RU2322259C1 - Carrier of antigens - Google Patents

Carrier of antigens Download PDF

Info

Publication number
RU2322259C1
RU2322259C1 RU2006123270/13A RU2006123270A RU2322259C1 RU 2322259 C1 RU2322259 C1 RU 2322259C1 RU 2006123270/13 A RU2006123270/13 A RU 2006123270/13A RU 2006123270 A RU2006123270 A RU 2006123270A RU 2322259 C1 RU2322259 C1 RU 2322259C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
lipid
carrier
holotoxin
cholesterol
mgdg
Prior art date
Application number
RU2006123270/13A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Александр Михайлович Попов (RU)
Александр Михайлович Попов
Ирина Арсентьевна Ли (RU)
Ирина Арсентьевна Ли
Эдуард Яковлевич Костецкий (RU)
Эдуард Яковлевич Костецкий
Нина Михайловна Санина (RU)
Нина Михайловна Санина
Александр Васильевич Цыбульский (RU)
Александр Васильевич Цыбульский
Валерий Леонидович Шныров (RU)
Валерий Леонидович Шныров
Андрей Николаевич Мазейка (RU)
Андрей Николаевич Мазейка
Original Assignee
Федеральное Агентство По Образованию Государственное Образовательное Учреждение Высшего Профессионального Образования "Дальневосточный Государственный Университет"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное Агентство По Образованию Государственное Образовательное Учреждение Высшего Профессионального Образования "Дальневосточный Государственный Университет" filed Critical Федеральное Агентство По Образованию Государственное Образовательное Учреждение Высшего Профессионального Образования "Дальневосточный Государственный Университет"
Priority to RU2006123270/13A priority Critical patent/RU2322259C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2322259C1 publication Critical patent/RU2322259C1/en

Links

Images

Landscapes

  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

FIELD: biotechnology, immunology.
SUBSTANCE: invention proposes a carrier of antigens as a lipid complex consisting of glycoside, cholesterol and lipid. As glycoside a carrier comprises holotoxin A1, and as lipid - monogalactosyldiacyl glycerides (MGDG) of sea macrophytes taken in the weight ratio 3 (holotoxin A1) : 2 (cholesterol) : (2-6) (MGDG). Prepared glycoside-cholesterol-lipid carrier shows stretched threadlike-tubular structure. Use of the prepared carrier of antigens allows enhancing the immunogenic activity of vaccine preparations, and to decrease or remove completely hemolytic toxicity of holotoxin A1, and to eliminate inflammatory, painful, toxic and hemolytic effects of vaccines.
EFFECT: improved and valuable medicinal properties of carrier and vaccines.
4 dwg, 11 ex

Description

Изобретение относится к биотехнологии и иммунологии, а именно к препаратам, объединяющим систему доставки антигенов и природных медиаторов, и может быть использовано в области медицины и ветеринарии.The invention relates to biotechnology and immunology, in particular to drugs that combine the delivery system of antigens and natural mediators, and can be used in the field of medicine and veterinary medicine.

Создание нового поколения вакцин связано с использованием изолированных антигенов, способных обеспечить высокоспецифический иммунный ответ к бактериальным, вирусным патогенам и опухолевым клеткам. Преимущества высокоочищенных субъединичных вакцин по сравнению с традиционными средствами иммунизации характеризуются экономичностью и безопасностью производства, снижением риска возникновения побочных эффектов, возможностью получения препаратов для перорального приема. В то же время иммуногенность большинства индивидуальных антигенов в силу ряда особенностей, таких как низкая молекулярная масса антигена, растворимость, напрямую зависят и опосредуются стимуляцией клеточного звена иммунной системы, а именно Т-хелперных клеток. Поэтому разработка эффективных субъединичных вакцин сопровождается поиском надежных, безопасных и адекватных адъювантов.The creation of a new generation of vaccines involves the use of isolated antigens that can provide a highly specific immune response to bacterial, viral pathogens and tumor cells. The advantages of highly purified subunit vaccines in comparison with traditional immunization agents are characterized by the economy and safety of production, a decrease in the risk of side effects, and the possibility of obtaining oral preparations. At the same time, the immunogenicity of most individual antigens due to a number of features, such as low molecular weight of the antigen, solubility, are directly dependent and are mediated by stimulation of the cellular component of the immune system, namely T-helper cells. Therefore, the development of effective subunit vaccines is accompanied by the search for reliable, safe and adequate adjuvants.

Представляют интерес адъюванты липидной природы, используемые в качестве носителей в вакцинных препаратах. Липиды способны связывать одновременно адъюванты и амфифильные антигены и представлять их иммунокомпетентным клеткам в корпускулярной форме. Антигены в составе носителей обладают высокой иммунологической активностью, а сами носители - биодеградируемостью и отсутствием собственной иммуногенности. Комплексы на основе липидной матрицы имеют большие перспективы для решения проблемы адекватного и пролонгированного представления вакцинных антигенов иммунной системе.Of interest are lipid adjuvants used as carriers in vaccine formulations. Lipids are able to bind simultaneously adjuvants and amphiphilic antigens and present them to immunocompetent cells in a corpuscular form. Antigens in the composition of the carriers have high immunological activity, and the carriers themselves are biodegradable and lack of their own immunogenicity. Complexes based on the lipid matrix have great prospects for solving the problem of adequate and prolonged presentation of vaccine antigens to the immune system.

Из уровня техники известно, что липидные носители могут существовать в виде эмульсий. Например, описаны водно-масляные растворы обратных мицелл и двухслойных везикул из растительного галактолипида дигалактозидиацилглицерола (ДГДГ) [пат. RU 2127124, опубл. 10.03.1999 г.]. Однако масляные адъюванты имеют ряд недостатков:It is known in the art that lipid carriers can exist as emulsions. For example, water-oil solutions of reverse micelles and bilayer vesicles from plant galactolipid digalactosidiacylglycerol (DGDG) are described [US Pat. RU 2127124, publ. 03/10/1999]. However, oil adjuvants have several disadvantages:

- при подкожном и внутримышечном введении вызывают местные реакции воспалительно-некротического характера, а повышенная вязкость затрудняет их введение;- with subcutaneous and intramuscular administration, local reactions of an inflammatory-necrotic nature are caused, and increased viscosity makes their introduction difficult;

- указанная эмульсия не дает существенного прироста иммуногенности белковых и других антигенов, поскольку сам ДГДГ не обладает иммуноадъювантными свойствами;- the specified emulsion does not give a significant increase in the immunogenicity of protein and other antigens, since DGDG itself does not have immunoadjuvant properties;

- нестабильность при хранении вакцины в готовом виде в результате расслоения фаз и нестандартность качества.- instability during storage of the vaccine in the finished form as a result of phase separation and non-standard quality.

Из уровня техники также известно, что в качестве носителя для представления антигенов используют липосомы, основным структурообразующим компонентом которых является ламеллярный фосфатидилхолин [Allison AG, Gregoriadis G. Liposomes as immunological adjuvants. Nature. 1974. Nov 15; 252(5480):252].It is also known from the prior art that liposomes are used as a carrier for presenting antigens, the main structure-forming component of which is lamellar phosphatidylcholine [Allison AG, Gregoriadis G. Liposomes as immunological adjuvants. Nature. 1974. Nov 15; 252 (5480): 252].

