RU2317335C1 - Method for predicting the progressing flow of chronic hepatitis c (development of cirrhosis) due to analyzing the combination of polymorphisms of cytokins genes - Google Patents
Method for predicting the progressing flow of chronic hepatitis c (development of cirrhosis) due to analyzing the combination of polymorphisms of cytokins genes Download PDFInfo
- Publication number
- RU2317335C1 RU2317335C1 RU2006127392/13A RU2006127392A RU2317335C1 RU 2317335 C1 RU2317335 C1 RU 2317335C1 RU 2006127392/13 A RU2006127392/13 A RU 2006127392/13A RU 2006127392 A RU2006127392 A RU 2006127392A RU 2317335 C1 RU2317335 C1 RU 2317335C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- gene
- patients
- chronic hepatitis
- development
- cirrhosis
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Введение.Introduction
Настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии и медицинской генетики и может быть использовано при определении прогноза течения хронического гепатита С. Предлагается способ, позволяющий установить предрасположенность к развитию цирроза печени при хроническом гепатите С по результатам тестирования ДНК на носительство определенных полиморфизмов генов цитокинов IL-1b, IL-6 и TGF-b1.The present invention relates to the field of molecular biology and medical genetics and can be used to determine the prognosis of the course of chronic hepatitis C. A method is proposed that allows to establish a predisposition to the development of liver cirrhosis in chronic hepatitis C according to the results of DNA testing for carriage of certain polymorphisms of IL-1b cytokine genes, IL-6 and TGF-b1.
Хронический гепатит С (ХГС) является ведущей формой хронических заболеваний печени с неуклонно прогрессирующим течением и характеризуется значительной межиндивидуальной вариабельностью клинической картины и исходов (Collier J.D., Woodall Т., et al., 2005). Основной причиной морбидности и смертности больных ХГС является цирроз печени (ЦП), скорость формирования которого варьирует от нескольких лет до нескольких десятков лет (Hoofnagle J.H., 2002). Считается, что у 20-30% больных ХГС цирроз печени развивается через 30 лет после инфицирования. Несмотря на то, что к настоящему времени установлено большое число факторов риска прогрессирующего течения ХГС, практикующие специалисты отмечают крайнюю сложность предсказания естественного течения заболевания и его прогноза у конкретного больного. В условиях ограниченной эффективности противовирусной терапии, большого числа нежелательных явлений на фоне лечения и высокой стоимости лекарственных препаратов вопрос об установлении индивидуального риска прогрессирования заболевания до стадии цирроза печени приобретает особую актуальность и диктует необходимость поиска дополнительных предикторов прогрессирования ХГС.Chronic hepatitis C (CHC) is a leading form of chronic liver disease with a steadily progressing course and is characterized by significant interindividual variability of the clinical picture and outcomes (Collier J.D., Woodall T., et al., 2005). The main cause of morbidity and mortality in patients with chronic hepatitis C is liver cirrhosis (CP), the rate of formation of which varies from several years to several tens of years (Hoofnagle J.H., 2002). It is believed that in 20-30% of patients with chronic hepatitis C, cirrhosis develops 30 years after infection. Despite the fact that a large number of risk factors have been established for the progressive course of chronic hepatitis C, practitioners note the extreme difficulty in predicting the natural course of the disease and its prognosis in a particular patient. Given the limited effectiveness of antiviral therapy, the large number of adverse events associated with treatment and the high cost of drugs, the issue of establishing an individual risk of disease progression to the stage of liver cirrhosis is particularly relevant and necessitates the search for additional predictors of chronic hepatitis C progression.
Уровень техники.The level of technology.
К настоящему времени установлен целый ряд факторов риска, ассоциированных с развитием цирроза печени. Условно эти факторы можно подразделить на модифицируемые и немодифицируемые. Среди модифицируемых факторов, влияющих на естественное течение ХГС, наиболее убедительные данные получены в отношении злоупотребления алкоголем, избыточной массы тела, коинфекции вирусами гепатита В и ВИЧ. Из немодифицируемых факторов риска прогрессирования ХГС упоминания заслуживают следующие: большая длительность заболевания, мужской пол и поздний возраст инфицирования. Вместе с тем учет традиционных факторов риска не всегда позволяет надежно предсказать вероятный исход заболевания, что послужило поводом к поиску дополнительных факторов, модифицирующих естественное течение ХГС.To date, a number of risk factors associated with the development of cirrhosis of the liver have been established. Conventionally, these factors can be divided into modifiable and unmodifiable. Among the modifiable factors affecting the natural course of chronic hepatitis C, the most convincing data were obtained regarding alcohol abuse, overweight, co-infection with hepatitis B viruses and HIV. Of the non-modifiable risk factors for the progression of chronic hepatitis C, the following deserve mention: a long duration of the disease, male gender, and late infection. However, taking into account traditional risk factors does not always allow reliable prediction of the likely outcome of the disease, which served as a reason for the search for additional factors that modify the natural course of chronic hepatitis C.
В последние годы особое внимание уделяется изучению генетических факторов риска прогрессирования ХГС. В ряде исследований, посвященных определению клинического и прогностического значения носительства аллельных вариантов гена HFE, установлена взаимосвязь между наличием мутации в этом гене и прогрессирующим течением ХГС (Smith В.С., Gorve J., et al., 1998). Изучалась также взаимосвязь аллельных вариантов генов цитокинов с развитием фиброза при ХГС. Powell E.E. et al. (2000), Gewaltig J. et al. (2002) и Wang H. et al. (2005) установили наличие такой связи между наследуемым полиморфизмом (+915) G/C в гене TGF-bl и прогрессирующим течением ХГС. Показано также, что на естественное течение заболевания может влиять (-511) С/Т полиморфизм в гене IL-1b (Bahr M.J. et al., 2003). Однако исследования, посвященные изучению ассоциации одного полиморфизма с особенностями течения ХГС, имеют ряд недостатков. С одной стороны, результаты работ нередко противоречат друг другу, а с другой - не предоставляют надежных критериев подразделения больных с высоким и низким риском развития цирроза печени. Устранение этих недостатков возможно при исследовании комбинации аллельных вариантов нескольких генов, поскольку при этом происходит суммирование факторов риска, а следовательно, повышается достоверность результатов и предсказательная способность модели.In recent years, special attention has been paid to the study of genetic risk factors for progression of CHC. In a number of studies on the determination of the clinical and prognostic value of the carriage of allelic variants of the HFE gene, a relationship was established between the presence of a mutation in this gene and the progressive course of chronic hepatitis C (Smith V.S., Gorve J., et al., 1998). The relationship of allelic variants of cytokine genes with the development of fibrosis in chronic hepatitis C was also studied. Powell E.E. et al. (2000), Gewaltig J. et al. (2002) and Wang H. et al. (2005) found the existence of such a relationship between the inherited polymorphism (+915) G / C in the TGF-bl gene and the progressive course of chronic hepatitis C. It was also shown that the (-511) C / T polymorphism in the IL-1b gene can affect the natural course of the disease (Bahr M.J. et al., 2003). However, studies on the association of a single polymorphism with the characteristics of the course of chronic hepatitis C have several drawbacks. On the one hand, the results of the work often contradict each other, and on the other hand, they do not provide reliable criteria for subdivision of patients with a high and low risk of developing liver cirrhosis. The elimination of these shortcomings is possible by studying the combination of allelic variants of several genes, since this leads to the summation of risk factors, and therefore, the reliability of the results and the predictive ability of the model increase.
