RU2325151C2 - Method of delivering water-insoluble and poorly soluble bioactive substances and pharmaceutical form based on it - Google Patents
Method of delivering water-insoluble and poorly soluble bioactive substances and pharmaceutical form based on it Download PDFInfo
- Publication number
- RU2325151C2 RU2325151C2 RU2006123043/15A RU2006123043A RU2325151C2 RU 2325151 C2 RU2325151 C2 RU 2325151C2 RU 2006123043/15 A RU2006123043/15 A RU 2006123043/15A RU 2006123043 A RU2006123043 A RU 2006123043A RU 2325151 C2 RU2325151 C2 RU 2325151C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- water
- insoluble
- biologically active
- poorly soluble
- active substances
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области фармакологии, а именно к способам получения системы доставки (лекарственным формам доставки) биологически активных веществ в виде наноразмерных макромолекулярных носителей на основе амфифильных полимеров, в которых инкапсулированы различные количества биологически активных веществ, в том числе гидрофобные, плохо- или нерастворимые в воде лекарственные вещества, а также к самим лекарственным формам доставки водонерастворимых и плохорастворимых лекарственных средств.The invention relates to the field of pharmacology, and in particular to methods for producing a delivery system (dosage forms of delivery) of biologically active substances in the form of nanoscale macromolecular carriers based on amphiphilic polymers in which various amounts of biologically active substances are encapsulated, including hydrophobic, poorly or insoluble in water medicinal substances, as well as to the dosage forms of the delivery of water-insoluble and poorly soluble drugs.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND
Доставка лекарственных препаратов к органам-мишеням в организме человека является одной из основных проблем химиотерапии. Известны способы получения орального применения липосом, включающих диэфирфосфатидилхолин/холестирин в пропорции 7:1. (DESHMUCK D.S. Life Sciences, 1981 г. 28, стр.239-242). Известная система доставки обеспечила желудочно-кишечную защиту инкапсулированного пептида, но не обеспечила его происхождения через кишечный барьер. Это объясняется слишком большим размером липосом, неустойчивостью структуры и проникновением активного вещества сквозь липосомную среду.The delivery of drugs to target organs in the human body is one of the main problems of chemotherapy. Known methods for obtaining oral administration of liposomes, including diester phosphatidylcholine / cholesterol in a ratio of 7: 1. (DESHMUCK D.S. Life Sciences, 1981.28, pp. 239-242). The known delivery system provided gastrointestinal protection of the encapsulated peptide, but did not ensure its origin through the intestinal barrier. This is due to too large liposomes, instability of the structure and penetration of the active substance through the liposome medium.
В настоящее время выделилось направление получения наночастиц, состоящих, в частности, из внутреннего ядра, образованного структурированными полисахаридами с привитыми на их наружной части жирными кислотами и покрытыми слоем из фосфолипидов. (I. De Miguel «Biochimica et Biophysica Acta, 1995 г., 1237, стр.48-49).At present, the direction of obtaining nanoparticles, in particular, from the inner core formed by structured polysaccharides with fatty acids grafted on their outer parts and coated with a layer of phospholipids, has been singled out. (I. De Miguel "Biochimica et Biophysica Acta, 1995, 1237, pp. 48-49).
В качестве ближайшего аналога, по мнению заявителей, может служить техническое решение, известное из WO 03077882 А2 25.09.2003 Д1. В Д1 раскрывается способ получения мицелл или лиофилизированных нанодисперсий гидрофобных лекарственных средств, заключенных в амфифильный сополимер, имеющий гидрофильный и гидрофобный полимерные блоки, при этом полученные частицы, включающие лекарственное средство имеют размер менее 1 мкм.According to the applicants, the closest analogue may be a technical solution known from WO 03077882 A2 09/25/2003 D1. D1 discloses a method for producing micelles or lyophilized nanodispersions of hydrophobic drugs encapsulated in an amphiphilic copolymer having hydrophilic and hydrophobic polymer blocks, and the resulting particles comprising the drug are less than 1 μm in size.
Общим существенным признаком известного и заявляемого технических решений является их форма - наночастицы, содержащие биоразлагаемый полимер.A common essential feature of the known and claimed technical solutions is their form - nanoparticles containing a biodegradable polymer.
В качестве недостатка известной системы доставки следует отметить тот факт, что она не способствует растворению плохо- или водонерастворимым лекарственных средств в организме человека, а следовательно, невозможно на ее основе создать лекарственную форму доставки плохо- или водонерастворимых лекарственных средств. Назначение известной системы ограничивается только целенаправленной доставкой лекарственного средства с контролируемым его выделением.As a disadvantage of the known delivery system, it should be noted that it does not contribute to the dissolution of poorly or water-insoluble drugs in the human body, and therefore it is impossible to create a dosage form for the delivery of poorly or water-insoluble drugs on its basis. The purpose of the known system is limited only by the targeted delivery of the drug with its controlled release.
Задачей, на которую направлено данное изобретение, является создание лекарственной формы доставки плохо- и водонерастворимых лекарственных средств к органам-мишеням, и, как следствие, повышение эффективности лечения ряда заболеваний.The objective of this invention is to create a dosage form for the delivery of poorly and water-insoluble drugs to target organs, and, as a result, increase the effectiveness of treatment of a number of diseases.
В качестве технического результата, достигаемого данным изобретением, следует отметить возможность повышения водосовместимости плохорастворимых и нерастворимых в воде биологически активных веществ, что позволило создать новые высокоэффективные водорастворимые формы биологически активных веществ для инъекционного, перорального и другого применения.As a technical result achieved by this invention, it should be noted the possibility of increasing the water compatibility of poorly soluble and water-insoluble biologically active substances, which allowed us to create new highly effective water-soluble forms of biologically active substances for injection, oral and other uses.
При этом использование таких форм биологически активных веществ позволяет обеспечить длительное действие препарата, его контролируемое выделение, использовать его различными путями введения, обеспечивает поступление активного вещества в оптимальных дозах, снижая возможность передозировки и проявления побочной токсичности.At the same time, the use of such forms of biologically active substances makes it possible to ensure the long-term effect of the drug, its controlled release, to use it in various ways of administration, ensures the supply of the active substance in optimal doses, reducing the possibility of overdose and the occurrence of side toxicity.
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION
Способ получения системы доставки (лекарственной формы доставки) плохорастворимых и малорастворимых биологически активных веществ путем их лиофилизации водорастворимыми амфифильными полимерами методом самоассоциации дифильных веществ при концентрациях выше их критической концентрации мицеллообразования (ККМ) или критической концентрации агрегации (ККА) в водных средах с образованием частиц в виде сферических наноразмерных структур, при этом векторы гидрофобных фрагментов дифильных молекул обращены внутрь частиц, образуя внутреннее ядро, которое содержит лекарственное средство, а гидрофильные полимерные цепи образуют водорастворимую оболочку данных частиц.A method of obtaining a delivery system (dosage form of delivery) of poorly soluble and poorly soluble biologically active substances by lyophilization with water-soluble amphiphilic polymers by the method of self-association of diphilic substances at concentrations higher than their critical micelle formation concentration (CMC) or critical aggregation concentration (CMC) in aqueous media with the formation of particles in the form of spherical nanoscale structures, with the vectors of hydrophobic fragments of diphilic molecules facing the inside of the particles, forming an internal its core, which contains the drug, and hydrophilic polymer chains form a water-soluble shell of these particles.
Дополнительно осуществляют лиофилизацию биологически активных веществ (это могут быть как органические, так и неорганические соединения) плохо- или водонерастворимых в воде за счет липосом, состоящих из липидов, которые образуют при ассоциации дополнительное векторное окружение вокруг ядра - липосомальную мембрану. Липосомальная мембрана из липидов модифицирована амфифильными полимерами, состоящими, как минимум, из одного фрагмента водорастворимого карбоцепного полимера, и, как минимум, одной концевой гидрофобной группы.In addition, lyophilization of biologically active substances (these can be both organic and inorganic compounds) is poorly or water-insoluble in water due to liposomes, consisting of lipids, which, upon association, form an additional vector environment around the nucleus - the liposome membrane. The liposomal lipid membrane is modified by amphiphilic polymers consisting of at least one fragment of a water-soluble carbochain polymer and at least one terminal hydrophobic group.
В качестве амфифильного полимера используют макромолекулярную структуру, состоящую, как минимум, из одного фрагмента водорастворимого карбоцепного полимера с включением, как минимум, одной концевой гидрофобной группы.As the amphiphilic polymer, a macromolecular structure is used consisting of at least one fragment of a water-soluble carbochain polymer with the inclusion of at least one terminal hydrophobic group.
