RU2303603C2 - Способ получения гептапептида и промежуточные соединения для его получения - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к способу получения гептапептида формулы: Н-Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro-OH, обладающего психостимулирующей активностью, и имеет своей целью упростить процесс, а также повысить выход целевого продукта. Сущность изобретения заключается в том, что синтез осуществляют путем конденсации С-концевого защищенного трипептида формулы: HCl·H-Pro-Gly-Pro-ОХ, где Х - защитная группа с N-концевым защищенным тетрапептидом формулы: Y-Thr-Lys(Y¹)-Pro-Arg-ОН, где Y и Y¹ - защитные группы, и полученный защищенный гептапептид формулы: Y-Thr-Lys(Y¹)-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro-OX обрабатывают деблокирующими агентами для удаления защитных групп и выделяют конечный продукт с помощью хроматографии. Также описываются трипептид формулы HCl·H-Pro-Gly-Pro-OBzl и тетрапептид формулы Вос-Thr-Lys-(Boc)-Pro-Arg-OH в качестве промежуточных соединений для синтеза гептапептида формулы: H-Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro-OH. 3 н. и 1 з.п. ф-лы.

Description

Изобретение относится к области фармацевтической химии, конкретно к новому способу получения гептапептида формулы:

H-Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro-OH

и промежуточным соединениям для его получения.

Этот гептапептид, обладающий психостимулирующей активностью, известен под названием селанк [1].

Известен способ получения селанка путем ступенчатого наращивания пептидной цепи, начиная с С-концевого защищенного трипептида-трифторацетата Н-Pro-Gly-Pro-OBzl с использованием N,N'-дициклогексилкарбодиимида с добавкой 1-оксибензотриазола, а также соответствующих пентафторфениловых эфиров защищенных аминокислот [2].

Недостатком известного способа получения селанка является низкий выход целевого продукта и необходимость защиты боковой гуанидиновой группы аргинина в процессе синтеза нитрогруппой, которая удаляется с большими трудностями и процесс ее удаления является весьма длительным.

Целью заявленного способа является упрощение процесса и повышение выхода конечного продукта

Поставленная цель достигается описываемым способом, согласно которому синтез гептапептида селанка осуществляют путем блочного наращивания пептидной цепи, начиная с С-концевого трипептида.

Список сокращений

АсОН - уксусная кислота

Boc - трет.-бутилоксикарбонил

Bzl - бензил

DCC - N,N'-дициклогексилкарбодиимид

DCHU - N,N'-дициклогексилмочевина

DMF - N,N-диметилформамид

EtOH - этанол

HOBt - 1-гидроксибензотриазол

HONp - пара-нитрофенол

HONSu - N-гидроксисукцинимид

HOPfp - пентафторфенол

MeOH - метанол

TFA - трифторуксусная кислота

Z - бензилоксикарбонил

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ТСХ - тонкослойная хроматография

Экспериментальная часть

В синтезе используют производные L-аминокислот фирмы Bachem (Швейцария), DCC, TFA, HOBt, HONSu, HONp и HOPfp фирмы Fluka (Швейцария). DMF очищают перегонкой над нингидрином и окисью бария. Аналитическую ВЭЖХ проводят на хроматографе фирмы Gilson (Франция).

ТСХ проводят на стеклянных хроматографических пластинках Merck-Kiselgel (ФРГ) в следующих системах растворителей:

А - хлороформ:метанол:АсОН 9:1:0.5

Б - хлороформ:метанол:32% АсОН 15:4:1

В - хлороформ:метанол:32% АсОН 5:3:1

Г - хлороформ:метанол:этилацетат 6:3:1

¹Н-ЯМР - спектры снимают на спектрометре WH-500 Bruker 500 МГц (ФРГ) в DMSO-d₆ при 300 К. Химические сдвиги (δ, м.д.) измеряют относительно тетраметилсилана. Масс-спектры регистрировали на масс-спектрометре Analytical Compact MALDI 4 фирмы Kratos (Великобритания).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Гидрохлорид бензилового эфира пролил-глицил-пролина

1.