Наиболее успешной попыткой применения данного подхода для оценки вероятности быстрого развития цирроза при ХГС является работа Richardson M.M. et al. (2005). Авторы исследовали ДНК 149 больных ХГС с медленным и быстрым темпом прогрессирования фиброза по 8 полиморфизмам в 6 различных генах, предположительно ассоциированных с прогрессированием фиброза. Из 6 исследованных генов два гена были связанны с окислительным стрессом (HFE и SOD2), два - с обменом липидов (МТР и АРОЕ) и два имели отношение к иммунному ответу (CCR5 и CTLA4). 6 из 8 исследованных полиморфизмов, для которых была экспериментально подтверждена связь с прогрессирующим развитием фиброза, были использованы в предложенной авторами модели для предсказания вероятного течения ХГС. По данным авторов, 15,2% больных с медленным темпом прогрессирования фиброза и 84,8% больных с быстрым темпом прогрессирования фиброза имели 5 и более из числа аллелей, включенных в предлагаемую модель. Способ прогнозирования быстрого развития фиброза при ХГС, предложенный Richardson et al., является наиболее близким аналогом настоящего изобретения. При всех достоинствах описанной в данной работе модели, она обладает существенным недостатком, который состоит в сложности практического применения, определяемой необходимостью проведения анализа слишком большого числа генов. Очевидно, что это связано со значительными затратами времени и средств. С учетом этого основной задачей настоящего изобретения было создание предсказательной модели прогрессирования фиброза при ХГС, которая, обладая достаточной степенью надежности, основывалась бы на изучении небольшого числа полиморфизмов.The most successful attempt to apply this approach to assess the likelihood of rapid development of cirrhosis in chronic hepatitis C is the work of Richardson M.M. et al. (2005). The authors examined the DNA of 149 patients with chronic hepatitis C with a slow and fast rate of fibrosis progression using 8 polymorphisms in 6 different genes, presumably associated with fibrosis progression. Of the 6 genes studied, two were associated with oxidative stress (HFE and SOD2), two were associated with lipid metabolism (MTP and APOE), and two were related to the immune response (CCR5 and CTLA4). 6 out of 8 investigated polymorphisms, for which the connection with the progressive development of fibrosis was experimentally confirmed, were used in the model proposed by the authors to predict the likely course of chronic hepatitis C. According to the authors, 15.2% of patients with a slow rate of fibrosis progression and 84.8% of patients with a fast rate of fibrosis progression had 5 or more of the number of alleles included in the proposed model. A method for predicting the rapid development of fibrosis in chronic hepatitis C, proposed by Richardson et al., Is the closest analogue of the present invention. For all the advantages of the model described in this paper, it has a significant drawback, which consists in the complexity of practical application, which is determined by the need to analyze too many genes. Obviously, this is associated with a significant investment of time and money. With this in mind, the main objective of the present invention was to create a predictive model of the progression of fibrosis in chronic hepatitis C, which, with a sufficient degree of reliability, would be based on the study of a small number of polymorphisms.
Раскрытие изобретения.Disclosure of the invention.
В связи с тем, что ключевую роль в прогрессировании фиброза у больных ХГС играют особенности иммунного ответа организма хозяина на патоген, представлялось целесообразным сосредоточить внимание на полиморфизме генов цитокинов. При этом предполагалось включить в группу полиморфизмов, рекомендуемую для исследования при тестировании ДНК больных ХГС с целью прогнозирования течения заболевания, те из них, которые предварительно будут определены как функционально значимые для быстрого развития фиброза.Due to the fact that the key role in the progression of fibrosis in patients with chronic hepatitis C is played by the characteristics of the host's immune response to the pathogen, it seemed advisable to focus on cytokine gene polymorphism. It was supposed to include in the group of polymorphisms recommended for research when testing the DNA of patients with chronic hepatitis C with the aim of predicting the course of the disease, those that will be previously determined to be functionally significant for the rapid development of fibrosis.
Цитокины - группа гормоноподобных белков и пептидов, синтезируемых и секретируемых клетками иммунной системы и другими типами клеток. Основные биологические функции цитокинов связаны с регуляцией развития и гомеостаза иммунной системы, контролем за ростом и дифференцировкой клеток и участием в неспецифических защитных реакциях организма. В свете решаемой задачи особый интерес представляют цитокины, участвующие в таких процессах, как воспаление, регенерация гепатоцитов и фиброгенез, типичными представителями которых, в частности, являются IL-1b, IL-6, IL-10 и TGF-b1. Поскольку считается, что до 50% индивидуальных различий в продукции цитокинов обусловлено наличием полиморфизмов (однонуклеотидных замен в пределах гена), закономерно было ожидать, что полиморфизмы, связанные с изменением продукции названных цитокинов, могут модифицировать естественное течение ХГС и служить маркерами прогрессирующего или доброкачественного течения заболевания.Cytokines are a group of hormone-like proteins and peptides synthesized and secreted by cells of the immune system and other types of cells. The main biological functions of cytokines are associated with the regulation of the development and homeostasis of the immune system, control over the growth and differentiation of cells and participation in non-specific protective reactions of the body. In light of the task at hand, cytokines involved in processes such as inflammation, hepatocyte regeneration, and fibrogenesis, of which, in particular, are IL-1b, IL-6, IL-10, and TGF-b1, are of particular interest. Since it is believed that up to 50% of individual differences in cytokine production are due to the presence of polymorphisms (single nucleotide substitutions within the gene), it was natural to expect that polymorphisms associated with changes in the production of these cytokines can modify the natural course of chronic hepatitis C and serve as markers of the progressive or benign course of the disease .
Известно, что полиморфизм в промоторном участке гена IL-1b в положении (-511) с заменой С на Т приводит к увеличению продукции цитокина в экспериментах in vitro и обусловливает высокую активность воспалительных реакций (Bahr M.J., 2003). В ряде публикаций показана ассоциация данного полиморфизма с формированием цирроза печени у больных ХГС (Bahr M.J., 2003) и развитием гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) (Tanaka Y., Furuta Т., et al., 2003).It is known that polymorphism in the promoter region of the IL-1b gene at position (-511) with the substitution of C for T leads to an increase in cytokine production in in vitro experiments and causes a high activity of inflammatory reactions (Bahr M.J., 2003). A number of publications have shown the association of this polymorphism with the formation of liver cirrhosis in patients with chronic hepatitis C (Bahr M.J., 2003) and the development of hepatocellular carcinoma (HCC) (Tanaka Y., T. Furuta, et al., 2003).
В гене TGF-b1 имеется несколько полиморфных сайтов, наиболее исследованным из которых является однонуклеотидная замена G на С в положении (+915), приводящая к замене Arg на Pro в 25 кодоне и, соответственно, к снижению уровня этого цитокина в сыворотке крови (Wang H., Mengsteab S. et al., 2005). Имеются также данные, что генотип (+915) GG, характеризующийся повышенной продукцией TGF-b1, ассоциирован с развитием фиброза легких и печени (Awad M.R., El-Gamel A., Hasleton P., et al. 1998; Powell Е.Е., Edwards-Smith C.J., et al., 2000). Однако однозначного мнения относительно связи данного полиморфизма с развитием фиброза не существует, поскольку в более поздних работах получены противоположные результаты (Suzuki S., Tanaka Y., Onto E., et al., 2003).The TGF-b1 gene has several polymorphic sites, the most studied of which is the single nucleotide substitution of G by C at position (+915), which leads to the replacement of Arg by Pro at the 25 codon and, accordingly, to a decrease in the level of this cytokine in blood serum (Wang H., Mengsteab S. et al., 2005). There is also evidence that the GG genotype (+915), characterized by increased production of TGF-b1, is associated with the development of pulmonary and hepatic fibrosis (Awad MR, El-Gamel A., Hasleton P., et al. 1998; Powell E.E. , Edwards-Smith CJ, et al., 2000). However, there is no unequivocal opinion regarding the relationship of this polymorphism with the development of fibrosis, since in later works opposite results were obtained (Suzuki S., Tanaka Y., Onto E., et al., 2003).
