New! View global litigation for patent families

RU2312495C2 - Method for obtaining unisexual female offspring in sturgeon fish - Google Patents

Method for obtaining unisexual female offspring in sturgeon fish

Info

Publication number
RU2312495C2
RU2312495C2 RU2005139936A RU2005139936A RU2312495C2 RU 2312495 C2 RU2312495 C2 RU 2312495C2 RU 2005139936 A RU2005139936 A RU 2005139936A RU 2005139936 A RU2005139936 A RU 2005139936A RU 2312495 C2 RU2312495 C2 RU 2312495C2
Authority
RU
Grant status
Grant
Patent type
Prior art keywords
fish
female
ovicells
induction
females
Prior art date
Application number
RU2005139936A
Other languages
Russian (ru)
Other versions
RU2005139936A (en )
Inventor
Виктор Павлович Васильев (RU)
Виктор Павлович Васильев
Екатерина Денисовна Васильева (RU)
Екатерина Денисовна Васильева
Александр Витальевич Рекубратский (RU)
Александр Витальевич Рекубратский
Дмитрий Сергеевич Павлов (RU)
Дмитрий Сергеевич Павлов
Original Assignee
Виктор Павлович Васильев
Екатерина Денисовна Васильева
Александр Витальевич Рекубратский
Дмитрий Сергеевич Павлов
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Grant date

Links

Abstract

FIELD: genomic engineering, pisciculture.
SUBSTANCE: the present innovation deals with induction of embryonic gynogenetic development due to inseminating ovicells with genetically inactivated sperm. Moreover, induction should be applied for ovicells of the females in the hybrids of phylogenetically distant species. Such females are able to produce unreduced diploid ovicells which are genetically identical to maternal ones. The innovation enables to create clonally reproducing female lines of sturgeon fish, (unisexual female offspring) in fish with different mechanisms of sex detection, the case when the mechanism is unknown, among them. Also, it gives the chance to considerably reduce expenses at forming a spawning school.
EFFECT: higher efficiency.
1 ex

Description

Изобретение относится к геномной инженерии в области рыбоводства и, в частности, направлено на решение проблемы регуляции пола у осетровых рыб, продуцентов ценного пищевого продукта - черной икры. The invention relates to genomic engineering in fish farming, and in particular is directed to solving problems in the regulation of sex sturgeon, producing valuable food product - caviar.

В условиях резкого сокращения естественных популяций осетровых рыб современное осетроводство ориентировано в основном на получение икры и потомства с целью их коммерческой реализации. Given the sharp reduction in natural populations of sturgeons modern sturgeon focused mainly on getting the eggs and offspring with a view to commercial sale. Позднее созревание осетровые рыб (7-15 лет) и невозможность определить пол вплоть до возраста полового созревания влечет за собой непроизводительные затраты выростных площадей, кормов, энергии и труда, т.к. Later maturing sturgeon fish (7-15 years) and the inability to determine the sex until the age of puberty leads to an overhead of nursery areas, feed, energy and labor, as самцы составляют около 50% стада. males are about 50% of the herd. В связи с этим весьма актуальным является получение однополо-женского потомства у осетровых рыб, позволяющее решить проблему массового производства осетровой икры. In connection with this very relevant to provide a same-sex-female offspring from sturgeon, which allows to solve the problem of mass production of sturgeon caviar.

Известны два подхода, с помощью которых можно регулировать пол у рыб: гормональная регуляция и генетическая регуляция (Кирпичников BC Генетика и селекция рыб. Л.: Наука, 1987, 520 с.). There are two approaches you can use to adjust the sex of fish: hormonal regulation and genetic regulation (Kirpichnikov BC Genetics and breeding fish L .: Science, 1987, 520..). Первый подход заключается в изменении полового состава в потомстве рыб с помощью воздействия на них половыми гормонами. The first approach is to change the sex ratio in the offspring of fish by means of exposure to sex hormones. Второй подход включает манипуляции с геномами рыб, в том числе метод индуцированного гиногенеза. The second approach involves manipulating the genomes of fish, including the method of induced gynogenesis.

Известен способ получения однополо-женского потомства у осетровых рыб путем гормональной регуляции пола (Omoto H, Maebayashi M., Mitsuhashi E., Yoshitomi К., Adachi Sh., Yamauchi К. Effects of estradiol-17β and 17α-methyltestosterone on gonadal sex differentiation in the F 2 hybrid sturgeon, the bester // Fisheries Sciences. 2002. Vol.68. No 5. P.1047-1054). A method of producing same sex-female progeny sturgeon by regulation of sex hormone (Omoto H, Maebayashi M., Mitsuhashi E., Yoshitomi K., Adachi Sh., Yamauchi K. Effects of estradiol-17β and 17α-methyltestosterone on gonadal sex differentiation in the F 2 hybrid sturgeon, the bester // Fisheries Sciences . 2002. Vol.68. No 5. P.1047-1054). Способ заключается в том, что в определенный период развития на рыб воздействуют женскими половыми гормонами - эстрогенами. The method consists in the fact that in a certain period of development on fish affect female hormones - estrogen. Такое воздействие приводит к феминизации самцов, т.е. Such exposure leads to male feminization, i.e. развитию у них вместо семенников женских половых желез - яичников. the development of their testes instead of female gonads - ovaries. В известном способе молоди бестера (гибриды между белугой, Huso huso и стерлядью, Acipenser ruthenus) скармливали корм, содержащий женский половой гормон эстрадиол. In the known method fry bestera (hybrids between the white sturgeon, Huso huso and sturgeon, Acipenser ruthenus) were fed a diet containing female sex hormone estradiol. В результате было получено потомство, которое на 95% состояло из самок. The resulting offspring was obtained which consisted of 95% of the females. Недостатками способа являются: невозможность получения инверсии пола у всех особей; The disadvantages of the method are: the inability to obtain sex reversal in all individuals; угнетение репродуктивной функции у генотипических самок и возникновение самцов интерсексов (гермафродитов) под воздействием гормонов; inhibition of reproductive function in females and the emergence of genotypic male intersex (hermaphrodite) under the influence of hormones; кроме того, воздействию необходимо подвергать каждое новое поколение рыб. Moreover, the impact must be subjected to each new generation of fish. В связи с этим более перспективным представляется направление генетической регуляции пола. In this regard, more promising direction of the genetic regulation of the floor.