В качестве фрагмента водорастворимого карбоцепного полимера используют фрагмент с молекулярным весом Mn=1000-20000. А в качестве концевой гидрофобной группы предпочтительно выбирают группу, включающую один или два алифатических радикала с числом атомов углерода в углеродной цепи 6-25.A fragment with a molecular weight of Mn = 1000-20000 is used as a fragment of a water-soluble carbochain polymer. And as the terminal hydrophobic group, a group is preferably selected comprising one or two aliphatic radicals with the number of carbon atoms in the carbon chain of 6-25.
В качестве водорастворимого карбоцепного полимера используют, например, поли-N-винилпирролидон, поливиниловый спирт, полиакриламид, поли-N-диалкилакриламид, поли-N-изопропилакриламид, поли-N-(2-гидроксипропил)метакриламид, соли ненасыщенных карбоновых кислот.As the water-soluble carbochain polymer, for example, poly-N-vinyl pyrrolidone, polyvinyl alcohol, polyacrylamide, poly-N-dialkyl acrylamide, poly-N-isopropyl acrylamide, poly-N- (2-hydroxypropyl) methacrylamide, and unsaturated carboxylic acid salts are used.
Система доставки лекарственных средств - лекарственная форма, (полученная по описанному выше способу) представляет собой сферические наночастицы, содержащие ядро, в которое включено плохо или водонерастворимое биологически активное вещество (лекарственное средство), окруженное векторами гидрофобных фрагментов дифильных молекул амфифильных полимеров, обращенных внутрь к ядру, а гидрофильные полимерные цепи амфифильных полимеров образуют водорастворимую оболочку данных частиц.The drug delivery system - the dosage form (obtained by the method described above) is a spherical nanoparticle containing a core that contains a poorly or water-insoluble biologically active substance (drug) surrounded by vectors of hydrophobic fragments of diphilic molecules of amphiphilic polymers facing inward to the core and the hydrophilic polymer chains of amphiphilic polymers form a water-soluble shell of these particles.
С целью дополнительной лиофилизации биологически активных веществ (это могут быть как органические, так и неорганические соединения), плохо- или водонерастворимых в воде, наночастица содержит векторное окружение вокруг ядра из липидов - липосомальную мембрану. Липосомальная мембрана модифицирована амфифильными полимерами, состоящими, как минимум, из одного фрагмента водорастворимого карбоцепного полимера и, как минимум, одной концевой гидрофобной группы.For the purpose of additional lyophilization of biologically active substances (it can be either organic or inorganic compounds), poorly or water insoluble in water, the nanoparticle contains a vector environment around the nucleus of lipids - a liposome membrane. The liposomal membrane is modified by amphiphilic polymers consisting of at least one fragment of a water-soluble carbochain polymer and at least one terminal hydrophobic group.
В качестве амфифильного полимера система содержит макромолекулярную структуру, состоящую, как минимум, из одного фрагмента водорастворимого карбоцепного полимера с включением, как минимум, одной концевой гидрофобной группы.As an amphiphilic polymer, the system contains a macromolecular structure consisting of at least one fragment of a water-soluble carbochain polymer with the inclusion of at least one terminal hydrophobic group.
В качестве фрагмента водорастворимого карбоцепного полимера система предпочтительно содержит фрагмент с молекулярным весом Mn=1000-20000. А в качестве концевой гидрофобной группы система содержит группу, включающую один или два алифатических радикала с числом атомов углерода в углеродной цепи 6-25.As a fragment of a water-soluble carbochain polymer, the system preferably contains a fragment with a molecular weight of Mn = 1000-20000. And as the terminal hydrophobic group, the system contains a group comprising one or two aliphatic radicals with the number of carbon atoms in the carbon chain of 6-25.
В качестве водорастворимого карбоцепного полимера система может содержать, например, поли-N-винилпирролидон, поливиниловый спирт, полиакриламид, поли-N-диалкилакриламид, поли-N-изопропилакриламид, поли-N-(2-гидроксипропил)метакриламид, соли ненасыщенных карбоновых кислот.As a water-soluble carbochain polymer, the system may contain, for example, poly-N-vinyl pyrrolidone, polyvinyl alcohol, polyacrylamide, poly-N-dialkyl acrylamide, poly-N-isopropyl acrylamide, poly-N- (2-hydroxypropyl) methacrylamide, unsaturated carboxylic acid salts.
Общие формулы предлагаемых амфифильных полимеров могут быть представлены следующим образом:The general formulas of the proposed amphiphilic polymers can be represented as follows:
Для всех амфифильных полимеров R - длинноцепная, алифатическая гидрофобная группа общего строения от -С6Н13 до -С25Н51:For all amphiphilic polymers, R is a long-chain, aliphatic hydrophobic group of a general structure from -C 6 H 13 to -C 25 H 51 :
Среднечисловая молекулярная масса (Мп) гидрофильной водорастворимой части полиакриламида, поли-М-изопропилакриламида, поли-2-гидроксипропилметакриламида и поли-N-винилпирролидона для разных образцов варьируется от 1000 до 20000.The number average molecular weight (Mp) of the hydrophilic water-soluble part of polyacrylamide, poly-M-isopropyl acrylamide, poly-2-hydroxypropylmethacrylamide and poly-N-vinylpyrrolidone for different samples varies from 1000 to 20,000.
Получение полимерных наночастиц, содержащих биологически активные веществаObtaining polymer nanoparticles containing biologically active substances
Полимерные наночастицы были получены различными способами, среди которых основными являются: метод прямого растворения (диспергирования), диализный метод и эмульсионный метод (нанопреципитация). Для всех методов полимер брали в таких количествах, чтобы в конечном растворе его концентрация была больше критической концентрации мицеллообразования или критической концентрации агрегации. Количество включаемого лекарственного вещества было от 0.1 до 60 весовых %.Polymer nanoparticles were obtained in various ways, among which the main ones are: direct dissolution (dispersion) method, dialysis method and emulsion method (nanoprecipitation). For all methods, the polymer was taken in such quantities that in the final solution its concentration was higher than the critical micelle concentration or critical aggregation concentration. The amount of drug substance included was from 0.1 to 60 weight%.
1. Метод прямого растворения1. The method of direct dissolution
а) Расчетное количество амфифильного полимера и лекарственного вещества растворяли в бидистиллированной обеспыленной воде или в 10 физиологическом растворе (0.15М NaCl, pH ~7.4). Раствор перемешивали наa) The calculated amount of amphiphilic polymer and drug substance was dissolved in bidistilled dedusted water or in 10 physiological saline (0.15 M NaCl, pH ~ 7.4). The solution was mixed on
качалке KS 500 "Labortechnik" (Германия) (также для перемешивания в некоторых экспериментах использовали качалку Вортекс) при 100 об/мин от 2 до 24 часов.shaker KS 500 "Labortechnik" (Germany) (also Vortex shaker was used in some experiments for mixing) at 100 rpm for 2 to 24 hours.
б) Расчетное количество амфифильного полимера и лекарственного вещества растворяли при нагревании до 40-50°С в бидистиллированной обеспыленной воде или в физиологическом растворе (0.15 М NaCl, pH ~7.4) в течение 2-6 часов. В случае наличия осадка невключенного лекарственного вещества растворы фильтровали на 0.4 или 0.2 мкм фильтрах Миллипор.b) The calculated amount of amphiphilic polymer and drug substance was dissolved by heating to 40-50 ° C in bidistilled dedusted water or in physiological saline (0.15 M NaCl, pH ~ 7.4) for 2-6 hours. If there was a precipitate of unincorporated drug substance, the solutions were filtered on 0.4 or 0.2 μm Millipore filters.
2. Диализный метод2. Dialysis method
Расчетное количество амфифильного полимера и лекарственного вещества растворяли в органическом растворителе (например, ДМСО или ДМФА), а затем диализовали относительно 4 л воды или физиологического раствора в течение 24,48 или 72 часов, используя диализные мешки с пределом фильтрации MW 600-20000 ("Sigma"). Полученный в диализном мешке водный раствор содержал частицы с включенным биологически активным веществом.The calculated amount of amphiphilic polymer and drug substance was dissolved in an organic solvent (e.g., DMSO or DMF) and then dialyzed relative to 4 L of water or physiological saline for 24.48 or 72 hours using dialysis bags with a filter limit of MW 600-20000 (" Sigma "). The aqueous solution obtained in the dialysis bag contained particles with a biologically active substance included.