Промоторный регион гена IL-10 содержит три полиморфизма, наиболее изученным из которых является замена G на А в положении (-1082). В ряде исследований было показано, что у лиц с аллелем А в положении (-1082) лимфоциты, стимулированные митогеном, производят меньшее количество противовоспалительного цитокина IL-10 (Lio D., Scola L., Crivello A., et al., 2003), что может приводить к усилению воспалительного процесса и способствовать фиброгенезу (Wang S.C., Ohata M., Schrum L., et al., 1998). До настоящего времени опубликовано очень мало работ по изучению ассоциации данного полиморфизма с прогрессированием фиброза печени, и только в одном исследовании выявлена тенденция к преобладанию (-1082) АА генотипа у больных с быстрым развитием цирроза печени (Knapp S. et al., 2003).The promoter region of the IL-10 gene contains three polymorphisms, the most studied of which is the replacement of G by A at position (-1082). In a number of studies, it was shown that in individuals with the A allele at position (-1082), mitogen stimulated lymphocytes produce less anti-inflammatory cytokine IL-10 (Lio D., Scola L., Crivello A., et al., 2003) , which can lead to an increase in the inflammatory process and promote fibrogenesis (Wang SC, Ohata M., Schrum L., et al., 1998). To date, very little work has been published on the association of this polymorphism with the progression of liver fibrosis, and only one study showed a tendency for the (-1082) AA genotype to prevail in patients with rapid development of liver cirrhosis (Knapp S. et al., 2003).
В отношении IL-6 известно, что он является маркером и участником воспалительных процессов, а также регулирует пролиферацию и апоптоз гепатоцитов, однако достоверных данных, свидетельствующих о влиянии данного цитокина или полиморфизмов его гена на течение HCV инфекции, в литературе не имеется. Наиболее изученный полиморфизм в гене IL-6 относится к замене G на С по положению (-174) в промоторном регионе. Известно, что при наличии аллеля G в указанной позиции продукция IL-6 после стимуляции липополисахаридом (ЛПС) увеличивается значительно сильнее по сравнению с начальным уровнем, чем в случае аллеля С (Fishman D., Faulds G. et al., 1998). Кроме того, в некоторых работах приводятся данные, указывающие на то, что (-174) G/C полиморфизм в гене IL-6 коррелирует с индексом массы тела и развитием сахарного диабета 2 типа.With regard to IL-6, it is known that it is a marker and participant in inflammatory processes, and also regulates the proliferation and apoptosis of hepatocytes, however, there are no reliable data in the literature on the effect of this cytokine or its gene polymorphisms. The most studied polymorphism in the IL-6 gene relates to the replacement of G by C at position (-174) in the promoter region. It is known that in the presence of the G allele at the indicated position, the production of IL-6 after stimulation with lipopolysaccharide (LPS) increases significantly more compared to the initial level than in the case of C allele (Fishman D., Faulds G. et al., 1998). In addition, some studies cite data indicating that (-174) G / C polymorphism in the IL-6 gene correlates with body mass index and the development of type 2 diabetes mellitus.
В настоящее время для выявления полиморфных состояний генов используется большое количество разнообразных способов, таких как аллель-специфичная ПЦР, масс-спектрометрия, метод гибридизации, ПЦР в реальном времени. В одном из конкретных воплощений изобретения нами был использован метод полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, однако при осуществлении предлагаемого способа может быть применен любой из известных ныне методов, обеспечивающий надежное детектирование точечных замен в последовательности ДНК.Currently, a large number of various methods are used to detect polymorphic states of genes, such as allele-specific PCR, mass spectrometry, hybridization method, real-time PCR. In one of the specific embodiments of the invention, we used the method of polymorphism of the lengths of restriction fragments, however, in the implementation of the proposed method, any of the currently known methods can be used to ensure reliable detection of point substitutions in the DNA sequence.
Проведенный нами анализ ДНК у 104 больных ХГС с различными стадиями развития фиброза (примеры 2-5) показал, чтоOur DNA analysis in 104 patients with chronic hepatitis C with various stages of fibrosis (examples 2-5) showed that
а) в случае полиморфизма (-511) С/Т в гене IL-1b TT генотип примерно в 5 раз чаще выявляется у больных, развивших цирроз печени (15,22%), по сравнению с больными, у которых отмечено медленное прогрессирование фиброза (2,86%), тогда как СС генотип достаточно четко ассоциирован с медленно прогрессирующим течением заболевания;a) in the case of polymorphism (-511) of C / T in the IL-1b TT gene, the genotype is approximately 5 times more likely to be detected in patients who developed cirrhosis (15.22%), compared with patients who have a slow progression of fibrosis ( 2.86%), while the SS genotype is clearly associated with a slowly progressing course of the disease;
б) в случае полиморфизма (+915) G/C в гене TGF-b1 гетерозиготный генотип GC в 2 раза чаще выявляется у больных с циррозом печени (19,57%), чем у больных с мягким течением заболевания (8,57%);b) in the case of polymorphism (+915) G / C in the TGF-b1 gene, the heterozygous GC genotype is 2 times more often detected in patients with liver cirrhosis (19.57%) than in patients with a mild course of the disease (8.57%) ;
в) в случае полиморфизма (-174) G/C в гене IL-6 генотип GG четко ассоциирован с медленной аккумуляцией фиброза и наблюдается у больных с 1 стадией фиброза в 2 раза чаще по сравнению с больными, развившими цирроз печени, а для генотипа СС отмечена явная тенденция к более частому выявлению у больных с циррозом печени (15,21%), чем у больных с благоприятным течением болезни (5,71%);c) in the case of (-174) G / C polymorphism in the IL-6 gene, the GG genotype is clearly associated with slow accumulation of fibrosis and is observed in patients with stage 1 fibrosis 2 times more often than in patients who developed cirrhosis, and for the CC genotype there is a clear tendency to more frequent detection in patients with cirrhosis (15.21%) than in patients with a favorable course of the disease (5.71%);
г) в случае полиморфизма (-1082) G/A в гене IL-10 частота аллелей и генотипов между анализируемыми группами достоверно не различалась.d) in the case of (-1082) G / A polymorphism in the IL-10 gene, the frequency of alleles and genotypes between the analyzed groups did not significantly differ.
На основании полученных данных как значимые для прогрессирования фиброза при HCV-инфекции были определены полиморфизмы (-511) С/Т гена IL-1b, (+915) G/C гена TGF-b1 и (-174) G/C гена IL-6, анализ комбинации которых и предлагается использовать в новом способе определения предрасположенности больных ХГС к агрессивному течению заболевания. При этом генотипы (-511) ТТ гена IL-1b, (-511) СТ гена IL-1b, (+915) GC гена TGF-b1, (+915) СС гена TGF-b1, (-174) GC гена IL-6 и (-174) СС гена IL-6 рассматриваются как в различной степени "профибротические", генотип (+915) GG гена TGF-b1 рассматривается как нейтральный, а генотипы (-511) СС гена IL-1b и (-174) GG гена IL-6 - как обладающие протективным действием в отношении прогрессирования фиброза. С учетом такого подхода для качественной оценки наследственной предрасположенности к прогрессированию фиброза у больных ХГС по результатам тестирования ДНК на наличие указанных полиморфизмов в генах цитокинов предложена модель, представленная в табл.11.Based on the data obtained, polymorphisms of the (-511) C / T of the IL-1b gene, (+915) G / C of the TGF-b1 gene and (-174) G / C of the IL- gene were identified as significant for the progression of fibrosis in HCV infection 6, an analysis of the combination of which is proposed to be used in a new method for determining the predisposition of patients with chronic hepatitis C to the aggressive course of the disease. The genotypes of (-511) TT gene IL-1b, (-511) CT gene IL-1b, (+915) GC gene TGF-b1, (+915) CC gene TGF-b1, (-174) GC gene IL -6 and (-174) SS of the IL-6 gene are considered to be “profibrotic” to varying degrees, the (+915) GG genotype of the TGF-b1 gene is considered to be neutral, and the (-511) SS genotypes of the IL-1b gene and (-174 ) GG of IL-6 gene - as having a protective effect against the progression of fibrosis. Given this approach, for the qualitative assessment of the hereditary predisposition to the progression of fibrosis in patients with chronic hepatitis C, according to the results of DNA testing for the presence of these polymorphisms in the cytokine genes, the model presented in Table 11 is proposed.
