл геномной ДНК, ПЦР смесь фирмы Amplisense, содержащая Taq-полимеразу, буфер для Taq-полимеразы и MgCl2.PCR was performed in a volume of 25 μl in a solution of the following composition: 6 pmol of each primer, four deoxynucleoside triphosphates (each at a concentration of 0.2 mM), 1 μl of genomic DNA, Amplisense PCR mixture containing Taq polymerase, Taq polymerase buffer and MgCl 2 .
Для рестрикционного анализа продукты ПЦР подвергали обработке соответствующей рестриктазой в течение 6 часов. На реакцию рестрикции брали 9 мкл ампликона, 0,5 мкл рестриктазы (3-4ЕД) и 1 мкл 10× буфера для рестриктазы.For restriction analysis, PCR products were subjected to treatment with an appropriate restriction enzyme for 6 hours. 9 μl of amplicon, 0.5 μl of restrictase (3-4 ED) and 1 μl of 10 × restriction buffer were taken for the restriction reaction.
Продукты рестрикции/амплификации анализировали посредством электрофореза в 2% агарозном геле, содержащем 1 мкг/мл бромистого этидия. Размер фрагментов определяли с помощью стандарта массы 500 п.о. - Ladder фирмы «Fermentas».The restriction / amplification products were analyzed by electrophoresis on a 2% agarose gel containing 1 μg / ml ethidium bromide. Fragment size was determined using a 500 bp mass standard. - Ladder from Fermentas.
4. Статистическая обработка результатов.4. Statistical processing of results.
Обработку результатов, полученных при ДНК-тестировании, проводили с помощью программы «Статистика 6.0» методом χ2.Processing of the results obtained by DNA testing was performed using the "Statistics 6.0" program using the χ 2 method.
II. Примеры реализации и результаты.II. Implementation examples and results.
Пример 1. Общая характеристика исследуемой группы.Example 1. General characteristics of the study group.
Исследуемая группа включала 120 пациенток, отобранных в соответствии с критериями, указанными в разделе «Материалы и методы». В контрольную группу было включено 200 здоровых доноров.The study group included 120 patients selected in accordance with the criteria specified in the section "Materials and methods". The control group included 200 healthy donors.
Первоначально женщины исследуемой группы были разделены на подгруппы по следующим критериям:Initially, women in the study group were divided into subgroups according to the following criteria:
а) наличие/отсутствие воспалительных заболеваний репродуктивной сферы (хронический аднексит, хронический эндометрит, бактериальный вагиноз, грибковый кольпит, хламидиоз, уреаплазмоз), как дополнительного фактора риска ПН - подгруппы «а1» и «а2», соответственно.a) the presence / absence of inflammatory diseases of the reproductive sphere (chronic adnexitis, chronic endometritis, bacterial vaginosis, fungal colpitis, chlamydia, ureaplasmosis), as an additional risk factor for PN - subgroups “A1” and “A2”, respectively.
б) наличие/отсутствие неблагоприятных исходов (выкидыши, неразвивающаяся беременность) в анамнезе - подгруппы «б1» и «б2», соответственно.b) the presence / absence of adverse outcomes (miscarriages, non-developing pregnancy) in the anamnesis - subgroups "b1" and "b2", respectively.
Далее в подгруппах «а» было проведено исследование зависимости частоты неблагоприятных исходов от наличия заболевания. При этом было установлено, что эти показатели в двух подгруппах различаются незначительно (частота неблагоприятных исходов для группы «а1» - 78%, для группы «а2» - 68%). Это позволило при проведении генетического анализа пренебречь наличием у пациенток воспалительных заболеваний, входящих в перечень, который приведен выше, и продолжить исследования только с учетом критерия, относящегося к наличию/отсутствию неблагоприятных исходов в анамнезе.Further, in subgroups “a”, a study was conducted of the dependence of the frequency of adverse outcomes on the presence of the disease. At the same time, it was found that these indicators in the two subgroups differ slightly (the frequency of adverse outcomes for the “A1” group is 78%, for the “A2” group - 68%). This allowed the genetic analysis to neglect the presence of inflammatory diseases in the patients listed on the list above and to continue research only taking into account the criterion related to the presence / absence of adverse outcomes in the anamnesis.
Пример 2. Проведение анализа ДНК на носительство полиморфизма С677Т гена MTHFR и его результаты.Example 2. DNA analysis for carriage of the C677T polymorphism of the MTHFR gene and its results.
Отбор образцов крови, выделение ДНК, ПЦР-амплификацию и анализ ПЦР-продуктов проводили в соответствии с методиками, описанными в разделе «Материалы и методы». При этом для амплификации использовали праймеры, представленные в нижеследующей таблице 1.Blood sampling, DNA isolation, PCR amplification and analysis of PCR products was carried out in accordance with the methods described in the section "Materials and methods". In this case, primers presented in the following table 1 were used for amplification.
ПЦР проводили при следующих условиях: денатурация (94°С, 5 мин) - 1 цикл, денатурация (94°С, 60 сек), отжиг (62°С, 90 сек) и элонгация (72°С, 60 сек) - 38 циклов, конечная элонгация (72°С, 5 мин) - 1 цикл.PCR was performed under the following conditions: denaturation (94 ° C, 5 min) - 1 cycle, denaturation (94 ° C, 60 sec), annealing (62 ° C, 90 sec) and elongation (72 ° C, 60 sec) - 38 cycles, final elongation (72 ° C, 5 min) - 1 cycle.