Антигены в составе липосомальных препаратов могут рассматриваться как иммуноадъюванты. В отличие от других адъювантов в месте инъекции липосомальных препаратов образования гранулем не происходит и даже наблюдается предотвращение токсических проявлений инкапсулированных лекарственных средств.Antigens in liposomal preparations can be considered as immunoadjuvants. Unlike other adjuvants, the formation of granulomas does not occur at the injection site of liposomal preparations, and even the prevention of toxic manifestations of encapsulated drugs is observed.

Везикулы липосом могут включать как гидрофобный антигенный материал в липидном бислое, так и гидрофильный во внутренней фазе. Комплексы липосом с антигеном способны стимулировать антителообразование, активизировать фагоциты и поглощаться макрофагами в различных органах и тканях организма, обеспечивать доставку лекарственных средств (антигенов) в клетку. Ограничение их использования является следствием следующих недостатков:Liposome vesicles can include both hydrophobic antigenic material in the lipid bilayer and hydrophilic in the internal phase. Complexes of liposomes with antigen are able to stimulate antibody formation, activate phagocytes and be absorbed by macrophages in various organs and tissues of the body, and ensure the delivery of drugs (antigens) to the cell. The restriction of their use is a consequence of the following disadvantages:

- химическая и физическая нестабильность везикул;- chemical and physical instability of vesicles;

- относительно умеренный иммунный ответ;- a relatively moderate immune response;

- неспособность стимулировать клеточный иммунный ответ, обеспечивающий противовирусную и противоопухолевую защиту.- inability to stimulate a cellular immune response, providing antiviral and antitumor protection.

По технической сущности и достигаемому результату наиболее близким к заявляемому техническому решению является иммуностимулирующий комплекс (ИСКОМ). Это липид-сапониновые частицы, состоящие из смеси растительных тритерпеновых гликозидов Quil А, холестерина и фосфолипидов [пат. RU 2120302, опубл. 20.10.1998 г.] (прототип). Такие комплексы имеют очень специфическую структуру, подтверждаемую данными электронной микроскопии и не являются липидными везикулами или липосомами. Это коллоидные частицы, состоящие из регулярных субъединиц, имеющих открытую сферическую структуру, которые под микроскопом выглядят как кольца. Основная структура ИСКОМ формируется как в присутствии антигена, так и без него. Структурной основой ИСКОМ является сапонин-холестериновый комплекс, способствующий развитию иммунного ответа. ИСКОМ позволяет на порядок снижать дозу вводимых антигенов, индуцировать существенный противовирусный иммунитет и повышать уровень гуморального иммунного ответа в дозах адъюванта намного меньших, чем в обычных вакцинах.The technical nature and the achieved result closest to the claimed technical solution is the immunostimulating complex (ISKOM). These are lipid-saponin particles, consisting of a mixture of Quil A plant triterpene glycosides, cholesterol and phospholipids [US Pat. RU 2120302, publ. October 20, 1998] (prototype). Such complexes have a very specific structure, confirmed by electron microscopy and are not lipid vesicles or liposomes. These are colloidal particles consisting of regular subunits with an open spherical structure that look like rings under a microscope. The basic structure of ISCOM is formed both in the presence of antigen and without it. The structural basis of ISCOM is the saponin-cholesterol complex, which contributes to the development of the immune response. ISCOM allows one to reduce the dose of antigens administered by an order of magnitude, induce significant antiviral immunity, and increase the level of the humoral immune response in adjuvant doses much lower than in conventional vaccines.

К серьезным недостаткам, препятствующим широкому использованию сапонинов Quil А в качестве адъювантов и системы доставки в составе вакцин против инфекционных заболеваний человека, относятся следующие:Serious disadvantages that prevent the widespread use of Quil A saponins as adjuvants and delivery systems in vaccines against human infectious diseases include the following:

- Quil А представляет собой гетерогенную смесь сапонинов, что является недопустимым для использования в медицине, поскольку смесь сапонинов с разными химическими и биологическими свойствами затрудняет стандартизацию ИСКОМ и может привести к непредсказуемым эффектам in vivo;- Quil A is a heterogeneous mixture of saponins, which is unacceptable for use in medicine, since a mixture of saponins with different chemical and biological properties complicates the standardization of ISCOM and can lead to unpredictable effects in vivo;

- высокая токсичность при внутривенном введении препарата, обусловленная высокой гемолитической активностью;- high toxicity with intravenous administration of the drug due to high hemolytic activity;

- воспалительные и болевые реакции у людей при внутримышечном введении, поэтому их использование в качестве неспецифического иммуностимулятора на человеке ограничивается пероральным введением;- inflammatory and pain reactions in humans with intramuscular administration, therefore their use as a non-specific immunostimulant in humans is limited to oral administration;

- химическая нестабильность в водных растворах по причине гидролиза сложноэфирной связи в одной из боковых углеводородных цепей;- chemical instability in aqueous solutions due to hydrolysis of the ester bond in one of the side hydrocarbon chains;

- деацилированные сапонины теряют адъювантные свойства, способность стимулировать Т-клеточный иммунный ответ первого класса и продуцировать антиген-специфические цитотоксические Т-лимфоциты, что негативно сказывается на эффективности вакцин против цитопатических инфекций вирусной или бактериальной природы, противоопухолевых и антипаразитарных вакцин.- deacylated saponins lose their adjuvant properties, the ability to stimulate a first-class T-cell immune response and produce antigen-specific cytotoxic T-lymphocytes, which negatively affects the effectiveness of vaccines against cytopathic infections of a viral or bacterial nature, antitumor and antiparasitic vaccines.

Предпринимаемые попытки выделения из Quil А фракции более очищенных сапонинов с низкими цитотоксическими свойствами приводят к тому, что полученные сапонины либо не образуют структуры в виде ИСКОМ, либо не обладают необходимой иммуностимулирующей активностью.Attempts to isolate from the Quil A fraction of more purified saponins with low cytotoxic properties lead to the fact that the obtained saponins either do not form structures in the form of ISCOM or do not possess the necessary immunostimulating activity.

Техническим результатом заявляемого решения является получение носителя антигенов, имеющего высокую иммунологическую эффективность в составе субъединичных вакцин и характеризующегося отсутствием токсичности, воспалительных и болевых реакций при применении.The technical result of the proposed solution is to obtain a carrier of antigens having high immunological efficacy in the composition of subunit vaccines and characterized by the absence of toxicity, inflammatory and pain reactions when used.

Технический результат обеспечивается получением носителя антигенов в виде липидного комплекса, состоящего из гликозида, холестерина и липида; в качестве гликозида комплекс содержит голотоксин А1, а в качестве липида моногалактозилдиацилглицериды (МГДГ) из морских макрофитов.The technical result is provided by obtaining a carrier of antigens in the form of a lipid complex consisting of glycoside, cholesterol and lipid; the complex contains holotoxin A 1 as a glycoside, and monogalactosyl diacylglycerides (MGDG) as marine macrophytes as a lipid.

Технический результат оптимальным образом достигается получением носителя антигенов в виде липидного комплекса, в котором весовое содержание голотоксина А1 к холестерину постоянно и равно 3:2, а весовое содержание моногалактозилдиацилглицеридов (МГДГ) из морских макрофитов может изменяться в интервале (2-6).The technical result is optimally achieved by obtaining an antigen carrier in the form of a lipid complex in which the weight content of holotoxin A 1 to cholesterol is constant and equal to 3: 2, and the weight content of monogalactosyldiacylglycerides (MGDG) from marine macrophytes can vary in the range (2-6).

