RU2300369C1 - Method for preparing polyelectolyte microparticles containing incapsulated substance and sensitive to environment composition alteration - Google Patents
Method for preparing polyelectolyte microparticles containing incapsulated substance and sensitive to environment composition alteration Download PDFInfo
- Publication number
- RU2300369C1 RU2300369C1 RU2005140842/15A RU2005140842A RU2300369C1 RU 2300369 C1 RU2300369 C1 RU 2300369C1 RU 2005140842/15 A RU2005140842/15 A RU 2005140842/15A RU 2005140842 A RU2005140842 A RU 2005140842A RU 2300369 C1 RU2300369 C1 RU 2300369C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- microparticles
- polyelectrolyte
- substance
- microarrays
- polyelectrolytes
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
- B01J13/02—Making microcapsules or microballoons
- B01J13/06—Making microcapsules or microballoons by phase separation
- B01J13/10—Complex coacervation, i.e. interaction of oppositely charged particles
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Manufacturing Of Micro-Capsules (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области фармации, биохимии и биотехнологии, а именно к способу получения микрочастиц, чувствительных к изменению состава окружающей среды и обеспечивающих рН-чувствительное высвобождение целевого вещества, предпочтительно предназначенного для лечения, профилактики и диагностики.The invention relates to the field of pharmacy, biochemistry and biotechnology, and in particular to a method for producing microparticles that are sensitive to changes in the composition of the environment and provide pH-sensitive release of the target substance, preferably intended for treatment, prevention and diagnosis.
Известен способ получения полиэлектролитных микрокапсул путем последовательной адсорбции противоположно заряженных полиэлектролитов на растворимых микроматрицах, последующее растворение матриц и включение в полученные полые микрокапсулы действующего вещества [1]. Недостатком этого способа получения является низкое количество действующего вещества, включаемого в полиэлектролитные стенки полых микрокапсул.A known method of producing polyelectrolyte microcapsules by sequential adsorption of oppositely charged polyelectrolytes on soluble microarrays, the subsequent dissolution of the matrices and the inclusion of the active substance in the obtained hollow microcapsules [1]. The disadvantage of this production method is the low amount of active substance included in the polyelectrolyte walls of hollow microcapsules.
Наиболее близким по технической сущности к заявляемому способу является способ получения полиэлектролитных микрокапсул последовательной адсорбцией противоположно заряженных полиэлектролитов на нерастворимых микроматрицах с включенным действующим веществом [2]. Недостатком этого способа являются сложности с включением действующего вещества в микроматрицы, а также использование большого количества стадий адсорбции полиэлектролитов на микроматрицах. Кроме того, при высокой эффективности включения действующего вещества в микрокапсулы, в данном способе не показано высвобождение действующего вещества из микрокапсул при изменении состава окружающей среды, что является важным при их применении.The closest in technical essence to the claimed method is a method for producing polyelectrolyte microcapsules by sequential adsorption of oppositely charged polyelectrolytes on insoluble microarrays with the active substance included [2]. The disadvantage of this method is the difficulty with the inclusion of the active substance in microarrays, as well as the use of a large number of stages of adsorption of polyelectrolytes on microarrays. In addition, with the high efficiency of incorporation of the active substance into the microcapsules, the method does not show the release of the active substance from the microcapsules with a change in the composition of the environment, which is important in their application.
Предложен более простой и менее многостадийный процесс получения полиэлектролитных микрочастиц путем адсорбции противоположно заряженных полиэлектролитов на микроматрицах, содержащих действующее вещество. При этом полиэлектролитные микрочастицы характеризуются высоким содержанием активного вещества - до 90% от массы микрочастиц (в зависимости от условий получения микрочастиц и количества стадий сорбции полиэлектролитов).A simpler and less multi-stage process for producing polyelectrolyte microparticles by adsorption of oppositely charged polyelectrolytes on microarrays containing the active substance is proposed. At the same time, polyelectrolyte microparticles are characterized by a high content of active substance - up to 90% by weight of microparticles (depending on the conditions for producing microparticles and the number of stages of sorption of polyelectrolytes).
Сущность изобретенияSUMMARY OF THE INVENTION
Объектом изобретения является способ получения полиэлектролитных микрочастиц путем проведения ряда стадий последовательной послойной адсорбции противоположно заряженных полиэлектролитов на нерастворимых микроматрицах, содержащих инкапсулируемое вещество при рН 3-8 и добавлении хлорида натрия до его концентрации в растворе 0-2,5 М.The object of the invention is a method for producing polyelectrolyte microparticles by carrying out a series of stages of sequential layer-by-layer adsorption of oppositely charged polyelectrolytes on insoluble microarrays containing encapsulated substance at pH 3-8 and adding sodium chloride to its concentration in a solution of 0-2.5 M.
В случае использования в качестве действующего вещества белков нерастворимые микроматрицы получают путем микроагрегирования белков высаливанием или более предпочтительно путем образования белок-полиэлектролитных комплексов микронных размеров. В качестве белков могут быть использованы, например, альбумин, химотрипсин и другие ферменты, гормоны роста, факторы роста, антигены, цитокины и др.In the case of using proteins as the active substance, insoluble microarrays are obtained by microaggregation of proteins by salting out, or more preferably by the formation of micron-sized protein-polyelectrolyte complexes. As proteins, for example, albumin, chymotrypsin and other enzymes, growth hormones, growth factors, antigens, cytokines, etc. can be used.