Для получения специфических рестрикционных фрагментов применяли рестриктазу HinfI.To obtain specific restriction fragments, the HinfI restriction enzyme was used.
О наличии в образце определенных аллельных вариантов гена MTHFR судили по появлению в геле фрагментов с размерами, указанными ниже (фиг.1А).The presence of certain allelic variants of the MTHFR gene in the sample was judged by the appearance in the gel of fragments with the dimensions indicated below (Fig. 1A).
При проведении ДНК-тестирования на носительство полиморфизма С677Т были получены следующие результаты.When conducting DNA testing for the carriage of C677T polymorphism, the following results were obtained.
а) Определение частоты встречаемости аллеля 677Т в группе доноров показало соответствие этого показателя равновесию Харди-Вайнберга, что свидетельствовало о репрезентативности выборки. В исследуемой группе этот аллель обнаруживался с такой же частотой (30,1%), что и в контрольной (30%).a) Determination of the frequency of occurrence of the 677T allele in the group of donors showed that this indicator corresponded to Hardy-Weinberg equilibrium, which indicated the representativeness of the sample. In the study group, this allele was detected with the same frequency (30.1%) as in the control (30%).
б) При сравнении частот встречаемости генотипов СС, СТ и ТТ в двух исследованных подгруппах пациенток (с наличием и отсутствием неблагоприятных исходов в анамнезе) было установлено, что у женщин с наличием неблагоприятных исходов в анамнезе частота генотипа MTHFR ТТ была примерно в 6 раз выше (17.9%), чем у остальных пациенток (3%, OR=5,67, p<0,05), и примерно вдвое выше, чем в популяции (9%, OR=1,9; р=0,3). Для гетерозиготы СТ результаты по двум анализируемым подгруппам практически совпадали (38,4% и 40,6%) и при этом соответствовали частоте встречаемости данного генотипа в популяции (42%). Представленность гомозиготного генотипа СС в группе с отсутствием неблагоприятных исходов была несколько выше, чем в группе с неблагоприятным анамнезом, однако выявленное различие не было статистически достоверным (фиг.2).b) When comparing the frequencies of occurrence of SS, CT, and TT genotypes in the two studied subgroups of patients (with the presence and absence of adverse outcomes in the anamnesis), it was found that in women with a history of adverse outcomes, the frequency of the MTHFR TT genotype was approximately 6 times higher ( 17.9%) than in other patients (3%, OR = 5.67, p <0.05), and approximately twice as high as in the population (9%, OR = 1.9; p = 0.3). For heterozygote CT, the results for the two analyzed subgroups practically coincided (38.4% and 40.6%) and at the same time corresponded to the frequency of occurrence of this genotype in the population (42%). The representation of the homozygous SS genotype in the group with the absence of adverse outcomes was slightly higher than in the group with an unfavorable history, however, the revealed difference was not statistically significant (Fig. 2).
С целью дополнительного контроля возможности искажения результатов в связи с наличием у пациенток воспалительных заболеваний при оценке распределения генотипов СС, СТ и ТТ в каждой из подгрупп были использованы только данные, полученные при тестировании ДНК женщин с отсутствием указанных заболеваний. Полученные данные (фиг.3) свидетельствуют о сохранении всех закономерностей, выявленных при анализе группы в целом.In order to further control the possibility of distortion of the results due to the presence of inflammatory diseases in the patients, when assessing the distribution of SS, CT, and TT genotypes in each of the subgroups, only data obtained by testing the DNA of women with no such diseases were used. The data obtained (figure 3) indicate the preservation of all the patterns identified in the analysis of the group as a whole.
На основании результатов тестирования ДНК на носительство полиморфизма С677Т был сделан вывод, что гомозиготное носительство аллеля 677Т является при прогнозировании ПН выраженным неблагоприятным признаком, а генотипы СС и СТ с точки зрения предрасположенности к заболеванию представляются нейтральными.Based on the results of DNA testing for the carriage of C677T polymorphism, it was concluded that homozygous carriage of the 677T allele is a pronounced unfavorable sign when predicting PN, and the genotypes of CC and CT from the point of view of the susceptibility to the disease appear to be neutral.
Пример 3. Проведение анализа ДНК на носительство полиморфизма R353Q гена фактора VII и его результаты.Example 3. DNA analysis for the carriage of polymorphism R353Q gene of factor VII and its results.
Отбор образцов крови, выделение ДНК, ПЦР-амплификацию и анализ ПЦР-продуктов проводили в соответствии с методиками, описанными в разделе «Материалы и методы». При этом для амплификации использовали праймеры, представленные в нижеследующей таблице 2.Blood sampling, DNA isolation, PCR amplification and analysis of PCR products was carried out in accordance with the methods described in the section "Materials and methods". In this case, primers presented in the following table 2 were used for amplification.
ПЦР проводили при следующих условиях: денатурация (94°С, 5 мин) - 1 цикл, денатурация (94°С, 30 сек), отжиг (58°С, 30 сек) и элонгация (72°С, 30 сек) - 39 циклов, конечная элонгация (72°С, 5 мин) - 1 цикл.PCR was performed under the following conditions: denaturation (94 ° C, 5 min) - 1 cycle, denaturation (94 ° C, 30 sec), annealing (58 ° C, 30 sec) and elongation (72 ° C, 30 sec) - 39 cycles, final elongation (72 ° C, 5 min) - 1 cycle.
О наличии в образце определенных аллельных вариантов гена VII фактора судили по появлению в геле фрагментов с размерами, указанными ниже (фиг.1Б).The presence of certain allelic variants of the gene of factor VII in the sample was judged by the appearance in the gel of fragments with the dimensions indicated below (Fig. 1B).