Полученный липидный комплекс имеет вытянутую нитевидно-тубулярную структуру с длиной частиц от 200 до 300 нм при диаметре тубул около 20 нм, которая отлична от структуры известных иммуностимулирующих комплексов.The resulting lipid complex has an elongated filamentous-tubular structure with a particle length of 200 to 300 nm and a tube diameter of about 20 nm, which is different from the structure of the known immunostimulating complexes.

Впервые получен носитель антигенов, обладающий высокими иммунологическими и инкорпорирующими характеристиками в отношении амфифильных антигенов, который обеспечивает повышение безопасности вакцин и характеризуется тем, что при его применении достигается снижение токсичности голотоксина A1, входящего в состав комплекса.For the first time, an antigen carrier has been obtained that has high immunological and incorporating characteristics with respect to amphiphilic antigens, which provides an increase in the safety of vaccines and is characterized in that when it is used, a decrease in the toxicity of holotoxin A 1 , which is part of the complex, is achieved.

Заявляемый носитель антигенов получают посредством смешения голотоксина А1, холестерина и МГДГ, взятых в весовом соотношении 3:2:(2-6) в следующем порядке: смешивают растворы холестерина и МГДГ в хлороформе при весовом соотношении холестерина и МГДГ 2:(2-6), упаривают под вакуумом до удаления хлороформа и добавляют 3 весовые части 0,4 процентного водного раствора голотоксина А1; смесь солюбилизируют, после чего доводят суммарную концентрацию липидов (холестерина и МГДГ) до 2 мг в 1 мл суспензии фосфатно-солевым буфером при pH 7,2. Указанная концентрация липидов является оптимальной для проведения электронно-микроскопических исследований. Полученную суспензию озвучивают с использованием ультразвукового дезинтегратора в течение 5 минут и оставляют на 2 часа до достижения равновесия в системе (пример 1).The inventive antigen carrier is obtained by mixing holotoxin A 1 , cholesterol and MGDG, taken in a weight ratio of 3: 2: (2-6) in the following order: mix solutions of cholesterol and MGDG in chloroform with a weight ratio of cholesterol and MGDG 2: (2-6 ), evaporated in vacuo to remove chloroform and add 3 parts by weight of a 0.4 percent aqueous solution of holotoxin A 1 ; the mixture is solubilized, after which the total concentration of lipids (cholesterol and MGDG) is adjusted to 2 mg in 1 ml of suspension with phosphate-buffered saline at pH 7.2. The indicated concentration of lipids is optimal for electron microscopy studies. The resulting suspension is voiced using an ultrasonic disintegrator for 5 minutes and left for 2 hours until equilibrium is reached in the system (Example 1).

Возможность получения носителя антигенов с особой тубулярной суперструктурой при диаметре тубул около 40 нм впервые показана нами в заявке на изобретение «Способ получения антигенов на основе липидов из морских макрофитов и тритерпенового гликозида кукумариозида» при использовании в качестве тритерпенового гликозида кукумариозида А2-2 из кукумарии Cucumaria japonica (заявка на изобретение № 2005131645/13(035476) от 12.10.2005 г.).The possibility of obtaining an antigen carrier with a special tubular superstructure with a tube diameter of about 40 nm was first shown by us in the application for the invention "A method for producing lipid-based antigens from marine macrophytes and cucumarioside triterpene glycoside" when using cucumarioside A 2 -2 as triterpene glycoside from Cucumaria cucumaria japonica (application for invention No. 2005131645/13 (035476) dated 12.10.2005).

Заявляемый носитель при разных соотношениях компонентов имеет ультрамикроскопические размеры и вытянутую нитевидно-тубулярную структуру с длиной частиц от 200 до 300 нм при диаметре тубул около 20 нм, что подтверждается данными электронной микроскопии (примеры 2,3, фиг.2, снимки А и Б). На фиг.2 приведены электронные микрофотографии липидного носителя антигенов, включающего: голотоксин A1:Хол:МГДГ из Zostera marina в весовых соотношениях 3:2:2 (снимок А) и 3:2:6 (снимок Б). Сравнение снимков А и Б на фиг.2 показывает, что изменение весового содержания МГДГ от 2 до 6 при формировании комплекса носителя антигена приводит к образованию хорошо оформленных тубулярных структур.The inventive carrier with different ratios of components has an ultramicroscopic size and an elongated filamentous-tubular structure with a particle length of 200 to 300 nm and a tube diameter of about 20 nm, which is confirmed by electron microscopy (examples 2,3, figure 2, pictures A and B) . Figure 2 shows electronic micrographs of a lipid carrier of antigens, including: holotoxin A 1 : Chol: MGDG from Zostera marina in weight ratios of 3: 2: 2 (image A) and 3: 2: 6 (image B). A comparison of images A and B in figure 2 shows that a change in the weight content of MGDG from 2 to 6 during the formation of the antigen carrier complex leads to the formation of well-formed tubular structures.

Показано также, что количество МГДГ из различных морских макрофитов при получении носителя антигенов заявляемым способом не влияет на его морфологические характеристики, если его весовое соотношение к голотоксину А1 и холестерину изменяется в интервале (2-6), т.е. оптимальным соотношением голотоксина A1, холестерина и МГДГ является 3:2:(2-6) (примеры 3-6, фиг.2, снимки А-Б).It was also shown that the amount of MGDG from various marine macrophytes upon receipt of an antigen carrier by the claimed method does not affect its morphological characteristics if its weight ratio to holotoxin A 1 and cholesterol varies in the range (2-6), i.e. the optimal ratio of holotoxin A 1 , cholesterol and MGDG is 3: 2: (2-6) (examples 3-6, figure 2, pictures A-B).

Обнаружено, что комплексы с похожей структурой, но с образованиями меньшего диаметра, могут формироваться и без добавления МГДГ при разных весовых соотношениях голотоксина А1 и холестерина (примеры 7, 8). Это явление обнаружено впервые - при использовании в качестве тритерпенового гликозида кукумариозида А2-2 из кукумарии Cucumaria japonica (заявка на изобретение № 2005131645/13(035476) от 12.09.2005 г.) нами не было зарегистрировано образования комплекса между кукумариозидом А2-2 и холестерином без добавления липидной матрицы.It was found that complexes with a similar structure, but with formations of a smaller diameter, can be formed without the addition of MHD at different weight ratios of holotoxin A 1 and cholesterol (examples 7, 8). This phenomenon is found for the first time - when used as a triterpene glycoside kukumariozida A 2 -2 of sea cucumber Cucumaria japonica (application for invention № 2005131645/13 (035,476) on 12.09.2005), we have been registered complex formation between the A 2 -2 kukumariozidom and cholesterol without the addition of a lipid matrix.

На снимках В и Г фиг.2 приведены электронные микрофотографии стерин-гликозидных структур, включающих голотоксин А1:Хол в весовых соотношениях 4:1 и 3:2, соответственно. На снимках видны структуры, сходные со структурой комплексных образований на снимках А и В; их диаметр практически в два раза меньше, чем при добавлении МГДГ в структуру комплексов, и составляет 10-12 нм. Увеличение количества холестерина приводит к появлению на снимке Г (фиг.2) белых пятен, свидетельствующих об избытке холестерина.Photographs B and D of Fig. 2 show electron micrographs of sterol-glycosidic structures including holotoxin A 1 : Chol in weight ratios of 4: 1 and 3: 2, respectively. The images show structures similar to the structure of complex formations in images A and B; their diameter is almost two times smaller than when adding MHD in the structure of complexes, and is 10-12 nm. An increase in the amount of cholesterol leads to the appearance of white spots in the image D (figure 2), indicating an excess of cholesterol.

