RU2297455C2 - Method for production of androsta-1,4-diene-3,17-dione from plant and animal derived sterols - Google Patents
Method for production of androsta-1,4-diene-3,17-dione from plant and animal derived sterols Download PDFInfo
- Publication number
- RU2297455C2 RU2297455C2 RU2005117587/13A RU2005117587A RU2297455C2 RU 2297455 C2 RU2297455 C2 RU 2297455C2 RU 2005117587/13 A RU2005117587/13 A RU 2005117587/13A RU 2005117587 A RU2005117587 A RU 2005117587A RU 2297455 C2 RU2297455 C2 RU 2297455C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- add
- sterols
- transformation
- sorbents
- androsta
- Prior art date
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Использование: биотехнология, медицинская промышленность.Usage: biotechnology, medical industry.
Сущность изобретения: андроста-1,4-диен-3,17-дион (АДД) получают микробиологическим отщеплением боковой цепи стеринов растительного или животного происхождения, используя в качестве трансформатора стеринов бактерию Mycobacterium neoaurum ВКПМ Ac-1656. Способ осуществляют в присутствии сорбентов продуктов реакции, главным образом АДД - соединения, токсичного для бактерий-трансформаторов, причем сорбент добавляется не в начале процесса трансформации, а в поздней лаг-фазе роста культуры. Способ позволяет проводить процесс превращения стеринов в АДД с высокой скоростью и высокой степенью конверсии. Применение полистирольных сорбентов, не нуждающихся в регенерации и отличающихся высокой механической прочностью и высокой сорбционной емкостью, обеспечивает возможность масштабирования процесса и повышения его экономичности.The inventive androsta-1,4-diene-3,17-dione (ADD) is obtained by microbiological cleavage of the side chain of sterols of plant or animal origin, using Mycobacterium neoaurum VKPM Ac-1656 as a sterol transformer. The method is carried out in the presence of sorbents of reaction products, mainly ADD, a compound toxic to transformer bacteria, and the sorbent is added not at the beginning of the transformation process, but in the late lag phase of culture growth. The method allows the process of conversion of sterols into ADD with a high speed and a high degree of conversion. The use of polystyrene sorbents that do not need regeneration and are characterized by high mechanical strength and high sorption capacity, provides the ability to scale the process and increase its efficiency.
Изобретение может быть использовано в микробиологической, химической и фармацевтической промышленности при получении стероида андростанового ряда - андроста-1,4-диен-3,17-диона (АДД), необходимого для синтеза стероидных лекарственных препаратов из стеринов растительного (фитостерины), либо животного происхождения (холестерин) с помощью микроорганизмов.The invention can be used in the microbiological, chemical and pharmaceutical industries for the preparation of an androstane steroid - androsta-1,4-diene-3,17-dione (ADD), which is necessary for the synthesis of steroid drugs from plant sterols (phytosterols) or animal origin (cholesterol) using microorganisms.
17-Кетостероиды (андрост-4-ен-3,17-дион (АД), АДД, 9α-гидрокси-АД) служат интермедиатами в синтезе стероидных препаратов, широко используемых в медицинской практике. АДД, в частности, является ключевым соединением в синтезе биологически активных стероидов, необходимых в животноводстве, ветеринарии и медицине, а именно - эстрогенов, а также гестагенов и анаболиков 19-норстероидного ряда [1].17-Ketosteroids (androst-4-en-3,17-dione (AD), ADD, 9α-hydroxy-AD) serve as intermediates in the synthesis of steroid preparations widely used in medical practice. ADD, in particular, is a key compound in the synthesis of biologically active steroids needed in animal husbandry, veterinary medicine and medicine, namely estrogens, as well as progestogens and anabolics of the 19-norsteroid series [1].
Указанные 17-кетостероиды получают отщеплением боковой цепи стеринов растительного или животного происхождения с помощью мутантных штаммов бактерий, преимущественно рода Mycobacterium. АДД получают с помощью мутантных штаммов микобактерий, таких как M.fortuitum, M.parafortuitum, M.phlei, M.vaccae [2-4], у которых ингибирован синтез 9α-гидроксилазы, отвечающей в сочетании с 1,2-дегидрогеназой за расщепление кольца В стероидного скелета.These 17-ketosteroids are obtained by cleavage of the side chain of sterols of plant or animal origin using mutant bacterial strains, mainly of the genus Mycobacterium. ADD is obtained using mutant strains of mycobacteria, such as M.fortuitum, M. parafortuitum, M.phlei, M.vaccae [2-4], in which the synthesis of 9α-hydroxylase, which, in combination with 1,2-dehydrogenase is responsible for cleavage, is inhibited rings in the steroid skeleton.