RQ - 239, 186, 53
QQ - 239RR - 186, 53
RQ - 239, 186, 53
QQ - 239
При проведении ДНК-тестирования на носительство полиморфизма R353Q гена фактора VII были получены следующие результаты.When conducting DNA testing for the carriage of the R353Q polymorphism of the factor VII gene, the following results were obtained.
а) Определение частоты встречаемости аллеля 353 Q в группе доноров показало соответствие этого показателя равновесию Харди-Вайнберга, что свидетельствовало о репрезентативности выборки. В исследуемой группе этот аллель обнаруживался практически с такой же частотой (13.4%), что и в контрольной (10%).a) Determination of the frequency of occurrence of the 353 Q allele in the donor group showed that this indicator corresponded to Hardy-Weinberg equilibrium, which indicated the representativeness of the sample. In the study group, this allele was detected with almost the same frequency (13.4%) as in the control (10%).
б) При сравнении частот встречаемости генотипов RR, RQ и QQ в двух исследованных подгруппах пациенток (с наличием и отсутствием неблагоприятных исходов в анамнезе) было установлено, что у женщин с наличием неблагоприятных исходов в анамнезе частота генотипа RQ VII фактора была примерно в 5 раз ниже (7.7%), чем у остальных пациенток (34.4%, OR=4.5, р<0,05), и примерно втрое ниже, чем в популяции (22%, OR=2.85; р=0,3), а частота гомозиготного генотипа RR соответственно выше, чем в группе с благоприятными исходами (65.6% и 89.7%, OR=1.36, р<0.05). Встречаемость гомозиготного генотипа QQ в группе с неблагоприятными исходами составляла всего 2,56% и при этом соответствовала частоте представленности данного генотипа в норме (2,4%); в группе пациенток без неблагоприятных исходов в анамнезе данный генотип выявлен не был (фиг.4).b) When comparing the frequencies of the RR, RQ, and QQ genotypes in the two studied subgroups of patients (with the presence and absence of adverse outcomes in the anamnesis), it was found that in women with the presence of adverse outcomes in the anamnesis, the frequency of the RQ VII factor genotype was approximately 5 times lower (7.7%) than other patients (34.4%, OR = 4.5, p <0.05), and about three times lower than in the population (22%, OR = 2.85; p = 0.3), and the frequency of homozygous RR genotype is correspondingly higher than in the group with favorable outcomes (65.6% and 89.7%, OR = 1.36, p <0.05). The occurrence of the homozygous QQ genotype in the group with unfavorable outcomes was only 2.56% and at the same time corresponded to the normal frequency of the present genotype (2.4%); in the group of patients without adverse outcomes in the history of this genotype was not detected (figure 4).
С целью дополнительного контроля возможности искажения результатов в связи с наличием у пациенток воспалительных заболеваний при оценке распределения генотипов RR, RQ и QQ в каждой из подгрупп были использованы только данные, полученные при тестировании ДНК женщин с отсутствием указанных заболеваний. Результаты этого анализа (фиг.5) свидетельствуют о сохранении всех закономерностей, выявленных при тестировании группы в целом (фиг, 4). Более того, отмеченная ранее связь генотипа RR с неблагоприятными исходами в данном варианте эксперимента выражена так же отчетливо с сохранением той же разницы (25%) между группами пациенток с неблагоприятными и благоприятными исходами.In order to further control the possibility of distortion of the results due to the presence of inflammatory diseases in patients, only data obtained by testing the DNA of women with no such diseases were used to evaluate the distribution of RR, RQ, and QQ genotypes in each subgroup. The results of this analysis (Fig. 5) indicate the preservation of all the patterns identified during testing of the group as a whole (Fig. 4). Moreover, the previously noted association of the RR genotype with unfavorable outcomes in this variant of the experiment is also expressed with the same difference (25%) between groups of patients with unfavorable and favorable outcomes.
На основании полученных данных был сделан вывод, что гетерозиготное носительство аллеля Q (RQ) при прогнозировании ПН должно рассматриваться как отчетливо протективный (препятствующий развитию патологии) признак. Генотип RR, при котором отсутствует Q-аллель, может быть определен как неблагоприятный с точки зрения исхода беременности. Что касается роли гомозиготы QQ в развитии ПН, то установить ее экспериментально не представлялось возможным в силу низкой частоты встречаемости этого генотипа в исследуемых группах (2,56%, данный генотип был определен только у двух пациенток), которая совпадает с незначительной представленностью данного генотипа и в норме (2,4%).Based on the data obtained, it was concluded that heterozygous carriage of the Q (RQ) allele when predicting PN should be considered as a clearly protective (preventing the development of pathology) trait. The RR genotype, in which there is no Q-allele, can be defined as unfavorable in terms of pregnancy outcome. As for the role of QQ homozygote in the development of PN, it was not experimentally possible to establish it due to the low frequency of occurrence of this genotype in the studied groups (2.56%, this genotype was determined only in two patients), which coincides with the low representation of this genotype and normal (2.4%).