Защита высвобождающихся из микрочастиц белков от действия протеолитических ферментов обеспечивается за счет высвобождения их в виде комплекса с полиэлектролитом, а также путем использования при получении микрочастиц на одной или нескольких стадий сорбции в качестве полиэлектролита ингибиторов протеиназ.The protection of proteins released from microparticles from the action of proteolytic enzymes is ensured by their release in the form of a complex with a polyelectrolyte, as well as by the use of proteinase inhibitors as a polyelectrolyte during the production of microparticles.
В случае использования в качестве действующего вещества нерастворимых в воде веществ микроматрицы для нанесения полиэлектролитов получают тонким помолом субстанций нерастворимых в воде веществ, в частности до среднего размера частиц 1-10 мкм или менее, или ультраозвучиванием их суспензии с получением частиц наноразмеров, в частности 100-200 нм. Например, в качестве нерастворимых в воде веществ могут быть использованы стероиды, антиоксиданты, например кверцетин и соединения селена, противоопухолевые вещества, например метотрексат и паклитаксель, фтивазид, фуросемид и др.If water-insoluble substances are used as active substances, microarrays for applying polyelectrolytes are obtained by fine grinding of substances of water-insoluble substances, in particular, to an average particle size of 1-10 microns or less, or by ultrasonication of their suspension to obtain nanosized particles, in particular 100- 200 nm. For example, steroids, antioxidants, such as quercetin and selenium compounds, antitumor substances, such as methotrexate and paclitaxel, phtivazide, furosemide, etc. can be used as water-insoluble substances.
В случае использования в качестве действующего вещества масел или жидких гидрофобных веществ в качестве микроматриц для нанесения полиэлектролитов применяют эмульсии этих веществ, содержащие ионный детергент, подвергнутые ультраозвучиванию. В качестве таких веществ могут быть использованы, например, масляные экстракты из растительного сырья, токоферол ацетат, каротиноиды и др.In the case of the use of oils or liquid hydrophobic substances as the active substance, emulsions of these substances containing ultra-sounding ionic detergent are used as microarrays for applying polyelectrolytes. As such substances can be used, for example, oil extracts from plant materials, tocopherol acetate, carotenoids, etc.
В качестве полиэлектролитов могут быть использованы природные или синтетические полианионы или поликатионы.As polyelectrolytes, natural or synthetic polyanions or polycations can be used.
Предпочтительно использование в качестве полианионов - декстрансульфата, хитозансульфата, хитозансукцината, хитозанфталата, дермотансульфата, хондро-этилсульфата, альгината, полистиролсульфоната, а также анионных белковых ингибиторов протеиназ (ингибитор из сои типа Баумана-Бирк, ингибитора протеиназ из утиных яиц), а в качестве поликатионов - хитозана, протамина, полилизина, поли-L-орнитина, желатины, полиэтиленимина, полиаллиламина и основного ингибитора протеиназ (апротинина).It is preferable to use dextransulfate, chitosan sulfate, chitosan succinate, chitosanphthalate, dermotan sulfate, chondroethyl sulfate, alginate, polystyrene sulfonate, as well as anionic protein inhibitors of proteinases (Bauman-Birk soy inhibitor, and protein inhibitors) as polyanions. - chitosan, protamine, polylysine, poly-L-ornithine, gelatin, polyethyleneimine, polyallylamine and the main proteinase inhibitor (aprotinin).
Проведение процесса сборки полиэлектролитных микрочастиц при строго определенных значениях рН раствора позволяет получать микрочастицы, высвобождающие инкапсулированное вещество в активном состоянии при желаемых значениях рН, при этом скорость высвобождения целевого вещества регулируется ионной силой раствора при сборке микрочастиц, количеством стадий сорбции полиэлектролитов, варьированием химической природы полиэлектролитов и их молекулярных масс. При варьировании исходных размеров микроагрегатов, содержащих активное вещество, и при ультразвуковом воздействии на микрочастицы удается получать частицы от нано- до микроразмера.The process of assembly of polyelectrolyte microparticles at strictly defined pH values of the solution allows to obtain microparticles that release the encapsulated substance in the active state at the desired pH values, while the rate of release of the target substance is controlled by the ionic strength of the solution during the assembly of microparticles, the number of stages of sorption of polyelectrolytes, varying the chemical nature of the polyelectrolytes and their molecular weights. By varying the initial sizes of microaggregates containing the active substance, and with ultrasonic treatment of microparticles, it is possible to obtain particles from nano to micro size.
Полиэлектролитные микрочастицы с инкапсулированным веществом могут храниться в течение 3 лет в виде суспензии без агрегирования и потери активности инкапсулированного вещества.Polyelectrolyte microparticles with an encapsulated substance can be stored for 3 years in the form of a suspension without aggregation and loss of activity of the encapsulated substance.
Полиэлектролитные микрочастицы с инкапсулированным веществом могут быть лиофильно высушены из водной суспензии. Ресуспензированные после лиофилизации полиэлектролитные микрочастицы сохраняют свой исходный размер до высушивания, а инкапсулированное в них вещество сохраняет свою активность.The encapsulated polyelectrolyte microparticles can be lyophilized from an aqueous suspension. Polyelectrolyte microparticles resuspended after lyophilization retain their original size until dried, and the substance encapsulated in them remains active.