Известны способы получения АДД с помощью бактерий Arthrobacter globiformis, A.oxydans, A. simplex, Brevibacterium lypolytica, Rhodococcus corallina, R.equi, R.terrae [5-9], отличающихся высокой способностью усваивать стерины в качестве единственного источника углерода. Условием успешного проведения процесса с помощью указанных бактерий является применение ингибиторов 9α-гидроксилазы, таких как соли никеля, кобальта, либо хелатных агентов (α,α-дипиридил, 8-оксихинолин), в отсутствии которых стерины расщепляются до углекислого газа и воды.Known methods for producing ADD using bacteria Arthrobacter globiformis, A.oxydans, A. simplex, Brevibacterium lypolytica, Rhodococcus corallina, R.equi, R.terrae [5-9], characterized by high ability to assimilate sterols as the sole carbon source. A prerequisite for a successful process using these bacteria is the use of 9α-hydroxylase inhibitors, such as salts of nickel, cobalt, or chelating agents (α, α-dipyridyl, 8-hydroxyquinoline), in the absence of which sterols break down to carbon dioxide and water.
Общим недостатком ранних способов получения АДД является низкое содержание стеринов в трансформационной среде (не более 1-2 г/л). Это связано с особенностью АДД, заключающейся в его токсичности для бактерий - трансформаторов при концентрации в среде выше 1 г/л. Например, уже в концентрации 0,8 г/л АДД подавляет рост культуры Mycobacterium vaccae ZIMET 11094 [4]. При этом следует заметить, что теоретический выход АДД (100% из 1 г холестерина) составляет 0,74 г.A common drawback of early methods for producing ADD is the low sterol content in the transformation medium (not more than 1-2 g / l). This is due to the peculiarity of ADD, which consists in its toxicity to transformer bacteria when the concentration in the medium is above 1 g / l. For example, already at a concentration of 0.8 g / L, ADD inhibits the growth of the culture of Mycobacterium vaccae ZIMET 11094 [4]. It should be noted that the theoretical yield of ADD (100% of 1 g of cholesterol) is 0.74 g.
Для преодоления вышеуказанного барьера в содержании стеринов 1 г/л разработано несколько способов. Известен способ, который заключается в проведении процесса в 2 стадии. На первой стадии из стеринов получают АД с помощью микобактерий при содержании фитостеринов в среде 5 г/л, а на второй стадии трансформируют АД в АДД 1,2-дегидрирующими грибами рода Fusarium [10]. Однако количество АДД в культуральной жидкости, образуемое грибами, не превышает 40%, по-видимому, из-за способности плесневых грибов одновременно с 1,2-дегидрированием кольца А в АД раскрывать кольцо D [11]. Описаны способы получения АДД, в которых, с целью повышения содержания стеринов в культуральной жидкости и соответственно образуемого АДД, бактериальные клетки изолируют от продукта трансформации. К таковым относятся способы, в которых для трансформации используют так называемые иммобилизованные клетки. Живые бактериальные клетки включают или адсорбируют на твердом гранулированном носителе [8, 12]. Однако существенным недостатком иммобилизации является как снижение трансформирующей активности иммобилизованных клеток по сравнению со свободными клетками, так и ухудшение доступа к ним субстрата.To overcome the above barrier in the content of sterols of 1 g / l, several methods have been developed. A known method, which consists in carrying out the process in 2 stages. In the first stage, blood pressure is obtained from sterols using mycobacteria with a phytosterol content of 5 g / l in the medium, and in the second stage, blood pressure is transformed into ADD by 1,2-dehydrogenating fungi of the genus Fusarium [10]. However, the amount of ADD in the culture fluid formed by fungi does not exceed 40%, apparently, due to the ability of molds simultaneously with 1,2-dehydrogenation of ring A in blood pressure to open ring D [11]. Methods for producing ADD are described in which, in order to increase the sterol content in the culture fluid and accordingly formed ADD, bacterial cells are isolated from the transformation product. These include methods in which so-called immobilized cells are used for transformation. Living bacterial cells include or adsorb on a solid granular support [8, 12]. However, a significant drawback of immobilization is both a decrease in the transforming activity of immobilized cells compared to free cells, and a decrease in the access of the substrate to them.
В литературе описаны способы получения АДД, которые отличаются использованием в процессе трансформации циклодекстринов и их модифицированных производных, образующих комплексы включения как с субстратами, так и с продуктами реакции [13].The literature describes methods for producing ADD, which differ in the use of cyclodextrins and their modified derivatives during the transformation process, forming inclusion complexes with both substrates and reaction products [13].