Пример 4. Определение зависимости исхода беременности от комбинации генотиповExample 4. Determining the dependence of the outcome of pregnancy on a combination of genotypes
Исходя из того, что генотип RQ фактора VII оказывает выраженное протективное действие и предупреждает появление неблагоприятных исходов, а генотип ТТ MTHFR в наибольшей степени предрасполагает к таким исходам, наиболее благоприятные и наиболее неблагоприятные сочетания генотипов в общем виде были определены нами как MTHFR TT-/VII RQ+ и MTHFR TT+/VII RQ- соответственно. В двух группах пациенток с комбинацией генотипов, отвечающих указанным условиям, было проведено сравнение частот неблагоприятных исходов. У пациенток с генотипом, попадающими под определение MTHFR TT-/VII RQ+, частота неблагоприятных исходов составила 31% (р<0,001), в то время как в группе пациенток с генотипом MTHFR TT+/VII RQ- частота неблагоприятных исходов была 92% (р<0.001) (фиг.6). Этими результатами еще раз был подтвержден вывод о протективном (в отношении развития ПН) характере действия мутантного аллеля 353Q фактора VII и отчетливой ассоциации между наличием генотипа ТТ MTHFR и риском развития заболевания.Based on the fact that the RQ factor VII genotype has a pronounced protective effect and prevents the occurrence of adverse outcomes, and the TT genotype MTHFR most predisposes to such outcomes, we identified the most favorable and most unfavorable combinations of genotypes in general as MTHFR TT- / VII RQ + and MTHFR TT + / VII RQ-, respectively. In two groups of patients with a combination of genotypes that meet these conditions, a comparison of the frequencies of adverse outcomes was performed. In patients with the genotype falling under the definition of MTHFR TT- / VII RQ +, the rate of adverse outcomes was 31% (p <0.001), while in the group of patients with the genotype MTHFR TT + / VII RQ-, the frequency of adverse outcomes was 92% (p <0.001) (Fig.6). These results once again confirmed the conclusion about the protective (in relation to the development of PN) nature of the action of the mutant allele of Factor VII 353Q and a clear association between the presence of the TT genotype MTHFR and the risk of developing the disease.
Важным этапом в процессе разработки модели для оценки генетической предрасположенности к ПН на основе анализа полиморфизмов С677Т и R353Q было получение ответа на вопрос о соотношении эффектов, характерных для каждого из генотипов, в условиях их определенной комбинации. Результаты проведенного нами анализа представлены на фиг.7. Очевидно, что наибольшая частота благоприятных исходов наблюдается у женщин с генотипом RQ/CC: она составляет 75%, что в 3 раза выше частоты неблагоприятных исходов (25%). В комбинации генотипа RQ с генотипом СТ, хотя и наблюдается некоторое снижение частоты благоприятных исходов по сравнению с частотой неблагоприятных (62.5% и 37.5% соотв.), доля последних составляет немногим более трети от общего числа. Число пациенток, имеющих комбинацию генотипов RQ/TT, было недостаточным для получения статистически достоверных данных относительно этой разновидности генотипа.An important step in the development of a model for assessing the genetic predisposition to PN based on the analysis of C677T and R353Q polymorphisms was to obtain an answer to the question about the ratio of effects characteristic of each of the genotypes under the conditions of their certain combination. The results of our analysis are presented in Fig.7. Obviously, the highest frequency of favorable outcomes is observed in women with the RQ / CC genotype: it is 75%, which is 3 times higher than the frequency of adverse outcomes (25%). In the combination of the RQ genotype with the CT genotype, although there is a slight decrease in the frequency of favorable outcomes compared with the frequency of adverse outcomes (62.5% and 37.5%, respectively), the proportion of the latter is a little more than a third of the total. The number of patients with a combination of RQ / TT genotypes was insufficient to obtain statistically reliable data regarding this genotype variant.
В группе женщин с генотипом RR (дикий тип, в предварительных экспериментах был оценен как неблагоприятный)/СС (дикий тип, определен как нейтральный) частота неблагоприятных исходов достоверно выше по сравнению с частотой благоприятных (72.1% и 27.9% соотв.). Генотип RR в комбинации с генотипом СТ MTHFR дает примерно такую же частоту неблагоприятных исходов (77.1% против 22.9%), что дикий тип RR/CC. Носительство генотипа RR/TT повышает частоту неблагоприятных исходов до 92.3%. В результате анализа конкретных комбинаций генотипов прослеживаются следующие закономерности:In the group of women with the RR genotype (wild type, in preliminary experiments it was assessed as unfavorable) / SS (wild type, defined as neutral), the frequency of adverse outcomes was significantly higher than the favorable rate (72.1% and 27.9%, respectively). The RR genotype in combination with the CT MTHFR genotype gives approximately the same frequency of adverse outcomes (77.1% versus 22.9%) as the wild type RR / CC. Carriage of the RR / TT genotype increases the frequency of adverse outcomes to 92.3%. As a result of the analysis of specific combinations of genotypes, the following patterns are traced:
а) генотип ТТ проявляет себя как неблагоприятный признак, а генотипы СТ и СС как «нейтральные» в комбинации с любым генотипом, относящимися к полиморфизму R353Q;a) the TT genotype manifests itself as an unfavorable sign, and the CT and SS genotypes are “neutral” in combination with any genotype related to R353Q polymorphism;
б) генотип RQ демонстрирует протективный эффект, a RR - характерное неблагоприятное влияние на фоне любого из двух «нейтральных» генотипов, относящихся к полиморфизму С677Т;b) the RQ genotype shows a protective effect, while RR shows a characteristic adverse effect against any of the two “neutral” genotypes related to C677T polymorphism;
в) влияние конкретной комбинации двух генотипов на развитие ПН представляет собой результат суммирования эффектов составляющих ее генотипов.c) the effect of a specific combination of two genotypes on the development of PN is the result of summing up the effects of its constituent genotypes.