Использование биосовместимых и биодеградируемых полиэлектролитов при получении микрочастиц позволяет использовать полиэлектролитные микрочастицы в качестве лекарственных средств, обеспечивающих рН-чувствительное высвобождение активного инкапсулируемого вещества, например, при их попадании в определенные участки желудочно-кишечного тракта.The use of biocompatible and biodegradable polyelectrolytes in the preparation of microparticles allows the use of polyelectrolyte microparticles as medicines that provide pH-sensitive release of the active encapsulated substance, for example, when they enter certain parts of the gastrointestinal tract.
Микрочастицы на основе как синтетических, так и природных полиэлектролитов с включенным инкапсулируемым веществом могут применяться в биокатализе как биореакторы или в биотехнологии, как контейнеры, содержащие активные вещества.Microparticles based on both synthetic and natural polyelectrolytes with the encapsulated substance included can be used in biocatalysis as bioreactors or in biotechnology, as containers containing active substances.
Способ получения полиэлектролитных микрочастиц, содержащих инкапсулируемое вещество, иллюстрируется следующими примерами.A method for producing polyelectrolyte microparticles containing an encapsulated substance is illustrated by the following examples.
Примеры 1-17.Examples 1-17.
Получение лиофильно высушенных полиэлектролитных микрочастиц на основе микроматриц, представляющих собой нерастворимые комплексы белков с полианионами.Obtaining freeze-dried polyelectrolyte microparticles based on microarrays, which are insoluble complexes of proteins with polyanions.
Для получения микроматриц нерастворимого комплекса белок-полианион смешивали 5 мл раствора белка (20 мг/мл) и 5 мл раствора полианиона (5 мг/мл). По примерам 1-17 использованные полиэлектролиты, рН и концентрация NaCl при получении микрочастиц приведены в таблице 1. Суспензию перемешивали 20 мин (300 об/мин), осадок микрочастиц сепарировали и дважды промывали раствором без полиэлектролита.To obtain microarrays of the insoluble protein-polyanion complex, 5 ml of a protein solution (20 mg / ml) and 5 ml of a polyanion solution (5 mg / ml) were mixed. In examples 1-17, the used polyelectrolytes, pH and NaCl concentration in the preparation of microparticles are shown in Table 1. The suspension was stirred for 20 minutes (300 rpm), the microparticle precipitate was separated and washed twice with a solution without polyelectrolyte.
К осадку микрочастиц нерастворимого комплекса белок-полианион прибавляли 10 мл раствора поликатиона (2,5 мг/мл). Смесь перемешивали 20 мин, осадок сепарировали и дважды промывали раствором без полиэлектролита.To a precipitate of microparticles of an insoluble protein-polyanion complex was added 10 ml of a polycation solution (2.5 mg / ml). The mixture was stirred for 20 min, the precipitate was separated and washed twice with a solution without polyelectrolyte.
Процесс повторяли до достижения трех стадий сорбции полиэлектролитов, затем микрочастицы суспензировали в растворе с теми же рН и концентрацией NaCl и хранили в таком виде при 4-6°С. Изучали эффективность включения белков в микрочастицы, в суспензии микрочастиц изучали размер микрочастиц, содержание в микрочастицах белка и активность включенных ферментов.The process was repeated until the three stages of sorption of polyelectrolytes were achieved, then the microparticles were suspended in a solution with the same pH and NaCl concentration and stored in this form at 4-6 ° C. The efficiency of incorporation of proteins into microparticles was studied; in a microparticle suspension, the size of microparticles, the content of protein in microparticles and the activity of the included enzymes were studied.
Образцы по примерам 3, 6-9 промывали трижды 1 мМ HCl и лиофильно высушивали. После высушивания образцы суспендировали в 1 мМ HCl и изучали размер микрочастиц (данные приведены в скобках в последней колонке таблицы 1).Samples in examples 3, 6-9 were washed three times with 1 mm HCl and freeze-dried. After drying, the samples were suspended in 1 mM HCl and the microparticle size was studied (data are shown in brackets in the last column of table 1).
Примеры 18-21.Examples 18-21.
Получение полиэлектролитных микрочастиц на основе микроматриц, представляющих собой нерастворимые комплексы белков с поликатионами.Obtaining polyelectrolyte microparticles based on microarrays, which are insoluble complexes of proteins with polycations.
Для получения микроматриц на нерастворимого комплекса белок-поликатион смешивали 5 мл раствора белка (20 мг/мл) и 5 мл раствора хитозана с молекулярной массой 22 кД. (5 мг/мл). По примерам 18-19 использованные полиэлектролиты, рН и концентрация NaCl при получении микрочастиц приведены в таблице 1. Суспензию перемешивали 20 мин (300 об/мин), осадок микрочастиц сепарировали и дважды промывали раствором без полиэлектролита,To obtain microarrays on an insoluble protein-polycation complex, 5 ml of a protein solution (20 mg / ml) and 5 ml of a chitosan solution with a molecular weight of 22 kD were mixed. (5 mg / ml). In examples 18-19, the used polyelectrolytes, pH and NaCl concentration in the preparation of microparticles are shown in Table 1. The suspension was stirred for 20 min (300 rpm), the microparticle precipitate was separated and washed twice with a solution without polyelectrolyte,
К осадку микрочастиц нерастворимого комплекса белок-поликатион прибавляли 10 мл раствора полианиона (2,5 мг/мл). Смесь перемешивали 20 мин, осадок сепарировали и дважды промывали раствором без полиэлектролита.10 ml of a polyanion solution (2.5 mg / ml) was added to the precipitate of microparticles of an insoluble protein-polycation complex. The mixture was stirred for 20 min, the precipitate was separated and washed twice with a solution without polyelectrolyte.
