RU2315094C9 - Method and device for producing phycoerythrin with high optical density - Google Patents
Method and device for producing phycoerythrin with high optical density Download PDFInfo
- Publication number
- RU2315094C9 RU2315094C9 RU2005126756/13A RU2005126756A RU2315094C9 RU 2315094 C9 RU2315094 C9 RU 2315094C9 RU 2005126756/13 A RU2005126756/13 A RU 2005126756/13A RU 2005126756 A RU2005126756 A RU 2005126756A RU 2315094 C9 RU2315094 C9 RU 2315094C9
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- phycoerythrin
- grown
- solution
- pigment
- tetraspores
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Cosmetics (AREA)
Abstract
Description
Предпосылки создания изобретенияBACKGROUND OF THE INVENTION
Область техникиTechnical field
Настоящее изобретение относится к способу и устройству для получения фикоэритрина с высокой оптической плотностью (ОП), более точно к способу и устройству для получения фикоэритрина с высокой оптической плотностью из группы растений, включающей Galaxaura oblongata, Halymenia ceylanica, Helminthocladia australis и Porphyra dentata.The present invention relates to a method and apparatus for producing phycoerythrin with high optical density (OD), and more particularly, to a method and apparatus for producing phycoerythrin with high optical density from a group of plants including Galaxaura oblongata, Halymenia ceylanica, Helminthocladia australis and Porphyra dentata.
Известный уровень техникиPrior art
Полученные из растений природные белковые пигменты безопасны для применения в пище и напитках. Они отличаются устойчивостью при умеренном нагреве и представляют собой кислые или щелочные растворы. Благодаря этому они могут применяться в пищевой и косметической промышленности в качестве окрашивающих веществ. Кроме того, пигменты в чистом виде могут применяться для мечения флуоресцином антител, используемых в качестве диагностических средств в иммунологических, клинических, цитологических и биохимических исследованиях.Natural protein pigments derived from plants are safe for use in food and beverages. They are resistant to moderate heat and are acidic or alkaline solutions. Due to this, they can be used in the food and cosmetic industry as coloring agents. In addition, pure pigments can be used for fluorescein labeling of antibodies used as diagnostic tools in immunological, clinical, cytological and biochemical studies.
Фикоцианин и фикоэритрин являются двумя природными белковыми пигментами, которые в настоящее время имеют широкое применение во множестве областей. Поскольку основным сырьем для получения фикоцианина являются сине-зеленые водоросли, такие как Spirulina и Microcystis, которые легко выращивать, и разработано множество способов выращивания водорослей и получения фикоцианина, поставки фикоцианина не являются проблемой. Тем не менее, по-прежнему ощущается дефицит фикоэритрина, в связи с чем его цена остается высокой. Такой дефицит объясняется нехваткой сырья и технологическими сложностями производства фикоэритрина в промышленных масштабах.Phycocyanin and phycoerythrin are two natural protein pigments that are currently widely used in many fields. Since the main raw material for producing phycocyanin is blue-green algae, such as Spirulina and Microcystis, which are easy to grow, and many methods have been developed to grow algae and produce phycocyanin, the supply of phycocyanin is not a problem. Nevertheless, there is still a shortage of phycoerythrin, in connection with which its price remains high. Such a shortage is explained by the lack of raw materials and the technological difficulties in the production of phycoerythrin on an industrial scale.
Большую часть фикоэритрина получают методом экстрагирования из талломных структур красных водорослей, таких как Porphyra и Ceramium и лишь в незначительной мере Porphyridium, которую теперь получают методом выращивания в резервуарах.Most phycoerythrin is obtained by extraction from red thallic structures of algae, such as Porphyra and Ceramium, and only to a small extent by Porphyridium, which is now obtained by growing in tanks.
Несмотря на то, что дикие красные водоросли и искусственно выращиваемая Porphyra во все больших количествах используются в качестве сырья для фикоэритрина, большая часть такого сырья имеет высокое содержание геля, что делает экстрагирование фикоэритрина из таких растений крайне сложным, в особенности если речь идет о сушеных водорослях. Кроме того, количество и качество диких водорослей зависит от времени года и температуры окружающей среды. Данные обстоятельства делают получение фикоэритрина из диких и искусственно выращиваемых водорослей Porphyra еще более затруднительным.Despite the fact that wild red algae and artificially grown Porphyra are used in increasing quantities as raw materials for phycoerythrin, most of these raw materials have a high gel content, which makes the extraction of phycoerythrin from such plants extremely difficult, especially when it comes to dried algae . In addition, the quantity and quality of wild algae depends on the season and ambient temperature. These circumstances make the production of phycoerythrin from wild and artificially grown Porphyra algae even more difficult.
Экстрагирование фикоэритрина из Porphyridium также связано со сложностями, поскольку сбор одноклеточных растений обычно требует больших затрат времени и труда, а растворимый полисахарид, который выделяется в процессе выращивания водорослей, замедляет сбор и влияет на экстрагирование фикоэритрина.The extraction of phycoerythrin from Porphyridium is also associated with difficulties, since the collection of unicellular plants usually requires a lot of time and labor, and the soluble polysaccharide that is released during the growth of algae slows down the collection and affects the extraction of phycoerythrin.