3. Эмульсионный метод3. Emulsion method
а) Предварительно готовили раствор гидрофобного лекарственного вещества в растворителе, в котором это вещество растворяется (этилацетат, ДМСО, ДМФА, этиловый спирт). В этот раствор добавляли расчетное количество амфифильного полимера и перемешивали при нагревании (30-40°С) в течение 20-40 минут. После этого раствор выливали в бидистиллированную обеспыленную воду. Полученную эмульсию интенсивно перемешивали 40-60 минут на вортексе и подвергали воздействию ультразвуком с частотой 22 кГц в течение 5-20 минут, непрерывно охлаждая ледяной водой (ультразвуковой диспергатор 4710 (Cole-Parmer Instruments, США)). Органический растворитель отгоняли на роторном испарителе.a) A solution of a hydrophobic drug substance in a solvent in which this substance is dissolved (Ethyl acetate, DMSO, DMF, ethyl alcohol) was preliminarily prepared. The calculated amount of amphiphilic polymer was added to this solution and stirred under heating (30–40 ° C) for 20–40 minutes. After that, the solution was poured into bidistilled dedusted water. The resulting emulsion was intensively mixed for 40-60 minutes on a vortex and subjected to ultrasound at a frequency of 22 kHz for 5-20 minutes, continuously cooled with ice water (4710 ultrasonic dispersant (Cole-Parmer Instruments, USA)). The organic solvent was distilled off on a rotary evaporator.
б) Расчетное количество амфифильного полимера и лекарственного вещества растворяли в этилацетате (или метиленхлориде) при перемешивании и нагревании (30-40°С). Затем к полученному раствору добавляли бидистиллированную воду. Полученную эмульсию интенсивно перемешивали 20-30 минут и ультраозвучивали 1-10 минут при мощности 40 Вт и импульсном режиме (1 сек через 1 сек) на приборе "VibraCell" (США) или 1-10 мнут при максимальной мощности на приборе "УЗДН - А" (Россия). Органический растворитель отгоняли на роторном растворители.b) The calculated amount of amphiphilic polymer and drug substance was dissolved in ethyl acetate (or methylene chloride) with stirring and heating (30-40 ° C). Then, bidistilled water was added to the resulting solution. The resulting emulsion was intensively mixed for 20-30 minutes and ultra-sounding for 1-10 minutes at a power of 40 W and a pulsed mode (1 second after 1 second) on a VibraCell device (USA) or 1-10 minutes at maximum power on a UZDN-A device " (Russia). The organic solvent was distilled off on rotary solvents.
Полученные полимерные наночастицы имеют устойчивую сферическую форму, узкое распределение по размерам для каждого образца полимера (средний размер частиц для разных образцов полимеров от 5 до 1500 нм).The obtained polymer nanoparticles have a stable spherical shape, a narrow size distribution for each polymer sample (average particle size for different polymer samples is from 5 to 1500 nm).
В качестве амфифильных полимеров использовали предпочтительно акриламид, N-изопропилакриламид, 2-гидроксипропилметакриламид и N-винилпирролидон.The amphiphilic polymers used are preferably acrylamide, N-isopropyl acrylamide, 2-hydroxypropyl methacrylamide and N-vinyl pyrrolidone.
Таким образом, были получены водорастворимые препараты в виде наночастиц следующих плохо растворимых гидрофобных лекарственных веществ:Thus, water-soluble preparations in the form of nanoparticles of the following poorly soluble hydrophobic drugs were obtained:
- Снотворных и успокаивающих лекарственных веществ: нитразепама, флунитрозипама, барбитала, бромизовала.- Hypnotics and sedative drugs: nitrazepam, flunitrozipam, barbital, bromized.
- Противосу дорожных лекарственных веществ: бензоала, гексамидина, дифенина, клоназепама.- Anti-road drugs: benzoal, hexamidine, diphenin, clonazepam.
- Транквилизаторов и антидепрессантов: сибазона, феназипама, пиразидола, флуоксетина.- Tranquilizers and antidepressants: sibazon, phenazipam, pyrazidol, fluoxetine.
- Лекарственных веществ для лечения паркинсонизма: циклодола, леводона, глудантана.- Medicinal substances for the treatment of parkinsonism: cyclodol, levodone, gludantan.
- Анальгезирующих (болеутоляющих) лекарственных веществ: амидопирина, фенацетина, парацетамола, ибупрофена.- Analgesic (painkiller) drugs: amidopyrine, phenacetin, paracetamol, ibuprofen.
- Противовоспалительных лекарственных веществ: диклофенака, индометацина, кортизона.- Anti-inflammatory drugs: diclofenac, indomethacin, cortisone.
- Сердечно-сосудистых лекарственных веществ: дигитоксина, кавинтона, теофиллина, форидона.- Cardiovascular medicinal substances: digitoxin, cavinton, theophylline, foridon.
- Гормональных лекарственных веществ: тиреоидина, эстрона, метилтестостерона, силаболина.- Hormonal drugs: thyroidin, estrone, methyltestosterone, silabolin.
- Витаминов и родственных веществ: бенфотиамина, рибофлавина, рутина.- Vitamins and related substances: benfotiamine, riboflavin, rutin.
- Ферментных лекарственных веществ: лизоамидазы, панкреатина, солизима.- Enzymatic medicinal substances: lysoamidase, pancreatin, solisim.
- Лекарственных веществ, стимулирующих или регулирующих метаболические процессы: фепромарона, дипиридамола, ловастатина.- Medicinal substances that stimulate or regulate metabolic processes: febromarona, dipyridamole, lovastatin.
- Противомикробных, противовирусных и противопаразитарных лекарственных веществ: ампициллина, тетрациклина, рифампицина, левом ицетина, стрептоцида, бонафтона, метисазона.- Antimicrobial, antiviral and antiparasitic medicinal substances: ampicillin, tetracycline, rifampicin, left acetamin, streptocide, bonafton, metisazon.
- Противогрибковых лекарственных веществ: нистатина, амфотерицина В, гризеофульвина.- Antifungal drugs: nystatin, amphotericin B, griseofulvin.
- Противоопухолевых лекарственных веществ: доксорубицина, метотрексата, цисплатина, эпирубицина, реумицина, хлодитана.- Anticancer drugs: doxorubicin, methotrexate, cisplatin, epirubicin, rumicin, chloditan.
- Диагностических лекарственных веществ: йодамида, билигноста, пентагастрина.- Diagnostic drugs: iodamide, bilignost, pentagastrin.
- Биологически активных пептидов и белков: ДНК, инсулина, тимоптина, грамицидина.- Biologically active peptides and proteins: DNA, insulin, thymoptin, gramicidin.
Получение липосом, модифицированных амфифильными полимерами и содержащих биологически активные веществаObtaining liposomes modified with amphiphilic polymers and containing biologically active substances
Способ солюбилизации биологически активных веществ с помощью модифицированных липосом основан на процессах самоассоциации дифильных веществ в водных средах, которые придают всей системе хорошую водосовместимость (растворимость в водных средах).The method of solubilization of biologically active substances using modified liposomes is based on the processes of self-association of diphilic substances in aqueous media, which give the whole system good water compatibility (solubility in aqueous media).
Для получения липосом, модифицированных амфифильными полимерами и содержащих биологически активные вещества, дополнительный липосомальный вектор формируют из липидов, например, из смеси фосфатидилхолин / холестерин (мольное соотношение 7:3) или фосфатидилхолин / холестерин / кардиолипин (мольное соотношение 7:3:1). Количество вводимого в липосомы модифицирующего амфифильного полимера составляло от 0.1 до 30 весовых %. Количество включаемого лекарственного вещества было от 0.1 до 60 весовых %.To obtain liposomes modified with amphiphilic polymers and containing biologically active substances, an additional liposomal vector is formed from lipids, for example, from a mixture of phosphatidylcholine / cholesterol (molar ratio 7: 3) or phosphatidylcholine / cholesterol / cardiolipin (molar ratio 7: 3: 1). The amount of modifying amphiphilic polymer introduced into liposomes was from 0.1 to 30% by weight. The amount of drug substance included was from 0.1 to 60 weight%.
Формирование модифицированных липосом, с включенными биологически активными веществами, проводили с использованием двух методик.The formation of modified liposomes with biologically active substances included was carried out using two methods.