Наиболее близким аналогом заявленного изобретения является способ получения однополо-женского потомства американского веслоноса, Polyodon spatula, относящегося к семейству Веслоносы, отряду Осетрообразные (Mims S. Aquaculture of paddlefish in the United States // Aquat. Living Resour. 2001. Vol 14. P.391-398). The closest analog of the claimed invention is a process for preparing same-sex-female offspring American paddlefish, Polyodon spatula, belonging to the family paddlefish, detachment sturgeon (Mims S. Aquaculture of paddlefish in the United States // Aquat. Living Resour. 2001. Vol 14. P. 391-398).

Известный способ включает в себя три этапа: индукцию гиногенетического развития эмбрионов путем оплодотворения яйцеклеток генетически инактивированной спермой, гормональную инверсию пола полученных гиногенетических самок и скрещивание самцов-инверсантов с обычными самками для получения однополо-женского потомства. The known method comprises three stages: induction of gynogenetic embryos by fertilization genetically inactivated sperm sex hormone derived inversion gynogenetic mating male and female-female inversantov conventional for unisex-female offspring.

Индукцию гиногенетического развития эмбрионов у веслоноса проводили с помощью активации яйцеклеток УФ-облученной гетерологичной спермой с последующей диплоидизацией эмбрионов тепловым шоком, который способствовал возвращению второго направительного тельца. Induction of gynogenetic embryos have paddlefish performed by activating oocytes UV irradiated heterologous sperm diploidization embryos followed by heat shock, which contributed to the return of the guide of the second cells. Затем гиногенетическим особям в возрасте 20 недель были имплантированы полунепроницаемые капсулы, содержащие метилтестостерон. Then gynogenetic individuals aged 20 weeks were implanted semipermeable capsules containing methyltestosterone. Все гиногенетические особи, не подвергавшиеся гормональному воздействию, оказались самками. All gynogenetic individuals not exposed to hormonal influences, were females. Около 90% генотипических самок были инвертированы в самцов. About 90% of genotypic females to males were inverted. В настоящее время выращивается потомство от скрещивания самцов-инверсантов с обычными самками. Currently grown offspring from the mating-inversantov males with normal females. Есть все основания полагать, что это потомство будет состоять только из самок. There is every reason to believe that the offspring will consist only of females.

Данный метод получения однополо-женского потомства может быть реализован только у видов рыб с женской гомогаметностью (в генотипе самки имеются две одинаковые половые хромосомы - XX) и мужской гетерогаметностью (в генотипе самцов имеются две разные половые хромосомы - Х и Y). This method of obtaining same-sex-female offspring can be realized only in fish species with female homogametic (in the female genotype have two identical sex chromosomes - XX) and men heterogamety (in genotype males have two different sex chromosomes - X and Y).

Механизм получения однополо-женского потомства известным способом заключается в следующем. A mechanism for obtaining unisexual-female offspring known manner is as follows.

Индуцированный гиногенез - это метод, при котором получают потомство, развитие которого осуществляется только за счет хромосомного набора яйцеклетки. Gynogenesis induced - a technique in which are the offspring of, the development of which is carried out only by the chromosomes of the egg. Для исключения из развития мужского набора хромосом сперматозоиды подвергают генетической инактивации с помощью ионизирующего или ультрафиолетового облучения. To exclude from the development of the male set of chromosomes of the sperm to undergo genetic inactivation by ionizing and ultraviolet radiation. Облученные сперматозоиды лишь активируют яйцеклетки к развитию, но их хромосомные наборы в развитии гиногенетических зародышей не участвуют. Irradiated sperm activates the egg only to development, but their chromosome sets in the development gynogenetic embryos are not involved.

Гиногенетические зародыши имеют гаплоидный набор хромосом - редуцированное в процессе мейоза количество аутосом и одну Х хромосому. Gynogenetic embryos have a haploid set of chromosomes - the reduced during meiosis number of autosomes and one X chromosome. Гаплоиды у рыб не могут нормально развиваться и погибают в ходе эмбриогенеза или вскоре после вылупления предличинок. Haploid fish can not develop normally and die during embryogenesis or shortly after hatching prelarvae. Диплоидизацию гиногенетических гаплоидов проводят с помощью подавления второго деления мейоза, подвергая ранних зародышей температурному шоку, который вызывает объединение гаплоидных хромосомных наборов яйцеклетки и второго направительного тельца. Diploidization gynogenetic haploids performed via suppression of the second meiotic division by subjecting early embryos thermal shock, which causes association haploid chromosome set of the guide and a second egg cells. При этом восстанавливается диплоидный набор аутосом и половых хромосом. This restores the diploid set of autosomes and sex chromosomes. Поскольку при женской гомогаметности половые хромосомы одинаковые, все гиногенетические диплоидные особи имеют одинаковый набор половых хромосом - XX. Since the female homogametic sex chromosomes are the same, all gynogenetic diploid individuals have the same set of sex chromosomes - XX. Таким образом, у видов рыб с женской гомогаметностью диплоидное гиногенетическое потомство представлено только самками (XX). Thus, the species of fish with female homogametic gynogenetic diploid offspring represented only by females (XX). Однако при диплоидизации за счет объединения двух дочерних наборов хромосом почти все гены гиногенетических особей переходят в гомозиготное состояние, что проявляется в значительном снижении жизнеспособности и плодовитости гиногенетических рыб (инбредная депрессия). However, when diploidization by combining the two sets of daughter chromosomes almost all genes in the moving gynogenetic individuals homozygous state, resulting in a significant reduction in the viability and fertility of gynogenetic fish (inbreeding depression). Многие самки оказываются полностью стерильными, а фертильные продуцируют небольшое количество икры. Many females are completely sterile and fertile produce a small amount of caviar. Для икряного рыбоводства гиногенетические самки непригодны. For roe fishery gynogenetic female unsuitable. Поэтому гиногенетическое потомство, состоящее из самок, используют для превращения их в самцов, подвергая воздействию мужских половых гормонов, андрогенов. Therefore gynogenetic offspring consisting of females, is used to convert them to the males by exposing the male sex hormones, androgens. При этом происходит маскулинизация самок - у них вместо яичников развиваются семенники. Thus there is a masculinization of the female - they develop ovaries instead of testes. Отличие таких самцов-инверсантов XX от обычных самцов XY состоит в том, что все продуцируемые ими сперматозоиды имеют только половую хромосому X. Самцов-инверсантов XX используют для скрещивания с обычными самками XX и получают потомство, представленное только самками. Unlike such male-inversantov XX by conventional XY males it is that all the produced spermatozoa they have only Male sex chromosome X. inversantov-XX are used for crossing with conventional female XX to yield progeny represented only females. Однополо-женское потомство, полученное в этом случае, имеет уже нормальный уровень гетерозиготности и, следовательно, нормальную жизнеспособность и плодовитость. Unisexual-female offspring obtained in this case, has been the normal level of heterozygosity and therefore normal viability and fertility.