4.1 г (55 ммоль) глицина растворяют в 55 мл 1 н. раствора NaOH, добавляют при охлаждении раствор 15.6 г (50 ммоль) Boc-Pro-ONSu в 100 мл DMF и перемешивают в течение 24 ч, контролируя протекание реакции с помощью ТСХ в системе Б. Раствор упаривают, остаток растворяют в воде, водный раствор экстрагируют эфиром (2×20 мл), подкисляют до рН 2-3 12 н. раствором HCl и экстрагируют смесью этилацетата с бутанолом в соотношении 2:1 (2×150 мл). Объединенные органические вытяжки промывают насыщенным раствором NaCl и водой до нейтральной реакции и упаривают. Остаток кристаллизуют из смеси эфир-гексан 1:1, отфильтровывают, сушат в вакууме. В итоге получают 11.6 г (85%) Ia с R_f 0.57 (A), 0.71 (Б), 0.86 (В).

2.

К раствору 9.0 г (44 ммоль) H-Pro-OBzl в 100 мл DMF, охлажденному до -10°С, прибавляют при интенсивном перемешивании охлажденный до той же температуры раствор 10.9 г (40 ммоль) Ia, 6.7 г (44 ммоль) HOBt и 9.2 г (44 ммоль) DCC в DMF. Реакционную смесь перемешивают 10 мин при -10°С и оставляют при комнатной температуре на 24 ч. Полноту конденсации контролируют с помощью ТСХ в системах (А) и (Г). По окончании реакции выпавший осадок DCHU отфильтровывают, фильтрат упаривают, остаток растворяют в этилацетате и промывают последовательно 2% H₂SO₄ (3×20 мл), водой, 2% раствором NaHCO₃, водой до нейтральной реакции. Раствор упаривают, остаток растирают с гексаном, отфильтровывают, сушат в вакууме. В итоге получают 17.1 г (93%) Iб с R_f 0.80 (A), 0.88 (Б), 0.50 (Г).

3.

6 г (13.1 ммоль) трипептида Iб растворяют в 3 н. растворе HCl в АсОН в течение 1 ч. Полноту деблокирования контролируют с помощью ТСХ в системе Б. Через 1 ч реакционную смесь упаривают в вакууме. Остаток растирают с сухим холодным эфиром, отфильтровывают, сушат в вакууме. В итоге получают 5.0 г (97%) I. Гомогенность полученного продукта подтверждают с помощью аналитической ВЭЖХ в условиях градиентного элюирования буфером Б в буфере А (А - 0.1% TFA, Б - 80% ацетонитрила в буфере А) от 10 до 70% буфера Б за 30 мин на колонке Ultrasphere ODS 4.6×250 мм, размер зерна 5 мкм, детекция при 220 нм. Чистота по данным ВЭЖХ 95%, R_t 17.5 мин (в указанных условиях). R_f 0.19 (А), 0.52 (Б), 0.76 (В). ¹Н-ЯМР-спектр (DMSO-d₆), δ, м.д.: 7.36 (аром. 5Н), 5.11 (CH₂-Ph, 2H);

Pro: 4.24 (α-CH, 1H); 2.32, 1.88 (β-СН₂, 2Н); 1.92 (γ-СН₂, 2Н); 3.58, 3.54 (δ-СН₂, 2Н);

Gly: 8.72 (NH, 1H); 4.11, 3.98 (α-СН₂, 2Н);

Pro: 4.39 (α-СН, 1H); 2.20, 1.86 (β-СН₂, 2Н); 1.92, 1.86 (γ-CH₂, 2H); 3.41, 3.25 (δ-СН₂, 2Н).