Известны также способы трансформации стеринов в присутствии органических сорбентов, селективных по отношению к 17-кетостероидам [14]. При использовании циклодекстринов либо сорбентов достигается значительное повышение эффективности процесса благодаря ликвидации эффекта его ингибирования продуктом. В случае циклодекстринов ингибирование культуры предотвращается вследствие образования комплексов включения с продуктом трансформации [13], во втором случае - благодаря селективной адсорбции АДД на смоле-сорбенте [14].Methods are also known for the transformation of sterols in the presence of organic sorbents selective for 17-ketosteroids [14]. When using cyclodextrins or sorbents, a significant increase in the efficiency of the process is achieved due to the elimination of the effect of its inhibition by the product. In the case of cyclodextrins, culture inhibition is prevented due to the formation of inclusion complexes with the transformation product [13], in the second case, due to the selective adsorption of ADD on a sorbent resin [14].
Эти способы позволяют вести процесс при нагрузках субстрата до 20 г/л. Согласно способу [13] трансформацию 5-20 г/л ситостерина проводят с помощью Mycobacterium sp. в присутствии водорастворимых циклодекстринов. Длительность трансформации 5 г/л стерина составляет 72-120 ч в зависимости от наличия заместителя в молекуле циклодекстрина и используемого штамма. Получают технический продукт, содержащий по данным ВЭЖХ 47-83% АДД. Качественный и количественный состав примесей в техническом продукте не указан.These methods allow the process to be carried out with substrate loads of up to 20 g / l. According to the method [13], the transformation of 5-20 g / l of sitosterol is carried out using Mycobacterium sp. in the presence of water-soluble cyclodextrins. The transformation duration of 5 g / l sterol is 72-120 hours, depending on the presence of a substituent in the cyclodextrin molecule and the strain used. A technical product is obtained containing, according to HPLC, 47-83% ADD. The qualitative and quantitative composition of impurities in the technical product is not specified.
Следует заметить, что несмотря на достаточно успешное решение части проблем при использовании химически модифицированных циклодекстринов, этот способ имеет ряд недостатков, таких как сложность и дороговизна получения модифицированных циклодекстринов, необходимость их регенерации, а также большая длительность процесса трансформации стеринов, обусловленная, вероятно, снижением доступности бактерий к субстратам, находящимся в комплексе включения с циклодекстринами.It should be noted that despite the rather successful solution of some problems when using chemically modified cyclodextrins, this method has several disadvantages, such as the complexity and high cost of obtaining modified cyclodextrins, the need for their regeneration, as well as the long duration of the sterol transformation process, probably due to a decrease in availability bacteria to substrates in the inclusion complex with cyclodextrins.
Из литературных данных следует, что независимо от способа и условий получения АДД в культуральной жидкости наряду с целевым продуктом присутствует промежуточный АД в соотношении АДД/АД 10/1-5/1. Кроме АД в качестве побочных продуктов могут также присутствовать тестостерон (ТС), 1-дегидро-ТС, продукты с недоокисленной боковой цепью, например спирты (20-гидроксиметилпрегн-4-ен-3-он (ГМП) и 1,2-дегидро-ГМП (ДГМП)) и другие, более полярные, чем целевой продукт, соединения [2,3,9,14]. Наличие указанных стероидных примесей, особенно АД, значительно усложняет выделение целевого продукта АДД.From the literature data it follows that regardless of the method and conditions for obtaining ADD in the culture fluid, along with the target product, there is an intermediate AD in the ratio ADD / AD 10 / 1-5 / 1. In addition to blood pressure, testosterone (TS), 1-dehydro-TS, products with an under-oxidized side chain, such as alcohols (20-hydroxymethylpregn-4-en-3-one (GMF) and 1,2-dehydro- GMP (DHMP)) and other compounds that are more polar than the target product [2,3,9,14]. The presence of these steroidal impurities, especially blood pressure, significantly complicates the selection of the target product ADD.
Наиболее близким к заявляемому способу по существу является способ [14], согласно которому в качестве адсорбента АДД использовали смолы марки Wofatit. Трансформацию фитостерина осуществляли с помощью штамма М. vaccae ZIMET 11094. Посевной материал вносили в питательную среду, в которой присутствовали стерины и смола-сорбент, которая неспецифично адсорбировала образующиеся 3,17-дикетостероиды и другие побочные Δ4-3-кетопродукты. При нагрузке фитостеринов не менее 10 г/л процесс заканчивался через 90-96 ч инкубации с образованием в качестве основного продукта АДД, содержание которого в конечной пробе по данным анализа составляло 67%. Соотношение АДД/АД и АДД/ДГМП составляло соответственно 8,5/1 и 8/1.Closest to the claimed method essentially is the method [14], according to which Wofatit resins were used as the adsorbent ADD. The transformation of phytosterol was carried out using strain M. vaccae ZIMET 11094. Inoculum was introduced into a nutrient medium in which sterols and a sorbent resin were present, which non-specifically adsorbed 3,17-diketosteroids and other by-products Δ 4 -3-ketoproducts. When the phytosterol load was at least 10 g / l, the process ended after 90-96 h of incubation with the formation of ADD as the main product, the content of which in the final sample according to the analysis was 67%. The ratio of ADD / AD and ADD / DHMP was 8.5 / 1 and 8/1, respectively.