В патенте США US 5,358,858 предложено решение названных выше задач при помощи способа получения фикоэритрина из Bangia atropurpurea и Porphyra angusta. Поскольку данные нитчатые растения не содержат гель, они могут сохраняться в условиях, таких как питательные среды с контролируемой температурой, степенью и длительностью освещенности. Фикоэритрин может быть легко экстрагирован из нитчатых растений. В ходе осуществления предложенного в названном изобретении способа:US Pat. No. 5,358,858 proposes a solution to the aforementioned problems using a method for producing phycoerythrin from Bangia atropurpurea and Porphyra angusta. Since these filamentous plants do not contain gel, they can be stored under conditions such as nutrient media with controlled temperature, degree and duration of illumination. Phycoerythrin can be easily extracted from filamentous plants. During the implementation of the proposed in the named invention method:
1. В море осуществляют сбор талломных структур зрелых Bangia atropurpurea или Porphyra angusta и промывают их стерилизованной морской водой. После непродолжительной сушки на воздухе их помещают в питательную среду (среду SWM-III, см. таблицу 1). Через несколько часов из талломных структур Bangia atropurpurea или Porphyra angusta выделяются споры. Затем выделившиеся споры извлекают из исходной питательной среды и помещают в камеру для проращивания, в которой температура соответствует комнатной температуре, степень освещенности составляет 1000-4000 люкс, а длительность освещенности составляет 10-16 часов в сутки.1. At sea, the thallus structures of mature Bangia atropurpurea or Porphyra angusta are collected and washed with sterilized sea water. After brief drying in air, they are placed in a nutrient medium (medium SWM-III, see table 1). After a few hours, spores stand out from the thallus structures of Bangia atropurpurea or Porphyra angusta. Then, the released spores are removed from the initial nutrient medium and placed in a germination chamber, in which the temperature corresponds to room temperature, the degree of illumination is 1000-4000 lux, and the duration of illumination is 10-16 hours per day.
(Получить HCl с более высокой плотностью и начальным уровнем рН менее 7, затем добавить раствор NaOH, чтобы довести рН до уровня около 7,5. Это позволяет избежать образования осадка.)(Get HCl with a higher density and an initial pH of less than 7, then add a NaOH solution to bring the pH to about 7.5. This avoids the formation of precipitate.)
2. После того, как из пор прорастут разветвленные нити, их переносят в колбы с питательной средой SWM-III и выращивают в указанных выше условиях до образования колоний. Затем нитчатые колонии измельчают в стерилизованной мельнице на небольшие отрезки и помещают в емкость большего объема, такую как резервуар, чтобы способствовать их дальнейшему росту. Затем нитчатые колонии переносят в более объемное помещение, где продолжают их выращивание. Затем их снова измельчают для дальнейшего выращивания до необходимого количества. Важно, что при выращивании нитчатых колоний в резервуарах в них необходимо подавать приточный воздух (300 мл/мин). Затем колонии собирают и фильтруют через сеть с числом ячеек от 100 до 400. Питательную среду извлекают и используют повторно.2. After the branched strands sprout from the pores, they are transferred to flasks with SWM-III growth medium and grown under the above conditions to form colonies. The filamentous colonies are then pulverized in a sterilized mill into small pieces and placed in a larger container, such as a reservoir, to facilitate their further growth. Then filamentous colonies are transferred to a larger room, where they continue to grow. Then they are again crushed for further cultivation to the required amount. It is important that when growing filamentous colonies in tanks, it is necessary to supply fresh air (300 ml / min) in them. Then the colonies are collected and filtered through a network with a number of cells from 100 to 400. The nutrient medium is removed and reused.
3. Затем собранные и профильтрованные нити Bangia atropurpurea или Porphyra angusta быстро сушат в вакууме или нагретым воздухом и измельчают их в порошок. Порошок добавляют в раствор фосфата или воду и тщательно перемешивают. Методом центрифугирования удаляют инородные вещества и получают красный прозрачный раствор пигмента. Чтобы получить неочищенный фикоэритрин, в раствор добавляют (NH4)2SO4 и получают 20%-30% насыщенный раствор, из которого удалены ненужные белки, после чего раствор отстаивают с использованием 60%-65% насыщенного раствора (NH4)2SO4. Полученный фикоэритрин имеет отношение ОП565/ОП280 в пределах 1,4-1,6 и может использоваться для производства пигментов, применимых в пищевой и косметической промышленности.3. Then the collected and filtered strands of Bangia atropurpurea or Porphyra angusta are quickly dried in vacuum or with heated air and crushed into powder. The powder is added to a phosphate solution or water and mixed thoroughly. Foreign matter is removed by centrifugation and a red, clear pigment solution is obtained. To obtain the crude phycoerythrin, (NH 4 ) 2 SO 4 is added to the solution and a 20% -30% saturated solution is obtained from which unnecessary proteins are removed, after which the solution is settled using a 60% -65% saturated solution (NH 4 ) 2 SO 4 . The obtained phycoerythrin has a ratio of OD 565 / OD 280 in the range of 1.4-1.6 and can be used for the production of pigments applicable in the food and cosmetic industries.
4. Неочищенный осажденный фикоэритрин дополнительно очищают методом гель-хроматографии. Например, после однократной очистки методом сефадексовой хроматографии G200 отношение ОП565/ОП280 полученного фикоэритрина может достигать 5,1-5,2. Степень чистоты фикоэритрина, измеренная методом электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия, составляет около 99%. Это является показателем того, что фикоэритрин, полученный способом по изобретению, может использоваться в качестве реагента для проведения иммуноанализа.4. The crude precipitated phycoerythrin is further purified by gel chromatography. For example, after a single purification by Sephadex chromatography G200, the ratio of OD 565 / OD 280 of the obtained phycoerythrin can reach 5.1-5.2. The purity of phycoerythrin, measured by electrophoresis in the presence of sodium dodecyl sulfate, is about 99%. This is an indication that phycoerythrin obtained by the method of the invention can be used as a reagent for immunoassay.
С учетом того, что фикоэритрин с отношением ОП565/ОП280 в пределах 5,1-5,2 получают в результате сложных процессов очистки, дважды осуществляемых на стадии 4, стоимость и продолжительность производства возрастают. В связи с этим необходимо создать способ с использованием нитей других растений, в котором фикоэритрин с высокой оптической плотностью может быть получен непосредственно из первого красного прозрачного раствора пигмента, который получают на стадии 3.Given that phycoerythrin with an OD ratio of 565 / OD 280 in the range of 5.1-5.2 is obtained as a result of complex purification processes carried out twice in
Краткое изложение сущности изобретенияSummary of the invention
С учетом описанного выше известного уровня техники задачей настоящего изобретения является создание способа получения фикоэритрина с высокой оптической плотностью, которому не присущи проблемы описанного выше обычного способа получения фикоэритрина из Bangia atropurpurea и Porphyra angusta.In view of the prior art described above, an object of the present invention is to provide a method for producing phycoerythrin with high optical density, which does not have the problems of the above conventional method for producing phycoerythrin from Bangia atropurpurea and Porphyra angusta.