Пример 2. N^α-трет.-Бутилоксикарбонил-треонил-N^ε-трет.бутилоксикарбонил)-лизил-пролил-аргинин

К суспензии 8.1 г (46.4 ммоль) аргинина в 150 мл DMF приливают раствор 15.8 г (45.5 ммоль) Z-Pro-ONp в 100 мл DMF, перемешивают в течение 24 ч до полного растворения, контролируя ход реакции с помощью ТСХ в системе В. DMF упаривают, остаток растворяют в 100 мл хлороформа и хроматографируют на колонке (2.5×30 см) с силикагелем в хлороформе. Элюцию осуществляют ступенчато хлороформом (500 мл) и затем смесями хлороформа с EtOH в соотношениях 8:2, 1:1 и 2:8 (по 500 мл каждой). Фракции, содержащие целевой продукт, упаривают досуха, остаток растирают с эфиром, отфильтровывают и сушат. В итоге получают 18.2 г (99%) соединения IIa с R_f 0.05 (А), 0.20 (Б), 0.55 (В).

18.2 г (45.0 ммоль) IIa растворяют в 400 мл EtOH и гидрируют над 5% Pd/C до исчезновения исходного соединения по ТСХ в системе В. Затем катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают досуха, остаток растворяют в 200 мл DMF и добавляют раствор 22.6 г (45.0 ммоль) Z-Lys(Boc)-ONp в 200 мл DMF. Ход реакции контролируют с помощью ТСХ в системе В. Обработку реакционной смеси проводят так же, как и при получении соединения (IIa). В итоге получают 26.8 г (94%) IIб с R_f 0.15 (А), 0.30 (Б), 0.75 (В).

26.8 г (42.3 ммоль) IIб растворяют в 400 мл EtOH и гидрируют над 5% Pd/C до исчезновения исходного соединения по ТСХ в системе В. Затем катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают досуха, остаток растворяют в 200 мл DMF и добавляют 16.2 г (42.3 ммоль) Boc-Thr-OPfp в 200 мл DMF. Ход реакции контролируют с помощью ТСХ в системе В. Обработку реакционной смеси проводят так же, как и при получении соединения IIa. В итоге получают 25.6 г (86%) II с R_f 0.10 (А), 0.22 (Б), 0.62(В). Аминокислотный анализ: Thr 0.92 (1), Lys 1.00 (1), Arg 0.98 (1), Pro не определяли. ¹Н-ЯМР-спектр (DMSO-d₆, δ, м.д.): 1.38 (Boc, 9Н); 1.36 (Boc, 9Н);

Thr - 6.40 (NH, 1H); 3.87 (α-СН, 1Н); 3.87 (β-CH, 1H); 1.02 (γ-СН₃, 3Н);

Lys - 7.82 (N^αH, 1H); 6.71 (N^εH, 1H); 4.49 (α-СН, 1H); 1.62, 1.47 (β-СН₂, 2Н); 1.64, 1.49 (γ-CH₂, 2H); 1.30 (δ-СН₂, 2Н); 2.88 (ε-СН₂, 2Н);

Pro - 4.35 (α-СН, 1H); 2.04, 1.81 (β-CH₂, 2H); 1.82 (γ-СН₂, 2H); 3.53, 3.64 (δ-СН₂, 2H);

Arg - 8.12 (N^αН, 1H); 7.53 (N^GH, 1H); 4.17 (α-СН, 1Н); 1.61, 1.74 (β-СН₂, 2H); 1.52 (γ-CH₂, 2H); 3.11 (δ-СН₂, 2Н).

Пример 3. Треонил-лизил-пролил-аргинил-пролил-глицил-пролин (селанк)

8.5 г (12 ммоль) тетрапептида II и 4.8 г (12 ммоль) трипептида I смешивают в 50 мл DMF, добавляют 2.8 г (18 ммоль) HOBt, охлаждают до -10°С, при интенсивном перемешивании добавляют 3.8 г (18 ммоль) DCC и оставляют при -10°С на 1 ч, а затем перемешивают 24 ч при комнатной температуре. Ход конденсации контролируют с помощью ТСХ в системе Б. Выпавший осадок DCHU отфильтровывают, фильтрат концентрируют в вакууме до вязкого раствора, пептид осаждают сухим эфиром, отфильтровывают, сушат в вакуум-эксикаторе. В итоге получают 11.8 г (91%) IIIa с R_f 0.42 (А), 0.84 (Б), 0.92 (В).