Пример №1. В первом случае липосом-формирующие компоненты, а также амфифильный полимер и биологически активное вещество в расчетных количествах растворяли в хлороформе при температуре 20°С. Полученный раствор вакуумировали в среде азота или аргона, полученную пленку замораживали. Затем пленку диспергировали в фосфатном буфере рН 7,4 0,01 М при 4°С. Диализат пропускали через фильтры Nucleopore (Spectrum Laboratories Inc.) с размером пор 0.6, 0.4, 0.2 и 0.1 мкм. При этом выделенные фракции липосом содержали частицы с размерами 100-200 нм.Example No. 1. In the first case, the liposome-forming components, as well as the amphiphilic polymer and biologically active substance, were dissolved in calculated amounts in chloroform at a temperature of 20 ° C. The resulting solution was evacuated in nitrogen or argon, and the resulting film was frozen. Then the film was dispersed in phosphate buffer pH 7.4 0.01 M at 4 ° C. The dialysate was passed through Nucleopore filters (Spectrum Laboratories Inc.) with pore sizes of 0.6, 0.4, 0.2 and 0.1 μm. In this case, the isolated liposome fractions contained particles with sizes of 100-200 nm.
Пример №2. Во втором случае липосом-формирующие компоненты, а также расчетные количества амфифильного полимера и лекарственного вещества растворяли в этаноле, а затем раствор упаривали на роторном испарителе Rotavapor (Buchi, Швейцария) при 35°С. Полученную пленку диспергировали в 0,01 М фосфатном буфере рН 9,2. Полученную эмульсию подвергали воздействию ультразвуком с частотой 22 кГц в течение 300-400 секунд, непрерывно охлаждая ледяной водой (ультразвуковой диспергатор 4710 (Cole-Parmer Instruments, США)). Фракцию липосом с размерами 100-200 нм выделяли с помощью гельпроникающей хроматографии с использованием сефадекса G-25.Example No. 2. In the second case, the liposome-forming components, as well as the calculated amounts of amphiphilic polymer and drug substance, were dissolved in ethanol, and then the solution was evaporated on a Rotavapor rotary evaporator (Buchi, Switzerland) at 35 ° С. The resulting film was dispersed in 0.01 M phosphate buffer pH 9.2. The resulting emulsion was subjected to ultrasound at a frequency of 22 kHz for 300-400 seconds, continuously cooled with ice water (ultrasonic disperser 4710 (Cole-Parmer Instruments, USA)). A 100-200 nm liposome fraction was isolated by gel permeation chromatography using Sephadex G-25.
С использованием этих методик в модифицированные амфифильными полимерами липосомы были включены следующие лекарственные вещества:Using these techniques, the following drugs were included in amphiphilic polymer modified liposomes:
- Снотворные и успокаивающие лекарственные вещества: нитразепам, флунитрозипам, барбитал, бромизовал.- Hypnotic and sedative drugs: nitrazepam, flunitrozipam, barbital, bromized.
- Противосудорожные лекарственные вещества: бензоал, гексамидин, дифенин, клоназепам.- Anticonvulsant drugs: benzoal, hexamidine, diphenin, clonazepam.
- Транквилизаторы и антидепрессанты: сибазон, феназипам, пиразидол, флуоксетин.- Tranquilizers and antidepressants: sibazon, phenazipam, pyrazidol, fluoxetine.
- Лекарственные вещества для лечения паркинсонизма: циклодол, леводон, глудантан.- Medicinal substances for the treatment of parkinsonism: cyclodol, levodon, gludantan.
- Анальгезирующие (болеутоляющие) лекарственные вещества: амидопирин, фенацетин, парацетамол, ибупрофен.- Analgesic (painkiller) drugs: amidopyrine, phenacetin, paracetamol, ibuprofen.
- Противовоспалительные лекарственные вещества: диклофенак, индометацин, кортизон.- Anti-inflammatory drugs: diclofenac, indomethacin, cortisone.
- Сердечно-сосудистые лекарственные вещества: дигитоксин, кавинтон, теофиллин, форидон.- Cardiovascular medicinal substances: digitoxin, cavinton, theophylline, foridon.
- Гормональные лекарственные вещества: тиреоидин, эстрон, метилтестостерон, силаболин.- Hormonal drugs: thyroidin, estrone, methyltestosterone, silabolin.
- Витамины и родственные вещества: бенфотиамин, рибофлавин, рутин.- Vitamins and related substances: benfotiamine, riboflavin, rutin.
- Ферментные лекарственные вещества: лизоамидаза, панкреатин, солизим.- Enzymatic medicinal substances: lysoamidase, pancreatin, solisim.
- Лекарственные вещества, стимулирующие или регулирующие метаболические процессы: фепромарон, дипиридамол, ловастатин.- Medicinal substances that stimulate or regulate metabolic processes: fepromaron, dipyridamole, lovastatin.
- Противомикробные, противовирусные и противопаразитарные лекарственные вещества: ампициллин, тетрациклин, рифампицин, левомицетин, стрептоцид, бонафтон, метисазон.- Antimicrobial, antiviral and antiparasitic medicinal substances: ampicillin, tetracycline, rifampicin, chloramphenicol, streptocid, bonafton, methisazone.
- Противогрибковые лекарственные вещества: нистатин, амфотерицин В, гризеофульвин.- Antifungal drugs: nystatin, amphotericin B, griseofulvin.
- Противоопухолевые лекарственные вещества: доксорубицин, метотрексат, цисплатин, эпирубицин, реумицин, хлодитан.- Anticancer drugs: doxorubicin, methotrexate, cisplatin, epirubicin, rumicin, chloditan.
- Диагностические лекарственные вещества: йодамид, билигност, пентагастрин.- Diagnostic medicinal substances: iodamide, bilignost, pentagastrin.
- Биологически активные пептиды и белки: ДНК, инсулин, тимоптин, грамицидин.- Biologically active peptides and proteins: DNA, insulin, thymoptin, gramicidin.
Для получения водорастворимых форм биологически активных веществ в виде порошков для приготовления растворов растворы модифицированных липосом и/или полимерных частиц сушили с использованием лиофильной сушки или сушки в кипящем слое.To obtain water-soluble forms of biologically active substances in the form of powders for the preparation of solutions, solutions of modified liposomes and / or polymer particles were dried using freeze drying or fluidized bed drying.
Для получения таблетированных форм биологически активных веществ полученные порошки подвергали прессованию.To obtain tablet forms of biologically active substances, the obtained powders were pressed.
1) Включение плохорастворимых и нерастворимых в воде веществ в полимерные наночастицы проводили с использованием в качестве модельных липофильных веществ водонерастворимых флуоресцентных красителей (пирен, перилен). Для этого, аликвоты содержащие 100 мкл пирена (перилена) в метаноле (10 мг/мл), были высушены под вакуумом. 1,8 мл физиологического раствора, содержащего 0,2% азида натрия, были добавлены к каждой пробирке с высушенным пиреном (периленом). Затем в пробирки добавляли 200 мкл последовательно разбавленных (10-4-10-10 М) образцов различных амфифильных полимеров и перемешивали сутки при комнатной температуре. Далее образцы фильтровали через 0,4 мкм фильтры Millipore для того, чтобы удалить остатки несолюбилизированного пирена. Интенсивность флуоресценции солюбилизированного пирена была измерена при длине волны возбуждения 339 нм и длине волны эмиссии 385 нм, используя люминесцентный спектрометр (Perkin Elmer LS-50B, U.K.). Интенсивность флуоресценции напрямую зависела от концентрации включенного в наночастицы красителя (чем больше иммобилизированного пирена или перилена, тем выше интенсивность флуоресценции). По полученным данным строили калибровочный график для каждого из красителей, по которому в дальнейшем определяли концентрацию иммобилизированных липофильных агентов.1) The incorporation of poorly soluble and water-insoluble substances into polymer nanoparticles was carried out using water-insoluble fluorescent dyes (pyrene, perylene) as model lipophilic substances. For this, aliquots containing 100 μl of pyrene (perylene) in methanol (10 mg / ml) were dried under vacuum. 1.8 ml of physiological saline containing 0.2% sodium azide was added to each tube with dried pyrene (perylene). Then, 200 μl of consecutively diluted (10 -4 -10 -10 M) samples of various amphiphilic polymers were added to the tubes and stirred for one day at room temperature. Next, the samples were filtered through 0.4 μm Millipore filters in order to remove residues of unsolubilized pyrene. The fluorescence intensity of the solubilized pyrene was measured at an excitation wavelength of 339 nm and an emission wavelength of 385 nm using a luminescent spectrometer (Perkin Elmer LS-50B, UK). The fluorescence intensity directly depended on the concentration of the dye incorporated into the nanoparticles (the more immobilized pyrene or perylene, the higher the fluorescence intensity). According to the data obtained, a calibration graph was constructed for each of the dyes, according to which the concentration of immobilized lipophilic agents was further determined.