Таким образом, поставленная задача разработки простого в исполнении и сравнительно недорогого (технический результат) способа прогнозирования предрасположенности к прогрессированию фиброза при HCV-инфекции была решена за счет использования новой комбинации полиморфизмов, определяемых при проведении ДНК-тестирования у пациентов с ХГС. Предложенный метод включает а) получение образца геномной ДНК больного ХГС, б) тестирование указанной ДНК на наличие аллелей, ассоциированных с прогрессированием фиброза, в) оценку результатов и составление заключения о вероятности прогрессирующего течения заболевания, и отличается тем, что ДНК анализируют на наличие полиморфизмов генов цитокинов (-511) С/Т IL-1b, (-174) G/C IL-6 и (+915) G/C TGF-b1, а заключение составляют на основании модели, представленной в табл.11.Thus, the task of developing a simple and relatively inexpensive (technical result) method for predicting a predisposition to the progression of fibrosis in HCV infection was solved by using a new combination of polymorphisms determined during DNA testing in patients with chronic hepatitis C. The proposed method includes a) obtaining a sample of the genomic DNA of a patient with chronic hepatitis C, b) testing the indicated DNA for the presence of alleles associated with the progression of fibrosis, c) evaluating the results and making a conclusion about the likelihood of a progressive course of the disease, and differs in that the DNA is analyzed for the presence of gene polymorphisms cytokines (-511) C / T IL-1b, (-174) G / C IL-6 and (+915) G / C TGF-b1, and the conclusion is based on the model shown in Table 11.
Краткое описание чертежей.A brief description of the drawings.
Фиг.1. - Электрофорез в агарозном геле после обработки соответствующего ПЦР-продукта рестриктазой Ava-I ((-511) СС генотип - 2 фрагмента (190 и 116 п.о.); (-511) СТ генотип - 3 фрагмента (306, 190 и 116 п.о.); (-511) ТТ генотип - 1 фрагмента (306 п.о.).Figure 1. - Agarose gel electrophoresis after processing the corresponding PCR product with Ava-I restriction enzyme ((-511) SS genotype - 2 fragments (190 and 116 bp); (-511) CT genotype - 3 fragments (306, 190 and 116 bp); (-511) TT genotype - 1 fragment (306 bp).
Фиг.2. Электрофорез в агарозном геле после обработки соответствующего ПЦР-продукта рестриктазой Mnl1 ((-1082) GG генотип - 1 фрагмент (141 п.о.); (-1082) GA генотип - 3 фрагмента (141, 92 и 49 п.о.); (-1082) АА генотип - 2 фрагмента (92 и 49 п.о.).Figure 2. Agarose gel electrophoresis after processing the corresponding PCR product with restriction enzyme Mnl1 ((-1082) GG genotype - 1 fragment (141 bp); (-1082) GA genotype - 3 fragments (141, 92 and 49 bp) ; (-1082) AA genotype - 2 fragments (92 and 49 bp).
Фиг.3. Электрофорез в агарозном геле после обработки соответствующего ПЦР-продукта рестриктазой SfaN1 ((-174) GG генотип - 2 фрагмента (140 и 58 п.о.); (-174) GC генотип - 3 фрагмента (198,140 и 59 п.о.); (-174) СС генотип - 1 фрагмент (198 п.о.).Figure 3. Agarose gel electrophoresis after processing the corresponding PCR product with restriction enzyme SfaN1 ((-174) GG genotype - 2 fragments (140 and 58 bp); (-174) GC genotype - 3 fragments (198,140 and 59 bp) ; (-174) SS genotype - 1 fragment (198 bp).
Фиг.4. Электрофорез в агарозном геле после обработки соответствующего ПЦР-продукта рестриктазой Bgl1 ((+915) GG генотип - 2 фрагмента (194 и 102 п.о.); (+915) GC генотип - 2 фрагмента (296 и 194); (+915) СС генотип - 1 фрагмент (296 п.о.).Figure 4. Agarose gel electrophoresis after processing the corresponding PCR product with restriction enzyme Bgl1 ((+915) GG genotype - 2 fragments (194 and 102 bp); (+915) GC genotype - 2 fragments (296 and 194); (+915 ) SS genotype - 1 fragment (296 bp).
Фиг.5. Частота встречаемости лиц в контрольной группе и среди больных ХГС без (-174) GG и (-511) СС генотипов.Figure 5. The frequency of occurrence of individuals in the control group and among patients with CHC without (-174) GG and (-511) SS genotypes.
По оси ординат - процент от общего числа индивидуумов данной группы. Незакрашенный столбец - контрольная группа (184 чел.); заштрихованный столбец - больные со стадией фиброза (по Knodell) F1 (35 чел.); столбец с пунктиром - больные со стадией фиброза F4 (46 чел.).The ordinate axis is the percentage of the total number of individuals in this group. Unfilled column - control group (184 people); shaded column - patients with stage of fibrosis (according to Knodell) F1 (35 people); column with a dashed line - patients with stage F4 fibrosis (46 people).
Осуществление изобретения.The implementation of the invention.
Материалы и методы.Materials and methods.
1. Критерии отбора больных ХГС для проведения анализа.1. Criteria for the selection of patients with chronic hepatitis C for analysis.
В данное исследование были включены больные, имеющие хроническую HCV инфекцию (anti HCV Ab+, HCV RNA+) с гистологически установленной стадией фиброза печени по Knodell. Из общего числа больных с I стадией фиброза печени в данное исследование были включены только те, у которых длительность инфекции составила не менее 10 лет, (считалось, что у этих больных имеет место медленный темп прогрессирования фиброза). В исследование не включались больные с сочетанной патологией печени. Контрольную группу составили здоровые доноры крови (отрицательные анти-HCV и HCV RNA) обоих полов в возрасте 18-45 лет. Все обследованные лица принадлежали к русской этнической группе и не были родственниками.This study included patients with chronic HCV infection (anti HCV Ab +, HCV RNA +) with a histologically established stage of liver fibrosis according to Knodell. Of the total number of patients with stage I liver fibrosis, only those with a duration of infection of at least 10 years were included in this study (it was believed that in these patients there is a slow rate of progression of fibrosis). The study did not include patients with concomitant liver disease. The control group consisted of healthy blood donors (negative anti-HCV and HCV RNA) of both sexes aged 18-45 years. All the individuals examined belonged to the Russian ethnic group and were not relatives.
Диагноз ХГС и ЦПС устанавливался на основании данных анамнеза, клинического обследования, результатов лабораторных методов диагностики, включая вирусологическое исследование (позитивные тесты на антитела к вирусу гепатита С и HCV RNA) и морфологического исследования печени.The diagnosis of chronic hepatitis C and CPS was established on the basis of medical history, clinical examination, the results of laboratory diagnostic methods, including virological testing (positive tests for antibodies to hepatitis C virus and HCV RNA) and morphological examination of the liver.
2. Выделение ДНК.2. Isolation of DNA.
Выделение геномной ДНК из образца крови проводили с помощью модифицированного метода с протеиназой К и экстракцией фенол-хлороформом. Для этого в 1,5 мл пробирку (Eppendorf) вносили 700 мкл анализируемого образца крови и 700 мкл ТЕ-буфера (10 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА) для гемолиза эритроцитов. Процедуру повторяли 2 раза, а затем к клеточному осадку добавляли 400 мкл буфера для протеиназы К, содержащего 200 мкг/мл протеиназы К, после чего инкубировали 4 часа при 60°С на термошейкере с постоянным перемешиванием (850 об/мин). Далее проводили фенол-хлороформную экстрацию ДНК с последующим осаждением 96% этанолом и центрифугированием в течение 10 мин при 10000 об/мин. После серии промывок ДНК элюировали ТЕ буфером (200 мкл). Концентрация выделенной ДНК составляла от 30 до 50 нг/мкл.Genomic DNA was isolated from a blood sample using a modified method with proteinase K and phenol-chloroform extraction. To do this, 700 μl of the analyzed blood sample and 700 μl of TE buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA) were added to a 1.5 ml tube (Eppendorf) for erythrocyte hemolysis. The procedure was repeated 2 times, and then 400 μl of Proteinase K buffer containing 200 μg / ml Proteinase K was added to the cell pellet, and then incubated for 4 hours at 60 ° C with a constant temperature shaker (850 rpm). Next, phenol-chloroform DNA extraction was carried out, followed by precipitation with 96% ethanol and centrifugation for 10 min at 10,000 rpm. After a series of washes, DNA was eluted with TE buffer (200 μl). The concentration of extracted DNA ranged from 30 to 50 ng / μl.