Полученные в этой серии экспериментов результаты приводят к однозначному выводу, что корректное прогнозирование риска развития ПН требует проведения ДНК-диагностики на носительство обоих названных полиморфизмов с целью определения генотипа пациентки.The results obtained in this series of experiments lead to the unequivocal conclusion that the correct prediction of the risk of PN development requires DNA diagnostics to support both of these polymorphisms in order to determine the patient’s genotype.
Пример 5. Составление прогноза развития ПН на основании результатов ДНК-тестирования.Example 5. Prediction of the development of PN based on the results of DNA testing.
Вариант 1:Option 1:
На основании проведенного нами экспериментального и теоретического анализа взаимосвязи носительства полиморфизмов С677Т в гене MTHFR и R353Q в гене фактора VII с риском невынашивания беременности составлена таблица (табл.3), где представлены все возможные (кроме включающих гомозиготу QQ, см. выше) варианты генотипов, которые могут быть определены в результате ДНК-тестирования на наличие двух указанных полиморфизмов, отмечено влияние каждого из них на развитие ПН и приведен прогноз, определяемый путем суммирования эффектов каждого из двух выявленных генотипов и подтвержденный экспериментальным путем (фиг.7).Based on our experimental and theoretical analysis of the relationship between the carriage of C677T polymorphisms in the MTHFR gene and R353Q in the factor VII gene with a risk of miscarriage, a table has been compiled (Table 3), where all possible (except those including QQ homozygous, see above) genotypes are presented, which can be determined as a result of DNA testing for the presence of these two polymorphisms, the effect of each of them on the development of PN is noted and a forecast is given that is determined by summing up the effects of each of the two identified GOVERNMENTAL genotypes and confirmed by experiment (Figure 7).
В таблице были приняты следующие обозначения:The following notation was adopted in the table:
+ благоприятный эффект+ beneficial effect
0 нейтральный0 neutral
- неблагоприятный- unfavorable
-- выраженно неблагоприятный- markedly unfavorable
Из результатов, представленных в таблице 3, с очевидностью следует, что при оценке риска развития заболевания только на основании данных о полиморфном состоянии гена MTHFR (согласно известным аналогам) прогноз мог бы быть ошибочным, по меньшей мере, в 4 из приведенных шести вариантов (RR/CC, RR/CT, RQ/CC, RQ/CT). Соответственно, основным преимуществом предлагаемого способа прогнозирования развития ПН в сравнении с известными аналогами является возможность получения более точной и надежной информации об индивидуальной предрасположенности женщины с определенным генотипом к этому заболеванию.From the results presented in Table 3, it clearly follows that when assessing the risk of developing a disease only on the basis of data on the polymorphic state of the MTHFR gene (according to known analogues), the prognosis could be erroneous in at least 4 of the six options (RR / CC, RR / CT, RQ / CC, RQ / CT). Accordingly, the main advantage of the proposed method for predicting the development of PN in comparison with known analogues is the ability to obtain more accurate and reliable information on the individual predisposition of a woman with a certain genotype to this disease.
В свою очередь это позволяет выработать правильную тактику лечения и объем проводимой терапии в каждом конкретном случае.In turn, this allows you to develop the right treatment tactics and the amount of therapy in each case.
ЛитератураLiterature
1. Ельчанинов А.П., Капустин С.И., Сироткина О.В., Волков В.К., Силяхина С.В., Ломакина С.В., Шварц Е.И., Папаян Л.П. Протромботические генотипы у молодых лиц с дисциркуляторной энцефалопатией. // Юбилейная Х Конференция "Нейроиммунология": Тез. докл. научн. конф. - СПб., 2000.1. Elchaninov A.P., Kapustin S.I., Sirotkina OV, Volkov V.K., Silyakhina S.V., Lomakina S.V., Schwartz E.I., Papayan L.P. Prothrombotic genotypes in young people with discirculatory encephalopathy. // Anniversary X Conference "Neuroimmunology": Abstracts. doc. scientific conf. - SPb., 2000.
2. de Sousa J.C., Soria C., Ayrault-Jarrier M., Pastier D., Bruckert E., Amiral J., Bereziat G., Caen J.P. Association between coagulation factors VII and X with triglyceride rich lipoproteins. J. Clin Pathol. 1988, Sep.; 41(9):940-4.2. de Sousa J.C., Soria C., Ayrault-Jarrier M., Pastier D., Bruckert E., Amiral J., Bereziat G., Caen J.P. Association between coagulation factors VII and X with triglyceride rich lipoproteins. J. Clin Pathol. 1988, Sep .; 41 (9): 940-4.
3. Deloughery T.G., Evans A., Sadeghi A., McWilliams J., Henner W.D., Taylor L.M. Jr, Press R.D. Common mutation in methylenetetrahydrofolate reductase. Correlation with homocysteine metabolism and late-onset vascular disease. Circulation. 1996, Dec. 15; 94(12):3074-8.3. Deloughery T.G., Evans A., Sadeghi A., McWilliams J., Henner W. D., Taylor L. M. Jr, Press R. D. Common mutation in methylenetetrahydrofolate reductase. Correlation with homocysteine metabolism and late-onset vascular disease. Circulation. 1996, Dec. fifteen; 94 (12): 3074-8.
4. Frosst P., Blom H.J., et al. "A candidate genetic risk factor for vascular disease: a common mutation in methylenetetrahydrofolate reductase." Nat Genet. 1995, May; 10(1):111-3.4. Frosst P., Blom H. J., et al. "A candidate genetic risk factor for vascular disease: a common mutation in methylenetetrahydrofolate reductase." Nat Genet. 1995, May; 10 (1): 111-3.