2) Включение амфотерицина В в полимерные наночастицы. Предварительно готовили раствор амфотерицина В в этилацетате (0,1-5 мг/мл). 5 мг амфифильного полимера растворяли в 1 мл этилацетата, содержащего амфотерицин В при перемешивании и нагревании (30-40°С). Затем добавляли 5 мл дистиллированной воды. Полученную эмульсию интенсивно перемешивали на вортексе 5 минут и ультраозвучивали в течение 1 мин. Органический растворитель отгоняли на роторном испарителе. Полученную суспензию наночастиц с включенным амфотерицином В хранили в защищенном от света месте.2) The inclusion of amphotericin B in polymer nanoparticles. A solution of amphotericin B in ethyl acetate (0.1-5 mg / ml) was preliminarily prepared. 5 mg of amphiphilic polymer was dissolved in 1 ml of ethyl acetate containing amphotericin B with stirring and heating (30-40 ° C). Then 5 ml of distilled water was added. The resulting emulsion was vortexed vigorously for 5 minutes and sonicated for 1 minute. The organic solvent was distilled off on a rotary evaporator. The resulting suspension of nanoparticles with amphotericin B included was stored in a dark place.
Количественное определение амфотерицина В спектрофотометрическим методом. Концентрацию амфотерицина В в наночастицах в водном растворе определяли по калибровочному графику на спектрофотометре "Shimadzu UV -265 FW" (Япония) при длине волны 405 нм. Для построения калибровочного графика приготовляли серию растворов неиммобилизированного амфотерицина В в метаноле различной концентрации (от 0,01 до 0,1 мг/мл). Затем измеряли поглощение растворами наночастиц с включенным антибиотиком и по калибровочному графику находили концентрацию амфотерицина В в наночастицах.Quantitative determination of amphotericin B by spectrophotometric method. The concentration of amphotericin B in nanoparticles in an aqueous solution was determined by a calibration graph on a Shimadzu UV -265 FW spectrophotometer (Japan) at a wavelength of 405 nm. To build a calibration graph, a series of solutions of non-immobilized amphotericin B in methanol of various concentrations (from 0.01 to 0.1 mg / ml) was prepared. Then, the absorption of the nanoparticles with the antibiotic on was measured, and the amphotericin B concentration in the nanoparticles was found from the calibration graph.
Эффективность противогрибкового действия включенного в наночастицы амфотерицина В in vitro. Была изучена прямая противогрибковая активность иммобилизированного амфотерицина В (AmphPol-AmB) in vitro и сопоставлена активность новых форм этого антибиотика с активностью обычного амфотерицина В (АтВ). Противогрибковая активность препаратов определяли против патогенных штаммов дрожжевых грибов (Candida spp. - C.albicans и C.tropicalis) и мицелиальных грибов (Aspergillus spp. и Fusarium spp.), которые были выделены из крови или спинномозговой жидкости онкологических больных.The effectiveness of the antifungal action of amphotericin B incorporated into nanoparticles in vitro. The direct antifungal activity of immobilized amphotericin B (AmphPol-AmB) in vitro was studied and the activity of new forms of this antibiotic was compared with the activity of ordinary amphotericin B (AtB). The antifungal activity of the preparations was determined against pathogenic strains of yeast fungi (Candida spp. - C. albicans and C.tropicalis) and mycelial fungi (Aspergillus spp. And Fusarium spp.), Which were isolated from the blood or cerebrospinal fluid of cancer patients.
Выделенные культуры инкубировали при температуре 35°С в течение 24-48 часов в тканевой культуральной среде PRMI-1640, содержащей различные количества иммобилизированного на полимерных наночастицах или обычного амфотерицина В, растворенных в диметилсульфоксиде. Концентрация препарата, необходимая для подавления роста штамма каждого вида дрожжевых грибов на 90% (MIC90), оценивалась визуально. Образцы, в которых не было роста, культивировались далее с использованием метода последовательных разведении для того, чтобы определить минимальную 90% фунгицидную концентрацию для штамма каждого вида (MFC90). Полученные результаты показали, что минимальная ингибиторная концентрация наночастиц с антибиотиком ниже такой концентрации свободного препарата, и что фунгицидная активность новых наноразмерных форм амфотерицина В несколько выше активности простого фунгицида (например против грибов штамма Fusarium spp.значение MIC90 для препарта AmphPol-AmB равно 2,2 мкг/мл, а для AmB MIC90=2,6 мкг/мл).The isolated cultures were incubated at a temperature of 35 ° C for 24-48 hours in a tissue culture medium PRMI-1640 containing various amounts of ordinary amphotericin B dissolved in dimethyl sulfoxide immobilized on polymer nanoparticles. The concentration of the drug necessary to inhibit the growth of the strain of each type of yeast by 90% (MIC90) was evaluated visually. Samples in which there was no growth were further cultured using a serial dilution method in order to determine the minimum 90% fungicidal concentration for each strain of strain (MFC90). The results showed that the minimum inhibitory concentration of nanoparticles with an antibiotic is lower than that of the free drug, and that the fungicidal activity of new nanoscale forms of amphotericin B is slightly higher than the activity of a simple fungicide (for example, against fungi of the strain Fusarium spp. MIC90 value for AmphPol-AmB preparation is 2.2 μg / ml, and for AmB MIC90 = 2.6 μg / ml).
Распределение полимерных частиц с амфотерицином В in vivo изучали при введении наночастиц, содержащих водную флюоресцирующую краску сульфородамин, зараженным Candida albicans мышам. Через день после заражения мышам вводили либо наночастицы с амфотерицином В и краской (S-AmphPol-AmB), либо идентичные наночастицы с краской, но без лекарства (S-AmphPol), либо наночастицы с амфотерицином В и без краски (AmphPol-AmB). Через 17 часов после введения мышей забивали. Почки замораживали, подвергали секции и исследовали либо непосредственно на локализацию красной флюоресценции, либо фиксировали и окрашивали, чтобы определить места грибковой инфекции. В почках мышей, получавших S-AmphPol-AmB и S-AmphPol, выявлялось яркое красное флюоресцирующее свечение в областях грибковой инфекции. В почках мышей, получавших AmphPol-AmB без краски, была только слабая диффузная аутофлюоресценция. Это говорит о том, что полимерные наночастицы с амфотерицином В или без него попадают в места инфекции.The distribution of polymer particles with amphotericin B in vivo was studied with the introduction of nanoparticles containing aqueous fluorescent sulphorodamine paint to infected Candida albicans mice. One day after infection, the mice were injected with either nanoparticles with amphotericin B and paint (S-AmphPol-AmB), or identical nanoparticles with paint, but without medicine (S-AmphPol), or nanoparticles with amphotericin B and without paint (AmphPol-AmB). Mice were sacrificed 17 hours after administration. The kidneys were frozen, sections were exposed and examined either directly for localization of red fluorescence, or fixed and stained to determine the sites of fungal infection. In the kidneys of mice treated with S-AmphPol-AmB and S-AmphPol, a bright red fluorescent glow was detected in the areas of fungal infection. In the kidneys of mice treated with AmphPol-AmB without paint, there was only weak diffuse autofluorescence. This suggests that polymer nanoparticles with or without amphotericin B enter the site of infection.
Легочный аспергиллез у кроликов. При изучении модели первичного легочного аспергиллеза кроликам с гранулоцитопенией внутривенно вводили одну из лекарственных форм. Максимально переносимая доза наночастиц с амфотерицином В составила 6 мг/кг/день, а обычного амфотерицина - 1.8 мг/кг/день. Выживаемость после заражения была значительно больше в группе, получавшей наночастицы с амфотерицином В, и не возрастала в группе амфотерицин. Частота геморрагических осложнений в группе животных, получавших иммобилизированный антибиотик, также была меньше. Из этого следует, что при первичном легочном аспергиллезе новая наноразмерная форма амфотерицина В значительно повышает выживаемость, уменьшает частоту повреждений тканей и микробиологической инфекции.Pulmonary aspergillosis in rabbits. When studying the model of primary pulmonary aspergillosis, one of the dosage forms was intravenously administered to rabbits with granulocytopenia. The maximum tolerated dose of nanoparticles with amphotericin B was 6 mg / kg / day, and that of conventional amphotericin was 1.8 mg / kg / day. Survival after infection was significantly greater in the group receiving nanoparticles with amphotericin B, and did not increase in the amphotericin group. The frequency of hemorrhagic complications in the group of animals treated with the immobilized antibiotic was also less. From this it follows that in primary pulmonary aspergillosis, a new nanoscale form of amphotericin B significantly increases survival, reduces the frequency of tissue damage and microbiological infection.
Пример №1.Example No. 1.