Накопление на смоле промежуточных продуктов трансформации и главным образом АД происходит, вероятно, потому, что АД, будучи первым продуктом полного отщепления боковой цепи стеринов, появляется уже в лаг-фазе и соответственно сразу адсорбируется на смоле. Однако индукция 1,2-дегидрогеназы - фермента, необходимого для образования АДД из АД, наиболее активно протекает в период логарифмической фазы роста культуры, и наличие смолы в самом начале роста бактерий может тормозить индукцию фермента. Не исключено, что вследствие этого может понижаться продуктивность культуры.The accumulation of intermediate transformation products on the resin and mainly AD occurs, probably because AD, being the first product of the complete cleavage of the side chain of sterols, appears already in the lag phase and, accordingly, is immediately adsorbed on the resin. However, the induction of 1,2-dehydrogenase, the enzyme necessary for the formation of ADD from AD, is most active during the logarithmic phase of culture growth, and the presence of resin at the very beginning of bacterial growth can inhibit the induction of the enzyme. It is possible that, as a result, crop productivity may decrease.
Важным моментом для крупномасштабного процесса является его экономичность. При одноразовом использовании сорбента в большом количестве (в указанном способе [14] - 175 мл на 10 г стерина) существенно возрастает стоимость конечного продукта. Большое значение имеет также механическая прочность сорбента, поскольку процесс превращения стеринов в 17-кетостероиды протекает при интенсивном перемешивании.An important point for a large-scale process is its efficiency. With a single use of the sorbent in large quantities (in the specified method [14] - 175 ml per 10 g of sterol), the cost of the final product increases significantly. The mechanical strength of the sorbent is also of great importance, since the process of converting sterols to 17-ketosteroids proceeds with vigorous stirring.
Целью настоящего изобретения является повышение эффективности и экономичности процесса трансформации стеринов в АДД.The aim of the present invention is to increase the efficiency and economy of the process of transformation of sterols into ADD.
Сущность предлагаемого способа заключается в том, что стерины растительного или животного происхождения трансформируют в АДД в присутствии синтетического сорбента целевого продукта с помощью нового мутантного штамма Mycobacterium neoaurum, депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ Ас-1656. Штамм Mycobacterium neoaurum ВКПМ Ac-1656 получен в результате традиционного мутагенеза и лабораторной селекции микобактерий с высокой трансформирующей способностью в отношении фитостеринов [15].The essence of the proposed method lies in the fact that sterols of plant or animal origin are transformed into ADD in the presence of a synthetic sorbent of the target product using a new mutant strain of Mycobacterium neoaurum, deposited in the All-Russian collection of industrial microorganisms under the number VKPM As-1656. The strain Mycobacterium neoaurum VKPM Ac-1656 was obtained as a result of traditional mutagenesis and laboratory selection of mycobacteria with high transforming ability against phytosterols [15].
По сравнению с известными культурами указанная микобактерия более устойчива к действию целевого продукта (АДД), бактериостатическая концентрация которого составляет 1,5-2,0 г/л. Культура практически не образует продуктов восстановления 17-кетогруппы - ТС и 1-дегидро-ТС. С целью ускорения трансформации и повышения выхода целевого продукта сорбент для извлечения АДД добавляют не в начале ферментации, а вносят в эффективном количестве в культуральную жидкость в конце ростовой лаг-фазы. В присутствии смолы-адсорбента АДД плотность биомассы в среде возрастает от начального значения 3·107 КОЕ/мл (после внесения посевного материала) до 4,5·109 КОЕ/мл, тогда как в отсутствие адсорбента она остается на том же уровне.Compared with known cultures, this mycobacterium is more resistant to the action of the target product (ADD), the bacteriostatic concentration of which is 1.5-2.0 g / l. The culture practically does not form the products of reduction of the 17-keto group - TS and 1-dehydro-TS. In order to accelerate the transformation and increase the yield of the target product, the sorbent for the extraction of ADD is not added at the beginning of fermentation, but is added in an effective amount to the culture fluid at the end of the growth lag phase. In the presence of an ADD adsorbent resin, the biomass density in the medium increases from the initial value of 3 · 10 7 CFU / ml (after application of seed) to 4.5 · 10 9 CFU / ml, whereas in the absence of adsorbent it remains at the same level.