К недостаткам данного метода следует отнести его трудоемкость и необходимость применять к зародышам и рыбам множество воздействий (температурный шок, гормональная обработка). The disadvantages of this method are its complexity and the need to apply a plurality of fish embryos and influences (temperature shock, hormone treatment).

Существенное ограничение на данный метод накладывает то обстоятельство, что он применим только к видам рыб, имеющим женскую гомогаметность. Significant limitation on this method imposes the fact that it applies only to the species of fish that have female homogametic. Между тем пол у многих видов рыб определяется другим механизмом. Meanwhile, the floor in many species of fish is determined by a different mechanism. Самки таких видов имеют не одинаковые, а разные половые хромосомы (W и Z), а самцы - наоборот, одинаковые (ZZ). Females of these species are not the same and different sex chromosomes (W and Z), and males - on the contrary, the same (ZZ). Женская гетерогаметность WZ приводит к тому, что диплоидное гиногенетическое потомство состоит из рыб с разными половыми генотипами: WZ - самки, ZZ - самцы и WW. Women heterogamety WZ leads to the fact that the diploid offspring gynogenetic consists of fish with different sex genotypes: WZ - female, ZZ - males and WW. Пол рыб с генотипом WW пока достоверно неизвестен. Gender fish with genotype WW until fairly unknown. Разнородность полового состава гиногенетического потомства не позволяет использовать его для получения однополо-женского потомства известным способом. Heterogeneity gynogenetic sex ratio of offspring does not allow it to get same-sex-female offspring in a known manner.

Американский веслонос, имеющий женскую гомогаметность, принадлежит к семейству Polyodontidae, а все остальные осетровые рыбы - продуценты черной икры (белуга, севрюга, осетры) - к семейству Acipenseridae. American paddlefish having female homogametic, belongs to the family Polyodontidae, and all other sturgeon - producers of caviar (sturgeon, sturgeon, sturgeon) - to Acipenseridae family. Показано, что один из представителей семейства Acipenseridae, белый осетр (Acipenser transmontanus), имеет женскую гетерогаметность (Van Eenennaam AL, Van Eenennaam JP, Medrano JF, Doroshov SI Evidence of female hetero-gametic genetic sex determination in white sturgeon // J. Hered. 1999b. V.90. P.231-233). It was shown that one of the representatives of the family Acipenseridae, white sturgeon (Acipenser transmontanus), has a female heterogamety (Van Eenennaam AL, Van Eenennaam JP, Medrano JF, Doroshov SI Evidence of female hetero-gametic genetic sex determination in white sturgeon // J. Hered . 1999b. V.90. P.231-233). Механизм определения пола у остальных видов осетровых рыб пока не изучен. The mechanism of sex determination in other species of sturgeon have not yet been studied.

Технический результат предлагаемого изобретения заключается в создании клонально размножающихся линий самок осетровых рыб, что позволяет получать однополо-женское потомство у рыб с любым механизмом определения пола, в том числе и тогда, когда механизм неизвестен, и дает возможность существенно сократить затраты при формировании маточного стада. The technical result of the invention is to establish a clonally propagated lines female sturgeon that produces same-sex-female offspring of fish with any mechanism of sex determination, including when the mechanism is unknown, and gives an opportunity to significantly reduce costs in the formation of broodstock.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе получения однополо-женского потомства у осетровых рыб, включающем индукцию гиногенетического развития эмбрионов путем оплодотворения яйцеклеток генетически инактивированной спермой, особенность заключается в том, что индукция гиногенетического развития применяется к яйцеклеткам самок гибридов филогенетически удаленных видов, способных продуцировать нередуцированные диплоидные яйцеклетки, генетически идентичные матери. Said technical result is achieved by the method for producing same sex-female progeny sturgeon comprising induction gynogenetic embryo development by fertilization genetically inactivated sperm feature is that induction gynogenetic development applied to the eggs of females hybrids phylogenetically remote species capable of producing unreduced diploid eggs are genetically identical to the mother.