Процесс повторяли до достижения трех стадий сорбции полиэлектролитов, затем микрочастицы суспензировали в растворе с теми же рН и концентрацией NaCl и хранили в таком виде при 4-6°С.The process was repeated until the three stages of sorption of polyelectrolytes were achieved, then the microparticles were suspended in a solution with the same pH and NaCl concentration and stored in this form at 4-6 ° C.
Примеры 22-29.Examples 22-29.
Процесс получения полиэлектролитных микрочастиц на суспензии микрочастиц нерастворимого комплекса белок-полианион проводили аналогично примерам 1-17, используя в качестве белка - инсулин, полианиона - ДС, поликатиона - протамин, до достижения от 1 до 8 стадий собрции полиэлектролитов (таблица 2, верхняя часть).The process of obtaining polyelectrolyte microparticles on a suspension of microparticles of an insoluble protein-polyanion complex was carried out similarly to examples 1-17, using insulin, polyanion - DS, polycation - protamine, until 1 to 8 stages of polyelectrolyte collection were achieved (table 2, top) .
Готовые микрочастицы трижды суспензировали в 1 мМ HCl, хранили в 1 мМ HCl при 4-6°С. Через 3 года изучали стабильность микрочастиц, анализируя количество белка, высвободившегося из микрочастиц.The finished microparticles were suspended three times in 1 mM HCl, stored in 1 mM HCl at 4-6 ° C. After 3 years, the stability of the microparticles was studied by analyzing the amount of protein released from the microparticles.
Примеры 30-37.Examples 30-37.
Для получения полиэлектролитных матриц высоленных микроагрегатов белка к 5 мл раствора инсулина (20 мг/мл) добавляли 0,15 г NaCl. Смесь перемешивали 1 ч.To obtain polyelectrolyte matrices of salted protein microaggregates, 0.15 g of NaCl was added to 5 ml of an insulin solution (20 mg / ml). The mixture was stirred for 1 hour.
Процесс получения полиэлектролитных микрочастиц на высоленных микроагрегатах белка проводили аналогично примерам 18-25, используя в качестве полианиона - ДС, поликатиона - протамин, до достижения от 1 до 8 стадий сорбции полиэлектролитов (см. таблицу 2).The process of obtaining polyelectrolyte microparticles on salted protein microaggregates was carried out similarly to examples 18-25, using DS as a polyanion, protamine polycation, to achieve from 1 to 8 stages of polyelectrolyte sorption (see table 2).
Примеры 38-43.Examples 38-43.
Получение лиофильно высушенных полиэлектролитных микрочастиц на основе микроматриц, представляющих собой микрочастицы высоленных агрегатов белков.Obtaining freeze-dried polyelectrolyte microparticles based on microarrays, which are microparticles of salted protein aggregates.
Процесс получения полиэлектролитных микрочастиц на суспензии нерастворимого комплекса белок-полианион проводили аналогично примерам 1-17, используя в качестве белка - химотрипсин, полианиона - декстрансульфат с молекулярной массой 500 кДа, поликатиона - хитозан с молекулярной массой 400 кДа до достижения от 1 до 6 стадий сорбции полиэлектролитов.The process of producing polyelectrolyte microparticles on a suspension of an insoluble protein-polyanion complex was carried out similarly to examples 1-17, using chymotrypsin as a protein, dextransulfate with a molecular weight of 500 kDa polyanion, and chitosan with a molecular weight of 400 kDa polycation to achieve from 1 to 6 stages of sorption polyelectrolytes.
Готовые микрочастицы трижды промывали помывали 1 мМ HCl и лиофильно высушивали и хранили при 4-6°С. После высушивания образцы мирочастиц суспендировали в 1 мМ HCl и изучали активность химотрисина.The prepared microparticles were washed three times, washed with 1 mM HCl and freeze-dried and stored at 4-6 ° C. After drying, samples of myrrh particles were suspended in 1 mM HCl and the activity of chymotrisin was studied.
Получение полиэлектролитных частиц, обработанных ультразвукомObtaining polyelectrolyte particles treated with ultrasound
Пример 44.Example 44
10 мл суспензии полиэлектролитных микрочастиц с химотрипсином, полученных по примеру 4, подвергали озвучиванию с помощью диспергатора ультразвукового «УЗДНА-А» (рабочая частота генератора 22 кГц) на ледяной бане. Через 2 мин озвучивания средний размер микрочастиц составил 3±2 мкм, удельная активность химотрипсина 83±3%.10 ml of a suspension of polyelectrolyte microparticles with chymotrypsin obtained according to example 4 was subjected to sonication using an ultrasonic disperser “UZDN-A” (operating frequency of the generator 22 kHz) in an ice bath. After 2 minutes of sonication, the average microparticle size was 3 ± 2 μm, the specific activity of chymotrypsin was 83 ± 3%.