Однако добавление мембранообразующего полярного липида МГДГ усиливает связывание голотоксина А1 со стерином, вызывая существенное снижение гемолитической активности иммуностимулирующего тритерпенового гликозида (пример 9), а также является необходимым условием для самопроизвольного включения амфифильных по своей природе белковых антигенов наружных мембран микроорганизмов. Эффективное весовое содержание МГДГ в системе голотоксин А1:Хол:МГДГ находится в диапазоне (2-6). Исследования с модельным поверхностным белком бактериального происхождения показывают, что оптимальное соотношение голотоксина А1:Хол:МГДГ для эффективного инкорпорирования (более 95%) псевдотуберкулезного порина составляет 3:2:6 (пример 10, фиг.4). На фиг.4 приведено распределение псевдотуберкулезного поринового белка по фракциям после осаждения образцов липид-гликозидных носителей с разным содержанием МГДГ ультрацентрифугированием в фосфатно-солевом буфере.However, the addition of a membrane-forming polar lipid MGDG enhances the binding of holotoxin A 1 to sterol, causing a significant decrease in the hemolytic activity of the immunostimulating triterpene glycoside (Example 9), and is also a necessary condition for the spontaneous incorporation of amphiphilic in nature protein antigens of the outer membranes of microorganisms. The effective weight content of MHD in the holotoxin A 1 system: Chol: MHD is in the range (2-6). Studies with a model surface protein of bacterial origin show that the optimal ratio of holotoxin A 1 : Chol: MGDG for effective incorporation (more than 95%) of pseudotuberculous porin is 3: 2: 6 (example 10, figure 4). Figure 4 shows the distribution of pseudotuberculosis porin protein in fractions after deposition of samples of lipid-glycoside carriers with different contents of MHD by ultracentrifugation in phosphate-buffered saline.

Снижение содержания МГДГ в комплексе носителя антигенов (менее двух весовых частей) приводит к не полному включению белка в структуру комплекса, а при его увеличении (более 6 весовых частей) не происходит существенного улучшения иммунологических и морфологических характеристик получаемого носителя антигенов.The decrease in the content of MHD in the complex of the antigen carrier (less than two weight parts) leads to incomplete inclusion of the protein in the structure of the complex, and with its increase (more than 6 weight parts), there is no significant improvement in the immunological and morphological characteristics of the resulting antigen carrier.

Примеры 2 и 3 (фиг.2, снимки А, Б) подтверждают, что введение МГДГ в смесь голотоксина A1 и холестерина в указанных выше соотношениях способствует формированию стабильного липидного комплекса, обладающего необходимыми для антигенного носителя свойствами и имеющего стандартную нитевидно-тубулярную структуру.Examples 2 and 3 (figure 2, pictures A, B) confirm that the introduction of MHD into a mixture of holotoxin A 1 and cholesterol in the above ratios contributes to the formation of a stable lipid complex that has the properties required for an antigenic carrier and has a standard thread-like tubular structure.

Оптимальность весового соотношения голотоксина A1 и холестерина (3:2) подтверждается данными электронной микроскопии. При таком соотношении наблюдается образование видимых электронных микроскопических комплексов. Увеличение содержания голотоксина A1 в составе носителя антигенов не рационально по двум причинам:The optimality of the weight ratio of holotoxin A 1 and cholesterol (3: 2) is confirmed by electron microscopy. With this ratio, the formation of visible electron microscopic complexes is observed. The increase in the content of holotoxin A 1 in the composition of the antigen carrier is not rational for two reasons:

- это не приводит к изменению структуры комплекса, но приведет к появлению его гемолитической активности;- this does not lead to a change in the structure of the complex, but will lead to the appearance of its hemolytic activity;

- голотоксин A1 проявляет свое иммуномодулирующее действие в сверхнизких концентрациях.- holotoxin A 1 shows its immunomodulatory effect in ultralow concentrations.

Таким образом, экспериментально установлено, что заявляемый липид-холестрин-гликозидный носитель антигенов, полученный при весовом соотношении голотоксин А1:холестерин:МГДГ, равном 3:2:(2-6), имеет оптимальные характеристики и не оказывает токсического действия при внутрибрюшном (в/б) и подкожном (п/к) введении экспериментальным животным (пример 11). По данным электронной микроскопии полученный носитель антигенов имеет вытянутую нитевидно-тубулярную структуру с длиной структурных образований от 200 до 300 нм при диаметре тубул около 20 нм.Thus, it was experimentally established that the inventive lipid-cholesterol-glycosidic antigen carrier obtained at a weight ratio of holotoxin A 1 : cholesterol: MGDG equal to 3: 2: (2-6) has optimal characteristics and does not have toxic effects with intraperitoneal ( in / b) and subcutaneous (s / c) administration to experimental animals (example 11). According to electron microscopy, the obtained antigen carrier has an elongated filamentous-tubular structure with a length of structural formations from 200 to 300 nm with a tube diameter of about 20 nm.

Ближайшими структурными аналогами заявляемого носителя являются липид-сапониновые комплексы гликоалкалоидов растений семейства пасленовые [Erik A.J. Keukens, Truus de Vrije, Claudia van den Boom, Pieter de Waard, Henk H. Plasman, Felix Thiel, Vladimir Chupin, Wim M.F.Jongen, Ben de Kruiff. Molekular basis of glicoalkaloid induced membrane disruption // Biochim Biophys Acta. 1995. Vol.1240, P.216-228]. Предложенная модель представляется нам справедливой для заявляемого носителя. Структура заявляемого носителя представляет собой трехслойную тубулу (фиг.1). Внутренний слой (2) структуры состоит из МГДГ, молекулы которого образуют монослой. При этом молекулы МГДГ обращены своими углеводными цепями во внутренний гидратированный канал (1), в то время как их жирнокислотные цепи обращены в противоположную сторону. Над монослоем гликолипидов (2) располагается слой из комплексов холестерин-агликон голотоксина А1 (3). Холестерин-агликоновые комплексы также образуют монослой и ориентированы таким образом, что углеводная цепь молекулы голотоксина A1 экспонирована на внешней стороне носителя (4). Из уровня техники известно, что образование комплекса холестерин-голотоксин А1 обусловлено взаимодействием холестерина и агликона данного гликозида за счет гидрофобных, ван-дер-ваальсовых связей и π-электронов обеих молекул.The closest structural analogues of the claimed carrier are lipid-saponin complexes of glycoalkaloids of plants of the nightshade family [Erik AJ Keukens, Truus de Vrije, Claudia van den Boom, Pieter de Waard, Henk H. Plasman, Felix Thiel, Vladimir Chupin, Wim MFJongen, Ben de Kruiff. Molekular basis of glicoalkaloid induced membrane disruption // Biochim Biophys Acta. 1995. Vol. 1240, P.216-228]. The proposed model seems to us fair for the claimed carrier. The structure of the claimed carrier is a three-layer tube (figure 1). The inner layer (2) of the structure consists of MHD, the molecules of which form a monolayer. In this case, the MGDG molecules are turned by their carbohydrate chains into the internal hydrated channel (1), while their fatty acid chains are turned in the opposite direction. Above the monolayer of glycolipids (2) is a layer of cholesterol-aglycon holotoxin A 1 (3) complexes. Cholesterol-aglycone complexes also form a monolayer and are oriented in such a way that the carbohydrate chain of the holotoxin A 1 molecule is exposed on the outer side of the carrier (4). It is known from the prior art that the formation of the cholesterol-holotoxin A 1 complex is due to the interaction of the cholesterol and aglycon of this glycoside due to hydrophobic, van der Waals bonds and π-electrons of both molecules.