Включение Доксорубицина (Докс) в наночастицы на основе амфифильного производного полиакриламида молекулярной массы 3000 с концевой додецильной гидрофобной группой (ПАА-ДД 3000) методом прямого растворения.The incorporation of Doxorubicin (Dox) into nanoparticles based on an amphiphilic derivative of a polyacrylamide of molecular weight 3000 with a dodecyl hydrophobic terminal group (PAA-DD 3000) by direct dissolution.
Для солюбилизации доксорубицина брали 1 мл раствора амфифильного полимера ПАА-ДД 3000 в фосфатном буфере с концентрацией 0,5 мг/мл, к которому добавляли доксорубицин в концентрации 0,1 мг/мл. Полученный раствор перемешивали на качалке KS 500 "Labortechnik" (Германия) при 100 об/мин и 50°С в течение 16 часов. Затем раствор ультраозвучивали при помощи ультразвукового диспергатора Sonopuls (Bandelin electronic, Германия) для того, чтобы избежать агрегации мицеллярных наночастиц в более крупные полимерные агрегаты из-за взаимодействия полимерных цепей. Несолюбилизованный доксорубицин отделяли центрифугированием на микроцентрифуге Denville 260D (США). Количество включенного в наноразмерные полимерные агрегаты биологически активного вещества вычисляли по спектрам флуоресценции доксорубицина. Эффективность загрузки в данном случае составила 18%. Средний диаметр образованных частиц с включенным доксорубицином, определенный методом динамического светорассеяния, составил 78±6 нм.To solubilize doxorubicin, 1 ml of a solution of amphiphilic polymer PAA-DD 3000 was taken in phosphate buffer at a concentration of 0.5 mg / ml, to which doxorubicin was added at a concentration of 0.1 mg / ml. The resulting solution was stirred on a KS 500 Labortechnik rocker (Germany) at 100 rpm and 50 ° C for 16 hours. Then, the solution was sonicated using an Sonopuls ultrasonic disperser (Bandelin electronic, Germany) in order to avoid aggregation of micellar nanoparticles into larger polymer aggregates due to the interaction of polymer chains. Unsolubilized doxorubicin was separated by centrifugation on a Denville 260D microcentrifuge (USA). The amount of biologically active substance included in nanoscale polymer aggregates was calculated from the fluorescence spectra of doxorubicin. The download efficiency in this case was 18%. The average diameter of the formed particles with doxorubicin incorporated, determined by dynamic light scattering, was 78 ± 6 nm.
Пример №2.Example No. 2.
Включение Индометацина (Инд) в наночастицы на основе амфифильного производного поли-N-изопропилакриламида молекулярной массы 5500 с концевой гексадецильной гидрофобной группой (ПИПАА-ГД 5500) диализным методом.Inclusion of Indomethacin (Ind) in nanoparticles based on an amphiphilic derivative of poly-N-isopropylacrylamide with a molecular weight of 5500 with a terminal hexadecyl hydrophobic group (PIPAA-GD 5500) using the dialysis method.
300 мг амфифильного полимера ПИПАА-ГД 5500 растворяли в 10 мл ДМФА, после чего добавляли в полученный раствор Инд (весовое соотношение 1:1) и перемешивали в течение 6 часов на вортексе Stuart (Великобритания). Для образования наноразмерных мицеллярных частиц с включенным индометацином и удаления несолюбилизированного биологически активного вещества приготовленный раствор диализовали в течение 48 часов относительно 3 л бидистиллированной воды, используя диализные мембраны из восстановленной целлюлозы с размером пор 1,5 кДа (Sigma, США). Полученный водный раствор наночастиц обрабатывали ультразвуком с помощью ультразвукового диспергатора Sonopuls (Bandelin electronic, Германия) и центрифугировали на микроцентрифуге Denville 260D (США), чтобы удалить из раствора остатки невключенного индометацина и размельчить более крупные полимерные агрегаты. Эффективность загрузки, определенная по спектрам флуоресценции индометацина, составила 36%. Размер получившихся полимерных частиц с включенным Инд, определенный методом динамического светорассеяния составил 42±4 нм.300 mg of the amphiphilic polymer PIPAA-GD 5500 was dissolved in 10 ml of DMF, and then Indus (weight ratio 1: 1) was added to the resulting solution and stirred for 6 hours on Stuart vortex (Great Britain). To form nanosized micellar particles with indomethacin incorporated and to remove unsolubilized biologically active substances, the prepared solution was dialyzed for 48 hours against 3 L of double-distilled water using dialysis membranes from reduced cellulose with a pore size of 1.5 kDa (Sigma, United States). The resulting aqueous solution of nanoparticles was sonicated using a Sonopuls ultrasonic disperser (Bandelin electronic, Germany) and centrifuged on a Denville 260D microcentrifuge (USA) to remove unincorporated indomethacin from the solution and grind larger polymer aggregates. The loading efficiency, determined by the fluorescence spectra of indomethacin, was 36%. The size of the resulting polymer particles with Indus turned on, determined by dynamic light scattering, was 42 ± 4 nm.
Пример №3.Example No. 3.
Включение Ампициллина (Амп) в наночастицы на основе амфифильного производного поли-N-винилпирролидона молекулярной массы 4000 с концевой октадецильной гидрофобной группой (ПВП-ОД 4000) эмульсионным методом.The inclusion of Ampicillin (Amp) in nanoparticles based on an amphiphilic derivative of poly-N-vinylpyrrolidone of molecular weight 4000 with an end octadecyl hydrophobic group (PVP-OD 4000) by the emulsion method.
200 мг полимера ПВП-ОД 4000 и 100 мг ампициллина (Амп) растворяли в 8 мл хлороформа. Полученный раствор интенсивно перемешивали 4 часа при нагревании до 40°С, после чего приливали к 40 мл бидистиллированной воды. Далее эмульсию интенсивно перемешивали и многократно обрабатывали ультразвуком в течение 1 минуты при максимальной мощности на ультразвуковом диспергаторе Sonopuls (Bandelin electronic, Германия). После этого органический растворитель и часть воды отгоняли на роторном испарителе Rotadest (MTA Kutesz, Венгрия), доводя объем водного раствора полимерных наночастиц с включенным Амп до 10 мл. Полученный раствор центрифугировали в течение 8 минут при скорости вращения 6500 об./мин на микроцентрифуге Denville 260D (США) и надосадочную жидкость фильтровали через мембраны Durapore с диаметром пор 0,15 мкм (Millipore Corp., Ирландия) для удаления несолюбилизованного Амп. Эффективность включения, определенная по спектрам флуоресценции ампициллина составила 55%. Размер полученных наноразмерных полимерных частиц с включенным Амп, определенный методом динамического светорассеяния, составил 22±2 нм.200 mg of the PVP-OD 4000 polymer and 100 mg of ampicillin (Amp) were dissolved in 8 ml of chloroform. The resulting solution was stirred intensively for 4 hours while heating to 40 ° C, after which it was poured into 40 ml of double-distilled water. Next, the emulsion was intensively mixed and repeatedly treated with ultrasound for 1 minute at maximum power on an ultrasonic disperser Sonopuls (Bandelin electronic, Germany). After that, the organic solvent and part of the water were distilled off on a Rotadest rotary evaporator (MTA Kutesz, Hungary), bringing the volume of an aqueous solution of polymer nanoparticles with Amp turned on to 10 ml. The resulting solution was centrifuged for 8 minutes at a speed of 6500 rpm on a Denville 260D microcentrifuge (USA) and the supernatant was filtered through 0.15 μm Durapore membranes (Millipore Corp., Ireland) to remove the unsolubilized Amp. The inclusion efficiency determined by the fluorescence spectra of ampicillin was 55%. The size of the obtained nanosized polymer particles with Amp turned on, determined by dynamic light scattering, was 22 ± 2 nm.
Пример №4.Example No. 4.
Включение Нистатина (Нис) в липосомы, модифицированные амфифильным полимером акриламида с молекулярной массой полимерного фрагмента Mn=4700 и одной концевой гексадецильной группой (ПАА-ГД 4700).The inclusion of Nystatin (Nis) in liposomes modified with an amphiphilic acrylamide polymer with a molecular weight of the polymer fragment Mn = 4700 and one terminal hexadecyl group (PAA-HD 4700).