5. Girelli D., Russo C., Ferraresi P., Olivieri О., Pinotti M., Friso S., Manzato F., Mazzucco A., Bemardi F., Corrocher R. Polymorphisms in the factor VII gene and the risk of myocardial infarction in patients with coronary artery disease. N Engl. J. Med., 2000 Sep. 14; 343(11):774-80.5. Girelli D., Russo C., Ferraresi P., Olivieri O., Pinotti M., Friso S., Manzato F., Mazzucco A., Bemardi F., Corrocher R. Polymorphisms in the factor VII gene and the risk of myocardial infarction in patients with coronary artery disease. N Engl. J. Med., 2000 Sep. fourteen; 343 (11): 774-80.
6. Goodman C.S., Coulam C.B., Jeyendran R.S., Acosta V.A., Roussev R. Which thrombophilic gene mutations are risk factors for recurrent pregnancy loss? Am J. Reprod Immunol. 2006, Oct.; 56(4):230-6.6. Goodman C. S., Coulam C. B., Jeyendran R. S., Acosta V. A., Roussev R. Which thrombophilic gene mutations are risk factors for recurrent pregnancy loss? Am J. Reprod Immunol. 2006, Oct .; 56 (4): 230-6.
7. Green F., Kelleher C., Wilkes H., Temple A., Meade T., Humphries S. A. common genetic polymorphism associated with lower coagulation factor VII levels in healthy individuals. Arterioscler Thromb. 1991, May-Jun; 11(3):540-6.7. Green F., Kelleher C., Wilkes H., Temple A., Meade T., Humphries S. A. common genetic polymorphism associated with lower coagulation factor VII levels in healthy individuals. Arterioscler Thromb. 1991, May-Jun; 11 (3): 540-6.
8. Hoffinan C., Shah A., Sodums M., Hultin M.B. Factor VII activity state in coronary artery disease. J. Lab. Clin. Med., 1988 Apr.; 111(4):475-81.8. Hoffinan C., Shah A., Sodums M., Hultin M.B. Factor VII activity state in coronary artery disease. J. Lab. Clin. Med., 1988 Apr .; 111 (4): 475-81.
9. Hohlagschwandtner M., Untried G., Heinze G., Huber J.C., Nagele F., Tempter C. Combined thrombophilic polymorphisms in women with idiopathic recurrent miscarriage. Fertil Steril. 2003, May; 79(5):1141-8.9. Hohlagschwandtner M., Untried G., Heinze G., Huber J.C., Nagele F., Tempter C. Combined thrombophilic polymorphisms in women with idiopathic recurrent miscarriage. Fertil Steril. 2003, May; 79 (5): 1141-8.
10. Holmes Z.R., Regan L., Chilcott I., Cohen H. The C677T MTHFR gene mutation is not predictive of risk for recurrent fetal loss. Br. J. Haematol. 1999, Apr.; 105(1):98-101.10. Holmes Z.R., Regan L., Chilcott I., Cohen H. The C677T MTHFR gene mutation is not predictive of risk for recurrent fetal loss. Br. J. Haematol. 1999, Apr .; 105 (1): 98-101.
11. Lane D.A., Grant P.J. "Role ofhemostatic gene polymorphisms in venous and arterial thrombotic disease." Blood. 2000, Mar. 1; 95(5):1517-32.11. Lane D.A., Grant P.J. "Role ofhemostatic gene polymorphisms in venous and arterial thrombotic disease." Blood. 2000, Mar. one; 95 (5): 1517-32.
12. Lissak A., Sharon A., Fruchter О., Kassel A., Sanderovitz J., Abramovici H. Polymorphism for mutation of cytosine to thymine at location 677 in the methylenetetrahydrofolate reductase gene is associated with recurrent early fetal loss. Am. J. Obstet Gynecol. 1999 Jul.; 181(1):126-30.12. Lissak A., Sharon A., Fruchter O., Kassel A., Sanderovitz J., Abramovici H. Polymorphism for mutation of cytosine to thymine at location 677 in the methylenetetrahydrofolate reductase gene is associated with recurrent early fetal loss. Am. J. Obstet Gynecol. 1999 Jul .; 181 (1): 126-30.
13. Makino A., Nakanishi T., Sugiura-Ogasawara M., Ozaki Y., Suzumori N., Suzumori К. No association of C677T methylenetetrahydrofolate reductase and an endothelial nitric oxide synthase polymorphism with recurrent pregnancy loss. Am. J. Reprod Immunol. 2004 Jul.; 52(1):60-6.18.13. Makino A., Nakanishi T., Sugiura-Ogasawara M., Ozaki Y., Suzumori N., Suzumori K. No association of C677T methylenetetrahydrofolate reductase and an endothelial nitric oxide synthase polymorphism with recurrent pregnancy loss. Am. J. Reprod Immunol. 2004 Jul .; 52 (1): 60-6.18.
14. Miller C.H., De Staercke C., Benson J., Hooper W.C., Dilley A., Evatt B.L., Benito C., Patterson-Bamett A., Eller D., Philipp C.S. Elevated factor VII as a risk factor for recurrent fetal loss. Relationship to factor VII gene polymorphisms. Thromb Haemost. 2005, Jun.; 93(6):1089-94.14. Miller C.H., De Staercke C., Benson J., Hooper W.C., Dilley A., Evatt B. L., Benito C., Patterson-Bamett A., Eller D., Philipp C.S. Elevated factor VII as a risk factor for recurrent fetal loss. Relationship to factor VII gene polymorphisms. Thromb Haemost. 2005, Jun .; 93 (6): 1089-94.