Молекулы МГДГ формируют внутренний монослой комплекса за счет гидрофобного взаимодействия жирнокислотных цепей соседних молекул гликолипидов. Сформировавшийся монослой в свою очередь взаимодействует с агликон-холестериновым монослоем, стабилизируя полученную в итоге структуру.MGDG molecules form an internal monolayer of the complex due to the hydrophobic interaction of the fatty acid chains of neighboring glycolipid molecules. The formed monolayer in turn interacts with the aglycon-cholesterol monolayer, stabilizing the resulting structure.

Предположительным механизмом присоединения поринового антигена к заявляемому комплексу является взаимодействие его гидрофобных участков с гидрофобным матриксом носителя.A possible mechanism for the attachment of the porin antigen to the claimed complex is the interaction of its hydrophobic sites with the hydrophobic matrix of the carrier.

Голотоксин A1 получают из доступного природного сырья - промысловой голотурии, дальневосточного трепанга Apostichopus japonicus S. [Еляков Г.Б., Мальцев И.И., Калиновский А.И., Стоник В.А. Строение Голотоксина А1 (стихопозида А), основного тритерпенового гликозида тихоокеанской промысловой голотурии Apostichopus japonicus // Биоорг. химия, 1983. Т. 9, № 2. С.280-281].Golotoxin A 1 is obtained from available natural raw materials - commercial holothuria, Far Eastern trepang Apostichopus japonicus S. [Elyakov GB, Maltsev II, Kalinovsky AI, Stonik VA The structure of Golotoksin A 1 (versoposide A), the main triterpene glycoside of the Pacific commercial holothurium Apostichopus japonicus // Bioorg. Chemistry, 1983. T. 9, No. 2. P.280-281].

Получаемое сырье включает сумму тритерпеновых гликозидов, основным компонентом которого является голотоксин A1; его структурная формула приведена на фиг.3 А.The resulting feedstock includes the sum of triterpene glycosides, the main component of which is holotoxin A 1 ; its structural formula is shown in figure 3 A.

Голотоксин A1 в низких дозах обладает адъювантной активностью, оказывая стимулирующее действие на развитие иммунного ответа в разных популяциях иммунокомпетентных клеток при пероральном и парентеральном введении в организм животных. В условиях in vitro голотоксин A1 изменяет функциональную активность иммунокомпетентных клеток, вызывает усиление бластогенеза лимфоцитов селезенки и цитотоксическую активность макрофагов крови. Макрофаги, активированные голотоксином А1, могут играть важную кооперирующую роль в иммуностимулирующей активности этого гликозида [Попов А.М., Атопкина Л.Н., Самошина Н.Ф., Уварова Н.И. Изучение иммуномодулирующей активности тетрациклических тритерпеновых гликозидов даммаранового и голостанового ряда // Антибиотики и химиотерапия. 1994. Т. 39, № 7. С.19-25].Golotoxin A 1 in low doses has adjuvant activity, providing a stimulating effect on the development of the immune response in different populations of immunocompetent cells upon oral and parenteral administration to animals. Under in vitro conditions, holotoxin A 1 changes the functional activity of immunocompetent cells, increases the blastogenesis of spleen lymphocytes and the cytotoxic activity of blood macrophages. Macrophages activated by holotoxin A 1 can play an important cooperating role in the immunostimulating activity of this glycoside [Popov AM, Atopkina LN, Samoshina NF, Uvarova NI Study of the immunomodulatory activity of tetracyclic triterpene glycosides of the dammaran and holostane series // Antibiotics and chemotherapy. 1994. T. 39, No. 7. S. 19-25].

Голотоксин A1 относится к типичным мембранотропным веществам. Мембранная активность голотоксина A1 обусловлена высоким аффинитетом к холестерину. Уже при низких концентрациях он способен с высокой степенью эффективности образовывать нетоксичные гликозид-стериновые или липид-гликозидные структуры [Попов А.М. Сравнительное изучение цитотоксического и гемолитического действия тритерпеноидов женьшеня и голотурий // Изв. РАН. Сер. биол. 2002. № 2. С.155-164].Holotoxin A 1 refers to typical membranotropic substances. The membrane activity of holotoxin A 1 is due to high cholesterol affinity. Even at low concentrations, it is able to form non-toxic glycoside-sterol or lipid-glycoside structures with a high degree of efficiency [A. Popov A comparative study of the cytotoxic and hemolytic effects of triterpenoids of ginseng and holothuria // Izv. RAS. Ser. biol. 2002. No. 2. S.155-164].

Таким образом, использование голотоксина A1 в комплексе с холестерином позволяет увеличить эффективность противовирусных вакцин, а именно: повысить иммуногенность антигенной субстанции вследствие корпускулярного представления антигенов в структуре носителя, обладающего иммунными свойствами, а также исключить гемотоксичность голотоксина A1 за счет прочного связывания гликозида с холестерином.Thus, the use of holotoxin A 1 in combination with cholesterol can increase the effectiveness of antiviral vaccines, namely: to increase the immunogenicity of antigenic substance due to the corpuscular presentation of antigens in the structure of the carrier having immune properties, and also to exclude the hemotoxicity of holotoxin A 1 due to the strong binding of glycoside with cholesterol .

В качестве липидной составляющей заявляемого носителя антигенов был выбран МГДГ, выделенный из морских водорослей, структурная формула которого приведена на фиг.3 (Б). Этот липид сочетает в комплексе структурообразующие, иммунные свойства и способность инкорпорировать поверхностно-мембранные антигены патогенных микроорганизмов. Используемый в качестве липидного компонента МГДГ из Ulva fenestrata (отдел зеленые водоросли - Chlorophyta), Ahnfeltia tobuchiensis (отдел красные водоросли - Rhodophyta), Laminaria japonica (отдел бурые водоросли - Phaeophyta), Zostera marina (зеленая морская трава - отдел Magnoliophyta) был выделен по методу Sanina N., Goncharova S., Kostetsky E. Fatty acid composition of individual polar lipid classes from marine macrophytes // Phytochemistry. 2004. V. 65. №6. Р. 721-730. Препараты липидного комплекса получали по описанной в заявке методике. Для получения конечного продукта использовали МГДГ, выделенный из Zostera marina (пример 3), из Ulva fenestrate (пример 4), Ahnfeltia tobuchiensis (пример 5), Laminaria japonica (пример 6).As the lipid component of the inventive antigen carrier, MHD was selected from seaweed, the structural formula of which is shown in figure 3 (B). This lipid combines in a complex structure-forming, immune properties and the ability to incorporate surface-membrane antigens of pathogenic microorganisms. MHD used as a lipid component from Ulva fenestrata (green algae department - Chlorophyta), Ahnfeltia tobuchiensis (red algae department - Rhodophyta), Laminaria japonica (brown algae department - Phaeophyta), Zostera marina (green sea grass - Magnoliophy department) method Sanina N., Goncharova S., Kostetsky E. Fatty acid composition of individual polar lipid classes from marine macrophytes // Phytochemistry. 2004. V. 65. No. 6. R. 721-730. The lipid complex preparations were prepared as described in the application. To obtain the final product, MGDG isolated from Zostera marina (Example 3), from Ulva fenestrate (Example 4), Ahnfeltia tobuchiensis (Example 5), Laminaria japonica (Example 6) were used.