Предлагаемый способ позволяет проводить полную конверсию фитостеринов при нагрузках не ниже 10 г/л в течение 60-75 ч с сохранением баланса по сумме образующихся продуктов и содержанием АДД 66-76%, при этом соотношение АДД/АД и АДД/ДГМП варьирует в зависимости от состава стеринов в пределах 10/1-9/1 и 12/1-8/1 соответственно.The proposed method allows for the complete conversion of phytosterols at loads of at least 10 g / l for 60-75 hours while maintaining a balance of the sum of the products formed and the ADD content of 66-76%, while the ratio of ADD / AD and ADD / DHMP varies the composition of sterols in the range of 10 / 1-9 / 1 and 12 / 1-8 / 1, respectively.
В качестве сорбента АДД могут быть использованы различные высокопористые неионогенные синтетические макросшитые полимеры. Могут быть использованы сорбенты марки «поролас», получаемые сополимеризацией дивинилбензола и этилстирола в присутствии различных модифицирующих добавок (например, винилацетат, акриловый эфир, метакриловая кислота), а также сверхсшитые полистиролы марки «пуролит» (например, смолы MN-200, MN-202).As the ADD sorbent, various highly porous nonionic synthetic macrocrosslinked polymers can be used. Porolas sorbents obtained by copolymerization of divinylbenzene and ethyl styrene in the presence of various modifying additives (for example, vinyl acetate, acrylic ether, methacrylic acid), as well as hypercrosslinked polystyrenes of the purolite brand (for example, resins MN-200, MN-202, can be used). )
Экономичность процесса повышается также за счет применяемых смол-сорбентов, отличающихся высокой механической прочностью и сорбционной емкостью. Используемые сорбенты не требуют регенерации, не разрушаются в ферментациях с отбойниками. Для полной адсорбции АДД достаточно количества смолы в отношении к стерину, равном 10:1, что почти в 2 раза меньше количества смолы Wofatit.The efficiency of the process is also increased due to the applied resin sorbents, characterized by high mechanical strength and sorption capacity. Used sorbents do not require regeneration, are not destroyed in fermentations with chippers. For complete adsorption of ADD, an amount of resin in relation to sterol of 10: 1 is sufficient, which is almost 2 times less than the amount of Wofatit resin.
Предлагаемый способ осуществляется с применением мутантного штамма Mycobacterium neoaurum ВКПМ Ac-1656, однако он может быть использован для реализации аналогичных ферментационных процессов биоконверсии стеринов до АДД с помощью других видов бактерий. Следующие примеры иллюстрируют предлагаемый способ.The proposed method is carried out using a mutant strain of Mycobacterium neoaurum VKPM Ac-1656, however, it can be used to implement similar fermentation processes of bioconversion of sterols to ADD using other types of bacteria. The following examples illustrate the proposed method.
Качественный анализ продуктов трансформации проводили, используя метод тонкослойной хроматографии; количественный анализ - с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).Qualitative analysis of transformation products was carried out using thin layer chromatography; quantitative analysis - using the method of high performance liquid chromatography (HPLC).
Содержание АДД и побочных продуктов оценивали в г/л и в % от теоретически возможного, учитывая истинное содержание стеринов в трансформируемом субстрате. Учитывали, что количество АДД при 100%-ном превращении 414 г смеси фитостеринов составляет 286 г, то есть теоретически из 10 г/л субстрата можно получить 6,87 г/л АДД.The content of ADD and by-products was evaluated in g / l and in% of the theoretically possible, taking into account the true content of sterols in the transformable substrate. It was taken into account that the amount of ADD at a 100% conversion of 414 g of a mixture of phytosterols is 286 g, that is, theoretically, from 10 g / l of the substrate, 6.87 g / l of ADD can be obtained.