Другой задачей настоящего изобретения является создание способа получения фикоэритрина с высокой оптической плотностью, обеспечивающего высокий весовой выход фикоэритрина в пересчете на единицу веса водорослей, выбранных из группы, включающей Galaxaura oblongata, Halymenia ceylanica, Helminthocladia australis и Porphyra dentata, с целью снижения стоимости производства.Another objective of the present invention is to provide a method for producing phycoerythrin with high optical density, providing a high weight yield of phycoerythrin in terms of unit weight of algae selected from the group consisting of Galaxaura oblongata, Halymenia ceylanica, Helminthocladia australis and Porphyra dentata, in order to reduce production costs.
Дополнительной задачей настоящего изобретения является создание способа получения фикоэритрина с высокой оптической плотностью, обеспечивающего получение фикоэритрина с высокой оптической плотностью из первого красного прозрачного раствора пигмента водорослей, выбранных из группы, включающей Galaxaura oblongata, Halymenia ceylanica, Helminthocladia australis и Porphyra dentate, с целью уменьшения числа стадий производственного процесса.An additional objective of the present invention is to provide a method for producing phycoerythrin with high optical density, providing phycoerythrin with high optical density from the first red transparent algae pigment solution selected from the group including Galaxaura oblongata, Halymenia ceylanica, Helminthocladia australis and Porphyra dentate, in order to reduce the number stages of the production process.
С учетом изложенных выше и других аргументов, которые станут очевидными из описания, в соответствии с общими принципами настоящего изобретения предложен способ получения фикоэритрина с высокой оптической плотностью (ОП), в ходе осуществления которого в питательной среде выращивают гаметофит со зрелыми споровместилищами для тетраспор, из которых получают тетраспоры, выращивают тетраспоры при температуре 15-30°С, освещенности 500-6000 люкс и отношении свет/темнота свыше 10:14, чтобы прорастить нити, собирают выращенные нити, добавляют выращенные нити в жидкий раствор с уровнем рН в пределах 5-10, методом центрифугирования жидкого раствора со скоростью 6000 об/мин в течение 10 минут при температуре 4°С получают красный прозрачный раствор белкового пигмента, содержащий фикоэритрин, и высаливают из красного прозрачного раствора белкового пигмента концентрат фикоэритрина в гелеобразной форме, при этом гаметофит выбирают из группы водорослей, жизненный цикл которых включает гамогенез, бесполое размножение и вегетативное размножение.In view of the above and other arguments that will become apparent from the description, in accordance with the general principles of the present invention, a method for producing phycoerythrin with high optical density (OD) is proposed, during which a gametophyte with mature spores for tetraspores is grown in a nutrient medium, of which get tetraspores, grow tetraspores at a temperature of 15-30 ° C, illumination of 500-6000 lux and a light / dark ratio of more than 10:14 to germinate the threads, collect the grown threads, add the grown yarn into a liquid solution with a pH level in the range of 5-10, by centrifuging a liquid solution at a speed of 6000 rpm for 10 minutes at 4 ° C, a red transparent protein pigment solution containing phycoerythrin is obtained and salted out from a red transparent protein solution the pigment is a phycoerythrin concentrate in a gel form, while the gametophyte is selected from the group of algae, the life cycle of which includes gamogenesis, asexual reproduction and vegetative reproduction.
В соответствии с поставленной выше задачей водоросли выбирают из группы, включающей Galaxaura oblongata, Halymenia ceylanica, Helminthocladia australis и Porphyra dentata.In accordance with the above task, algae are selected from the group including Galaxaura oblongata, Halymenia ceylanica, Helminthocladia australis and Porphyra dentata.
В соответствии с поставленной выше задачей на фиг.7В проиллюстрирована спектрограмма хроматографического анализа фикоэритрина, экстрагированного из выращенных нитей спор красных водорослей Galaxaura oblongata, осуществленного на волне 565 нм методом жидкостной хроматографии высокого разрешения.In accordance with the above task, FIG. 7B illustrates a spectrogram of a chromatographic analysis of phycoerythrin extracted from grown spore strands of red algae Galaxaura oblongata carried out on a wavelength of 565 nm by high-performance liquid chromatography.
В соответствии с поставленной выше задачей на фиг.8В проиллюстрирована спектрограмма хроматографического анализа фикоэритрина, экстрагированного из выращенных нитей спор красных водорослей Halymenia ceylanica, осуществленного на волне 565 нм методом жидкостной хроматографии высокого разрешения.In accordance with the above task, FIG. 8B illustrates a spectrogram of the chromatographic analysis of phycoerythrin extracted from the grown spores of Halymenia ceylanica red algae carried out on a wavelength of 565 nm by high performance liquid chromatography.
В соответствии с поставленной выше задачей на фиг.9В проиллюстрирована спектрограмма хроматографического анализа фикоэритрина, экстрагированного из выращенных нитей спор красных водорослей Helminthocladia australis, осуществленного на волне 565 нм методом жидкостной хроматографии высокого разрешения.In accordance with the above task, FIG. 9B illustrates a spectrogram of a chromatographic analysis of phycoerythrin extracted from grown spore strands of Helminthocladia australis red algae carried out on a wavelength of 565 nm by high performance liquid chromatography.
В соответствии с поставленной выше задачей на фиг.10В проиллюстрирована спектрограмма хроматографического анализа фикоэритрина, экстрагированного из выращенных нитей спор красных водорослей Porphyra dentata, осуществленного на волне 565 нм методом жидкостной хроматографии высокого разрешения.In accordance with the above task, FIG. 10B illustrates a spectrogram of a chromatographic analysis of phycoerythrin extracted from grown spore strands of red algae Porphyra dentata, carried out on a wavelength of 565 nm by high performance liquid chromatography.