Вне зависимости от источника выделения МГДГ из морских макрофитов полученные препараты представляют собой водную суспензию липидного комплекса, имеющего нитевидно-тубулярную структуру длиной 200-300 нм при диаметре тубул около 20 нм.Regardless of the source of isolation of MHD from marine macrophytes, the preparations obtained are an aqueous suspension of a lipid complex having a filament-tubular structure 200-300 nm long with a tube diameter of about 20 nm.

Этот липид является самым ненасыщенным гликоглицеролипидом и включает широкий спектр полиеновых жирных кислот. Из уровня техники известно влияние ненасыщенных жирных кислот, в частности линоленовой и арахидоновой, на состояние мембран клеток иммунной системы, в особенности макрофагов.This lipid is the most unsaturated glycoglycerolipid and includes a wide range of polyene fatty acids. The prior art knows the effect of unsaturated fatty acids, in particular linolenic and arachidonic, on the state of the membranes of cells of the immune system, especially macrophages.

Эффективность использования МГДГ в качестве липида при формировании носителей антигенов, имеющих тубулярную структуру, исследована и обоснована нами в заявке на изобретение 2005131645/13(035476) от 12.10.2005 г. В заявке показано, что МГДГ проявляет самостоятельную иммуноадьювантную активность при в/б и п/к введении, сопоставимую с активностью адъюванта Фрейнда и даже превосходящую его при иммунизации корпускулярным Т-зависимым антигеном - эритроциты барана (ЭБ); обладает способностью подавлять активность эффекторов гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ).The effectiveness of using MGDG as a lipid in the formation of antigen carriers with a tubular structure was investigated and substantiated by us in the application for invention 2005131645/13 (035476) dated 12.10.2005. The application showed that MGDG exhibits independent immuno-adjuvant activity with i.v. and sc administration, comparable with the activity of Freund's adjuvant and even superior to it when immunized with a corpuscular T-dependent antigen - sheep erythrocytes (EB); has the ability to suppress the activity of delayed-type hypersensitivity effectors (HRT).

Следует отметить, что новые функции голотоксина А1 и МГДГ, которые они проявляют в заявляемом изобретении, не вытекают с очевидностью из известных для них свойств.It should be noted that the new functions of holotoxin A 1 and MGDG, which they exhibit in the claimed invention, do not follow with obviousness from the properties known to them.

На основе голотоксина А1, холестерина и МГДГ впервые получен носитель антигенов, имеющий нитевидно-тубулярную структуру, позволяющую увеличить эффективность противовирусных вакцин, а именно: повысить иммуногенность антигенной субстанции вследствие корпускулярного представления антигенов в структуре липид-гликозидного носителя, обладающего иммунными свойствами, а также исключить гемотоксичность за счет прочного связывания гликозида с мембранообразующими липидами - холестерином и МГДГ в структуре липид-гликозидного матрикса (пример 9).On the basis of holotoxin A 1 , cholesterol and MGDG, an antigen carrier was obtained for the first time, having a filamentous-tubular structure, which allows increasing the effectiveness of antiviral vaccines, namely: increasing the immunogenicity of antigenic substance due to the corpuscular representation of antigens in the structure of a lipid-glycosidic carrier having immune properties, as well as eliminate hemotoxicity due to the strong binding of glycoside with membrane-forming lipids - cholesterol and MGDG in the structure of the lipid-glycoside matrix (approx. p 9).

Подлинность препарата определяется качественным и количественным составом структурных компонентов (голотоксина A1, холестерина и МГДГ), являющихся исходными при получении носителя антигенов; его структура подтверждается данными электронной микроскопии (фиг.2, снимки А, Б). Препарат стабилен при температуре (-4°С) более трех месяцев.The authenticity of the drug is determined by the qualitative and quantitative composition of the structural components (holotoxin A 1 , cholesterol and MGDG), which are the initial ones when receiving the carrier of antigens; its structure is confirmed by electron microscopy (Fig.2, pictures A, B). The drug is stable at a temperature (-4 ° C) of more than three months.

Предлагаемый липид-гликозидный комплекс при подкожном и внутрибрюшинном введении мышам не вызывает воспалительных, болевых, токсических, а также высоких цитолитических эффектов (пример 11).The proposed lipid-glycosidic complex with subcutaneous and intraperitoneal administration to mice does not cause inflammatory, pain, toxic, as well as high cytolytic effects (example 11).

Возможность осуществления изобретения подтверждается следующими примерами.The possibility of carrying out the invention is confirmed by the following examples.

Пример 1. Приготовление препарата липид-гликозидного носителя, состоящего из голотоксина A1, холестерина и МГДГ.Example 1. Preparation of a lipid-glycoside carrier preparation consisting of holotoxin A 1 , cholesterol and MGDG.

Приготовление растворов исходных компонентов проводят следующим образом: 5 мг МГДГ растворяют в 1 мл хлороформа и 5 мг холестерина растворяют в 1 мл хлороформа, 4 мг голотоксина A1 растворяют в 1 мл дистиллированной воды. Микродозатором отбирают необходимое количество растворенного в хлороформе холестерина и МГДГ, упаривают под вакуумом и солюбилизируют сухой остаток 0,4% раствором голотоксина А1. После тщательного перемешивания в смесь добавляют солевой фосфатный буфер, pH 7,2, до конечной концентрации липидов в смеси 2 мг в 1 мл. Полученную суспензию озвучивают ультразвуковым дезинтегратором SONOPULS Ultraschall - Homogenizatoren HD 2070 (Германия) при частоте 20 кГц, мощность 7 Вт в режиме 7 (0,7 с работа, 0,3 с перерыв) в течение 5 минут, и затем выдерживают в течение 2 часов до полного формирования комплексов.The preparation of solutions of the starting components is carried out as follows: 5 mg of MGDG is dissolved in 1 ml of chloroform and 5 mg of cholesterol is dissolved in 1 ml of chloroform, 4 mg of holotoxin A 1 is dissolved in 1 ml of distilled water. The necessary amount of cholesterol and MGDG dissolved in chloroform is selected with a microdoser, evaporated in vacuo and the dry residue is solubilized with a 0.4% holotoxin A 1 solution. After thorough mixing, salt phosphate buffer, pH 7.2, is added to the mixture to a final concentration of lipids in the mixture of 2 mg in 1 ml. The resulting suspension is voiced by the ultrasonic disintegrator SONOPULS Ultraschall - Homogenizatoren HD 2070 (Germany) at a frequency of 20 kHz, power 7 W in mode 7 (0.7 s operation, 0.3 s break) for 5 minutes, and then incubated for 2 hours until complete formation of complexes.