.

11.8 г IIIa растворяют в TFA и выдерживают в течение 1 ч, затем реакционную массу упаривают, остаток растирают с холодным сухим эфиром, отфильтровывают и сушат в вакууме. В итоге получают 10.6 г (97%) IIIб с R_f 0.25 (Б), 0.57 (В).

(селанк).

10.6 г (9.8 ммоль) IIIб растворяют в 100 мл EtOH и гидрируют над 5% Pd/C до исчезновения исходного соединения по ТСХ в системе В. Катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают досуха, остаток осаждают сухим эфиром, отфильтровывают, сушат, растворяют в 70 мл 0.05 М пиридинацетатного буфера с рН 4.5 и наносят на колонку (2.6×45 см) с SP-сефадексом, уравновешенную этим же буфером. Пептиды элюируют линейным градиентом ионной силы от 0.05 до 1 М того же буфера. Фракции, содержащие целевой продукт (по данным ТСХ и ВЭЖХ), объединяют, упаривают досуха, затем еще дважды упаривают с добавленим воды. Остаток растворяют в 20-30 мл воды и прибавляют 200-300 мл изопропилового спирта. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают изопропиловым спиртом, эфиром, сушат, затем растворяют в деионизованной воде и лиофилизуют. В итоге получают 6.0 г (81%) III. Чистота продукта, определенная с помощью аналитической ВЭЖХ, составляет 98%, время удерживания R_t 10.9 мин. Колонка 4.6×250 мм Ultropac TSK ODS-120T, 5 мкм, детекция при 220 нм. Буфер А - 0.05 М КН₂PO₄, рН 3, буфер Б - 70% ацетонитрил в буфере А. Элюция градиентом концентрации буфера Б от 0 до 60% за 30 мин со скоростью потока 1 мл/мин.

Аминокислотный анализ: Thr 0.92 (1), Gly 1.00 (1), Lys 1.02 (1), Arg 0.98 (1), Pro не определяли. R_f 0.14 (B).

¹Н-ЯМР (DMSO-d₆, δ, м.д.):

Thr - 8.10 (NH, 1H); 3.57 (α-CH, 1H); 3.79 (β-СН, 1Н); 1.14 (γ-СН₃, 3Н);

Lys - 8.65 (N^αH, 1Н); 7.73 (NH⁺ ₃); 4.5 (α-CH, 1H); 1.67, 1.54 (β-CH₂, 2Н); 1.39 (γ-СН₂, 2Н); 1.56 (δ-СН₂, 2Н); 2.38 (ε-CH₂, 2H);

Pro - 4.36 (α-СН, 1H); 2.05, 1.78 (β-CH₂, 2H); 1.87 (γ-СН₂, 2H); 3.56, 3.65 (δ-СН₂, 2H);

Arg - 8.05 (N^αH, 1H); 7.58 (N^GH, 1H); 4.48 (α-CH, 1H); 1.72, 1.54 (β-СН₂, 2H); 1.56 (γ-CH₂, 2H); 3.10 (δ-СН₂, 2Н);

Pro: 4.40 (α-CH, 1H); 2.05, 1.89 (β-СН₂, 2H); 1.86 (γ-СН₂, 2H); 3.61, 3.54 (δ-СН₂, 2H);

Gly: 8.0 (NH, 1H); 4.02, 3.82 (СН₂, 2H);

Pro: 4.26 (α-CH, 1H); 2.14, 2.12 (β-СН₂, 2H); 1.90 (γ-СН₂, 2H); 3.48, 3.50 (δ-СН₂, 2H).

Масс-спектр, m/z: 751.9 (вычислено 751.89 для С₃₃Н₅₇N₁₁O₉).