Явление нередукции яйцеклеток известно у многих видов (естественных форм) рыб (Васильев В.П. Эволюционная кариология рыб. М.: Наука, 1985, 301 с.). The phenomenon is known nonreduction eggs in many species (natural forms), fish (Vasiliev VP Evolutionary Karyology fish. M .: Science, 1985, 301 pp.). Все эти формы имеют гибридное происхождение. All of these forms have a hybrid origin. Размножаются такие формы с помощью естественного гиногенеза, т.е. Multiply such forms by natural gynogenesis, i.e. в их яйцеклетках имеется возникший в ходе эволюции специальный цитоплазматический механизм, который исключает мужской набор хромосом из развития. in their egg cells has arisen in the course of evolution cytoplasmic special mechanism which cancels the male set of chromosomes from the development. Диплоидность яйцеклеток обусловливает нормальное развитие гиногенетических особей. Diploid oocytes causes the normal development of gynogenetic individuals.

Диплоидность яйцеклеток у естественных гибридов и их гиногенетических потомков обусловлена особой трансформацией мейоза, которая заключается в том, что еще до начала первого мейотического деления в хромосомах протекает дополнительная репликация ДНК (эндоредупликация), в результате чего число хромосом удваивается. Diploid oocytes from natural hybrids and their descendants gynogenetic due singular transformation meiosis, which consists in the fact that before the beginning of the first meiotic division additional DNA replication occurs in the chromosomes (endoreduplication), thereby doubling the number of chromosomes. В связи с этим в первом делении мейоза конъюгация и рекомбинация протекают не между гомологичными, а генетически идентичными сестринскими хромосомами. In this regard, in the first meiotic division conjugation and recombination do not occur between the homologous and genetically identical sister chromosomes. Кроме диплоидности генетическим следствием такой трансформации мейоза является то, что все созревшие яйцеклетки изогенны и тождественны генотипу матери. Besides diploid genetic consequence of this transformation of meiosis it is that all ripe ova are isogenic, and are identical genotype mother. Этим они отличаются от обычных рыб, мейотическая рекомбинация у которых приводит к генетическому разнообразию (изменчивости) продуцируемых яйцеклеток. In this they differ from the usual fish, meiotic recombination in which leads to genetic diversity (variability) produced eggs. Явление нередукции яйцеклеток возникает не у всяких гибридов, а только в случае определенной (не слишком большой и не слишком малой) филогенетической удаленности видов, составляющих гибридную комбинацию. Phenomenon nonreduction eggs does not occur in any of hybrids, but only in the case of a certain (not too big and not too small), the phylogenetic distance of species that make up the hybrid combination.

Изогенность яйцеклеток, их тождественность материнскому генотипу и наличие у них механизма инактивации хромосомного набора спермия (естественный гиногенез) приводит к тому, что все особи, развивающиеся из таких яйцеклеток, представляют собой своеобразный клон, воспроизводящий генотип матери, т.е. Isogenic eggs, their identity maternal genotype and that they have a mechanism for the inactivation of chromosomes of the sperm (natural gynogenesis) leads to the fact that all the individuals developing from such eggs are a kind of clone that plays the mother genotype, ie, имеет место клональное наследование. there is a clonal inheritance. Поэтому этот клон состоит только из самок и является, таким образом, однополо-женским. Therefore this clone consists only of females and is, therefore, same-sex-female. Половой состав потомства в этом случае не зависит от женской гомо- или гетерогаметности. Sexual progeny composition in this case is independent of the female homo- or heterogametic.

Предварительными исследованиями установлено, что некоторые искусственные гибриды филогенетически удаленных видов осетровых рыб также способны к аналогичной трансформации мейоза, при котором гибридные самки с большей или меньшей частотой продуцируют нередуцированные диплоидные яйцеклетки, генетически идентичные матери. Preliminary studies established that some artificial hybrids phylogenetically remote species of sturgeon are also capable of similar transformation meiosis, whereby hybrid females with greater or lesser frequency produce unreduced diploid egg cell genetically identical to the mother. Поэтому в заявляемом способе получения однополо-женского потомства у осетровых рыб индукция гиногенетического развития применяется к яйцеклеткам самок гибридов филогенетически удаленных видов. Therefore, the claimed method for producing same-sex-female offspring in sturgeons induction gynogenetic development applied to the eggs of females hybrids phylogenetically distant species. При осеменении таких яйцеклеток генетически инактивированной (облученной) спермой полученное потомство представляет собой тождественный матери клон, а следовательно, все рыбы в потомстве являются самками. When such egg insemination genetically inactivated (irradiated) sperm obtained offspring is a clone identity mother and, hence, all the fish in the offspring are females.

Таким образом, заявляемый способ позволяет получить клонально размножающиеся линии самок осетровых рыб независимо от механизма определения пола. Thus, the claimed method allows to obtain the line clonally propagated sturgeon females regardless of sex determination mechanism. Это дает возможность формирования маточного стада, состоящего из одних самок, с целью дальнейшего массового получения осетровой икры. This enables formation of broodstock consisting of some females to achieve further mass production of caviar. При этом отпадает необходимость идентификации пола, применения к зародышам и рыбам таких воздействий, как температурный шок, гормональная обработка, и сокращаются затраты на выращивание самцов. This eliminates the need to identify sex, application to the fish embryos, and such effects as thermal shock, hormone processing, and reduced costs for growing males. Получение именно клонально размножающихся линий самок имеет еще и то преимущество, что при клонировании первого поколения гибридов все последующие поколения генетически идентичны первому, сохраняя его рыбохозяйственные показатели, тогда как обычно гибриды осетровых наиболее продуктивны в первом поколении, а в последующих поколениях их продуктивность снижается. Getting it is clonally propagated female line also has the advantage that during the cloning of the first generation hybrids all future generations of genetically identical to the first, while maintaining its fisheries indicators, while generally hybrids of sturgeon are the most productive in the first generation and subsequent generations of their productivity is reduced. Кроме того, при использовании предлагаемого способа решается проблема биобезопасности, т.к. Furthermore, when using the proposed method is solved biosafety issue, since в случае попадания клональных гибридных самок в естественные водоемы и их скрещиваний с близкими чистыми видами потомство окажется триплоидным и поэтому стерильным. in case of contact with clonal hybrid females in natural water bodies and their crosses with similar kinds of pure offspring will triploid and thus sterile.