15. Mtiraoui N., Zammiti W., Ghazouani L., Braham N.J., Saidi S., Finan R.R., Almawi W.Y., Mahjoub T. Methylenetetrahydrofolate reductase C677T and A1298C polymorphism and changes in homocysteine concentrations in women with idiopathic recurrent pregnancy losses. Reproduction. 2006, Feb.; 131(2):395-401.15. Mtiraoui N., Zammiti W., Ghazouani L., Braham N.J., Saidi S., Finan R.R., Almawi W.Y., Mahjoub T. Methylenetetrahydrofolate reductase C677T and A1298C polymorphism and changes in homocysteine concentration in women with idiopathic recurrent pregnancy. Reproduction. 2006, Feb .; 131 (2): 395-401.
16. Orlando M., Leri О., Macioce G., Mattia G., Ferri G.M. Factor VII in subjects at risk for thromboembolism: activation or increased synthesis? Haemostasis. 1987; 17(6):340-3.16. Orlando M., Leri O., Macioce G., Mattia G., Ferri G.M. Factor VII in subjects at risk for thromboembolism: activation or increased synthesis? Haemostasis. 1987; 17 (6): 340-3.
17. Pauer H.U., Voigt-Tschirschwitz Т., Hinney В., Burfeind P., Wolf C., Emons G., Neesen J. Analyzes of three common thrombophilic gene mutations in German women with recurrent abortions. Acta Obstet Gynecol Scand. 2003, Oct.; 82(10):942-7.17. Pauer H.U., Voigt-Tschirschwitz T., Hinney B., Burfeind P., Wolf C., Emons G., Neesen J. Analyzes of three common thrombophilic gene mutations in German women with recurrent abortions. Acta Obstet Gynecol Scand. 2003, Oct .; 82 (10): 942-7.
18. Raziel A., Komberg Y., Friedler S., Schachter M., Sela B.A., Ron-El R. Hypercoagulable thrombophilic defects and hyperhomocysteinemia in patients with recurrent pregnancy loss. Am J. Reprod Immunol. 2001, Feb.; 45(2):65-71.18. Raziel A., Komberg Y., Friedler S., Schachter M., Sela B.A., Ron-El R. Hypercoagulable thrombophilic defects and hyperhomocysteinemia in patients with recurrent pregnancy loss. Am J. Reprod Immunol. 2001, Feb .; 45 (2): 65-71.
19. Schwahn B., Rozen R. Polymorphisms in the methylenetetrahydrofolate reductase gene: clinical consequences. Am J. Pharmacogenomics. 2001; 1(3):189-201.19. Schwahn B., Rozen R. Polymorphisms in the methylenetetrahydrofolate reductase gene: clinical consequences. Am J. Pharmacogenomics. 2001; 1 (3): 189-201.
20. Unfried G., Griesmacher A., Weismuller W., Nagele F., Huber J.C., Tempfer C.B. The C677T polymorphism of the methylenetetrahydrofolate reductase gene and idiopathic recurrent miscarriage. Obstet Gynecol. 2002, Apr.; 99(4):614-9.20. Unfried G., Griesmacher A., Weismuller W., Nagele F., Huber J.C., Tempfer C.B. The C677T polymorphism of the methylenetetrahydrofolate reductase gene and idiopathic recurrent miscarriage. Obstet Gynecol. 2002, Apr .; 99 (4): 614-9.
21. Wang X.P., Lin Q.D., Ma Z.W., Zhao A.M. [C677T and A1298C mutation of the methylenetetrahydrofolate reductase gene in unexplained recurrent spontaneous abortion]. Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi. 2004, Apr.; 39(4):238-41.21. Wang X.P., Lin Q.D., Ma Z.W., Zhao A.M. [C677T and A1298C mutation of the methylenetetrahydrofolate reductase gene in unexplained recurrent spontaneous abortion]. Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi. 2004, Apr .; 39 (4): 238-41.
22. Welch G.N., Loscaizo J. "Homocysteine and atherothrombosis." N Engi J. Med. 1998 Apr. 9; 338(15):1042-50.22. Welch G.N., Loscaizo J. "Homocysteine and atherothrombosis." N Engi J. Med. 1998 Apr. 9; 338 (15): 1042-50.