3. ПЦР-амплификация и анализ ПЦР-продуктов.3. PCR amplification and analysis of PCR products.
Для определения полиморфизмов в исследуемых генах применялся метод ПДРФ (полиморфизма длины рестрикционных фрагментов). ПЦР проводили в термоциклере Master Cycler (Eppendorf). При этом использовали пробу следующего состава: 100 мМ Tris-HCl, рН 8,3 (25°С), 50 мМ KCl, MgCl2 (концентрация подбиралась индивидуально для каждой пары праймеров), четыре дезоксинуклеозидтрифосфата (по 200 мкМ каждого), Taq-полимераза (0,5 ед./реакцию) и 1-2 мкг геномной ДНК и праймеры (4-8 пмоль/реакцию). Конечный объем реакционной смеси составлял 25 мкл. При постановке ПЦР использовался прием "горячего старта" (Hebert В., Bergeron J., Potworowski E.F., Tijssen P., 1993).To determine the polymorphisms in the studied genes, the RFLP method (restriction fragment length polymorphism) was used. PCR was performed in a Master Cycler thermal cycler (Eppendorf). A sample of the following composition was used: 100 mM Tris-HCl, pH 8.3 (25 ° С), 50 mM KCl, MgCl 2 (the concentration was selected individually for each pair of primers), four deoxynucleoside triphosphates (200 μM each), Taq- polymerase (0.5 units / reaction) and 1-2 μg of genomic DNA and primers (4-8 pmol / reaction). The final volume of the reaction mixture was 25 μl. When setting up PCR, a hot start technique was used (Hebert B., Bergeron J., Potworowski EF, Tijssen P., 1993).
Условия проведения реакции несколько различались в зависимости от определяемого аллеля (см. примеры 2-4).The reaction conditions were slightly different depending on the determined allele (see examples 2-4).
Рестрикционный анализ продуктов ПЦР проводился с помощью соответствующей рестриктазы в течение 6 часов.Restriction analysis of PCR products was carried out using an appropriate restriction enzyme for 6 hours.
Продукты рестрикции анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле, концентрация которого подбиралась в зависимости от длины рестрикционных фрагментов.The restriction products were analyzed by agarose gel electrophoresis, the concentration of which was selected depending on the length of the restriction fragments.
4. Статистическая обработка результатов4. Statistical processing of results
Данные представляли как среднее арифметическое со стандартным отклонением. Статистическая значимость различий для количественных признаков в случае нормального распределения последних оценивалась с помощью t-критерия. Статистическая значимость различий качественных признаков в сравниваемых группах оценивалась при помощи точного критерия Фишера и критерия χ2. Уровень значимости был принят р<0,05. Для статистической обработки был использован пакет программ Statistica 6.0.Data were presented as arithmetic mean with standard deviation. The statistical significance of differences for quantitative traits in the case of a normal distribution of the latter was evaluated using the t-test. The statistical significance of differences in qualitative characteristics in the compared groups was evaluated using the exact Fisher test and the χ 2 criterion. A significance level was adopted p <0.05. For statistical processing, the Statistica 6.0 software package was used.
Пример 1. Характеристика группы патентов, отобранных для ДНК-тестирования.Example 1. Characterization of a group of patents selected for DNA testing.
В соответствии с указанными выше критериями было отобрано 104 пациента, из которых 35 имели раннюю (F1) стадию фиброза, а 46 - цирроз печени (F4). Больные с медленным темпом прогрессирования фиброза были статистически достоверно моложе, были инфицированы в более раннем возрасте, имели меньший индекс массы тела и уровень аланиновой аминотрансферазы по сравнению с больными, развившими цирроз печени. В то же время длительность заболевания у них достоверно не отличалась от таковой у больных, развивших цирроз печени (табл.1).In accordance with the above criteria, 104 patients were selected, of which 35 had an early (F1) stage of fibrosis, and 46 had cirrhosis of the liver (F4). Patients with a slow rate of fibrosis progression were statistically significantly younger, were infected at an earlier age, had a lower body mass index and alanine aminotransferase level compared with patients who developed liver cirrhosis. At the same time, the duration of the disease in them did not significantly differ from that in patients who developed cirrhosis of the liver (Table 1).
Сравнительная характеристика обследованных больных.Table 1.
Comparative characteristics of the examined patients.
Пример 2. Определение полиморфизма (-511) С/Т IL-lb.Example 2. Determination of polymorphism (-511) C / T IL-lb.
Геномную ДНК, выделенную из каждого образца крови, подвергали ПЦР-амплификации, как описано в разделе "Материалы и методы".Genomic DNA isolated from each blood sample was subjected to PCR amplification as described in the Materials and Methods section.
При проведении ПЦР использовали праймеры 5′-TGG CAT TGA TCT GGT TCA TC-3′ и 5′-GTT TAG GAA TCT TCC CAC TT-3′ и следующие условия: начальная денатурация (94°С, 2 мин) - 1 цикл, денатурация (94°С, 30 сек), отжиг (55°С, 1 мин) и элонгация (74°С, 1 мин) - 32 цикла, заключительная элонгация (70°С, 10 мин) - 1 цикл.When performing PCR, primers 5′-TGG CAT TGA TCT GGT TCA TC-3 ′ and 5′-GTT TAG GAA TCT TCC CAC TT-3 ′ and the following conditions were used: initial denaturation (94 ° C, 2 min) - 1 cycle, denaturation (94 ° С, 30 sec), annealing (55 ° С, 1 min) and elongation (74 ° С, 1 min) - 32 cycles, final elongation (70 ° С, 10 min) - 1 cycle.
ПЦР-продукт обрабатывали рестриктазой AvaI и анализировали в 2% геле. О наличии в тестируемой ДНК аллеля (-511) С судили по появлению двух фрагментов размером 190 и 116 п.о. (фиг.1). После анализа всех образцов рассчитывали частоту встречаемости аллелей (-511) С и (-511) Т и распространенность генотипов в анализируемых группах. Полученные результаты представлены, соответственно, в табл.2 и табл.3The PCR product was treated with AvaI restriction enzyme and analyzed in a 2% gel. The presence of an allele (-511) C in the tested DNA was judged by the appearance of two fragments of 190 and 116 bp in size. (figure 1). After analysis of all samples, the frequency of occurrence of alleles (-511) C and (-511) T and the prevalence of genotypes in the analyzed groups were calculated. The results are presented, respectively, in table 2 and table 3
Частота аллелей (-511) С/Т полиморфизма гена IL-1bTable 2.
Allele frequency (-511) C / T polymorphism of the IL-1b gene
(-511) С/ТIL-1b
(-511) C / T
Распространенность генотипов (-511) С/Т полиморфизма гена IL-1bTable 3.
The prevalence of genotypes (-511) C / T polymorphism of the IL-1b gene
(-511) С/Т)IL-1b
(-511) C / T)
У больных с медленным темпом прогрессирования фиброза аллель С (-511) С/Т полиморфизма выявлялся чаще (0,814), чем во всех других группах, однако различия достигали статистической значимости только в сравнении с контролем (р=0,05). По нашим данным, ТТ генотип более чем в 5 раз чаще выявлялся у больных, развивших цирроз печени (15,22%), по сравнению с больными, у которых отмечено медленное прогрессирование фиброза печени (2,86%) (р=0,05). И наоборот, СС генотип был достаточно четко ассоциирован с медленно прогрессирующим течением заболевания. Низкая встречаемость (-511) ТТ генотипа у больных с медленным темпом прогрессирования фиброза по сравнению с популяционной частотой, а также частотой обнаружения данного генотипа у больных с ЦП свидетельствует о том, что выявление его у больных ХГС является прогностически неблагоприятным.In patients with a slow rate of progression of fibrosis, the C (-511) C / T allele was detected more frequently (0.814) than in all other groups, however, the differences reached statistical significance only in comparison with the control (p = 0.05). According to our data, the TT genotype was more than 5 times more likely to be detected in patients who developed cirrhosis of the liver (15.22%), compared with patients who showed slow progression of liver fibrosis (2.86%) (p = 0.05 ) Conversely, the SS genotype was quite clearly associated with the slowly progressing course of the disease. The low incidence of the (-511) TT genotype in patients with a slow rate of fibrosis progression compared with the population frequency, as well as the frequency of detection of this genotype in patients with CP, indicates that its detection in patients with chronic hepatitis C is prognostically unfavorable.