Таким образом, совокупность отличительных признаков обеспечивает достижение указанного технического результата. Thus, the set of distinctive features achieves said technical result.

В результате проведения анализа уровня техники не обнаружены аналоги, характеризующиеся признаками, тождественными всем существенным признакам заявленного изобретения. As a result of the analysis of the prior art analogs do not detected, characterized by the features identical to all essential features of the claimed invention. Следовательно, заявленное изобретение соответствует условию «новизна». Therefore, the claimed invention meets the "novelty" condition.

Новая совокупность признаков обеспечивает достижение нового технического результата и не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, поскольку никогда ранее у осетровых рыб и в целом у позвоночных животных не было искусственно получено однополо-женское потомство путем клонирования самок с неизвестным механизмом определения пола. The new combination of features provides a new technical result achievement and does not flow to the skilled explicitly in the prior art, since never before have sturgeon and unisexual-female offspring was artificially prepared in general vertebrates by cloning females with unknown mechanism of sex determination. Таким образом, заявленное изобретение соответствует условию «изобретательский уровень». Thus, the claimed invention meets the condition of "inventive level".

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения с получением указанного технического результата. DETAILED DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS to obtain the technical result.

Способ осуществляют следующим образом. The process is carried out as follows.

Получают гибриды осетровых рыб филогенетически отдаленных видов, самки которых способны продуцировать диплоидные нередуцированные яйцеклетки. Get hybrid sturgeon phylogenetically distant species, females are capable of producing diploid unreduced egg. При этом выбирают таких гибридных самок, икра которых крупнее, чем обычная (диплоидные яйцеклетки крупнее гаплоидных), или же состоит из смеси крупных (диплоидных) и мелких (гаплоидных) яйцеклеток. When this is selected such hybrid females eggs which are larger than normal (diploid oocyte larger haploid) or consists of a mixture of coarse (diploid) and small (haploid) eggs. Облучают спермии одного из родительских видов или самца гибрида ионизирующей или УФ-радиацией в дозе, вызывающей полную генетическую инактивацию всех спермиев. Irradiated sperm of one of the parental species or hybrid male of ionizing or UV radiation in a dose producing complete genetic inactivation of sperm. Осеменяют яйцеклетки гибридов облученной спермой. Inseminated egg hybrids irradiated sperm. При этом происходит индукция гиногенетического развития эмбрионов. This is accompanied by the induction of gynogenetic embryo development. Применения температурного шока для диплоидизации гиногенетических гаплоидных зародышей не требуется, так как яйцеклетки, в которых произошла премейотическая эндоредупликация хромосом, уже диплоидны. thermal shock application for diploidization gynogenetic haploid embryos is not required, since the egg, which occurred premeiotic endoreduplication of chromosomes already diploid. Подавляющее большинство гиногенетических эмбрионов, развивающихся из редуцированных яйцеклеток, останутся гаплоидами и погибнут. The vast majority of gynogenetic embryos developing from reduced egg cells remain haploids and perish. Таким образом, по выходу жизнеспособных гиногенетических личинок можно судить о частоте эндоредупликации у данной гибридной комбинации и у данной гибридной самки. Thus, the output of viable larvae gynogenetic can judge the frequency endoreduplication in this hybrid combination and this hybrid females.

Диплоидные жизнеспособные гиногенетические личинки могут возникнуть двумя путями: за счет спонтанного подавления второго деления мейоза или за счет диплоидности яйцеклеток, обусловленной эндоредупликацией ДНК. Diploid gynogenetic viable larvae can occur in two ways: the spontaneous suppression of the second meiotic division or by ova diploidy caused DNA endoreduplication. Доказано, что частота появления личинок за счет спонтанного подавления второго деления мейоза у осетровых рыб очень мала и составляет около 0.1% (Рекубратский А.В., Грунина А.С., Барминцев В.А., Голованова Т.С., Чудинов О.С., Абрамова А.Б., Панченко Н.С., Купченко С.А. Мейотический гиногенез у севрюги, русского осетра и стерляди // Онтогенез. 2003. Т.32. №2. С.121-131). It is proved that the frequency of larvae due to spontaneous suppression of the second meiotic division sturgeon fish is very small and amounts to about 0.1% (Rekubratsky AV Grunina AS, Barmintsev VA, Golovanova TS, CHudinov O .With., Abramova AB, NS Panchenko, SA Kupchenko meiotic gynogenesis in stellate sturgeon, Russian sturgeon and sterlet // Developmental Biology. 2003 T.32. №2. S.121-131). Эти личинки не будут изогенными и могут отличаться от самки по индивидуальным генетическим характеристикам. These larvae are not isogenic and may differ from females by individual genetic characteristics. Они могут развиться как в самок, так и самцов. They may develop in females and males. Личинки, возникшие за счет диплоидности яйцеклеток, обусловленной эндоредупликацией ДНК, представляют собой клон, генетически тождественный матери. Larvae that emerged due to the diploid eggs due to endoreduplication DNA clone are genetically identical mother. Из них могут развиться только самки. Only females can develop from them.

Выращивание и гиногенетическое воспроизводство гибридных самок, способных с большой частотой продуцировать диплоидные яйцеклетки, позволяет сформировать маточное стадо, от которого можно будет в промышленных масштабах получать однополо-женское потомство осетровых рыб. Cultivation and gynogenetic reproduction hybrid females, with a high frequency capable of producing diploid oocyte allows broodstock form, from which it will be possible on an industrial scale to obtain female offspring unisexual-sturgeon.

Пример осуществления способа. Example of the method.