Пример 45.Example 45
5 мл суспензии полиэлектролитных микрочастиц с инсулином (средний размер 5-13 мкм), полученных по примеру 33, подвергали озвучиванию по примеру 44 в течение 3 мин. Средний размер частиц после озвучивание составил 100-200 нм.5 ml of a suspension of polyelectrolyte microparticles with insulin (average size 5-13 μm) obtained in example 33 was subjected to sounding in example 44 for 3 minutes The average particle size after scoring was 100-200 nm.
рН чувствительное высвобождение капсулированных веществ из полиэлектролитных микрочастиц.pH sensitive release of encapsulated substances from polyelectrolyte microparticles.
Пример 46.Example 46
Аликвоту суспензии полиэлектролитных микрочастиц с альбумином, полученных по примеру 1, смешивали с универсальным буфером (0,02 М Н3PO4, 0,02 М СН3СООН, 0,02 М Н3ВО3+0,1 М NaOH, рН 3-8) до получения конечной концентрации белка 0,25 мг/мл. После 1 часа перемешивания на качалке (100 об/мин) образцы 5 мин центрифугировали при 1000 g и в супернатанте определяли концентрацию белка.An aliquot of a suspension of polyelectrolyte microparticles with albumin obtained according to example 1 was mixed with universal buffer (0.02 M H 3 PO 4 , 0.02 M CH 3 COOH, 0.02 M H 3 BO 3 +0.1 M NaOH, pH 3-8) until a final protein concentration of 0.25 mg / ml is obtained. After 1 hour of stirring on a shaker (100 rpm), the samples were centrifuged for 5 min at 1000 g and the protein concentration was determined in the supernatant.
Высвобождение белка из микрочастиц, определенное как отношение содержания белка в супернатанте и в суспензии микрочастиц в зависимости от рН, показано на фиг.1 АThe release of protein from microparticles, defined as the ratio of the protein content in the supernatant and in the suspension of microparticles as a function of pH, is shown in FIG. 1 A
Примеры 47-50.Examples 47-50.
Процесс проводили по примеру 46, используя образцы полиэлектролитных микрочастиц, полученные по примерам 2 (с инсулином), 3 (с химотрипсином), 5 (с трипсином), 7 (с апротинином). Результаты показаны на фиг.1 А.The process was carried out as in example 46, using samples of polyelectrolyte microparticles obtained in examples 2 (with insulin), 3 (with chymotrypsin), 5 (with trypsin), 7 (with aprotinin). The results are shown in FIG. 1 A.
Фиг.1. Влияние рН на высвобождение белка из полиэлектролитных микрочастиц. Номер кривой соответствует номеру примера, по которому получены микрочастицы.Figure 1. The effect of pH on the release of protein from polyelectrolyte microparticles. The curve number corresponds to the example number by which the microparticles were obtained.
Регулирование скорости высвобождения инкапсулированного вещества из полиэлектролитных микрочастиц варьированием числа стадий сорбции полиэлектролитов, последовательностью использования полианионов и поликатионов на последней стадии сорбции при получении микрочастиц и использование полиэлектролитных микрочастиц как средств, высвобождающих капсулированные вещества.The regulation of the rate of release of the encapsulated substance from polyelectrolyte microparticles by varying the number of stages of sorption of polyelectrolytes, the sequence of use of polyanions and polycations at the last stage of sorption in the preparation of microparticles, and the use of polyelectrolyte microparticles as means that release encapsulated substances.
Примеры 51-56.Examples 51-56.
Процесс высвобождения белка проводили по примеру 46, используя образцы микрочастиц с химотрипсином с различным числом стадий сорбции полиэлектролитов декстрансульфата с молекулярной массой 500 кДа и хитозана с молекулярной массой 400 кДа, полученные по примерам 38-43. Результаты показаны на фиг.1 Б.The protein release process was carried out according to example 46, using samples of microparticles with chymotrypsin with a different number of stages of sorption of polyelectrolytes of dextran sulfate with a molecular weight of 500 kDa and chitosan with a molecular weight of 400 kDa, obtained according to examples 38-43. The results are shown in figure 1 B.
Пример 57.Example 57
Процесс высвобождения белка проводили по примеру 46 при рН 7,0, используя образец микрочастиц с инсулином, полученный по примеру 6 с использованием трех стадий сорбции декстрансульфата с молекулярной массой 500 кДа и ингибитора протеиназ - апротинина.The protein release process was carried out according to example 46 at pH 7.0 using a sample of insulin microparticles obtained in example 6 using three stages of sorption of dextransulfate with a molecular weight of 500 kDa and aprotinin proteinase inhibitor.
Супернатант хроматографировали на колонке с сефадексем G-50f (19,5×2,0 см) в универсальном буфере с рН 7,0 (фиг.2). На выходе с колонки анализировали содержание белка и активность ингибитора протеиназ. Обнаружено наличие активного ингибитора протеиназ, находящегося в высокомолекулярном комплексе с полиэлектролитами, и инсулина в не связанном с полиэлектролитами состоянии.The supernatant was chromatographed on a Sephadex G-50f column (19.5 × 2.0 cm) in universal buffer with a pH of 7.0 (FIG. 2). At the column outlet, the protein content and activity of the proteinase inhibitor were analyzed. The presence of an active inhibitor of proteinases in a high molecular weight complex with polyelectrolytes and insulin in a state not associated with polyelectrolytes were found.
Фиг.2. Гель-хроматография на сефадексе G-50f белка, высвободившегося из образца, полученного по примеру 6: 1- Д280, 2 -Д750 (белок по Лоури), 3- условные ингибиторные единицы.Figure 2. Sephadex gel chromatography G-50f of the protein released from the sample obtained in Example 6: 1-D 280 , 2-D 750 (Lowry protein), 3-conditional inhibitor units.