Пример 1. Бактерии Mycobacterium neoaurum ВКПМ Ac-1656 поддерживают на твердой среде следующего состава, г/л: глюкоза - 10, соевая мука - 5,0, лимонная кислота - 2,2, мочевина - 0,5, аммоний хлористый - 1,0, калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,5, магний сернокислый - 0,5, кальций углекислый - 1,5, железо сернокислое - 0,05, агар-агар - 25, рН 7,0 - 7,5. Клетки в возрасте 10-15 сут переносят в жидкую среду того же состава, но без агара и содержащую 8 г/л соевой муки (обезжиренная мука и необезжиренная в соотношении 1,5:2.5). Инокулят выращивают в течение 4 сут при температуре 29-31°C и переносят в трансформационную среду, содержащую, г/л: измельченные в присутствии ПАВ (размер частиц не более 15 ммк) соевые фитостерины следующего состава - (25,6% (3-ситостерина, 23% кампестерина, 22,3% стигмастерина и 12,6% не идентифицированных стеринов) - 10 (в 100%-ном исчислении стероидного субстрата), глюкоза - 10, соевая мука - 15 (обезжиренная и необезжиренная в соотношении 1:2), лимонная кислота 2,2, (NH4)2HPO4 - 1,5, MgSO4 - 0,5, FeSO4 - 0,05, СаСО3 - 1,5, деионизированная вода, рН 6,8-7,2. Ферментацию проводят при температуре 30-31°С в течение 60 ч, полистирольный сорбент «Пуролит» в количестве 100 г вносят в культуральную жидкость в поздней ростовой лаг-фазе. О потреблении фитостерина судят с помощью ТСХ. По окончании процесса, определяемого по отсутствию стеринов в культуральной жидкости, смолу отделяют от культуральной жидкости фильтрацией, продукты трансформации элюируют со смолы последовательно спиртом и хлористым метиленом и определяют методом ВЭЖХ-анализа содержание АДД и других стероидов. Результатом трансформации 31,5 г фитостеринов (в пересчете на 100%-ное содержание) являются 22 г технического продукта, содержащего 74% АДД, 7,8% АД и 8,1% ДГМП.Example 1. The bacteria Mycobacterium neoaurum VKPM Ac-1656 support on a solid medium of the following composition, g / l: glucose - 10, soy flour - 5.0, citric acid - 2.2, urea - 0.5, ammonium chloride - 1, 0, monosubstituted potassium phosphate - 0.5, magnesium sulfate - 0.5, calcium carbonate - 1.5, ferrous sulfate - 0.05, agar-agar - 25, pH 7.0 - 7.5. Cells aged 10-15 days are transferred to a liquid medium of the same composition, but without agar and containing 8 g / l of soy flour (non-fat flour and non-fat in a ratio of 1.5: 2.5). The inoculum is grown for 4 days at a temperature of 29-31 ° C and transferred to a transformation medium containing, g / l: soy phytosterols of the following composition, crushed in the presence of a surfactant (particle size no more than 15 mmk) - (25.6% (3- sitosterol, 23% campesterol, 22.3% stigmasterol and 12.6% unidentified sterols) - 10 (in the 100% calculation of the steroid substrate), glucose - 10, soy flour - 15 (fat-free and non-fat in the ratio 1: 2 ), citric acid 2.2, (NH 4 ) 2 HPO 4 - 1.5, MgSO 4 - 0.5, FeSO 4 - 0.05, CaCO 3 - 1.5, deionized water, pH 6.8-7 , 2. Fermentation is carried out at a rate at a temperature of 30-31 ° C for 60 hours, a polystyrene sorbent “Purolit” in the amount of 100 g is added to the culture fluid in the late growth lag phase. The consumption of phytosterol is measured using TLC. At the end of the process, determined by the absence of sterols in the culture fluid , the resin is separated from the culture fluid by filtration, the transformation products are eluted from the resin successively with alcohol and methylene chloride, and the content of ADD and other steroids is determined by HPLC analysis. The result of the transformation of 31.5 g of phytosterols (in terms of 100% content) is 22 g of a technical product containing 74% ADD, 7.8% blood pressure and 8.1% DHMP.
Пример 2. Способ осуществляют по примеру 1, но в качестве полистирольного сорбента используют «Поролас» также в количественном отношении к стерину 10/1. Трансформацию проводят в течение 62 ч и получают элюат, содержащий 72% АДД с примесью АД и ДГМП в соотношении 10/1 и 11/1 соответственно.Example 2. The method is carried out as in example 1, but as a polystyrene sorbent use "Porolas" also in quantitative terms to sterol 10/1. The transformation is carried out for 62 hours and get an eluate containing 72% ADD mixed with blood pressure and DHMP in the ratio of 10/1 and 11/1, respectively.
Пример 3. Способ осуществляют по примеру 1, но в качестве субстрата используют соевые фитостерины (41,2% β-ситостерина, 23,8% кампестерина, 20,2% стигмастерина, ~3% брассикастерина, кампастанола, стигмастанола). Трансформацию проводят в течение 65 ч и получают элюат, содержащий 70% АДД с примесью АД и ДГМП в соотношении 9,5/1 и 10/1 соответственно.Example 3. The method is carried out as in example 1, but soy phytosterols (41.2% β-sitosterol, 23.8% campesterol, 20.2% stigmasterol, ~ 3% brassicasterol, campastanol, stigmastanol) are used as a substrate. The transformation is carried out for 65 h and get an eluate containing 70% ADD mixed with blood pressure and DHMP in the ratio of 9.5 / 1 and 10/1, respectively.