Пример 3. Определение полиморфизма (-1082) G/A IL-10.Example 3. Determination of polymorphism (-1082) G / A IL-10.
При проведении ПЦР использовали праймеры 5′-ТТС ССС AGG TAG AGC AAC ACT-3′ и 5′-5′-GAT GGG GTG GAA GAA GTT GAA-3′ и следующие условия: начальная денатурация (95°С, 3 мин), 29 циклов: денатурация (95°С, 30 сек), отжиг (64°С, 20 сек) и элонгация (72°С, 30 сек); заключительная элонгация (72°С, 10 мин) - 1 цикл.When performing PCR, primers 5′-TTS CCC AGG TAG AGC AAC ACT-3 ′ and 5′-5′-GAT GGG GTG GAA GAA GTT GAA-3 ′ and the following conditions were used: initial denaturation (95 ° С, 3 min), 29 cycles: denaturation (95 ° С, 30 sec), annealing (64 ° С, 20 sec) and elongation (72 ° С, 30 sec); final elongation (72 ° C, 10 min) - 1 cycle.
ПЦР-продукт обрабатывали рестриктазой MnlI и анализировали в 3% геле. О наличии в тестируемой ДНК аллеля (-1082) А судили по появлению двух фрагментов размером 92 п.о. и 49 п.о. (фиг.2). После анализа всех образцов рассчитывали частоту встречаемости аллелей (-1082) G и (-1082) А и распространенность генотипов в анализируемых группах. Полученные результаты представлены, соответственно, в табл.4 и табл.5.The PCR product was treated with restriction enzyme MnlI and analyzed on a 3% gel. The presence of an allele (-1082) A in the tested DNA was judged by the appearance of two fragments of 92 bp in size. and 49 bp (figure 2). After analysis of all samples, the frequency of occurrence of the alleles (-1082) G and (-1082) A and the prevalence of genotypes in the analyzed groups were calculated. The results are presented, respectively, in table 4 and table 5.
Частота аллелей (-1082) G/A полиморфизма гена IL-10Table 4.
Allele frequency (-1082) G / A gene polymorphism IL-10
(-1082)G/AIL-10
(-1082) G / A
Распространенность генотипов (-1082) G/A полиморфизма гена IL-10Table 5.
The prevalence of genotypes (-1082) G / A polymorphism of the IL-10 gene
(-1082) G/A)IL-10
(-1082) G / A)
Экспериментально определенная распространенность аллелей и генотипов полиморфизма (-1082) G/A гена IL-10 не различалась между всеми исследованными группами. Т.о., по нашим данным, этот полиморфизм явным образом не ассоциирован с изменением скорости прогрессирования фиброза у больных ХГС, поэтому он не был включен в предложенную модель.The experimentally determined prevalence of alleles and genotypes of (-1082) G / A polymorphism of the IL-10 gene did not differ between all the studied groups. Thus, according to our data, this polymorphism is not explicitly associated with a change in the rate of progression of fibrosis in patients with chronic hepatitis C, so it was not included in the proposed model.
Пример 4. Определение полиморфизма (-174) G/C IL-6.Example 4. Determination of polymorphism (-174) G / C IL-6.
При проведении ПЦР-амплификации участка геномной ДНК, включающего положение (-174) гена IL-6, использовали праймеры 5′-TGA CTT CAG СТТ ТАС ТСТ TTG Т-3′ и 5′-CTG АТТ GGA ААС СТТ АТТ AAG-3′ и следующие условия: начальная денатурация (94°С 10 мин) - 1 цикл, затем 35 циклов: денатурация (94°С, 60 сек), отжиг (55°С, 35 сек) и элонгация (72°С, 60 сек); заключительная элонгация (72°С, 10 мин) - 1 цикл.When conducting PCR amplification of a portion of genomic DNA, including the position (-174) of the IL-6 gene, primers 5′-TGA CTT CAG CTT TAC TST TTG T-3 ′ and 5′-CTG ATT GGA AAC CTT ATT AAG-3 ′ were used and the following conditions: initial denaturation (94 ° С 10 min) - 1 cycle, then 35 cycles: denaturation (94 ° С, 60 sec), annealing (55 ° С, 35 sec) and elongation (72 ° С, 60 sec) ; final elongation (72 ° C, 10 min) - 1 cycle.
ПЦР-продукт анализировали, как описано в примере 2, используя для рестрикции рестриктазу SfaN1. О наличии аллеля (-174) G судили по появлению двух фрагментов 140 п.о. и 48 п.о. (фиг.3).The PCR product was analyzed as described in Example 2, using SfaN1 restriction enzyme for restriction. The presence of the (-174) G allele was judged by the appearance of two 140 bp fragments. and 48 bp (figure 3).
По результатам анализа всех образцов рассчитывали частоту аллелей (-174) G и С (табл. 6) и распротраненность соответствующих генотипов (табл. 7).According to the results of the analysis of all samples, the frequency of the (-174) G and C alleles (Table 6) and the prevalence of the corresponding genotypes (Table 7) were calculated.
Частота аллелей (-174) G/C полиморфизма гена IL-6Table 6.
Allele frequency (-174) of G / C IL-6 gene polymorphism
(-174) G/CIL-6
(-174) G / C
Распространенность генотипов (-174) G/C полиморфизма гена IL-6Table 7.
The prevalence of genotypes of (-174) G / C polymorphism of the IL-6 gene
(-174)G/CIL-6
(-174) G / C
Согласно полученным экспериментальным данным, частота встречаемости аллеля (-174) G максимальна у больных с медленно прогрессирующим течением заболевания (0,634), а минимальна - у больных с ЦП (0,476). Результаты анализа встречаемости различных генотипов свидетельствуют о том, что генотип GG четко ассоциирован с медленным формированием фиброза и наблюдается у больных с 1 стадией фиброза в 2 раза чаще по сравнению с больными, развившими цирроз печени (р=0,006). Что касается полиморфизма (-174) СС, то, хотя различия между группами пациентов с различными стадями фиброза не достигали статистической значимости (р=0,16), очевидной была тенденция к более частому выявлению этого полиморфизма у больных с циррозом печени (15,21%) по сравнению с больными, у которых отмечено благоприятное течение болезни (5,71%).According to the obtained experimental data, the frequency of occurrence of the (-174) G allele is maximum in patients with a slowly progressing course of the disease (0.634), and minimal in patients with CP (0.476). The results of the analysis of the occurrence of various genotypes indicate that the GG genotype is clearly associated with the slow formation of fibrosis and is observed in patients with stage 1 fibrosis 2 times more often than in patients who developed cirrhosis (p = 0.006). As regards (-174) SS polymorphism, although the differences between groups of patients with different stages of fibrosis did not reach statistical significance (p = 0.16), there was an obvious tendency to more frequently identify this polymorphism in patients with liver cirrhosis (15.21 %) compared with patients who have a favorable course of the disease (5.71%).
Таким образом, в процессе разработки предлагаемого изобретения впервые показана обратная корреляция между развитием цирроза печени и носительством (-174) GG генотипа гена IL-6, который выявлялся у 54,29% больных с медленным темпом прогрессирования фиброза и только у 21,74% больных с ЦП (р=0,006). Этот результат вкупе с данными о том, что генотип (-174) СС в 3 раза чаще выявляется у больных с ЦП (15,21%) по сравнению с больными, имевшими благоприятное течение ХГС (5,71%), позволил сделать вывод о том, что генотип GG обладает протективным эффектом в отношении прогрессирования фиброза печени у больных ХГС.Thus, in the process of developing the present invention, the inverse correlation between the development of liver cirrhosis and carriage of the (-174) GG genotype of the IL-6 gene, which was detected in 54.29% of patients with a slow rate of fibrosis progression and only in 21.74% of the patients, was first shown. with CP (p = 0.006). This result, together with the data that the genotype (-174) of SS is 3 times more likely to be detected in patients with CP (15.21%) compared with patients who had a favorable course of chronic hepatitis C (5.71%), the fact that the GG genotype has a protective effect against the progression of liver fibrosis in patients with chronic hepatitis C.