Пример 58.Example 58
Использования полиэлектролитных микрочастиц как биокатализаторов.The use of polyelectrolyte microparticles as biocatalysts.
Использовали суспезию микрочастиц, полученных по примеру 43. Аликвоту суспензии разбавляли в 100 раз 0,001 М HCl. Через 10 мин измеряли активность химотрипсина в суспензии с использованием в качестве субстрата бензоил-аргинин-этилового эфира. Сохранение удельной активности химотрипсина составило 9%.Used a suspension of microparticles obtained in example 43. An aliquot of the suspension was diluted 100 times with 0.001 M HCl. After 10 min, the activity of chymotrypsin in suspension was measured using benzoyl-arginine-ethyl ether as a substrate. Preservation of the specific activity of chymotrypsin was 9%.
Аликвоту суспензии разбавляли в 100 раз 0,05 М фосфатным буфером. Через 10 мин измеряли активность химотрипсина в суспензии с использованием в качестве субстрата бензоил-аргинин-этилового эфира. Сохранение удельной активности химотрипсина по отношению к ферменту, взятому для микрокапсулирования, составило 19%.An aliquot of the suspension was diluted 100 times with 0.05 M phosphate buffer. After 10 min, the activity of chymotrypsin in suspension was measured using benzoyl-arginine-ethyl ether as a substrate. Preservation of the specific activity of chymotrypsin with respect to the enzyme taken for microencapsulation was 19%.
Аликвоту суспензии смешивали с 9 объемами раствора 0,025 М NaOH. Через 30 сек прозрачный раствор разбавляли 90 объемами 0,05 М трис-буферы с рН 7,8. Через 10 мин измеряли активность химотрипсина, высвободившегося при разрушении микрочастиц,An aliquot of the suspension was mixed with 9 volumes of a solution of 0.025 M NaOH. After 30 seconds, the clear solution was diluted with 90 volumes of 0.05 M Tris buffers with a pH of 7.8. After 10 min, the activity of chymotrypsin released during the destruction of microparticles was measured,
суспензии с использованием в качестве субстрата бензоил-аргинин-этилового эфира.suspensions using benzoyl-arginine-ethyl ether as a substrate.
Сохранение удельной активности химотрипсина составило 58%.Preservation of the specific activity of chymotrypsin was 58%.
Получение полиэлктролитных микрочастиц на основе микроматриц плохо растворимых веществ.Obtaining polyelectrolyte microparticles based on microarrays of poorly soluble substances.
Пример 59.Example 59
Для получения микроматриц нерастворимого вещества кверцетин подвергали тонкому помолу на агатовой ступке и суспендировали до концентрации 2 мг/мл в растворе 0,25 М NaCl с рН 3,0 в течение 20 мин.To obtain insoluble matter microarrays, quercetin was finely ground on an agate mortar and suspended to a concentration of 2 mg / ml in a solution of 0.25 M NaCl with a pH of 3.0 for 20 minutes.
Для получения полиэлектролитных микрочастиц смешивали 5 мл озвученной суспензии кверцетина и 5 мл раствора декстрансульфата с молекулярной массой 500 кДа (5 мг/мл) в 0,25 М NaCl с рН 3,0. Смесь перемешивали 30 мин (300 об/мин), осадок сепарировали и дважды промывали раствором без полиэлектролита. К осадку микрочастиц прибавляли 10 мл раствора хитозана с молекулярной массой 400 кДа (2,5 мг/мл) в 0,25 М NaCl с рН 3,0. Смесь перемешивали 20 мин, осадок микрочастиц сепарировали и дважды промывали раствором без полиэлектролита. К осадку микрочастиц прибавляли 10 мл раствор декстрансульфата (2,5 мг/мл) в 0,25 М NaCl с рН 3,0. Смесь перемешивали 20 мин, осадок микрочастиц сепарировали и дважды промывали раствором без полиэлектролита, затем полиэлектролитные микрочастицы суспензировали в растворе с 1 мМ HCl и хранили в таком виде при 4-6°С. Полиэлектролитные микрочастицы имели средний размер 15±10 мкм, содержание кверцетина в них составило 85±5%.To obtain polyelectrolyte microparticles, 5 ml of a sonicated suspension of quercetin and 5 ml of a solution of dextransulfate with a molecular weight of 500 kDa (5 mg / ml) in 0.25 M NaCl with pH 3.0 were mixed. The mixture was stirred for 30 min (300 rpm), the precipitate was separated and washed twice with a solution without polyelectrolyte. 10 ml of a solution of chitosan with a molecular weight of 400 kDa (2.5 mg / ml) in 0.25 M NaCl with a pH of 3.0 was added to the precipitate of microparticles. The mixture was stirred for 20 minutes, the microparticle precipitate was separated and washed twice with a solution without polyelectrolyte. A 10 ml solution of dextran sulfate (2.5 mg / ml) in 0.25 M NaCl at pH 3.0 was added to the microparticle precipitate. The mixture was stirred for 20 min, the precipitate of microparticles was separated and washed twice with a solution without polyelectrolyte, then the polyelectrolyte microparticles were suspended in a solution with 1 mM HCl and stored in this form at 4-6 ° С. Polyelectrolyte microparticles had an average size of 15 ± 10 μm, the content of quercetin in them was 85 ± 5%.