В соответствии с поставленной выше задачей в качестве питательной среды используется среда SWM-III.In accordance with the task set above, SWM-III medium is used as a nutrient medium.
В соответствии с поставленной выше задачей среда SWM-III представляет собой неорганическую среду SWM-IIIIn accordance with the above task, the SWM-III medium is an inorganic medium SWM-III
В соответствии с поставленной выше задачей в процессе выращивания тетраспор с целью проращивания нитей нити дополнительно измельчают на небольшие отрезки и в таких же условиях выращивают их емкости большего объема до тех пор, пока они не вырастут до необходимых размеров, при этом в емкость подают приточный воздух, чтобы небольшие отрезки нитей находились во взвешенном состоянии.In accordance with the task set above, in the process of growing tetraspores with the aim of germinating the threads, the threads are additionally crushed into small segments and, under the same conditions, their larger containers are grown until they grow to the required size, while the supply air is supplied to the container, so that small pieces of threads are in suspension.
В соответствии с поставленной выше задачей выращивание происходит в улучшенных условиях при температуре 20°С, освещенности 2000 люкс и отношении свет/темнота 12:12.In accordance with the above task, cultivation occurs in improved conditions at a temperature of 20 ° C, illumination of 2000 lux and a light / dark ratio of 12:12.
В соответствии с поставленной выше задачей на стадии сбора выращенных нитей дополнительно осуществляют сбор выращенных нитей с использованием сети с числом ячеек от 20 до 400, высушивают выращенные нити и измельчают их в порошок.In accordance with the task set above, at the stage of collecting the grown yarns, they additionally collect the grown yarns using a network with a number of cells from 20 to 400, dry the grown yarns and grind them into powder.
В соответствии с поставленной выше задачей способ сушки выращенных нитей выбирают из группы, включающей метод вакуумной сушки или метод сушки нагретым воздухом.In accordance with the above task, the method of drying the grown yarns is selected from the group including the method of vacuum drying or the method of drying with heated air.
В соответствии с поставленной выше задачей жидкий раствор состоит из воды и фосфата калия.In accordance with the above task, the liquid solution consists of water and potassium phosphate.
В соответствии с поставленной выше задачей на стадии высаливания фикоэритрина в гелеобразной форме в красный прозрачный белковый раствор пигмента дополнительно добавляют 20% раствор (NH4)2SO4 и центрифугируют красный прозрачный белковый раствор пигмента со скоростью 6000 об/мин в течение 10 минут при температуре 4°С, чтобы удалить нежелательные белки и получить раствор белкового пигмента с более высокой степенью чистоты.In accordance with the task set above, at the stage of salting out phycoerythrin in gel form, a 20% solution of (NH 4 ) 2 SO 4 is additionally added to the red transparent protein pigment and the red transparent pigment protein solution is centrifuged at a speed of 6000 rpm for 10 minutes at a
В соответствии с поставленной выше задачей на стадии высаливания фикоэритрина в гелеобразной форме в красный прозрачный белковый раствор пигмента с более высокой степенью чистоты дополнительно добавляют 60-65% раствор (NH4)2SO4 и центрифугируют красный прозрачный белковый раствор пигмента с более высокой степенью чистоты со скоростью 6000 об/мин в течение 10 минут при температуре 4°С, чтобы получить концентрат фикоэритрина в гелеобразной форме.In accordance with the task stated above, at the stage of salting out phycoerythrin in gel form, a 60-65% (NH 4 ) 2 SO 4 solution of a higher purity is additionally added to a red transparent protein solution of a pigment, and a red transparent protein solution of a pigment with a higher degree of purity is centrifuged at a speed of 6000 rpm for 10 minutes at a temperature of 4 ° C, to obtain a phycoerythrin concentrate in gel form.
В соответствии с поставленной выше задачей на стадии высаливания фикоэритрина в гелеобразной форме концентрат фикоэритрина в гелеобразной форме дополнительно подвергают диализу и очищают фикоэритрин методом гель-хроматографии.In accordance with the task stated above, at the stage of salting out phycoerythrin in gel form, the phycoerythrin concentrate in gel form is additionally subjected to dialysis and purified by phycoerythrin by gel chromatography.
В соответствии с поставленной выше задачей гель-хроматография представляет собой сефадексовую гель-хроматографию G200.In accordance with the above task, gel chromatography is a Sephadex gel chromatography G200.
В соответствии с поставленной выше задачей на стадии высаливания фикоэритрина в гелеобразной форме концентрат фикоэритрина в гелеобразной форме дополнительно очищают методом ультрафильтрации.In accordance with the task set above, at the stage of salting out phycoerythrin in gel form, the phycoerythrin concentrate in gel form is further purified by ultrafiltration.
Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings
Описанные особенности и многие из сопутствующих преимуществ настоящего изобретения можно легче оценить по прочтении следующего ниже подробного описания со ссылкой на приложенные чертежи, на которых:The described features and many of the accompanying advantages of the present invention can be more easily appreciated by reading the following detailed description with reference to the attached drawings, in which:
на фиг.1 показана спектрограмма хроматографического анализа оптической плотности и флуоресценции фикоэритрина, измеренных методом жидкостной хроматографии высокого разрешения,figure 1 shows a spectrogram of a chromatographic analysis of the optical density and fluorescence of phycoerythrin, measured by high-performance liquid chromatography,
на фиг.2 показан жизненный цикл Bangia atropurpurea,figure 2 shows the life cycle of Bangia atropurpurea,
на фиг.3 показан жизненный цикл Porphyra angusta,figure 3 shows the life cycle of Porphyra angusta,
на фиг.4 показан жизненный цикл Nemalion;figure 4 shows the life cycle of Nemalion;
на фиг.5А-5С показана спектрограмма хроматографического анализа фикоэритрина, экстрагированного из Bangia atropurpurea, проведенного методом жидкостной хроматографии высокого разрешения на волнах 280 нм, 565 нм и 615 нм,on figa-5C shows a spectrogram of a chromatographic analysis of phycoerythrin extracted from Bangia atropurpurea, carried out by liquid chromatography high resolution at 280 nm, 565 nm and 615 nm,
на фиг.6А-6С показана спектрограмма хроматографического анализа фикоэритрина, экстрагированного из Porphyra angusta, проведенного методом жидкостной хроматографии высокого разрешения на волнах 280 нм, 565 нм и 615 нм,on figa-6C shows a spectrogram of a chromatographic analysis of phycoerythrin extracted from Porphyra angusta, carried out by high performance liquid chromatography at 280 nm, 565 nm and 615 nm,
на фиг.7А-7С показана спектрограмма хроматографического анализа фикоэритрина, экстрагированного из Galaxaura oblongata, проведенного методом жидкостной хроматографии высокого разрешения на волнах 280 нм, 565 нм и 615 нм,7A-7C show a spectrogram of a chromatographic analysis of phycoerythrin extracted from Galaxaura oblongata by high-performance liquid chromatography at 280 nm, 565 nm and 615 nm,
на фиг.8А-8С показана спектрограмма хроматографического анализа фикоэритрина, экстрагированного из Halymenia ceylanica, проведенного методом жидкостной хроматографии высокого разрешения на волнах 280 нм, 565 нм и 615 нм,on figa-8C shows a spectrogram of a chromatographic analysis of phycoerythrin extracted from Halymenia ceylanica, carried out by high-performance liquid chromatography at 280 nm, 565 nm and 615 nm,
на фиг.9А-9С показана спектрограмма хроматографического анализа фикоэритрина, экстрагированного из Helminthocladia australis, проведенного методом жидкостной хроматографии высокого разрешения на волнах 280 нм, 565 нм и 615 нм,on figa-9C shows a spectrogram of chromatographic analysis of phycoerythrin extracted from Helminthocladia australis, carried out by high-performance liquid chromatography at 280 nm, 565 nm and 615 nm,
на фиг.10А-10С показана спектрограмма хроматографического анализа фикоэритрина, экстрагированного из Porphyra dentata, проведенного методом жидкостной хроматографии высокого разрешения на волнах 280 нм, 565 нм и 615 нм,10A-10C show a spectrogram of a chromatographic analysis of phycoerythrin extracted from Porphyra dentata by high-performance liquid chromatography at 280 nm, 565 nm and 615 nm,
на фиг.11-15 показаны элементы предложенного в настоящем изобретении устройства для получения фикоэритрина с высокой оптической плотностью.11-15 show elements of a device for producing phycoerythrin with high optical density proposed in the present invention.
Описание предпочтительного варианта осуществленияDescription of Preferred Embodiment
Далее более подробно описаны некоторые примерные варианты осуществления настоящего изобретения. Тем не менее, следует признать, что настоящее изобретение может быть реализовано на практике в целом ряде других вариантов осуществления помимо непосредственно описанных, а объем настоящего изобретения не ограничен ничем, кроме приложенных патентных притязаний.Some exemplary embodiments of the present invention are described in more detail below. However, it should be recognized that the present invention can be practiced in a number of other embodiments other than those directly described, and the scope of the present invention is not limited by anything other than the attached patent claims.
Фикоэритрины являются растворимыми в воде флуоресцирующими белковыми пигментами, которые получают из водорослей. Благодаря их особым флуоресцирующим свойствам их широко применяют для мечения флуоресцином антител, используемых в качестве диагностических средств. Поскольку фикоэритрин обладает наибольшей интенсивностью флуоресценции среди фикобилипротеинов, его применяют во многих тестах с использованием флуоресцина. На фиг.1 показана спектрограмма хроматографического анализа абсорбции и эмиссии фикоэритрина, проведенного методом жидкостной хроматографии высокого разрешения. Хроматография осуществлялась в следующих условиях:Phycoerythrins are water soluble fluorescent protein pigments that are obtained from algae. Owing to their special fluorescent properties, they are widely used for fluorescein labeling of antibodies used as diagnostic tools. Since phycoerythrin has the highest fluorescence intensity among phycobiliproteins, it is used in many tests using fluorescin. Figure 1 shows a spectrogram of a chromatographic analysis of the absorption and emission of phycoerythrin, carried out by high performance liquid chromatography. Chromatography was performed under the following conditions:
Колонна для проведения жидкостной хроматографии высокого разрешения:High Resolution Liquid Chromatography Column:
HYDROCELL DEAE NP10HYDROCELL DEAE NP10
Размер колонны: 50×4,6 ммColumn Size: 50 × 4.6 mm
Буфер A: 10 mMK-PBS pH 6,0Buffer A: 10 mMK-PBS pH 6.0
Буфер В: 10 mMk-PBS,0.5 M NaCl pH 6,0Buffer B: 10 mMk-PBS, 0.5 M NaCl pH 6.0
Градиент: 0% буфер В → 12 мин. → 50% буфер ВGradient: 0% buffer B → 12 min. → 50% buffer B
Детекция: 565 нмDetection: 565 nm
Расход жидкости: 1 мл/мин.Fluid flow rate: 1 ml / min.
Жидкостную хроматографию высокого разрешения осуществляли с использованием насоса, фильтров, детекторов и записывающего устройства.High resolution liquid chromatography was carried out using a pump, filters, detectors and a recording device.