23. Wu А.Н., Tsongalis G.J. Correlation of polymorphisms to coagulation and biochemical risk factors for cardiovascular diseases. Am J. Cardiol. 2001, Jun. 15; 87(12):1361-6.23. Wu A.N., Tsongalis G.J. Correlation of polymorphisms to coagulation and biochemical risk factors for cardiovascular diseases. Am J. Cardiol. 2001, Jun. fifteen; 87 (12): 1361-6.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2006145533/13A RU2330071C1 (en) | 2006-12-21 | 2006-12-21 | Application of dna-diagnostics for presence of polymorphism r353q in gene of factor vii of blood coagulation for estimation of predisposition to development of habitual noncarrying of pregnancy and method of predisposition estimation to this disease by means of analysis of combination of polymorphisms c677t of gene mthfr and of gene r353q of factor vii |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2006145533/13A RU2330071C1 (en) | 2006-12-21 | 2006-12-21 | Application of dna-diagnostics for presence of polymorphism r353q in gene of factor vii of blood coagulation for estimation of predisposition to development of habitual noncarrying of pregnancy and method of predisposition estimation to this disease by means of analysis of combination of polymorphisms c677t of gene mthfr and of gene r353q of factor vii |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2330071C1 true RU2330071C1 (en) | 2008-07-27 |
Family
ID=39811056
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2006145533/13A RU2330071C1 (en) | 2006-12-21 | 2006-12-21 | Application of dna-diagnostics for presence of polymorphism r353q in gene of factor vii of blood coagulation for estimation of predisposition to development of habitual noncarrying of pregnancy and method of predisposition estimation to this disease by means of analysis of combination of polymorphisms c677t of gene mthfr and of gene r353q of factor vii |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2330071C1 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2532367C2 (en) * | 2012-10-18 | 2014-11-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Университетская медицина" | Method for detecting genetic predisposition to recurrent pregnancy loss |
| RU2552302C1 (en) * | 2014-04-22 | 2015-06-10 | Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Российский национальный исследовательский медицинский университет (ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России) | Method for predicting risk of habitual miscarriage |
| RU2611358C1 (en) * | 2016-02-03 | 2017-02-21 | федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Южный федеральный университет" | Method of predicting high risk of reproductive loss in first trimester of pregnancy |
-
2006
- 2006-12-21 RU RU2006145533/13A patent/RU2330071C1/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| UNFRIED G. et al., Obstet. Gynecol, 99(4), 614-619, 2002. NELSON D. et al., Am. J. Perinatal., 18(4), 195-201, 2001. HUMPHRIES S. et al., Arch. Pathol. Lab. Med., 116(12), 1322-1329, 1992. * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2532367C2 (en) * | 2012-10-18 | 2014-11-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Университетская медицина" | Method for detecting genetic predisposition to recurrent pregnancy loss |
| RU2552302C1 (en) * | 2014-04-22 | 2015-06-10 | Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Российский национальный исследовательский медицинский университет (ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России) | Method for predicting risk of habitual miscarriage |
| RU2611358C1 (en) * | 2016-02-03 | 2017-02-21 | федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Южный федеральный университет" | Method of predicting high risk of reproductive loss in first trimester of pregnancy |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6210877B1 (en) | Prediction of coronary artery disease | |
| Makino et al. | No association of C677T methylenetetrahydrofolate reductase and an endothelial nitric oxide synthase polymorphism with recurrent pregnancy loss | |
| Dilley et al. | Mutations in the factor V, prothrombin and MTHFR genes are not risk factors for recurrent fetal loss | |
| Jusić et al. | The association of factor V G1961A (factor V Leiden), prothrombin G20210A, MTHFR C677T and PAI-1 4G/5G polymorphisms with recurrent pregnancy loss in Bosnian women | |
| Rahimi et al. | MTHFR C677T and eNOS G894T variants in preeclamptic women: Contribution to lipid peroxidation and oxidative stress | |
| Seremak-Mrozikiewicz et al. | The significance of genetic polymorphisms of factor V Leiden and prothrombin in the preeclamptic Polish women | |
| Wolski et al. | Contribution of inherited thrombophilia to recurrent miscarriage in the Polish population | |
| Kim et al. | No association of the genetic polymorphisms of endothelial nitric oxide synthase, dimethylarginine dimethylaminohydrolase, and vascular endothelial growth factor with preeclampsia in Korean populations | |
| Jenkins et al. | Preeclampsia risk and angiotensinogen polymorphisms M235T and AGT-217 in African American and Caucasian women | |
| RU2330071C1 (en) | Application of dna-diagnostics for presence of polymorphism r353q in gene of factor vii of blood coagulation for estimation of predisposition to development of habitual noncarrying of pregnancy and method of predisposition estimation to this disease by means of analysis of combination of polymorphisms c677t of gene mthfr and of gene r353q of factor vii | |
| Lindgren et al. | The effect of a specific histidine-rich glycoprotein polymorphism on male infertility and semen parameters | |
| JP5128796B2 (en) | Genetic risk detection method for cerebrovascular disorders | |
| Niktalab et al. | Different polymorphisms of vascular endothelial growth factor gene in patients with pre-eclampsia among the Iranian women population | |
| Jääskeläinen et al. | M385T polymorphism in the factor V gene, but not Leiden mutation, is associated with placental abruption in Finnish women | |
| CN113789376B (en) | Kit for predicting and screening adolescent idiopathic scoliosis and application | |
| WO2019110706A1 (en) | Methods for predicting the risk of developing a sepsis or a systemic inflammatory response syndrome (sirs) | |
| Sun et al. | Interleukin-6 gene polymorphism and the risk of systemic inflammatory response syndrome caused by wasp sting injury | |
| Pegoraro et al. | Coagulation gene polymorphisms as risk factors for myocardial infarction in young Indian Asians: cardiovascular topic | |
| Cozaru et al. | The genetic profile of thrombophilia in reproductive disorders | |
| US20070042364A1 (en) | Target genes for inflammatory bowel disease | |
| US7785781B2 (en) | Method of diagnosis of a predisposition to develop thrombotic disease and its uses | |
| Germanová et al. | Short Communication Pregnancy-Associated Plasma Protein A Polymorphisms in Patients with Risk Pregnancies | |
| Pazoki et al. | The prevalence of common mutations in thrombophilic patients in Iranian population with recurrent miscarriage | |
| Ibrahim et al. | Methylenetetrahydrofolate C677T polymorphism and pre-eclamptic Egyptian women | |
| Lakshmiprabha et al. | HFE Gene Polymorphism and Iron Status in Preeclampsia |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20151222 |