Пример 4. Гидрохлорид трет.-бутилового эфира пролил-глицил-пролина

1.

19,5 г (260 ммоль) глицина растворяют в 260 мл 1 н. NaOH, полученный раствор добавляют к охлажденному до 0°С раствору 96,0 г (260 ммоль) Z-Pro-ONp в 600 мл DMF. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 16 часов, упаривают, остаток растворяют в 300 мл воды и трижды экстрагируют эфиром. Эфирный слой отделяют, к водному слою добавляют 150 мл 2 н. раствора HCl, выпавшее масло экстрагируют 600 мл этилацетатата. Органический слой отделяют и промывают водой до нейтральной реакции, сушат над Na₂SO₄, упаривают, остаток перекристаллизовывают из эфира. В итоге получают: 67,5 г (85%) продукта с Т. пл. 122-123°С; R_f 0,81 (Б), R_f 0,65 (Г).

2.

К раствору 45.7 г (220 ммоль) H-Pro-Obu^t HCl в 500 мл DMF, охлажденному до -10°С, прибавляют при интенсивном перемешивании охлажденный до той же температуры раствор 67.5 г (220 ммоль) IVa, 33.4 г (220 ммоль) HOBt и 45.3 г (220 ммоль) DCC в 100 мл DMF. Реакционную смесь перемешивают 10 мин при -10°С и оставляют при комнатной температуре на 24 ч. Полноту конденсации контролируют с помощью ТСХ в системах (А) и (Г). По окончании реакции выпавший осадок DCHU отфильтровывают, фильтрат упаривают, остаток растворяют в этилацетате (800 мл) и промывают последовательно 2% H₂SO₄ (3×250 мл), водой (3×250 мл), 2% раствором NaHCO₃ (3×250 мл), водой до нейтральной реакции. Раствор упаривают, остаток растирают с гексаном, отфильтровывают, сушат в вакууме. В итоге получают 90.9 г (90%) IVб, с R_f 0.82 (A), 0.91 (Б), 0.6 (Г).

3.

90.9 г (198 ммоль) IVб растворяют в 1000 мл EtOH и гидрируют над 5% Pd/C до исчезновения исходного соединения по ТСХ в системе Б. Затем катализатор отфильтровывают, к фильтрату добавляют 198 мл 1 н. водного раствора соляной кислоты и упаривают досуха, маслообразный остаток упаривают с изопропиловым спиртом, остаток обрабатывают эфиром. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают на фильтре эфиром и сушат. В итоге получают 68.1 г (95%) IV с R_f 0.15 (А), 0.45 (Б), 0.70 (В). Гомогенность полученного продукта также подтверждают с помощью аналитической ВЭЖХ в условиях градиентного элюирования буфером Б в буфере А (А - 0.1% TFA, Б - 80% ацетонитрила в буфере А) от 10 до 70% буфера Б за 30 мин на колонке Ultrasphere ODS 4.6×250 мм, размер зерна 5 мкм, детекция при 220 нм. Чистота по данным ВЭЖХ 96%, R_t 15.9 мин (в указанных условиях). ¹Н-ЯМР-спектр (DMSO-d₆). δ, м.д.:

Pro: 4.23 (α-CH, 1H); 2.32, 1.87 (β-СН₂, 2Н); 1.91 (γ-СН₂, 2Н); 3.58, 3.54 (δ-СН₂, 2Н);

Gly: 8.72 (NH, 1H); 4.11, 3.97 (α-CH₂, 2H);

Pro: 4.37 (α-CH, 1H); 2.22, 1.86 (β-CH₂, 2H); 1.92, 1.86 (γ-CH₂, 2H); 3.40, 3.25 (δ-СН₂, 2H).