Как показано на фиг.2 и фиг.3, на протяжении жизненного цикла Bangia atropurpurea и Porphyra angusta попеременно происходит гамогенез и бесполое размножение очередных поколений. У зрелой мужской особи гаметофитов в сперматангиях вырабатываются спермации. Такие спермации попадают в воду и переносятся течением, оказываясь в карпогонах женских особей гаметофитов. В зрелом карпогоне вырабатываются карпоспоры, из которых образуются нитчатые талломные структуры (споровые растения) с споровместилищами для спор в форме раковин, споры которых, выделяясь из зрелых споровместилищ, вырастают в молодые прямостоящие талломные структуры. Через некоторое время молодые прямостоящие талломные структуры выделяют моноспоры, из которых многократно вырастают новые молодые прямостоящие талломные структуры или прямостоящие талломные структуры (гаметофиты) в надлежащем состоянии. Тем самым, продолжается попеременный гамогенез и бесполое размножение очередных поколений.As shown in FIG. 2 and FIG. 3, throughout the life cycle of Bangia atropurpurea and Porphyra angusta, gamogenesis and asexual reproduction of successive generations alternately occur. In mature male gametophytes, spermatozoa are produced in spermatangia. Such spermatozoa fall into the water and are carried by the course, appearing in the carpogons of female gametophytes. Carpospores are produced in the mature carpogon, from which filamentous thallic structures (spore plants) are formed with spore-receptacles for shell-shaped spores, the spores of which, standing out from mature spore-receptacles, grow into young upright thallus structures. After some time, young upright thallic structures emit monospores, from which new young upright thallic structures or upright thallic structures (gametophytes) many times grow in proper condition. Thus, alternating gamogenesis and asexual reproduction of successive generations continues.
У других водорослей, таких как Nemalion, показанной на фиг.4, в течение жизненного цикла происходит чередование гамогенеза, бесполого размножения и вегетативного размножения. В зрелом карпогоне вырабатываются карпоспоры, из которых вырастают споровые растения с тетраспорами, которые, выделяясь из зрелых споровместилищ, вырастают в нитчатые талломные структуры. Нитчатые талломные структуры, выросшие из тетраспор, и нитчатые талломные структуры, выросшие из карпоспор, обладают различными свойствами. Так, нитчатые талломные структуры, выросшие из карпоспор, не содержат гель и тем самым могут сохраняться в определенных контролируемых условиях, таких как вторая среда с заданной температурой, степенью освещенности и суточной длительностью освещенности. В настоящем изобретении предложен способ экстрагирования фикоэритрина с высокой оптической плотностью из нитчатых талломных структур тетраспор. Для этого выбирают водоросли из группы, включающей Galaxaura oblongata, Halymenia ceylanica, Helminthocladia australis, Porphyra dentate или любые их сочетания. Более подробно это показано на фиг.11-15 на примере Galaxaura oblongata. Ниже описаны предложенные в изобретении способ и устройство.In other algae, such as Nemalion, shown in figure 4, during the life cycle there is an alternation of gamogenesis, asexual reproduction and vegetative propagation. Carpospores are produced in a mature carpogon, from which spore plants with tetraspores grow, which, standing out from mature spore sites, grow into filamentous thallic structures. Filamentous thallic structures grown from tetraspores, and filamentous thallic structures grown from karpospores have various properties. Thus, filamentous thallic structures grown from Karpospores do not contain gel and can thus be preserved under certain controlled conditions, such as a second medium with a given temperature, degree of illumination, and daily duration of illumination. The present invention provides a method for extracting phycoerythrin with high optical density from filamentous thallic structures of tetraspores. For this, algae are selected from the group including Galaxaura oblongata, Halymenia ceylanica, Helminthocladia australis, Porphyra dentate, or any combination thereof. This is shown in more detail in FIGS. 11-15 by the example of Galaxaura oblongata. The method and device proposed in the invention are described below.
1. Гаметофиты со зрелыми споровместилищами, выбранные из водорослей, жизненный цикл которых включает гамогенез, бесполое размножение и вегетативное размножение, таких как Galaxaura oblongata, Halymenia ceylanica, Helminlhocladia australis и Porphyra denlala, собирают и промывают стерилизованной водой, представляющей собой первую среду (не показана). После кратковременной воздушной сушки их помещают во вторую среду 100 (неорганическая среда SWM-III). Спустя несколько часов из водорослей удаляют тетраспоры 101. Затем тетраспоры 101 извлекают из второй среды и помещают в вегетационную камеру, такую как камеру 103 из листового стекла, в которой температура, степень освещенности, отношение свет/темнота и суточная длительность освещенности составляют соответственно 15-30°С, 500-6000 люкс, свыше 10:14 и 10-16 часов в сутки. Более предпочтительно температура, степень освещенности и отношение свет/темнота составляют соответственно 20°С, 2000 люкс и 12-12. См. фиг.11.1. Gametophytes with mature spore vessels, selected from algae, whose life cycle includes gamogenesis, asexual propagation and vegetative propagation, such as Galaxaura oblongata, Halymenia ceylanica, Helminlhocladia australis and Porphyra denlala, are collected and washed with sterilized water (not the first ) After short-term air drying, they are placed in the second medium 100 (inorganic medium SWM-III). After several hours, the
2. После того, как из тетраспор проросли разветвленные нити 201, нити 201 (не показаны) собирают и переносят в колбу с неорганической средой SWM-III, такую как емкость 200, и выращивают в указанных выше условиях до образования колоний. Затем нитчатые колонии разрезают на небольшие отрезки и переносят в емкость большего объема, чтобы способствовать их дальнейшему росту. Затем нитчатые колонии переносят в более объемное помещение, где продолжают их выращивание. После переноса в более объемное помещение происходит их дальнейший рост. Затем колонии снова измельчают для дальнейшего выращивания до необходимого количества. Важно, что при выращивании нитчатых колоний в резервуарах в них необходимо подавать приточный воздух (300 мл/мин) при помощи насоса 202, чтобы колонии находились во взвешенном состоянии в среде 204. Затем колонии собирают и фильтруют через сеть 203 с числом ячеек от 100 до 400. Питательную среду извлекают и используют повторно. См. фиг.12.2. After