Способ осуществлен на гибридах между белугой и стерлядью (гибрид бестер). A method performed on hybrids between white sturgeon and sturgeon (Bester hybrid). Бестеры получены уже довольно давно и используются в аквакультуре. Bester received for quite some time and are used in aquaculture. Выбор именно этого гибрида осетровых рыб сделан, исходя из данных о фертильности, плодовитости и размерах яйцеклеток бестеров, которые позволили предположить, что часть яйцеклеток, продуцируемых самками бестера, является диплоидной, т.е. The choice of this hybrid sturgeon is made on the basis of data on fertility, fecundity and egg size Bester, who suggested that part of the eggs produced by females Bester is diploid, that is, их хромосомный набор сформировался в результате премейотической эндоредупликации хромосом. their chromosome set was formed by premeiotic endoreduplication of chromosomes.

От 15 самок бестера, 5 самок стерляди и 2 самок белуги получили икру. 15 females Bester Sterlet 5 females and 2 females of beluga caviar received. Сперму получили от 5 самцов бестера и смешали ее. Sperm obtained from the 5 males Bester and mixed it. Из икры, полученной от каждой самки, отобрали равные порции, которые использовали в эксперименте для постановки скрещиваний. From eggs produced by each female, selected equal portions which were used in the experiment to arm crosses. У всех самцов и самок после получения гамет были взяты и зафиксированы в 96% этаноле фрагменты плавника для проведения последующего молекулярно-генетического анализа. All males and females after receiving gametes were taken and fixed in 96% ethanol fin fragments for subsequent molecular genetic analysis. Часть спермы обучили коротковолновым УФ-светом в течение 7 мин. Part sperm trained shortwave UV light for 7 min. Предварительными исследованиями установлено, что такая процедура вызывает полную генетическую инактивацию спермиев, однако спермии после облучения сохраняют подвижность и способны активировать яйцеклетки к гиногенетическому развитию. Preliminary studies have found that such a procedure is complete genetic inactivation of sperm, but the sperm cells after irradiation retain mobility and are able to activate the egg to gynogenetic development.

С использованием икры каждой из самок были поставлены следующие скрещивания: With the use of eggs from each female following mating were delivered:

(1) самка бестера × самец бестера, осеменение нормальной спермой (контроль); (1) male female bestera × bestera, insemination sperm normal (control);

(2) самка бестера × самец бестера, осеменение облученной спермой; (2) female male bestera × bestera, insemination sperm irradiated;

(3) самка стерляди × самец бестера, нормальная сперма (контроль); (3) the female sterlets × bestera male, normal sperm (controls);

(4) самка стерляди × самец бестера, осеменение облученной спермой; (4) male female sterlets × bestera, insemination sperm irradiated;

(5) самка стерляди × самец бестера, осеменение облученной спермой, тепловой шок; (5) the female male sterlets × bestera, insemination sperm irradiated, heat shock;

(6) самка белуги × самец бестера, осеменение нормальной спермой (контроль); (6) female male Beluga × bestera, insemination sperm normal (control);

(7) самка белуги × самец бестера, осеменение облученной спермой. (7) the female sturgeon × bestera male, irradiated insemination sperm.

(8) самка белуги × самец бестера, осеменения облученной спермой, тепловой шок. (8) male female sturgeon × bestera, insemination sperm irradiated, heat shock.

Эмбрионов инкубировали в чашках Петри при температуре 20°С. The embryos were incubated in Petri dishes at 20 ° C. Через 5-10 мин после осеменения эмбрионов из скрещиваний 5 и 8 подвергали тепловому шоку при температуре 37°С продолжительностью 2,5 мин. After 5-10 min after insemination embryos from crosses of 5 and 8 was subjected to heat shock at 37 ° C for 2.5 minutes duration. Тепловой шок в этот момент развития подавляет у эмбрионов второе деление мейоза, обеспечивая тем самым восстановление диплоидности. Heat shock at this point of development in the embryo suppresses second division of meiosis, thereby ensuring the restoration of diploidy. Инкубация продолжалась 7 дней. Incubation continued for 7 days. Вылупление предличинок продолжалось 2 дня. Hatching prelarvae lasted 2 days. Переход личинок к активному питанию происходил через 6-9 дней после вылупления. The transition to active feeding of larvae occurred after 6-9 days after hatching.

В скрещиваниях получены следующие результаты. The following results were obtained in crosses.

Во всех скрещиваниях контрольных вариантов (1, 3, 6) получены нормальные предличинки (выход от числа оплодотворенной икры от 65 до 85%), большая часть которых (75-90%) и дальше развивалась нормально и приступила к активному питанию. In all embodiments of control crosses (1, 3, 6) received normal prelarvae (yield the number of fertilized eggs from 65 to 85%), most of which (75-90%), and further developed normally and started to actively feeding.

Почти все эмбрионы от скрещиваний, в которых икру стерляди и белуги осеменяли облученной спермой (варианты 4 и 7), развивались ненормально, они имели четкие признаки гаплоидного синдрома (искривление осевого скелета, оводнение перикарда, нитевидное сердце). Almost all the embryos from crosses in which sterlet and beluga caviar inseminated irradiated sperm (versions 4 and 7), developed abnormally, they had clear signs of haploid syndrome (curvature of the axial skeleton, hydration of the pericardium, heart filamentous). Все эмбрионы из скрещивания 7 погибли до вылупления. All embryos from crosses 7 died before hatching. Большая часть эмбрионов из варианта 4 также погибла до вылупления. Most of the embryos from the embodiment 4 is also lost before hatching. Всего среди вылупившихся предличинок (0-2% в разных скрещиваниях) найдены только 4 морфологически нормальных экземпляра (0.005%). Just hatched among prelarvae (0-2% in different crosses) found only 4 of morphologically normal copies (0.005%). Все уродливые предличинки погибли в течение нескольких дней после вылупления, еще до перехода на активное питание. All ugly prelarvae died within a few days after hatching, before the transition to active feeding. Две из четырех нормальных личинок приступили к активному питанию. Two of the four normal larvae started active feeding. Они могли возникнуть за счет спонтанного подавления второго деления мейоза в оплодотворенных яйцеклетках, что привело к восстановлению диплоидного статуса гиногенетических эмбрионов. They could be due to spontaneous suppression of the second meiotic division in a fertilized egg, which led to the restoration of the diploid status gynogenetic embryos.