Пример 5. Определение полиморфизма (+915 G/C) TGF-β1.Example 5. Determination of polymorphism (+915 G / C) TGF-β1.
При проведении ПЦР-амплификации участка геномной ДНК, включающего положение (+915) гена TGF-1b, использовали праймеры 5′-TTCCCTCGAGGCCCTCCTA-3′ и 5′-GCCGCAGCTTGGACAGGATC-3′ и следующие условия: начальная денатурация (94°С 10 мин) - 1 цикл, затем 35 циклов: денатурация (94°С, 75 сек), отжиг (62°С, 75 сек) и элонгация (72°С, 75 сек); заключительная элонгация (72°С, 5 мин) - 1 цикл.When conducting PCR amplification of a genomic DNA region, including the position (+915) of the TGF-1b gene, primers 5′-TTCCCTCGAGGCCCTCCTA-3 ′ and 5′-GCCGCAGCTTGGACAGGATC-3 ′ were used and the following conditions: initial denaturation (94 ° С 10 min) - 1 cycle, then 35 cycles: denaturation (94 ° C, 75 sec), annealing (62 ° C, 75 sec) and elongation (72 ° C, 75 sec); final elongation (72 ° C, 5 min) - 1 cycle.
ПЦР-продукт анализировали, как описано в примере 2, используя для рестрикции рестриктазу Bgl1. О наличии вариантного аллеля судили по появлению тяжелого фрагмента 296 п.о. вследствие потери сайта рестрикции (фиг.4).The PCR product was analyzed as described in Example 2, using Bgl1 restriction enzyme for restriction. The presence of a variant allele was judged by the appearance of a heavy fragment of 296 bp due to loss of restriction site (figure 4).
На основании данных по всем исследованным образцам рассчитывали частоту встречаемости аллелей (+915) G и (+915) С и распространенность возможных генотипов в анализируемых группах. Полученные результаты представлены, соответственно, в табл.8 и табл.9.Based on the data for all studied samples, the frequency of occurrence of (+915) G and (+915) С alleles and the prevalence of possible genotypes in the analyzed groups were calculated. The results obtained are presented, respectively, in table 8 and table 9.
Частота аллелей (+915) G/C полиморфизма гена TGF-b1Table 8.
Allele frequency (+915) G / C polymorphism of the TGF-b1 gene
(+915) G/CTGF-b1
(+915) G / C
Распространенность генотипов (+915) G/C полиморфизма ген TGF-b1Table 9.
The prevalence of genotypes (+915) G / C polymorphism TGF-b1 gene
(+915) G/CTGF-b1
(+915) G / C
Несмотря на то, что нами не было получено статистически значимых отличий между группами при сравнении частоты вариантного аллеля С (+915) G/C полиморфизма, тенденция к большей частоте выявления этого аллеля у больных с ЦП (0,098) по сравнению с пациентами с доброкачественным течением заболевания (0,043) была очевидной (р=0,15).Despite the fact that we did not obtain statistically significant differences between the groups when comparing the frequency of the variant C (+915) G / C allele polymorphism, the tendency to a higher detection rate of this allele in patients with CP (0.098) compared with patients with a benign course disease (0.043) was evident (p = 0.15).
При определении встречаемости генотипов было обнаружено, что гетерозиготный генотип по мутантному аллелю гена TGF-b1 (GC генотип) в 2 раза чаще выявляется у больных с ЦПС (19,57%), чем у больных с мягким течением заболевания (8,57%) (р=0,14). Сделать однозначный вывод относительно (предположительно "профибротического") влияния генотипа СС на прогрессирование фиброза не представлялось возможным, т.к. встречаемость этого генотипа в популяции чрезвычайно низка и составляет всего лишь 0,37%.When determining the occurrence of genotypes, it was found that the heterozygous genotype for the mutant allele of the TGF-b1 gene (GC genotype) is 2 times more likely to be detected in patients with CPS (19.57%) than in patients with a mild course of the disease (8.57%) (p = 0.14). It was not possible to draw an unambiguous conclusion regarding the (presumably "profibrotic") influence of the SS genotype on the progression of fibrosis, because the occurrence of this genotype in the population is extremely low and amounts to only 0.37%.
Пример 6. Анализ частоты встречаемости комбинации аллелей и прогнозирование возможности агрессивного течения заболевания.Example 6. Analysis of the frequency of occurrence of a combination of alleles and predicting the possibility of an aggressive course of the disease.
С целью определения зависимости степени надежности прогнозирования течения заболевания от количества определяемых полиморфизмов (из числа трех предлагаемых нами для анализа) было проведено соответствующее суммирование результатов ДНК-тестирования, полученных в примерах 1, 3 и 4 (табл.8).In order to determine the dependence of the degree of reliability of predicting the course of the disease on the number of determined polymorphisms (out of the three we propose for analysis), a corresponding summation of the DNA testing results obtained in Examples 1, 3, and 4 was carried out (Table 8).
Частота выявления различных сочетаний аллелей, связанных с прогрессирующим течением ХГСTable 10.
The frequency of detection of various combinations of alleles associated with the progressive course of chronic hepatitis C
Отсутствие аллелей (первая строка табл.10), ассоциированных с прогрессирующим течением ХГС, отмечено почти у трети (28,57%) больных с медленно прогрессирующим фиброзом и только у 8,7% больных, развивших цирроз печени; при этом различия были статистически значимы (р=0,02).The absence of alleles (the first row of Table 10) associated with the progressive course of chronic hepatitis C was observed in almost a third (28.57%) of patients with slowly progressive fibrosis and only in 8.7% of patients who developed cirrhosis of the liver; the differences were statistically significant (p = 0.02).
Результаты, обобщающие случаи выявления в образце ДНК одного из трех ассоциированных с развитием фиброза аллелей (вторая строка табл.10), не позволили обнаружить достоверных различий между анализируемыми группами.The results summarizing the cases in which one of the three alleles associated with the development of fibrosis was detected in the DNA sample (second row of Table 10) did not reveal significant differences between the analyzed groups.
Одновременное присутствие в геноме больных ХГС двух аллелей, ассоциированных с быстрым развитием фиброза (строка 3 табл.10), чаще выявлялось у пациентов с ЦП (43,48%), чем у пациентов с доброкачественным течением заболевания (25,71%), однако различия не достигали статистической значимости (р=0,08). Вместе с тем, после вычета из группы с двумя факторами, больных (3 больных с F1 и 3 больных с F4) с (-174) GG генотипом, который определен нами как "протективный" (см. пример 3), выявленные различия стали достоверными (р=0,05). Наряду с указанным генотипом, определенным "защитным" действием, по нашим данным, обладает и генотип (-511) СС по гену IL-1b, поэтому с целью получить более убедительное доказательство существования протективного действия на естественное течение ХГС у носителей "профибротических" аллелей из анализа нами были исключены все больные, имеющие (-511) СС и (-174) GG генотипы (фиг.5). Как следует из полученных данных, только 8,57% больных из группы с медленным темпом прогрессирования фиброза по сравнению с 34,78% пациентов, развивших цирроз печени, и 41,08% здоровых доноров, не были носителями (-174) GG и (-511) СС генотипов (р=0,005 и р=0,0001, соответственно). Проведенный анализ показывает, что отсутствие указанных генотипов значительно снижает вероятность благоприятного течения ХГС, и определяет необходимость учета их протективного действия при составлении заключения.The simultaneous presence in the genome of patients with CHC of two alleles associated with the rapid development of fibrosis (
Носительство сразу трех "профибротических" аллелей (строка 4 табл.10) не было отмечено ни у одного из 35 больных с медленно прогрессирующим течением заболевания, в то время как в группе больных, развивших цирроз печени, таких пациентов было около 20%.Carriage of three “profibrotic” alleles at once (row 4 of Table 10) was not observed in any of 35 patients with a slowly progressing course of the disease, while in the group of patients who developed cirrhosis of the liver, such patients were about 20%.