Смесь липидов кардиолипина и яичного лецитина (мольной соотношение 7:3) растворяли в 15 мл смеси хлороформ/метанол (2:1 об./об.) до общей концентрации липидов в растворе 15 мг/мл. Затем к раствору добавляли 8 мольн. % (от количества липидов) амфифильного полимера ПАА-ГД 4700 и 200 мг Нис. Полученную смесь тщательно перемешивали в 250 мл круглодонной колбе. Затем на роторном испарителе Rotovator (Buchi, Швейцария) при пониженном давлении и 35°С отгоняли органический растворитель. Процесс продолжали до полного удаления растворителя и образования однородной пленки на стенках колбы. В колбу добавляли 5 мл фосфатного буфера (рН 7,4) и тщательно перемешивали в течение 40 минут до образования гомогенной молочно-белой суспензии. Суспензию выдерживали 4 часа для завершения процесса набухания системы. Затем полученную суспензию диспергировали, воздействуя ультразвуком (ультразвуковой диспергатор Sonopuls (Bandelin electronic, Германия)) и охлаждая ледяной водой. Выделение фракции липосом с размером 100-200 нм и удаление несолюбилизированного Нис осуществляли фильтрованием смеси через фильтры Nucleopore (Spectrum Laboratories Inc., США) с размером пор 0,2 мкм. Размер полученных липосом определяли методом динамического рассеяния. Эффективность включения Нис, определенная флуориметрическим методом, составила 72%.A mixture of lipid cardiolipin and egg lecithin (molar ratio 7: 3) was dissolved in 15 ml of a mixture of chloroform / methanol (2: 1 vol./about.) To a total concentration of lipids in a solution of 15 mg / ml. Then, 8 moles were added to the solution. % (of the amount of lipids) of the amphiphilic polymer PAA-HD 4700 and 200 mg Nis. The resulting mixture was thoroughly mixed in a 250 ml round bottom flask. Then, an organic solvent was distilled off under reduced pressure and 35 ° C. using a Rotovator rotary evaporator (Buchi, Switzerland). The process was continued until complete removal of the solvent and the formation of a uniform film on the walls of the flask. 5 ml of phosphate buffer (pH 7.4) was added to the flask and mixed thoroughly for 40 minutes until a homogeneous milky-white suspension formed. The suspension was held for 4 hours to complete the process of swelling of the system. Then, the resulting suspension was dispersed by sonication (Sonopuls ultrasonic dispersant (Bandelin electronic, Germany)) and cooling with ice water. The extraction of liposome fractions with a size of 100-200 nm and the removal of unsolubilized Nis was carried out by filtering the mixture through Nucleopore filters (Spectrum Laboratories Inc., USA) with a pore size of 0.2 μm. The size of the obtained liposomes was determined by dynamic scattering. The efficiency of Nis inclusion, determined by the fluorimetric method, was 72%.
Пример №5.Example No. 5.
Включение Амфотерицина В (Амф) в липосомы, модифицированные амфифильным полимером N-винилпирролидона с молекулярной массой полимерного фрагмента Mn=3300 и одной концевой октадецильной группой (ПВП-ОД 3300).Inclusion of Amphotericin B (Amph) in liposomes modified with an amphiphilic polymer of N-vinylpyrrolidone with a molecular weight of the polymer fragment Mn = 3300 and one terminal octadecyl group (PVP-OD 3300).
Смесь липидов фосфатидилхолина, холестерина и кардиолипина (мольное соотношение 7:3:1) растворяли в 20 мл хлороформа до общей концентрации липидов в растворе 20 мг/мл. Затем в раствор вводили 12 мольн.% от количества липидов амфифильного полимера ПВП-ОД 3300 и 250 мг Амф. Полученную смесь тщательно перемешивали в 250 мл круглодонной колбе и сушили под вакуумом в среде аргона при 45°С в течение 8 часов до полного удаления растворителя и образования однородной тонкой пленки. Затем полученную пленку из липидов, полимера и Амф растворяли в 8 мл фосфатного буфера (рН 7,4), перемешивали и полученную суспензию диализовали в течение 16 часов при охлаждении до 4°С относительно 3 л буферного раствора. Полученные модифицированные липосомы с включенным Амф отделяли от неиммобилизованного антибиотика, используя колоночную хроматографию (Sephadex G-25; 0,8×5,2 см). Размер полученных липосом, определенный методом динамического светорассеяния, составил 120±10 нм. Эффективность включения Амф в модифицированные амфифильным полимером липосомы, определенная флуориметрическим методом, составила 82%.A mixture of phosphatidylcholine, cholesterol and cardiolipin lipids (molar ratio 7: 3: 1) was dissolved in 20 ml of chloroform to a total lipid concentration of 20 mg / ml in solution. Then, 12 mol% of the amount of lipids of the amphiphilic polymer PVP-OD 3300 and 250 mg Amph was introduced into the solution. The resulting mixture was thoroughly mixed in a 250 ml round bottom flask and dried under vacuum in argon at 45 ° C for 8 hours until the solvent was completely removed and a uniform thin film formed. Then, the obtained film of lipids, polymer, and Amph was dissolved in 8 ml of phosphate buffer (pH 7.4), mixed, and the resulting suspension was dialyzed for 16 hours while cooling to 4 ° C with respect to 3 L of buffer solution. The resulting modified liposomes with AMP incorporated were separated from the non-immobilized antibiotic using column chromatography (Sephadex G-25; 0.8 × 5.2 cm). The size of the obtained liposomes, determined by dynamic light scattering, was 120 ± 10 nm. The efficiency of incorporating Amph into liposomes modified with an amphiphilic polymer, as determined by the fluorimetric method, was 82%.
Наноразмерные формы биологически активных веществ на основе новых амфифильных полимеров, содержащих гидрофильный фрагмент водорастворимого полимера и гидрофобный длинноцепной алифатический фрагмент.Table 1.
Nanoscale forms of biologically active substances based on new amphiphilic polymers containing a hydrophilic fragment of a water-soluble polymer and a hydrophobic long-chain aliphatic fragment.
Номенклатура полимеров и алифатических радикалов:Nomenclature of polymers and aliphatic radicals:
ПВП - поли-N-винилпирролидонPVP - poly-N-vinylpyrrolidone
ПАА - полиакриламидPAA - Polyacrylamide
ПИПАА - поли-N-изопропилакриламидPIPAA - poly-N-isopropylacrylamide
ПГПМА - поли-N-(2-гидроксипропил) метакриламидаPHPMA - poly-N- (2-hydroxypropyl) methacrylamide
Гек2 - дигексилHuck 2 - Digexil
Окт2 - диоктилOct 2 - Dioctyl
Окт - октилOct - Octyl
ДД - додецилDD - dodecyl
ГД - гексадецилHD - hexadecyl
ОД - окдадецилOD - Okdedecyl
Липосомальные формы биологически активных веществ, модифицированные амфифильными полимерами, содержащими гидрофильный фрагмент водорастворимого полимера и гидрофобный длинноцепной алифатический фрагмент.Table 2.
Liposomal forms of biologically active substances modified with amphiphilic polymers containing a hydrophilic fragment of a water-soluble polymer and a hydrophobic long-chain aliphatic fragment.