Пример 2. Приготовление препарата липид-гликозидного носителя, состоящего из трех весовых частей голотоксина A1, двух весовых частей холестерина и двух весовых частей МГДГ из Zostera marina по описанной в примере 1 методике. Микродозатором отбирают 200 мкл раствора холестерина и 200 мкл раствора МГДГ, упаривают под вакуумом досуха и солюбилизируют сухой остаток 0,4% раствором голотоксина А1, объем которого составляет 375 мкл. После тщательного перемешивания в смесь добавляют 625 мкл солевого фосфатного буфера, pH 7,2. Конечная концентрация липидов составляет 2 мг в 1 мл. Суспензию озвучивают 5 минут на ультразвуковом дезинтеграторе. Полученный препарат представляет собой водную суспензию, включающую частицы носителя, имеющего ультрамикроскопическую тубулярную липидную структуру с длиной тубул 100-300 нм. На фиг.2 (снимок А) приведена электронная микрофотография, полученного липид-гликозидного носителя (увеличение Х 50000).Example 2. Preparation of a lipid-glycoside carrier preparation consisting of three parts by weight of holotoxin A 1 , two parts by weight of cholesterol and two parts by weight of MGDG from Zostera marina according to the procedure described in Example 1. 200 μl of cholesterol solution and 200 μl of MGDG solution are taken with a microdoser, evaporated to dryness under vacuum and the dry residue is solubilized with a 0.4% holotoxin A 1 solution, the volume of which is 375 μl. After thorough mixing, 625 μl of phosphate buffered saline, pH 7.2, are added to the mixture. The final lipid concentration is 2 mg per 1 ml. The suspension is voiced for 5 minutes on an ultrasonic disintegrator. The resulting preparation is an aqueous suspension comprising particles of a carrier having an ultramicroscopic tubular lipid structure with a tube length of 100-300 nm. Figure 2 (snapshot A) shows an electron micrograph of the obtained lipid-glycosidic carrier (magnification X 50,000).

Пример 3. Препарат липидного носителя получали по описанной в примере 1 методике при весовом соотношении исходных компонентов 3:2:6 с использованием МГДГ из Zostera marina. На фиг.2 (снимок Б) приведена электронная микрофотография липидного носителя, полученного с использованием МГДГ из Zostera marina (увеличение Х 50000).Example 3. The preparation of the lipid carrier was obtained according to the procedure described in example 1 at a weight ratio of the starting components of 3: 2: 6 using MGDG from Zostera marina. Figure 2 (image B) shows an electron micrograph of a lipid carrier obtained using MGDG from Zostera marina (magnification X 50,000).

Пример 4. Препарат липидного носителя получали по описанной в примере 3 методике с использованием МГДГ из Ulva fenestrate. Использование МГДГ, выделенного из Ulva fenestrate не изменяло морфологию носителя.Example 4. The preparation of the lipid carrier was obtained according to the procedure described in example 3 using MGDG from Ulva fenestrate. The use of MGDG isolated from Ulva fenestrate did not alter the morphology of the carrier.

Пример 5. Препарат липидного носителя получали по описанной в примере 3 методике с использованием МГДГ из Ahnfeltia tobuchiensis. Использование МГДГ, выделенного из Ahnfeltia tobuchiensis, не изменяло морфологию носителя.Example 5. A lipid carrier preparation was prepared according to the procedure described in Example 3 using MGDG from Ahnfeltia tobuchiensis. The use of MGDG isolated from Ahnfeltia tobuchiensis did not alter the morphology of the carrier.

Пример 6. Препарат липидного носителя получали по описанной в примере 3 методике с использованием МГДГ из Laminaria japonica. Использование МГДГ, выделенного из Laminaria japonica, не изменяло морфологию носителя.Example 6. A lipid carrier preparation was prepared according to the procedure described in Example 3 using MGDG from Laminaria japonica. The use of MGDG isolated from Laminaria japonica did not alter the morphology of the carrier.

Пример 7. Препарат гликозид-стеринового комплекса получали по описанной в примере 1 методике на основе голотоксина A1 и холестерина при их весовом соотношении 4:1 без добавления МГДГ. По данным электронной микроскопии голотоксин A1 в присутствии холестерина и в отсутствии МГДГ формирует нитевидные структуры длиной 100-200 нм. На фиг.2 (снимок В) приведена электронная микрофотография гликозид-стеринового комплекса, полученного в условиях примера 4 (увеличение Х 50000).Example 7. The preparation of a glycoside-sterol complex was obtained according to the procedure described in example 1 based on holotoxin A 1 and cholesterol at a weight ratio of 4: 1 without adding MGDG. According to electron microscopy, holotoxin A 1 in the presence of cholesterol and in the absence of MGDG forms threadlike structures 100-200 nm long. Figure 2 (snapshot B) shows an electron micrograph of a glycoside-sterol complex obtained under the conditions of example 4 (magnification X 50,000).

Пример 8. Препарат гликозид-стеринового комплекса получали по описанной в примере 1 методике на основе голотоксина A1 и холестерина при их весовом соотношении 3:2 без добавления МГДГ. По данным электронной микроскопии голотоксин A1 в отсутствии МГДГ и в избытке холестерина формирует нитевидные структуры. На фиг.2 (снимок Г) приведена электронная микрофотография гликозид-стеринового комплекса, полученного в условиях примера 5 (увеличение Х 50000).Example 8. The preparation of a glycoside-sterol complex was obtained according to the procedure described in example 1 based on holotoxin A 1 and cholesterol at a weight ratio of 3: 2 without adding MGDG. According to electron microscopy, holotoxin A 1 forms threadlike structures in the absence of MGDG and in excess of cholesterol. Figure 2 (snapshot D) shows an electron micrograph of a glycoside-sterol complex obtained under the conditions of Example 5 (magnification X 50,000).

Пример 9. Липидные носители, приведенные в примерах 2 и 3, тестировали на гемолитическую активность в условиях in vitro с использованием в качестве тест-системы эритроцитов беспородных мышей. Гепаринизированную кровь, полученную путем декапитации мыши, промывали в изотоническом растворе хлорида натрия 2-кратным центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 мин при комнатной температуре. Из осадка эритроцитов получали 0,5% клеточную суспензию. Исследуемые препараты готовили в фосфатно-солевом буфере, pH 7,4, и последовательно разносили по 10 мкл по лункам планшета методом двукратных серийных разведений с последующим добавлением суспензии эритроцитов по 90 мкл на лунку. В контрольные лунки добавляли по 10 мкл фосфатно-солевого буфера. Инкубирование проводили в течение 1 и 2 часов в термостате при 37°С. Оценку гемолитической активности исследуемых препаратов производили при визуальном осмотре лунок. Минимальную эффективную дозу вещества, вызывающую 100% гемолиз (ЕД100), определяли по появлению прозрачного раствора «лаковой» крови.Example 9. Lipid carriers shown in examples 2 and 3 were tested for hemolytic activity in vitro using erythrocytes from outbred mice as a test system. Heparinized blood obtained by decapitation of the mouse was washed in an isotonic sodium chloride solution by 2-fold centrifugation at 3000 rpm for 15 min at room temperature. A 0.5% cell suspension was obtained from the erythrocyte sediment. The studied preparations were prepared in phosphate-buffered saline, pH 7.4, and successively dispensed in 10 μl per well of the plate by the method of two serial dilutions followed by the addition of a suspension of red blood cells of 90 μl per well. 10 μl of phosphate-buffered saline was added to control wells. Incubation was carried out for 1 and 2 hours in a thermostat at 37 ° C. The hemolytic activity of the studied drugs was evaluated by visual inspection of the wells. The minimum effective dose of a substance that causes 100% hemolysis (ED 100 ) was determined by the appearance of a clear solution of “varnish” blood.

Гемолитическое действие голотоксина F1, включенного в комплекс заявляемого носителя антигенов, по отношению к эритроцитам белой мыши в течение двух часов наблюдения в составе липидных носителей снижалось в 9,8 раз по сравнению с действием того же количества индивидуального тритерпенового гликозида.The hemolytic effect of holotoxin F 1 , included in the complex of the claimed antigen carrier, in relation to white mouse erythrocytes within two hours of observation in the composition of lipid carriers decreased by 9.8 times compared with the action of the same amount of individual triterpene glycoside.