Пример 5. N^α-трет.-Бензилоксикарбонил-треонил-N^ε-(трет.-бутилоксикарбонил)-лизил-пролил-аргинин

23.4 г (21.15 ммоль) IIб растворяют 400 мл EtOH и гидрируют над 5% Pd/C до исчезновения исходного соединения по ТСХ в системе В. Затем катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают досуха, остаток растворяют в 100 мл DMF и добавляют раствор 7.4 (21.15 ммоль) Z-Thr-ONSu в 100 мл DMF. Ход реакции контролируют с помощью ТСХ в системе В. Обработку реакционной смеси проводят так же, как и при получении соединения IIa. В итоге получают 13.1 г (84%) V с R_f 0.12 (А), 0.28 (Б), 0.67 (В). Аминокислотный анализ: Thr 0.90 (1), Lys 1.00 (1), Arg 1.00 (1), Pro не определяли. ¹Н-ЯМР-спектр (DMSO-d₆, δ, м.д.): 7.4-7.2 (аром.); 4.2 (-СН₂Ph, 2H); 1.38 (Boc, 9Н),

Thr - 6.41 (NH, 1H); 3.87 (α-CH, 1H); 3.87 (β-СН, 1H); 1.02 (γ-СН₃, 3Н),

Lys - 7.82 (N^αН, 1H); 6.71 (N^εH, 1H); 4.49 (α-CH, 1H); 1.62, 1.47 (β-CH₂, 2H); 1.64, 1.49 (γ-CH₂, 2H); 1.30 (δ-СН₂, 2H); 2.88 (ε-СН₂, 2Н),

Pro - 4.35 (α-CH, 1H); 2.04, 1.81 (β-СН₂, 2H); 1.82 (γ-CH₂, 2H); 3.53, 3.64 (δ-СН₂, 2H),

Arg - 8.12 (N^αН, 1H); 7.53 (N^GH, 1H); 4.17 (α-CH, 1H); 1.61, 1.74 (β-СН₂, 2Н); 1.52 (γ-СН₂, 2Н); 3.11 (δ-СН₂, 2Н).

Пример 6. Треонил-лизил-пролил-аргинил-пролил-глицил-пролин (селанк)

8.5 г (12 ммоль) тетрапептида II и 4.3 г (12 ммоль) трипептида IV смешивают в 50 мл DMF, добавляют 2.8 г (18 ммоль) HOBt, охлаждают до -10°С, при интенсивном перемешивании добавляют 3.8 г (18 ммоль) DCC и оставляют при -10°С на 1 ч, а затем перемешивают 24 ч при комнатной температуре. Ход конденсации контролируют с помощью ТСХ в системе Б. Выпавший осадок DCHU отфильтровывают, фильтрат концентрируют в вакууме до вязкого раствора, пептид осаждают сухим эфиром, отфильтровывают, сушат в вакуум-эксикаторе. В итоге получают 10.9 г (90%) VI с R_f 0.43 (А), 0.80 (Б), 0.94 (В).

(селанк).

10.9 г VI растворяют в TFA и выдерживают в течение 1 ч, затем реакционную массу упаривают, остаток растирают с холодным сухим эфиром, отфильтровывают и сушат в вакууме над щелочью. Полученный осадок растворяют в 50 мл 0.05 М пиридинацетатного буфера с рН 4.5 и хроматографируют на колонке (2.6×45 см) с SP-сефадексом, элюируя пептиды линейным градиентом ионной силы от 0.05 до 1 М того же буфера, как описано в примере 3. В итоге получают 6.3 г (85%) III. Чистота продукта, определенная с помощью аналитической ВЭЖХ, составляет 97.7%, время удерживания R_t 10.9 мин. Колонка 4.6×250 мм Ultropac TSK ODS-120T, 5 мкм, детекция при 220 нм. Буфер А - 0.05 М КН₂PO₄, рН 3, буфер Б - 70% ацетонитрил в буфере А. Элюция градиентом концентрации буфера Б от 0 до 60% за 30 мин со скоростью потока 1 мл/мин. Аминокислотный анализ: Thr 0.93 (1), Gly 1.00 (1), Lys 1.02 (1), Arg 0.99 (1), Pro не определяли. R_f 0.14 (B).