3. Затем профильтрованные нити 300 собирают флотационным методом и быстро высушивают в сушилке, такой как установка 301 для вакуумной сушки или сушки нагретым воздухом и измельчают в порошок в мельнице 302. См. фиг.13. Порошок, например 2,4 г порошка добавляют в раствор с уровнем рН в пределах 5-10, такой как содержащий 70 мл и 10 мМ фосфата калия 304 или любой жидкости, и тщательно перемешивают мешалкой 303. После центрифугирования в центрифуге 305 со скоростью 6000 об/мин в течение 10 минут при температуре 4°С получают красный прозрачный раствор пигмента. См. фиг.14. Затем получают неочищенный фикоэритрин путем добавления 20%-30% насыщенного раствора (NH4)2SO4, 307, чтобы удалить излишний белковый осадок 308 при помощи осадителя (не показан), и методом осаждения добавляют 60%-65% насыщенный раствор (NH4)2SO4 309, чтобы получить неочищенный фикоэритрин с высокой оптической плотностью, пригодный для получения пигментов 310, применимых в пищевой и косметической промышленности. Методом испытаний было установлено, что отношение ОП565/ОП280 У пигмента 310 составляет 2,66. См. фиг.15. Упомянутый выше красный прозрачный раствор пигмента также может быть получен путем непосредственного измельчения влажных нитей и добавления к ним фосфата калия. Пигмент также можно получить методом ультрафильтрации.3. Then the filtered
4. Осажденный неочищенный фикоэритрин может быть дополнительно очищен методом гель-хроматографии или ультрафильтрации. Например, после однократной очистки методом сефадексовой хроматографии G200 отношение ОП565/ОП280 у полученного фикоэритрина составляет 4,5. После процесса многократной очистки отношение ОП565/ОП280 у фикоэритрина достигает 5,3. Степень чистоты фикоэритрина составляет около 99% по результатам электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия. Это является показателем того, что фикоэритрин, полученный предложенным в изобретении способом, может применяться в качестве реагента для проведения иммуноанализа.4. Precipitated crude phycoerythrin can be further purified by gel chromatography or ultrafiltration. For example, after a single purification by Sephadex chromatography G200, the ratio of OD 565 / OD 280 of the resulting phycoerythrin is 4.5. After a multiple purification process, the ratio of OD 565 / OD 280 of phycoerythrin reaches 5.3. The purity of phycoerythrin is about 99% according to the results of electrophoresis in the presence of sodium dodecyl sulfate. This is an indication that phycoerythrin obtained by the method of the invention can be used as a reagent for immunoassay.
На фиг 5А-6С показана спектрограмма хроматографического анализа методом жидкостной хроматографии высокого разрешения на волнах 280 нм, 565 нм и 615 нм, которому был подвергнут фикоэритрин, экстрагированный из Bangia atropurpurea и Porphyra angusta. На фиг 7А-10С показана спектрограмма хроматографического анализа методом жидкостной хроматографии высокого разрешения на волнах 280 нм, 565 нм и 615 нм, которому был подвергнут фикоэритрин, экстрагированный из Galaxaura oblongata, Halymenia ceylanica, Helminthocladia australis и Porphyra dentata. Поскольку спектрограммы хроматографического анализа фикоэритрина различаются в зависимости от того, из водорослей какого вида экстрагирован фикоэритрин, они позволяют легко определить источник происхождения фикоэритрина.FIGS. 5A-6C show a high resolution liquid chromatography chromatography spectrogram at 280 nm, 565 nm and 615 nm to which phycoerythrin extracted from Bangia atropurpurea and Porphyra angusta was subjected. Figures 7A-10C show a high-resolution liquid chromatography spectrogram at 280 nm, 565 nm and 615 nm that was subjected to phycoerythrin extracted from Galaxaura oblongata, Halymenia ceylanica, Helminthocladia australis and Porphyra dentata. Since the spectrograms of the chromatographic analysis of phycoerythrin differ depending on the type of phycoerythrin extracted from the algae, they make it easy to determine the source of phycoerythrin.
В таблице 2 приведены два значения оптической плотности для шести видов водорослей, в число которых входят Bangia atropurpurea, Porphyra angusta, Galaxaura oblongata, Halymenia ceylanica, Helminthocladia australis и Porphyra dentata. На первой строке таблицы 2 приведены количества (в миллиграммах) фикоэритрина, полученного в пересчете на одинаковое количество (в граммах) водорослей. На второй и третьей строках приведены отношения ОП565/ОП280 и ОП615/ОП565 для водорослей, используемых в настоящем изобретении, и водорослей Bangia atropurpurea и Porphyra angusta. Чем выше первое отношение, тем большей степенью чистоты отличается полученный фикоэритрин. Полученный таким способом фикоэритрин отличается достаточно высокой степенью чистоты для производства пищевых и косметических пигментов. Он также применим для иммунотерапии с целью профилактики заболеваний. Второе отношение является отношением степени чистоты фикоцианина и фикоэритрина. Чем ниже второе отношение, тем меньше степень чистоты полученного фикоцианина и, следовательно, тем выше качество полученного фикоэритрина. Из этого следует, что из нитей водорослей, используемых в настоящем изобретении, таких как Galaxaura oblongata, Halymenia ceylanica, Helminthocladia australis и Porphyra dentata, может быть получен фикоэритрин с более высокой оптической плотностью, чем это известно из уровня техники.Table 2 shows two values of optical density for six species of algae, which include Bangia atropurpurea, Porphyra angusta, Galaxaura oblongata, Halymenia ceylanica, Helminthocladia australis and Porphyra dentata. The first line of table 2 shows the amount (in milligrams) of phycoerythrin obtained in terms of the same amount (in grams) of algae. The second and third lines show the ratios OD 565 / OD 280 and OD 615 / OD 565 for the algae used in the present invention and the algae Bangia atropurpurea and Porphyra angusta. The higher the first ratio, the greater the degree of purity of the obtained phycoerythrin. The phycoerythrin obtained in this way is notable for a sufficiently high degree of purity for the production of food and cosmetic pigments. It is also applicable to immunotherapy for the prevention of diseases. The second ratio is the ratio of the purity of phycocyanin and phycoerythrin. The lower the second ratio, the lower the purity of the obtained phycocyanin and, therefore, the higher the quality of the obtained phycoerythrin. It follows that from algae threads used in the present invention, such as Galaxaura oblongata, Halymenia ceylanica, Helminthocladia australis and Porphyra dentata, phycoerythrin with a higher optical density than is known from the prior art can be obtained.