Пример 10. Полученные по описанной в примере 1 методике препараты липидных носителей смешивали с 0,6 мг псевдотуберкулезного поринового белка. Весовые соотношения структурообразующих компонентов голотоксин А1:Хол:МГДГ составляли 3:2:2, 3:2:6 или 3:2:10. При этом содержание голотоксина во всех исследованных препаратах было постоянно и составляло 0,6 мг. После ультразвукового дезинтегрирования белоксодержащие образцы носителей осаждали на ультрацентрифуге со скоростью 45000×g в течение 30 мин. Из центрифужных пробирок, сверху вниз до осадка, отбирали 12 фракций и в каждой определяли содержание белка по методу Лоури.Example 10. Obtained according to the method described in example 1, preparations of lipid carriers were mixed with 0.6 mg of pseudotuberculosis porin protein. The weight ratios of the structure-forming components of holotoxin A 1 : Chol: MGDG were 3: 2: 2, 3: 2: 6 or 3: 2: 10. At the same time, the content of holotoxin in all the studied preparations was constant and amounted to 0.6 mg. After ultrasonic disintegration, protein-containing carrier samples were deposited on an ultracentrifuge at a speed of 45,000 × g for 30 min. 12 fractions were taken from centrifuge tubes, from top to bottom, and the protein content was determined in each according to the Lowry method.

В результате эксперимента было показано (фиг.4), что более 95% белка после перемешивания и ультразвуковой обработки включается в состав липидных носителей, содержащих голотоксин A1, холестерин и МГДГ в соотношении 3:2:(6-10). Снижение количества МГДГ в 3-5 раз приводит к частичной утрате инкорпорирующих свойств носителя.As a result of the experiment, it was shown (Fig. 4) that more than 95% of the protein after mixing and ultrasound treatment is included in the composition of lipid carriers containing holotoxin A 1 , cholesterol and MGDG in a ratio of 3: 2: (6-10). A decrease in the amount of MGDG by 3-5 times leads to a partial loss of the incorporating properties of the carrier.

Пример 11. Полученный заявляемым способом (пример 2, 3) липидный носитель антигенов был испытан на группе беспородных мышей (по 10 в контрольной и опытной группе) на его безопасность. В ходе наблюдения у животных контролировали появление воспалительных или болевых реакций, признаков токсичности или гибели.Example 11. Obtained by the claimed method (example 2, 3) the lipid carrier of antigens was tested on a group of outbred mice (10 in the control and experimental group) for its safety. During the observation, the appearance of inflammatory or pain reactions, signs of toxicity, or death was controlled in animals.

Однократное внутрибрюшинное введение белым беспородным мышам препарата липидного носителя из расчета 100 и 200 мкг голотоксина A1 на мышь не вызывает гибели животных и проявления токсических эффектов в течение трех дней наблюдения. Испытываемые дозы голотоксина A1 соответствуют 5 и 10 мкг/кг веса. При этом оптимальная иммунотропная доза голотоксина A1 составляет 0,05-50 мкг на 1 кг веса.A single intraperitoneal injection of a white lipid mouse into a preparation of a lipid carrier at the rate of 100 and 200 μg of holotoxin A 1 per mouse does not cause animal death and toxic effects within three days of observation. The tested doses of holotoxin A 1 correspond to 5 and 10 μg / kg of body weight. The optimal immunotropic dose of holotoxin A 1 is 0.05-50 μg per 1 kg of weight.

Однократное подкожное введение липидных комплексов, приведенных в примерах 2 и 3, из расчета 100 и 200 мкг голотоксина A1 на мышь, не вызывает воспалительных и болевых эффектов у животных в течение трех дней наблюдения.A single subcutaneous injection of the lipid complexes shown in examples 2 and 3, based on 100 and 200 μg of holotoxin A 1 per mouse, does not cause inflammatory and pain effects in animals within three days of observation.

Claims (1)

Носитель антигенов в виде липидного комплекса, состоящий из гликозида, холестерина и липида, отличающийся тем, что в качестве гликозида он содержит голотоксин A1, а в качестве липида-моногалактозилдиацилглицериды (МГДГ) из морских макрофитов, взятые в весовом соотношении 3(голотоксин А1):2(холестерин):(2-6) (МГДГ) и представляет собой вытянутую нитевидно-тубулярную структуру.The carrier of antigens in the form of a lipid complex composed of a glycoside, cholesterol and lipid, characterized in that the glycoside it contains holotoxin A 1, and as a lipid-monogalaktozildiatsilglitseridy (MGDG) from marine macrophytes, taken in a weight ratio of 3 (holotoxin A 1 ): 2 (cholesterol) :( 2-6) (MGDG) and is an elongated filamentous-tubular structure.
RU2006123270/13A 2006-06-29 2006-06-29 Carrier of antigens RU2322259C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2006123270/13A RU2322259C1 (en) 2006-06-29 2006-06-29 Carrier of antigens

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2006123270/13A RU2322259C1 (en) 2006-06-29 2006-06-29 Carrier of antigens

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2322259C1 true RU2322259C1 (en) 2008-04-20

Family

ID=39453953

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2006123270/13A RU2322259C1 (en) 2006-06-29 2006-06-29 Carrier of antigens

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2322259C1 (en)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Benvegnu et al. New generation of liposomes called archaeosomes based on natural or synthetic archaeal lipids as innovative formulations for drug delivery
US4606918A (en) Polyoxypropylene-polyoxyethylene block polymer based adjuvants
JP2828391B2 (en) Liposomes with oligosaccharides on the surface
DE69131709T2 (en) Vaccine Compositions Containing Liposomes
CA1261264A (en) Immunopotentiating agents and method
US4772466A (en) Vaccines comprising polyoxypropylene-polyoxyethylene block polymer based adjuvants
DE69631970T2 (en) Archaeoliposomes, coenzyme Q10 containing archaeoliposomes and coenzyme Q10 containing liposomes as adjuvant and drug delivery vehicle
US8653049B2 (en) Normuramyl glycopeptide compounds
AU2006229381B2 (en) Liposome composition for immune induction
FR2726764A1 (en) ADDITIVE FOR VACCINE COMPOSITION
US4770874A (en) Polyoxypropylene-polyoxyethylene block polymer based adjuvants
US5084441A (en) Acetylated low density lipoproteins: a delivery system to phagocytic cells for stimulating immunologic response and host resistance
JPH10508829A (en) Synthetic ganglioside derivatives
RU2322259C1 (en) Carrier of antigens
EP0165123A2 (en) Lipophile derivatives of muramyl peptides having macrophage-activating properties, compositions containing them and processes for obtaining them
AU2006342615B8 (en) Therapeutic agent for allergy containing liposome having oligosaccharide on its surface
RU2319506C2 (en) Method for preparing carrier of antigens based on lipids from sea macrophytes and triterpene glycoside cucumarioside
JP4643009B2 (en) Novel compounds for cancer treatment
RU2311926C2 (en) Antigen carrier and adjuvant
CA2761917C (en) Method for detoxification of lipopolysaccharide (lps) or of lipid a of gram-negative bacteria
WO1996014841A1 (en) Antiviral and antitumor pharmaceutical compositions
Li et al. Physicochemical and immune properties of glycoglycerolipids from Laminaria japonica in immunostimulating complexes (ISCOMs)
Fioretto et al. The Janus effect of colloidal self-assembly on the biological response of amphiphilic drugs
JPH0482824A (en) Liposome and oil-in-water type emulsion
Demana University of Otago Library. Declaration concerning thesis

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20180630