Таким образом, по нашим данным, полиморфизмы (-511) С/Т в гене IL-1b, (-174) G/C в гене IL-6 и (+915) G/C в гене TGF-b1 влияют на естественное течение хронического гепатита С у пациентов русской этнической принадлежности. При этом генотипы (-511) ТТ гена IL-1b, (-174) СС гена IL-6 и (+915) GC гена TGF-b1 и, по-видимому, (+915) СС гена TGF-b1 ассоциированы с выраженным "профибротическим" ("++") действием, генотипы (-511) СТ гена IL-1b и (-174) GC гена IL-6 характеризуются умеренным "профибротическим" действием ("+"), генотип (+915) GG гена TGF-b1 - нейтральным эффектом ("0"), а генотипы (-511) СС гена IL-1b и (-174) GG гена IL-6 - протективным ("-") эффектом. В таблице 11 представлены возможные варианты генотипов, которые могут быть определены в результате ДНК-тестирования на наличие трех функционально значимых для течения ХГС полиморфизмов, и отмечено влияние каждого из них на развитие фиброза. Использование данной таблицы позволяет дать качественную оценку предрасположенности пациента с определенным генотипом к прогрессированию фиброза.Thus, according to our data, (-511) C / T polymorphisms in the IL-1b gene, (-174) G / C in the IL-6 gene, and (+915) G / C in the TGF-b1 gene affect the natural course chronic hepatitis C in patients of Russian ethnicity. Moreover, the (-511) TT genotypes of the IL-1b gene, (-174) SS of the IL-6 gene and (+915) GC of the TGF-b1 gene and, apparently, (+915) SS of the TGF-b1 gene "profibrotic" ("++") action, genotypes of (-511) ST of IL-1b gene and (-174) GC of IL-6 gene are characterized by moderate "profibrotic" action ("+"), genotype (+915) of GG gene TGF-b1 - neutral effect ("0"), and genotypes (-511) CC of the IL-1b gene and (-174) GG IL-6 gene - a protective ("-") effect. Table 11 presents the possible variants of genotypes that can be determined as a result of DNA testing for the presence of three functionally significant polymorphisms for the course of CGS, and the effect of each of them on the development of fibrosis is noted. Using this table allows you to give a qualitative assessment of the predisposition of a patient with a certain genotype to the progression of fibrosis.
Предлагаемая модель, основанная на анализе комбинации полиморфизмов генов цитокинов, позволяет выделить среди больных ХГС группу высокого риска развития цирроза печени и с большей уверенностью рекомендовать этим больным интенсивную противовирусную, а в перспективе и антифибротическую терапию.The proposed model, based on an analysis of the combination of cytokine gene polymorphisms, allows us to identify a high-risk group for developing liver cirrhosis among patients with chronic hepatitis C and to more confidently recommend intensive antiviral therapy and, in the future, antifibrotic therapy.
Claims (1)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2006127392/13A RU2317335C1 (en) | 2006-07-28 | 2006-07-28 | Method for predicting the progressing flow of chronic hepatitis c (development of cirrhosis) due to analyzing the combination of polymorphisms of cytokins genes |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2006127392/13A RU2317335C1 (en) | 2006-07-28 | 2006-07-28 | Method for predicting the progressing flow of chronic hepatitis c (development of cirrhosis) due to analyzing the combination of polymorphisms of cytokins genes |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2317335C1 true RU2317335C1 (en) | 2008-02-20 |
Family
ID=39267213
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2006127392/13A RU2317335C1 (en) | 2006-07-28 | 2006-07-28 | Method for predicting the progressing flow of chronic hepatitis c (development of cirrhosis) due to analyzing the combination of polymorphisms of cytokins genes |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2317335C1 (en) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2657586C1 (en) * | 2017-04-10 | 2018-06-14 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Астраханский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for predicting the course of chronic genotype 1 hepatitis c in untreated patients with high viral load |
-
2006
- 2006-07-28 RU RU2006127392/13A patent/RU2317335C1/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
BAHR M.J. et al., Liver International, 2003, 23, 420-425. TAG C.G. et al., Cytokine, 2003, 24 (5), 173-181. LAPINSKI T.W., Arch. Immunol. Ther. Exp., 2001, 49 (4), 311-316. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2657586C1 (en) * | 2017-04-10 | 2018-06-14 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Астраханский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for predicting the course of chronic genotype 1 hepatitis c in untreated patients with high viral load |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Yang et al. | PNPLA3 and TM6SF2 variants as risk factors of hepatocellular carcinoma across various etiologies and severity of underlying liver diseases | |
Mascheretti et al. | Pharmacogenetic investigation of the TNF/TNF-receptor system in patients with chronic active Crohn's disease treated with infliximab | |
Wang et al. | Transforming growth factor-β1 gene polymorphisms are associated with progression of liver fibrosis in Caucasians with chronic hepatitis C infection | |
Hesse et al. | Absence of MxA induction by interferon β in patients with MS reflects complete loss of bioactivity | |
Dai et al. | Tumor Necrosis Factor–α Promoter Polymorphism at Position− 308 Predicts Response to Combination Therapy in Hepatitis C Virus Infection | |
Wang et al. | Interleukin-10 promoter polymorphism predicts initial response of chronic hepatitis B to interferon alfa | |
US20150110733A1 (en) | Genetic markers predictive of response to glatiramer acetate | |
Comabella et al. | Pharmacogenomics and multiple sclerosis: moving toward individualized medicine | |
Bayram et al. | The significance of exonuclease 1 K589E polymorphism on hepatocellular carcinoma susceptibility in the Turkish population: a case–control study | |
Palmieri et al. | The− A2518G Polymorphism of Monocyte Chemoattractant Protein-1 Is Associated With Crohn's Disease | |
Luedecking-Zimmer et al. | Investigation of oxidized LDL-receptor 1 (OLR1) as the candidate gene for Alzheimer's disease on chromosome 12 | |
Youssef et al. | SOCS1 and pattern recognition receptors: TLR9 and RIG-I; novel haplotype associations in Egyptian fibrotic/cirrhotic patients with HCV genotype 4 | |
WO2023142619A1 (en) | Marker for dilated cardiomyopathy genetic detection and use thereof | |
Manichaikul et al. | Characterization of Ath29, a major mouse atherosclerosis susceptibility locus, and identification of Rcn2 as a novel regulator of cytokine expression | |
Golchin et al. | Analysis of two CDKN2B-AS polymorphisms in relation to coronary artery disease patients in North of Iran | |
KR20080084806A (en) | Methods and compositions for the assessment of cardiovascular function and disorders | |
US20100009368A1 (en) | Methods and compositions for the assessment of cardiovascular function and disorders | |
Lemay et al. | Bleomycin-induced pulmonary fibrosis susceptibility genes in AcB/BcA recombinant congenic mice | |
RU2317335C1 (en) | Method for predicting the progressing flow of chronic hepatitis c (development of cirrhosis) due to analyzing the combination of polymorphisms of cytokins genes | |
Suzuki et al. | A novel genetic marker for coronary spasm in women from a genome-wide single nucleotide polymorphism analysis | |
US20140011863A1 (en) | Methods and compositions for assessment of pulmonary function and disorders | |
JP5427352B2 (en) | A method for determining the risk of developing obesity based on genetic polymorphisms associated with human body fat mass | |
Dhawan et al. | Is endothelin gene polymorphism associated with postoperative atrial fibrillation in patients undergoing coronary artery bypass grafting? | |
Talaat et al. | Transforming Growth Factor‐β1 Gene Polymorphism (T29C) in Egyptian Patients with Hepatitis B Virus Infection: A Preliminary Study | |
CN115679003A (en) | Compositions, systems and uses for predicting drug efficacy |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20150729 |
|
NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20170117 |
|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20180729 |