RPE - фикоэритриновый белок с максимальной способностью к поглощению ультрафиолетовых лучей на волне длиной 566 нм и флуоресценцией на волне длиной 575 нм.RPE is a phycoerythrin protein with a maximum ability to absorb ultraviolet rays at a wavelength of 566 nm and fluorescence at a wavelength of 575 nm.
Ва - Bangia atropurpureaBa - Bangia atropurpurea
Pa - Porphyra angustaPa - Porphyra angusta
Go - Galaxaura oblongataGo - Galaxaura oblongata
He - Halymenia ceylanicaHe - Halymenia ceylanica
Ha - Helminthocladia australisHa - Helminthocladia australis
Pd - Porphyra dentataPd - Porphyra dentata
Несмотря на то, что выше проиллюстрирован и описан конкретный вариант осуществления изобретения, для специалиста в данной области техники очевидно, что в него могут быть внесены различные изменения, не выходящие за объем изобретения, который ограничен исключительно приложенными притязаниями.Although a specific embodiment of the invention has been illustrated and described above, it will be apparent to those skilled in the art that various changes may be made thereto without departing from the scope of the invention, which is limited solely by the attached claims.
Claims (25)
Applications Claiming Priority (13)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN03236855.0 | 2003-01-27 | ||
CN03236857.7 | 2003-01-27 | ||
CN 03102041 CN1239514C (en) | 2003-01-27 | 2003-01-27 | Use and method for preparing high absorbance phycoerythrobilin using pink columnar galaxaura |
CN03102039.9 | 2003-01-27 | ||
CN03102041.0 | 2003-01-27 | ||
CN03102040.2 | 2003-01-27 | ||
CN 03102039 CN1238373C (en) | 2003-01-27 | 2003-01-27 | Use and method for preparing high absorbance phycoerythrobilin using helminthocladia |
CN 03236858 CN2643649Y (en) | 2003-01-27 | 2003-01-27 | Device for producing high absorbency phycoerythrin by longleaf laver |
CN03102038.0 | 2003-01-27 | ||
CN03236856.9 | 2003-01-27 | ||
CN 03236856 CN2604441Y (en) | 2003-01-27 | 2003-01-27 | Apparatus for producing high-absorbance rhodophyll with Helminthocladiaceae |
CN 03102038 CN1238372C (en) | 2003-01-27 | 2003-01-27 | Use and method for preparing high absorbance phycoerythrobilin using H. ceylanica |
CN03236858.5 | 2003-01-27 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2005126756A RU2005126756A (en) | 2006-02-27 |
RU2315094C2 RU2315094C2 (en) | 2008-01-20 |
RU2315094C9 true RU2315094C9 (en) | 2008-03-27 |
Family
ID=36114237
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2005126756/13A RU2315094C9 (en) | 2003-01-27 | 2004-01-20 | Method and device for producing phycoerythrin with high optical density |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2315094C9 (en) |
-
2004
- 2004-01-20 RU RU2005126756/13A patent/RU2315094C9/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2315094C2 (en) | 2008-01-20 |
RU2005126756A (en) | 2006-02-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Vonshak | Laboratory techniques for the cultivation of microalgae | |
Brody et al. | The effect of wavelength and intensity of light on the proportion of pigments in Porphyridium cruentum | |
Rothhaupt | Differences in particle size‐dependent feeding efficiencies of closely related rotifer species | |
US5358858A (en) | Process for preparing phycoerythrin from bangia atropurpurea and porphyra angusta | |
Nichols et al. | Action spectra studies of phycocyanin formation in a mutant of Cyanidium caldarium | |
RU2315094C9 (en) | Method and device for producing phycoerythrin with high optical density | |
KR100792608B1 (en) | Process and device for preparing phycoerythrin with high od ratio | |
US10745351B2 (en) | Method of producing phycocyanin powder | |
Nakamura et al. | Encystment of Chattonella antiqua in laboratory cultures | |
Lee et al. | Effects of host cell extracts on cultures of endosymbiotic diatoms from larger foraminifera | |
JP4915760B2 (en) | Non-mature monoalgal culture, method for producing the same, and algal body in which the same was grown | |
WO2005094563A1 (en) | Immature unialgal culture strain | |
US20040137583A1 (en) | Method for producing high OD phycoerythrin | |
JP3141083U (en) | A device that produces phycoerythrin with a high absorption coefficient | |
TWI223000B (en) | Method of Porphyra dentata for producing high OD phycoerythrin | |
KR100526170B1 (en) | A collecting apparatus of floating algal clump and harvesting algae by the apparatus | |
TWI222463B (en) | Method of Galaxaura oblongata for producing high OD phycoerythrin | |
JP2648088B2 (en) | Preparation method of phycoerythrin from oshikenori and kosulinori | |
TWI224135B (en) | Method of Helminthocladia australis for producing high OD phycoerythrin | |
BROOKS JR | Physiology and genetics of Astrephomene Gubernaculifera. | |
Mezzetti et al. | Determination of resistance to Phytophthora cactorum culture filtrate in apple clonal rootstocks, cultivars and leaf regenerants, using the in vitro proliferation and the optical probe methods. | |
CN2604440Y (en) | Arrangement for producing high-absorbance rhodophyll with ceylon sea membrance | |
CN1238373C (en) | Use and method for preparing high absorbance phycoerythrobilin using helminthocladia | |
DeMort | The culture and biochemical analysis of some estuarine phytoplankton species | |
CN2643649Y (en) | Device for producing high absorbency phycoerythrin by longleaf laver |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
TH4A | Reissue of patent specification | ||
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20130121 |