Пример 4. Способ осуществляют по примеру 1, но в качестве субстрата используют фитостерины из отходов переработки древесины хвойных пород (66,7% β-ситостерина, 20,7% смеси кампестерина и стигмастерина). Трансформацию проводят в течение 75 ч и получают элюат, содержащий 66% АДД с примесью АД и ДГМП в соотношении 9/1 и 8/1 и около 1% 1-дегидро-ТС.Example 4. The method is carried out as in example 1, but phytosterols from the waste products of coniferous wood (66.7% β-sitosterol, 20.7% mixture of campesterol and stigmasterol) are used as a substrate. The transformation is carried out for 75 hours and get an eluate containing 66% ADD mixed with AD and DHMP in the ratio of 9/1 and 8/1 and about 1% 1-dehydro-TS.
Пример 5. Способ осуществляют по примеру 1, но в качестве субстрата используют холестерин (98%). Трансформацию проводят в течение 60 ч и получают элюат, содержащий 76% АДД с примесью 7,5% АД и 6,4% ДГМП.Example 5. The method is carried out as in example 1, but cholesterol (98%) is used as a substrate. The transformation is carried out for 60 hours and get an eluate containing 76% ADD mixed with 7.5% AD and 6.4% DHMP.
Источники информацииInformation sources
1. Машковский М.Д. Лекарственные средства, Харьков, Торсинг, 1997.1. Mashkovsky M.D. Medicines, Kharkov, Torsing, 1997.
2. Wovcha M.G., Biggs С.В, Pyke T.R. US Pat. 4339539. C1. 435/253.2. Wovcha M.G., Biggs C. B., Pyke T.R. US Pat. 4,339,539. C1. 435/253.
3. Imata Y., Takahashi K., Katogi S. Japan Pat. 79/59 395.3. Imata Y., Takahashi K., Katogi S. Japan Pat. 79/59 395.
4. Hoerhold С., Gottschaldt В., Grosse H.-h. Fifth Int. Conf. on Chemistry & Biotechnol. Varna, Bulgaria. V.4, p.92-110, 1989.4. Hoerhold S., Gottschaldt B., Grosse H.-h. Fifth Int. Conf. on Chemistry & Biotechnol. Varna, Bulgaria. V.4, p. 92-110, 1989.
5. Srivastava S.K., Srivastava R.A.K., Mathur S.N. J. Appl. Bacteriol. V.59, p.399-402, 1985.5. Srivastava S.K., Srivastava R.A.K., Mathur S.N. J. Appl. Bacteriol. V. 59, p. 399-402, 1985.
6. Srivastava R.A.K., Srivastava S.K., Mathur S.N. Curr.Sci. V.52, p.823-824, 1983.6. Srivastava R.A.K., Srivastava S.K., Mathur S.N. Curr.Sci. V. 52, p. 823-824, 1983.
7. Nishikawa D., Imada Y., et al. US Pat 4057469. C1. 195/51 G.7. Nishikawa D., Imada Y., et al. US Pat 4057469. C1. 195/51 G.
8. Ahmad S., Roy P.K., Basu S.K., Johri B.N. Indian J.Exp.Biol. V. 31, p.319-322, 1993.8. Ahmad S., Roy P.K., Basu S.K., Johri B.N. Indian J. Exp. Biol. V. 31, p. 319-322, 1993.
9. Japan Pat. 80.111796. C1. С 12 Р 33/00.9. Japan Pat. 80.111796. C1. C 12 P 33/00.
10. Kutney J.P., Hemngton E.J., Spassov G. et al. WO 03/064674. 2003.10. Kutney J.P., Hemngton E.J., Spassov G. et al. WO 03/064674. 2003.
11. Ахрем А.А., Титов Ю.А. Стероиды и микроорганизмы, М.: Наука, 1972.11. Akhrem A.A., Titov Yu.A. Steroids and microorganisms, Moscow: Nauka, 1972.
12. Lee C.Y., Liu W.H. Appl. Microbiol. Biotechnol. V.36, p.598-603, 1992.12. Lee C.Y., Liu W.H. Appl. Microbiol. Biotechnol. V.36, p. 598-603, 1992.
13. Донова М.В., Довбня Д.В., Калиниченко А.Н. и др. Патент РФ 2039824. Кл. С 12 Р 33/16, С 07 J 1/00.13. Donova M.V., Dovbnya D.V., Kalinichenko A.N. and other RF Patent 2039824. Cl. C 12 P 33/16, C 07 J 1/00.