¹Н-ЯМР (DMSO-d₆, δ, м.д.):

Thr - 8.10 (NH, 1H); 3.57 (α-CH, 1H); 3.79 (β-СН, 1Н); 1.14 (γ-СН₃, 3Н),

Lys - 8.65 (N^αН, 1H); 7.73 (NH⁺ ₃); 4.5 (α-СН, 1H); 1.67, 1.54 (β-СН₂, 2Н); 1.39 (γ-СН₂, 2Н); 1.56 (δ-СН₂, 2Н); 2.38 (ε-CH₂, 2Н),

Pro - 4.36 (α-СН, 1H); 2.05, 1.78 (β-CH₂, 2Н); 1.87 (γ-СН₂, 2Н); 3.56, 3.65 (δ-СН₂, 2Н),

Arg - 8.05 (N^αН, 1H); 7.58 (N^GH, 1H); 4.48 (α-СН, 1H); 1.72, 1.54 (β-СН₂, 2Н); 1.56 (γ-СН₂, 2Н); 3.10 (δ-CH₂, 2H),

Pro: 4.40 (α-СН, 1H); 2.05, 1.89 (β-СН₂, 2H); 1.86 (γ-СН₂, 2H); 3.61, 3.54 (δ-СН₂, 2H);

Gly: 8.0 (NH, 1H); 4.02, 3.82 (СН₂, 2H);

Pro: 4.26 (α-СН, 1H); 2.14, 2.12 (β-СН₂, 2H); 1.90 (γ-СН₂, 2H); 3.48, 3.50 (δ-СН₂, 2H).

Масс-спектр, m/z: 751.9 (вычислено 751.89 для С₃₃Н₅₇N₁₁O₉).

Пример 7. Треонил-лизил-пролил-аргинил-пролил-глицил-пролин (селанк)

7.4 г (10 ммоль) тетрапептида V и 3.6 г (10 ммоль) трипептида IV смешивают в 50 мл DMF, добавляют 2.28 г (15 ммоль) HOBt, охлаждают до -10°С, при интенсивном перемешивании добавляют 3.1 г (15 ммоль) DCC и оставляют при -10°С на 1 ч, а затем перемешивают 24 ч при комнатной температуре. Ход конденсации контролируют с помощью ТСХ в системе Б. Выпавший осадок DCHU отфильтровывают, фильтрат концентрируют в вакууме до вязкого раствора, пептид осаждают сухим эфиром, отфильтровывают, сушат в вакуум-эксикаторе. В итоге получают 9.5 г (92%) VIIa с R_f 0.45 (А), 0.81 (Б), 0.95 (В).

9.5 г VIIa растворяют в TFA и выдерживают в течение 1 ч, затем реакционную массу упаривают, остаток растирают с холодным сухим эфиром, отфильтровывают и сушат в вакууме над щелочью. В итоге получают 10.0 г (97%) VIIб с R_f 0.45 (Б), 0.7 (В).

10.0 г соединения VIIб растворяют в 100 мл EtOH и гидрируют над 5% Pd/C до исчезновения исходного соединения по ТСХ в системе В. Катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают досуха, остаток осаждают сухим эфиром, отфильтровывают, сушат.

Полученный осадок растворяют в 50 мл 0.05 М пиридинацетатного буфера с рН 4,5 и хроматографируют на колонке (2.6×45 см) с SP-сефадексом, элюируя пептиды линейным градиентом ионной силы от 0.05 до 1 М того же буфера, как описано в примере 3. В итоге получают 6.1 г (82%) III. Чистота продукта, определенная с помощью аналитической ВЭЖХ, составляет 97.9%, время удерживания R_t 10.9 мин. Колонка 4.6×250 мм Ultropac TSK ODS-120T, 5 мкм, детекция при 220 нм. Буфер А - 0.05 М КН₂PO₄, рН 3, буфер Б - 70% ацетонитрил в буфере А. Элюция градиентом концентрации буфера Б от 0 до 60% за 30 мин со скоростью потока 1 мл/мин. Аминокислотный анализ: Thr 0.93 (1), Gly 1.00 (1), Lys 1.02 (1), Arg 1.00 (1), Pro не определяли. R_f 0.14 (B).