В вариантах 5 и 8, в которых для диплоидизации гиногенетических гаплоидов стерляди и белуги с помощью подавления второго деления мейоза применяли тепловой шок, были получены нормальные диплоидные личинки (10-15%). In embodiments 5 and 8, in which normal diploid larvae (10-15%) were obtained for diploidization gynogenetic haploids and Beluga sterlets via suppression of the second meiotic division applied thermal shock.

В скрещиваниях варианта 2, в которых облученной спермой осеменили икру бестера, отмечено большое количество нормально развивающихся эмбрионов. In crosses of Embodiment 2 in which the exposed sperm inseminated eggs bestera, noted a large amount of normally developing embryos. Выход морфологически нормальных предличинок в разных скрещиваниях (икра разных самок) составил от 3 до 25%. Yield morphologically normal prelarvae in different crosses (roe different females) ranged from 3 to 25%. Большая часть из них (65-85%) приступила к активному питанию. Most of them (65-85%) has started active feeding.

Опытных (173 шт., вариант 2) и контрольных (50 шт., вариант 1) бестеров выращивали в аквариумах. Experienced (173 pcs., Version 2) and control (50 pcs., Variant 1) were grown in the aquariums Bester. Кроме того, выращивали по 30 шт. In addition, grown to 30 pieces. диплоидных гиногенетических особей стерляди (вариант 5) и белуги (вариант 8). gynogenetic diploid individuals sterlets (embodiment 5) and sturgeon (embodiment 8). В возрасте 2 месяцев у всех рыб были взяты фрагменты плавников для прижизненного молекулярно-генетического анализа. At the age of 2 months, all the fragments of fish fins were taken for in vivo molecular genetic analysis. Выделение ДНК из плавников молоди и их родителей проводили стандартным методом. Isolation of DNA from juvenile fins and their parents was performed by the standard method. Исследовали RAPD-спектры тотальной ДНК и полиморфизм микросателлитных последовательностей (4 локуса). We investigated RAPD-spectra of total DNA and sequences of microsatellite polymorphism (4 locus).

Анализ показал, что ДНК контрольных рыб (вариант 1) содержала аллели микросателлитных локусов, имевшихся как у матерей, так и отцов, а их RAPD-спектры представляли собой комбинацию полос, характерных для обоих родителей. Analysis showed that the control fish DNA (version 1) contained microsatellite loci alleles that existed both mothers and fathers and their RAPD-spectra represented by a combination of bands characteristic of both parents. Таким образом, в данном варианте наблюдалась картина, которая имеет место при обычном скрещивании. Thus, in this embodiment, the observed pattern, that occurs in conventional breeding.

Частота гомозигот по микросателлитным локусам среди гиногенетических особей стерляди и белуги (варианты 5 и 8) была значительно выше, чем в контроле. The frequency of microsatellite loci homozygous individuals among gynogenetic sterlets and sturgeon (embodiments 5 and 8) was significantly higher than in controls. Гиногенетические особи различались между собой, а также отличались от матерей как по наборам микросателлитных аллелей, так и по RAPD-спектрам. Gynogenetic specimens differed, and differed from mothers both sets of microsatellite alleles, and by RAPD-spectra. Генетические различия в гиногенетическом потомстве чистых видов вызваны расхождением в разные половые клетки гомологичных хромосом и рекомбинацией хромосом в процессе мейоза. Genetic differences in gynogenetic offspring pure species caused by discrepancies in the various germ cells homologous chromosomes and recombination of chromosomes during meiosis.

В опытном варианте (2) большая часть особей (80-90%) идентична по исследованным показателям и не отличается от своих матерей, т.е. In an experimental embodiment (2) most of the animals (80-90%) is identical in the investigated parameters and does not differ from their mothers, i.e. они могут быть идентифицированы как материнские клоны. they can be identified as the parent clones. Эта ситуация могла возникнуть только в том случае, если часть яйцеклеток самок бестера была диплоидной вследствие эндоредупликации ДНК в раннем мейозе. This situation could arise only in the case of the eggs of females Bester was due diploid DNA endoreduplication in early meiosis. Все такие рыбы могут быть только самками. All of these fish can be only females. Выявленные генетические различия у небольшой части опытных рыб могут быть вызваны изменениями при эндоредупликации ДНК, а также мутациями. Identified genetic differences in a small proportion of experienced fish can be caused when endoreduplication DNA changes and mutations. Самки бестера, у которых наблюдался наибольший выход гиногенетических диплоидных предличинок, были отобраны для дальнейшего воспроизводства с целью формирования маточного стада, от которого можно будет в промышленных масштабах получать однополо-женское потомство осетровых рыб. Females bestera in which the highest yield was observed gynogenetic diploid prelarvae were selected for further reproduction for the purpose of forming the broodstock, from which it will be possible on an industrial scale to obtain female offspring unisexual-sturgeon.

Таким образом, заявляемый способ позволяет получить клонально размножающиеся линии самок осетровых рыб (однополо-женское потомство) независимо от механизма определения пола и тем самым сократить материальные затраты при формировании маточного стада. Thus, the claimed method allows to obtain the line clonally reproducing females sturgeon (unisexual-female offspring) regardless of sex determination mechanism and thereby reduce the material costs in forming the broodstock. Аналогичным способом однополо-женское потомство может быть получено не только у бестера, но и у гибридов между другими видами осетровых рыб при условии, что эти гибриды способны продуцировать нередуцированные гаметы, генетически идентичные материнскому генотипу. In a similar manner unisexual-female offspring it can be obtained not only bestera but hybrids between other species of sturgeon, provided that these hybrids produce unreduced gametes capable of genetically identical to the maternal genotype.