Пример 60.Example 60
Для получения микроматриц нерастворимого вещества суспензию 15 мг/мл 1,5 дифенил-3-селенапентадион-1,5 в воде подвергали озвучиванию по примеру 44 в течение 5 мин.To obtain insoluble matter microarrays, a suspension of 15 mg / ml of 1,5 diphenyl-3-selenapentadione-1,5 in water was sonicated in Example 44 for 5 minutes.
Для получения полиэлектролитных микрочастиц смешивали 5 мл озвученной суспензии и 5 мл раствора хитозана с молекулярной массой 150 кДа (2 мг/мл) с рН 3,0 смешивали и перемешивали 10 мин (300 об/мин), осадок сепарировали и дважды промывали 0,001 М HCl. К осадку микрочастиц прибавляли 10 мл раствора хитозан-сульфата с молекулярной массой 150 кДа (2 мг/мл) с рН 3,0. Смесь перемешивали 10 мин, осадок микрочастиц сепарировали и дважды промывали раствором без полиэлектролита. Указанную процедуру повторяли до достижения 5 стадий сорбции полиэлектролитов. По окончании процесса осадок дважды промывали, а затем полиэлектролитные микрочастицы суспензировали в растворе с 1 мМ HCl и хранили в таком виде при 4-6°С. Полиэлектролитные микрочастицы с 1,5 дифенил-3-селенапентадион-1,5 имели средний размер 3±2,5 мкм.To obtain polyelectrolyte microparticles, 5 ml of the sonicated suspension were mixed and 5 ml of a solution of chitosan with a molecular weight of 150 kDa (2 mg / ml) with a pH of 3.0 were mixed and stirred for 10 min (300 rpm), the precipitate was separated and washed twice with 0.001 M HCl . 10 ml of a solution of chitosan sulfate with a molecular weight of 150 kDa (2 mg / ml) with a pH of 3.0 was added to the precipitate of microparticles. The mixture was stirred for 10 min, the precipitate of microparticles was separated and washed twice with a solution without polyelectrolyte. This procedure was repeated until 5 stages of sorption of polyelectrolytes were achieved. At the end of the process, the precipitate was washed twice, and then the polyelectrolyte microparticles were suspended in a solution with 1 mM HCl and stored in this form at 4-6 ° C. Polyelectrolyte microparticles with 1.5 diphenyl-3-selenapentadione-1.5 had an average size of 3 ± 2.5 μm.
10 мл суспензии сепарировали и отделяли супернатант. К осадку приливали 10 подсолнечного масла и перемешивали (100 об/мин). Через 7 ч не было обнаружено высвобождения 1,5 дифенил-3-селенапентадион-1,5 из микрочастиц. В контрольной суспензии через 10 мин после добавления подсолнечного масла наблюдалось полное растворение суспензии микроматриц озвученого 1,5 дифенил-3-селенапентадион-1,5.10 ml of the suspension was separated and the supernatant was separated. 10 sunflower oil was added to the precipitate and mixed (100 rpm). After 7 hours no release of 1.5 diphenyl-3-selenapentadione-1.5 from the microparticles was detected. In the control suspension, 10 min after the addition of sunflower oil, the complete dissolution of the microarray suspension of 1.5 diphenyl-3-selenapentadione-1.5 was observed.
Пример 61.Example 61
Способ получения полиэлектролитных микрочастиц на основе микроматриц, представляющих собой микроэмульсии масел.A method of producing polyelectrolyte microparticles based on microarrays, which are microemulsions of oils.
Для получения микроматриц готовили эмульсию, содержащую токоферола 2,5% об. и 0,1% вес. додецилсульфата натрия.To obtain microarrays, an emulsion was prepared containing tocopherol 2.5% vol. and 0.1% weight. sodium dodecyl sulfate.
Для получения микрочастиц эмульсию смешивали с раствором 2 мг/мл полиаллиламина с молекулярной массой 60 кДа в соотношении 1:1 по объему и подвергали озвучиванию по примеру 44 в течение 1 мин. Полученную суспензию смешивали в соотношении 1:1 с раствором 2 мг/мл полистиролсульфоната с молекулярной массой 70 кДа и перемешивали 10 мин (300 об/мин). Осадок сепарировали с использованием ультрафильтрации и дважды промывали раствором 0,15 М NaCl с рН 4,0. К осадку последовательно прибавляли по одному объему растворов полиэлектролитов в 0,15 М NaCl с рН 4,0, инкубировали 10 мин и дважды промывали растворами без полиэлектролитов до достижения пяти стадий сорбции полиэлектролитов. Полиэлектролитные микрочастицы с токоферолом имели средний размер 10±5 мкм.To obtain microparticles, the emulsion was mixed with a solution of 2 mg / ml polyallylamine with a molecular weight of 60 kDa in a ratio of 1: 1 by volume and subjected to sonication in Example 44 for 1 min. The resulting suspension was mixed in a 1: 1 ratio with a solution of 2 mg / ml polystyrenesulfonate with a molecular weight of 70 kDa and stirred for 10 minutes (300 rpm). The precipitate was separated using ultrafiltration and washed twice with a solution of 0.15 M NaCl with a pH of 4.0. One volume of solutions of polyelectrolytes in 0.15 M NaCl with a pH of 4.0 was successively added to the precipitate, incubated for 10 min, and washed twice with solutions without polyelectrolytes until five stages of sorption of polyelectrolytes were reached. Polyelectrolyte microparticles with tocopherol had an average size of 10 ± 5 μm.