¹Н-ЯМР (DMSO-d₆, δ, м.д.):

Thr - 8.10 (NH, 1H); 3.57 (α-СН, 1Н); 3.79 (β-СН, 1Н); 1.14 (γ-СН₃, 3Н);

Lys - 8.65 (N^αH, 1H); 7.73 (NH⁺ ₃); 4.5 (α-СН, 1H); 1.67, 1.54 (β-СН₂, 2Н); 1.39 (γ-CH₂, 2H); 1.56 (δ-CH₂, 2H); 2.38 (ε-СН₂, 2H),

Pro - 4.36 (α-СН, 1H); 2.05, 1.78 (β-CH₂, 2H); 1.87 (γ-СН₂, 2H); 3.56, 3.65 (δ-CH₂, 2H),

Arg - 8.05 (N^αН, 1H); 7.58 (N^GН, 1H); 4.48 (α-СН, 1H); 1.72, 1.54 (β-СН₂, 2H); 1.56 (γ-CH₂, 2H); 3.10 (δ-СН₂, 2Н),

Pro: 4.40 (α-СН, 1Н); 2.05, 1.89 (β-СН₂, 2Н); 1.86 (γ-CH₂, 2Н); 3.61, 3.54 (δ-CH₂,2Н);

Gly: 8.0 (NH, 1H); 4.02, 3.82 (СН₂, 2Н);

Pro: 4.26 (α-СН, 1H); 2.14, 2.12 (β-CH₂, 2Н); 1.90 (γ-CH₂, 2Н); 3.48, 3.50 (δ-СН₂, 2Н).

Масс-спектр, m/z: 752.5 (вычислено 751.89 для С₃₃H₅₇N₁₁O₉).

Как видно из приведенных примеров, заявленный способ позволяет упростить процесс и повысить выход конечного гектапептида.

Литература

1. М.М.Kozlovskaya, I.I.Kozlovskii, E.A.Val'dman, S.B.Sebedinin, «Selank and short peptides of the tuftsin family in the regulation of adaptive behavior in stress», Neurosci. and Behavioral Physiology. 33, p.853-860 (2003).

2. Патент РФ 1124544, кл. С07К 7/06, 1995.

3. Э.Шредер, К.Любке. Пептиды. T.1. M.: «Мир», 1967.

Claims (4)

1. Способ получения гептапептида формулы

H-Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro-OH,

отличающийся тем, что синтез осуществляют путем конденсации С-концевого защищенного трипептида формулы

HCl·Н-Pro-Gly-Pro-OX,

где Х - защитная группа, с N-концевым защищенным тетрапептидом формулы

Y-Thr-Lys(Y¹)-Pro-Arg-OH,

где Y и Y¹ - защитные группы,

и полученный защищенный гептапептид формулы

Y-Thr-Lys(Y¹)-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro-OX

обрабатывают деблокирующими агентами для удаления защитных групп и выделяют конечный продукт с помощью хроматографии.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что Х представляет собой бензил (Bzl), Y и Y¹ - трет.-бутилоксикарбонил (Boc), а деблокирование защищенного гептапептида проводят последовательно обработкой трифторуксусной кислотой и каталитическим гидрированием в присутствии 5% Pd/C.

3. Трипептид формулы

HCl·H-Pro-Gly-Pro-OBzl,

в качестве промежуточного соединения для синтеза гептапептида формулы

H-Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro-OH.

4. Тетрапептид формулы

Boc-Thr-Lys-(Boc)-Pro-Arg-OH,

в качестве промежуточного соединения для синтеза гептапептида формулы

H-Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro-OH.