14. Gottschaldt В., Grosse H-H., Hoerhold С. et al. DD Pat. 301 740. C1. С 12 Р 33/16.14. Gottschaldt B., Grosse H-H., Hoerhold C. et al. DD Pat. 301 740. C1. C 12 P 33/16.
15. Войшвилло Н.Б., Андрюшина В.А., Савинова Т.С. и др. Прикл. биохим. микробиол. Т.39. С.173-179. 2003.15. Voishvillo N.B., Andryushina V.A., Savinova T.S. and others. Prikl. biochem. microbiol. T.39. S.173-179. 2003.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2005117587/13A RU2297455C2 (en) | 2005-06-08 | 2005-06-08 | Method for production of androsta-1,4-diene-3,17-dione from plant and animal derived sterols |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2005117587/13A RU2297455C2 (en) | 2005-06-08 | 2005-06-08 | Method for production of androsta-1,4-diene-3,17-dione from plant and animal derived sterols |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2005117587A RU2005117587A (en) | 2006-12-20 |
| RU2297455C2 true RU2297455C2 (en) | 2007-04-20 |
Family
ID=37666494
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2005117587/13A RU2297455C2 (en) | 2005-06-08 | 2005-06-08 | Method for production of androsta-1,4-diene-3,17-dione from plant and animal derived sterols |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2297455C2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2512076C1 (en) * | 2012-11-16 | 2014-04-10 | Российская Федерация, От Имени Которой Выступает Министерство Промышленности И Торговли Российской Федерации | Method of obtaining androst-4,9(11)-dien-3,17-dione from phytosterol |
-
2005
- 2005-06-08 RU RU2005117587/13A patent/RU2297455C2/en not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2512076C1 (en) * | 2012-11-16 | 2014-04-10 | Российская Федерация, От Имени Которой Выступает Министерство Промышленности И Торговли Российской Федерации | Method of obtaining androst-4,9(11)-dien-3,17-dione from phytosterol |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2005117587A (en) | 2006-12-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Malaviya et al. | Androstenedione production by biotransformation of phytosterols | |
| Mahato et al. | Current trends in microbial steroid biotransformation | |
| Martin | Microbial cleavage of sterol side chains | |
| Capek et al. | Microbial transformations of steroids | |
| Mahato et al. | Steroid transformations by microorganisms—II | |
| Donova et al. | Mycobacterium sp. mutant strain producing 9α-hydroxyandrostenedione from sitosterol | |
| Ahmad et al. | Biotransformation of sterols: selective cleavage of the side chain | |
| US5166055A (en) | Microbiological preparation of 9-alpha-hydroxy-17-keto steroids | |
| JPS6352880B2 (en) | ||
| RU2297455C2 (en) | Method for production of androsta-1,4-diene-3,17-dione from plant and animal derived sterols | |
| Bokkenheuser et al. | Biotransformation of steroids | |
| Adham et al. | Biochemical studies on the microbial Δ1-dehydrogenation of cortisol by Pseudomonas fluorescens | |
| Molchanova et al. | Preparation of androsta-1, 4-diene-3, 17-dione from sterols using Mycobacterium neoaurum VKPM Ac-1656 strain | |
| US4397947A (en) | Microbial process for 9α-hydroxylation of steroids | |
| Manosroi et al. | Enhancement of 17α-hydroxyprogesterone production from progesterone by biotransformation using hydroxypropyl-β-cyclodextrin complexation technique | |
| Bokkenheuser et al. | Steroid desmolase synthesis by Eubacterium desmolans and Clostridium cadavaris | |
| Williamson et al. | Microbiological hydroxylation of estradiol: formation of 2-and 4-hydroxyestradiol by Aspergillus alliaceus | |
| Edenharder et al. | Epimerization, oxidation and reduction of bile acids by Eubacterium lentum | |
| US4444884A (en) | Process for preparing steroids | |
| TWI421256B (en) | Method for producing 5-ene-3-keto or 3,6-diketone of fatty alcohol, method for producing lipid metabolism improving agent, food and animal and animal feed, and analysis method | |
| JPS5934353B2 (en) | Novel mutant microorganism of Mycobacterium faluthuitum | |
| SARANGTHEM et al. | Biosynthesis of Succulent Bamboo Shoots of Bambusa balcooa | |
| Saunders et al. | The use of a hydrophobic resin as a product reservoir in steroid transformations | |
| RU2205224C2 (en) | Method for preparing androst-4-en-3,17-dione or their derivatives from sterol of vegetable and animal origin | |
| Abd-Elsalam et al. | MICROBIAL CONVERSION OF PLANT STEROL (Β, SITOSTEROLS) INTO IMPORTANT STEROID ANDROGENS USING NEW LOCALLY ISOLATED BACTERIA |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20070609 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20080920 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20140609 |