1. DE 19902553 A1, 22.02.1999. Polyelectrolythullen auf biologischen Templaten. B01J 13/02.1. DE 1990 2553 A1, 02.22.1999. Polyelectrolythullen auf biologischen Templaten. B01J 13/02.
2. DE 10037707 A1, 2.08.2000. Polyelectrolytkapselnherstellung durch Oberflachenprazipitation. B01J 13/02.2. DE 10037707 A1, 2.08.2000. Polyelectrolytkapselnherstellung durch Oberflachenprazipitation. B01J 13/02.
Claims (9)
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2005140842/15A RU2300369C1 (en) | 2005-12-27 | 2005-12-27 | Method for preparing polyelectolyte microparticles containing incapsulated substance and sensitive to environment composition alteration |
| PCT/RU2006/000621 WO2007075118A1 (en) | 2005-12-27 | 2006-11-22 | Method for producing polyelectrolytic microparticles which contain an encapsulated substance and are sensitive to the environment composition change |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2005140842/15A RU2300369C1 (en) | 2005-12-27 | 2005-12-27 | Method for preparing polyelectolyte microparticles containing incapsulated substance and sensitive to environment composition alteration |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2300369C1 true RU2300369C1 (en) | 2007-06-10 |
Family
ID=38218273
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2005140842/15A RU2300369C1 (en) | 2005-12-27 | 2005-12-27 | Method for preparing polyelectolyte microparticles containing incapsulated substance and sensitive to environment composition alteration |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2300369C1 (en) |
| WO (1) | WO2007075118A1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2641034C1 (en) * | 2017-01-27 | 2018-01-15 | федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Северо-Кавказский федеральный университет" | Method for polyelectrolite microcapsules preparation |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10001172A1 (en) * | 2000-01-13 | 2001-07-26 | Max Planck Gesellschaft | Templating solid particles with polymer multilayers |
| DE60110809T2 (en) * | 2000-08-28 | 2005-10-06 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Multi-layer controlled and sustained release polyelectrolyte capsules |
-
2005
- 2005-12-27 RU RU2005140842/15A patent/RU2300369C1/en not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-11-22 WO PCT/RU2006/000621 patent/WO2007075118A1/en active Application Filing
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2641034C1 (en) * | 2017-01-27 | 2018-01-15 | федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Северо-Кавказский федеральный университет" | Method for polyelectrolite microcapsules preparation |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2007075118A1 (en) | 2007-07-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Joye et al. | Biopolymer-based nanoparticles and microparticles: Fabrication, characterization, and application | |
| McClements | Designing biopolymer microgels to encapsulate, protect and deliver bioactive components: Physicochemical aspects | |
| Joye et al. | Production of nanoparticles by anti-solvent precipitation for use in food systems | |
| Filipović-Grčić et al. | Mucoadhesive chitosan-coated liposomes: characteristics and stability | |
| Abdelkader et al. | Review on micro-encapsulation with Chitosan for pharmaceuticals applications | |
| Ma et al. | Formation of soy protein isolate (SPI)-citrus pectin (CP) electrostatic complexes under a high-intensity ultrasonic field: Linking the enhanced emulsifying properties to physicochemical and structural properties | |
| Jarudilokkul et al. | Preparation of chitosan nanoparticles for encapsulation and release of protein | |
| Augustin et al. | Nanostructured materials in the food industry | |
| Ebrahimnezhad et al. | Survival of Lactobacillus acidophilus as probiotic bacteria using chitosan nanoparticles | |
| JPH04225915A (en) | Pharmaceutical composition containing polyelectrolytic complex in particle form and at least one active substance | |
| CN107028883B (en) | Preparation method of curcumin-carrying nanoemulsion | |
| IL293762A (en) | Protein cage-stabilized pickering emulsions and the use thereof | |
| JPH08509246A (en) | Use of a transacylation reaction between an esterified polysaccharide and a polyaminated or polyhydroxylated material for the production of microparticles, the microparticles so produced, methods and compositions containing same | |
| A Chaudhari et al. | Immobilization of proteins in alginate: functional properties and applications | |
| CN1994469A (en) | Biodegradable magnetic nanoparticle, preparation method and application thereof | |
| JP4982178B2 (en) | Microencapsulation system and its application | |
| JP2005506893A (en) | Stable aqueous / aqueous emulsion systems and their use | |
| JP2018507916A (en) | Exosome delivery technology | |
| RU2300369C1 (en) | Method for preparing polyelectolyte microparticles containing incapsulated substance and sensitive to environment composition alteration | |
| Levy et al. | Mixed-walled microcapsules made of cross-linked proteins and polysaccharides: preparation and properties | |
| Rahimnejad et al. | Production of protein nanoparticles for food and drug delivery system | |
| Baiocco | Fabrication and characterisation of vegetable chitosan derived microcapsules | |
| Hariyadi et al. | Stability of freeze-dried ovalbumin-alginate microspheres with different lyoprotectants | |
| Oner et al. | Properties of human albumin microparticles prepared by a chilled cross-linking technique | |
| De Temmerman et al. | Lyophilization of protein-loaded polyelectrolyte microcapsules |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20111228 |