Изложенные выше сведения свидетельствуют о том, что способ получения однополо-женского потомства осетровых рыб по заявленному изобретению относится к геномной инженерии в области рыбоводства и, в частности, направлен на решение проблемы регуляции пола у осетровых рыб. The above data indicate that the method for producing same-sex-female offspring sturgeon according to the claimed invention relates to the genomic engineering in the field of fisheries and, in particular, aims to address gender issues in the regulation of sturgeon. Для заявленного способа в том виде, как он охарактеризован в изложенной формуле изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке средств и методов. For the declared method in the form as it is characterized in the claims set forth, it confirmed the possibility of using the means described in the application and methods. Следовательно, заявленное изобретение соответствует условию "промышленная применимость". Therefore, the claimed invention meets the condition of "industrial applicability".

Claims (1)

  1. Способ получения однополо-женского потомства у осетровых рыб, включающий индукцию гиногенетического развития эмбрионов путем оплодотворения яйцеклеток генетически инактивированной спермой, отличающийся тем, что индукция гиногенетического развития применяется к яйцеклеткам самок гибридов филогенетически удаленных видов, способных продуцировать нередуцированные диплоидные яйцеклетки, генетически идентичные матери. A process for preparing same-sex-female progeny sturgeon comprising gynogenetic induction of embryo development by fertilization of oocytes by sperm genetically inactivated, characterized in that the induction gynogenetic applied to the eggs of females hybrids phylogenetically remote species capable of producing unreduced diploid egg cell genetically identical to the mother.
RU2005139936A 2005-12-21 2005-12-21 Method for obtaining unisexual female offspring in sturgeon fish RU2312495C2 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2005139936A RU2312495C2 (en) 2005-12-21 2005-12-21 Method for obtaining unisexual female offspring in sturgeon fish

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2005139936A RU2312495C2 (en) 2005-12-21 2005-12-21 Method for obtaining unisexual female offspring in sturgeon fish

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2005139936A true RU2005139936A (en) 2007-06-27
RU2312495C2 true RU2312495C2 (en) 2007-12-20

Family

ID=38315166

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2005139936A RU2312495C2 (en) 2005-12-21 2005-12-21 Method for obtaining unisexual female offspring in sturgeon fish

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2312495C2 (en)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104145854A (en) * 2014-07-11 2014-11-19 中国长江三峡集团公司 Method for using frozen Chinese sturgeon sperms to perform wet insemination
RU2632649C2 (en) * 2015-09-21 2017-10-06 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт пресноводного рыбного хозяйства" ФГБНУ "ВНИИПРХ" Method of obtaining dna from fish ovicell

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MIMS S. Aquaculture of paddlefish in the United States, Aquat. Living Resour., 2001, v.14, p.391-398. OMOTO H. et al. Effects of estradiol-17β and 17α-methyltestosterone on gonadal sex differentiation in the F 2 hybrid sturgeon, the bester. Fisheries Sciences, 2002, v.68, no.5, p.1047-1054. *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104145854A (en) * 2014-07-11 2014-11-19 中国长江三峡集团公司 Method for using frozen Chinese sturgeon sperms to perform wet insemination
CN104145854B (en) * 2014-07-11 2016-05-04 中国长江三峡集团公司 A method of using a wet sturgeon semen insemination
RU2632649C2 (en) * 2015-09-21 2017-10-06 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт пресноводного рыбного хозяйства" ФГБНУ "ВНИИПРХ" Method of obtaining dna from fish ovicell

Also Published As

Publication number Publication date Type
RU2005139936A (en) 2007-06-27 application

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Morris The XO and OY chromosome constitutions in the mouse
Reatty Parthenogenesis in vertebrates
Thorgaard et al. Polyploidy induced by heat shock in rainbow trout
Yamamoto Artificially induced sex‐reversal in genotypic males of the medaka (Oryzias latipes)
Wells et al. The health of somatic cell cloned cattle and their offspring
Piferrer Endocrine sex control strategies for the feminization of teleost fish
Li et al. Cloned ferrets produced by somatic cell nuclear transfer
Nagy et al. Investigation on carp, Cyprinus carpio L. gynogenesis
Fishback et al. Estimates of genetic parameters and genotype by environment interactions for growth traits of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) as inferred using molecular pedigrees
Stanley et al. Growth of American oysters increased by polyploidy induced by blocking meiosis I but not meiosis II
Benzie Penaeid genetics and biotechnology
Kjørsvik et al. Egg and larval quality criteria as predictive measures for juvenile production in turbot (Scophthalmus maximus L.)
Thorgaard et al. Adult triploids in a rainbow trout family
Yamamoto Studies on sex-manipulation and production of cloned populations in hirame, Paralichthys olivaceus (Temminck et Schlegel)
Jalabert Particularities of reproduction and oogenesis in teleost fish compared to mammals
Scheerer et al. Genetic analysis of androgenetic rainbow trout
Sekino et al. Microsatellite-based pedigree tracing in a Japanese flounder Paralichthys olivaceus hatchery strain: implications for hatchery management related to stock enhancement program
Arai Genetic improvement of aquaculture finfish species by chromosome manipulation techniques in Japan
Corley-Smith et al. Production of androgenetic zebrafish (Danio rerio)
Donaldson et al. Sex control in fish with particular reference to salmonids
Venge Studies of the maternal influence on the birth weight in rabbits
Hussain et al. Genetic improvement and conservation of carp species in Bangladesh
Maestripieri et al. Maternal effects in mammals
Refstie et al. Induction of polyploidy in salmonids by cytochalasin B
Suzuki et al. Survival, growth and fertility of gynogenetic diploids induced in the cyprinid loach, Misgurnus anguillicaudatus

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20071222