Номенклатура полимеров, алифатических радикалов и липидов:Nomenclature of polymers, aliphatic radicals and lipids:
ПВП - поли-N-винилпирролидонPVP - poly-N-vinylpyrrolidone
ПАА - полиакриламидPAA - Polyacrylamide
ПИПАА - поли-N-изопропилакриламидPIPAA - poly-N-isopropylacrylamide
ПГПМА - поли-N-(2-гидроксипропил) метакриламидаPHPMA - poly-N- (2-hydroxypropyl) methacrylamide
ДД - додецилDD - dodecyl
ГД - гексадецилHD - hexadecyl
ОД - окдадецилOD - Okdedecyl
КЛ - кардиолипинKL - cardiolipin
ЯЛ - яичный лецитинYAL - egg lecithin
ФХ - фосфатидилхолинPF - phosphatidylcholine
X - холестеринX - cholesterol
ФЭА - фосфатидилэтаноламинFEA - phosphatidylethanolamine
ФС - фосфатидилсеринFS - phosphatidylserine
ТО - триолеинTO - triolein
ФГ - фосфатидилглицеролFG - phosphatidylglycerol
ТК - триоктаноилTK - trioctanoyl
Claims (43)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2006123043/15A RU2325151C2 (en) | 2006-06-29 | 2006-06-29 | Method of delivering water-insoluble and poorly soluble bioactive substances and pharmaceutical form based on it |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2006123043/15A RU2325151C2 (en) | 2006-06-29 | 2006-06-29 | Method of delivering water-insoluble and poorly soluble bioactive substances and pharmaceutical form based on it |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2006123043A RU2006123043A (en) | 2008-01-20 |
| RU2325151C2 true RU2325151C2 (en) | 2008-05-27 |
Family
ID=39107936
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2006123043/15A RU2325151C2 (en) | 2006-06-29 | 2006-06-29 | Method of delivering water-insoluble and poorly soluble bioactive substances and pharmaceutical form based on it |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2325151C2 (en) |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2478371C2 (en) * | 2008-12-26 | 2013-04-10 | Самъянг Биофармасьютикалз Корпорейшн | Method of obtaining composition of polymeric micelles, containing drug, poorly dissolved in water |
| RU2491288C1 (en) * | 2012-05-17 | 2013-08-27 | Закрытое акционерное общество "Нанотехнологии и инновации" (ЗАО "НТиИ") | Method for preparing nanosized amphotericin b |
| RU2540077C2 (en) * | 2008-10-27 | 2015-01-27 | Селлсьютикс Корпорейшн | Synthetic immune protection mimetics and use thereof |
| WO2016043620A1 (en) * | 2014-09-17 | 2016-03-24 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Научно-Производственный Центр "Амифион" | Amphiphilic polymers and delivery systems based thereon |
| RU2580649C1 (en) * | 2015-03-27 | 2016-04-10 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Научно-Производственный Центр "Амфион" | Water-compatible polymer compositions for delivery of biologically active substances |
| RU2607598C1 (en) * | 2015-07-31 | 2017-01-10 | Антон Борисович Архипов | Method of producing hybrid two-phase system of delivery of poorly soluble and insoluble in water biologically active substances with controlled release kinetic |
| RU2608304C1 (en) * | 2015-09-11 | 2017-01-17 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Научно-Производственный Центр "Амфион" | Amphiphilic polymer-metal complexes and synthesis method thereof |
| RU2752177C1 (en) * | 2020-09-29 | 2021-07-23 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Научно-Производственный Центр "Амфион" | Vectorized water-compatible polymer micellar particles for delivery of biologically active substances through blood-brain barrier |
| RU2752314C1 (en) * | 2020-07-10 | 2021-07-26 | Общество с ограниченной ответственностью "Таргет-Инжиниринг" | Method for obtaining nanoscale systems of oligopeptide-polymer particle based on amphiphilic copolymers of n-vinylpyrrolidone with (di)methacrylates and their use as active substance in cosmethology and medicine |
| RU2760274C1 (en) * | 2020-07-10 | 2021-11-23 | Общество с ограниченной ответственностью "Таргет-Инжиниринг" | Method for obtaining nanoscale systems of low molecular weight biologically active compounds based on amphiphilic copolymers of n-vinylpyrrolidone with branched structure dimethacrylates for cosmeceutical applications |
| RU2760274C9 (en) * | 2020-07-10 | 2022-09-15 | Общество с ограниченной ответственностью "Таргет-Инжиниринг" | Method for obtaining nanoscale systems of low molecular weight biologically active compounds based on amphiphilic copolymers of n-vinylpyrrolidone with branched structure dimethacrylates for cosmeceutical applications |
-
2006
- 2006-06-29 RU RU2006123043/15A patent/RU2325151C2/en not_active IP Right Cessation
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2540077C2 (en) * | 2008-10-27 | 2015-01-27 | Селлсьютикс Корпорейшн | Synthetic immune protection mimetics and use thereof |
| RU2478371C2 (en) * | 2008-12-26 | 2013-04-10 | Самъянг Биофармасьютикалз Корпорейшн | Method of obtaining composition of polymeric micelles, containing drug, poorly dissolved in water |
| RU2491288C1 (en) * | 2012-05-17 | 2013-08-27 | Закрытое акционерное общество "Нанотехнологии и инновации" (ЗАО "НТиИ") | Method for preparing nanosized amphotericin b |
| WO2016043620A1 (en) * | 2014-09-17 | 2016-03-24 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Научно-Производственный Центр "Амифион" | Amphiphilic polymers and delivery systems based thereon |
| RU2580649C1 (en) * | 2015-03-27 | 2016-04-10 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Научно-Производственный Центр "Амфион" | Water-compatible polymer compositions for delivery of biologically active substances |
| RU2607598C1 (en) * | 2015-07-31 | 2017-01-10 | Антон Борисович Архипов | Method of producing hybrid two-phase system of delivery of poorly soluble and insoluble in water biologically active substances with controlled release kinetic |
| RU2608304C1 (en) * | 2015-09-11 | 2017-01-17 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Научно-Производственный Центр "Амфион" | Amphiphilic polymer-metal complexes and synthesis method thereof |
| WO2017044009A1 (en) * | 2015-09-11 | 2017-03-16 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Научно-Производственный Центр "Амфион" | Amphiphilic polymeric metal complexes and method of producing same |
| RU2752314C1 (en) * | 2020-07-10 | 2021-07-26 | Общество с ограниченной ответственностью "Таргет-Инжиниринг" | Method for obtaining nanoscale systems of oligopeptide-polymer particle based on amphiphilic copolymers of n-vinylpyrrolidone with (di)methacrylates and their use as active substance in cosmethology and medicine |
| RU2760274C1 (en) * | 2020-07-10 | 2021-11-23 | Общество с ограниченной ответственностью "Таргет-Инжиниринг" | Method for obtaining nanoscale systems of low molecular weight biologically active compounds based on amphiphilic copolymers of n-vinylpyrrolidone with branched structure dimethacrylates for cosmeceutical applications |
| RU2760274C9 (en) * | 2020-07-10 | 2022-09-15 | Общество с ограниченной ответственностью "Таргет-Инжиниринг" | Method for obtaining nanoscale systems of low molecular weight biologically active compounds based on amphiphilic copolymers of n-vinylpyrrolidone with branched structure dimethacrylates for cosmeceutical applications |
| RU2752177C1 (en) * | 2020-09-29 | 2021-07-23 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Научно-Производственный Центр "Амфион" | Vectorized water-compatible polymer micellar particles for delivery of biologically active substances through blood-brain barrier |
| RU2784321C1 (en) * | 2022-05-16 | 2022-11-23 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" (НИУ "БелГУ") | Method for obtaining liposomal nanocontainers with immobilized enzyme |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2006123043A (en) | 2008-01-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2325151C2 (en) | Method of delivering water-insoluble and poorly soluble bioactive substances and pharmaceutical form based on it | |
| Dymek et al. | Liposomes as biocompatible and smart delivery systems–the current state | |
| Li et al. | Well-defined, reversible disulfide cross-linked micelles for on-demand paclitaxel delivery | |
| US6592894B1 (en) | Hydrogel-isolated cochleate formulations, process of preparation and their use for the delivery of biologically relevant molecules | |
| US6599527B1 (en) | Preparation of pharmaceutical compositions | |
| JP2006508126A (en) | Protein-stabilized liposome formulation of pharmaceutical formulation | |
| US20080181939A1 (en) | Polymersomes and related encapsulating membranes | |
| Gupta | Biocompatible microemulsion systems for drug encapsulation and delivery | |
| JP2012207042A (en) | Method and composition to solubilize biologically active compound with low water solubility | |
| KR20140041522A (en) | Polymeric nanoparticles for drug delivery | |
| Lafi et al. | Aptamer-functionalized pH-sensitive liposomes for a selective delivery of echinomycin into cancer cells | |
| Ma et al. | A highly stable norcantharidin loaded lipid microspheres: preparation, biodistribution and targeting evaluation | |
| WO2009062299A1 (en) | Gel-stabilized liposome compositions, methods for their preparation and uses thereof | |
| RU2465009C2 (en) | Nucleic acid complex and composition for nucleic acid delivery | |
| AU3111401A (en) | New cochleate formulations, process of preparation and their use for the delivery of biologically relevant molecules | |
| Mfuh et al. | Novel asparagine-derived lipid enhances distearoylphosphatidylcholine bilayer resistance to acidic conditions | |
| CN102188379A (en) | Preparation method of drug-carrying liposome | |
| US11077057B2 (en) | Polymer-grafted nanobins | |
| CN110759974B (en) | Phospholipid-polyethylene glycol-rabies virus derived peptide polymer, and preparation method and application thereof | |
| Charumathy et al. | Recent update on liposome-based drug delivery system | |
| US8318198B1 (en) | Pharmaceutical composition of nanoparticles | |
| TWI630000B (en) | Stabilized high drug load nanocarriers, methods for their preparation and use thereof | |
| RU2740553C2 (en) | Method of producing liposomal form of betulin, having hepatoprotective activity | |
| Sharma et al. | Pharmacosomes as Unique and Potential Drug Delivery System | |
| Sathe et al. | LIPOSOMES: AN OVERVIEW |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20190630 |