RU2295537C2 - Modified antagonistic antibody - Google Patents
Modified antagonistic antibody Download PDFInfo
- Publication number
- RU2295537C2 RU2295537C2 RU2003114746/13A RU2003114746A RU2295537C2 RU 2295537 C2 RU2295537 C2 RU 2295537C2 RU 2003114746/13 A RU2003114746/13 A RU 2003114746/13A RU 2003114746 A RU2003114746 A RU 2003114746A RU 2295537 C2 RU2295537 C2 RU 2295537C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- chain
- receptor
- region
- antibody
- modified antibody
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION
Данное изобретение относится к модифицированным антителам, содержащим две или более V-областей Н-цепи и две или более V-областей L-цепи моноклонального антитела, которое обнаруживает агонистическую активность посредством сшивания молекулы (молекул) клеточной поверхности или внутриклеточной молекулы (молекул). Эти модифицированные антитела имеют агонистическую активность трансдукции сигнала в клетки посредством сшивания молекул (молекулы) клеточной поверхности и применимы в качестве лекарственного средства для различных целей.The present invention relates to modified antibodies containing two or more V regions of an H chain and two or more V regions of an L chain of a monoclonal antibody that exhibits agonistic activity by crosslinking a cell surface molecule (s) or an intracellular molecule (s). These modified antibodies have agonistic activity of signal transduction into cells through crosslinking of the cell surface molecules (molecules) and are applicable as a medicine for various purposes.
Уровень техникиState of the art
Патентная заявка Японии JP-A 9-295999 описывает получение специфического моноклонального антитела с использованием линии стромальных клеток селезенки в качестве сенсибилизирующего антигена, с целью получения специфических антител, которые могут узнавать вышеупомянутые стромальные клетки селезенки, и получение новых моноклональных антител, которые узнают мышиный ассоциированный с интегрином белок (мышиный IAP) в качестве антигена. Патентная заявка Японии JP-A 9-295999 описывает также, что эти моноклональные антитела способны индуцировать апоптоз миелоидных клеток.Japanese Patent Application JP-A 9-295999 describes the preparation of a specific monoclonal antibody using the spleen stromal cell line as a sensitizing antigen, in order to obtain specific antibodies that can recognize the aforementioned spleen stromal cells, and to obtain new monoclonal antibodies that recognize the murine associated with integrin protein (mouse IAP) as an antigen. Japan Patent Application JP-A 9-295999 also describes that these monoclonal antibodies are capable of inducing apoptosis of myeloid cells.
WO 99/12973 описывает моноклональные антитела, антигеном для которых служит ассоциированный с интегрином белок человека (далее называемый IAP человека; его аминокислотная последовательность и нуклеотидная последовательность описаны в J.Cell Biol., 123, 485-496, 1993; см. также Journal of Cell Science, 108, 3419-3425, 1995), которые способны индуцировать апоптоз ядросодержащих клеток крови (гемоцитов) человека (миелоидная клетка и лимфоцит), содержащих указанный IAP человека. Эти моноклональные антитела называют антителом MABL-1 и антителом MABL-2, а гибридомы, продуцирующие эти антитела, также называют MABL-1 (FERM ВР-6100) и MABL-2 (FERM BP-6101), соответственно.WO 99/12973 describes monoclonal antibodies for which the human integrin-associated protein (hereinafter referred to as human IAP; its amino acid sequence and nucleotide sequence is described in J. Cell Biol., 123, 485-496, 1993; see also Journal of Cell Science, 108, 3419-3425, 1995), which are capable of inducing apoptosis of human nucleated blood cells (hemocytes) (myeloid cell and lymphocyte) containing said human IAP. These monoclonal antibodies are called the MABL-1 antibody and the MABL-2 antibody, and the hybridomas producing these antibodies are also called MABL-1 (FERM BP-6100) and MABL-2 (FERM BP-6101), respectively.
Японская патентная заявка 11-63557 описывает получение одноцепочечных Fv-областей, представляющих собой Fv-области моноклональных антител, антигеном которых является IAP человека. Одноцепочечные Fv способны индуцировать апоптоз ядросодержащих клеток крови, имеющих IAP человека.Japanese Patent Application 11-63557 describes the preparation of single chain Fv regions, which are Fv regions of monoclonal antibodies, the antigen of which is human IAP. Single chain Fvs are capable of inducing apoptosis of nucleated blood cells having human IAPs.
Моноклональное антитело, узнающее IAP в качестве антигена, индуцирует апоптоз ядросодержащих клеток крови, содержащих IAP человека, но оно также вызывает гемагглютинацию in vitro. Это указывает на то, что введение большого количества моноклонального антитела, узнающего IAP в качестве антигена, может приводить к побочному эффекту, такому как гемагглютинация.A monoclonal antibody that recognizes IAP as an antigen induces apoptosis of nucleated blood cells containing human IAP, but it also causes hemagglutination in vitro. This indicates that the administration of a large amount of a monoclonal antibody recognizing IAP as an antigen can lead to a side effect, such as hemagglutination.
Авторы изобретения провели интенсивное исследование в отношении использования моноклональных антител против IAP человека в качестве терапевтического агента при заболеваниях крови и получили одноцепочечные Fv, имеющие одноцепочечный Fv-фрагмент, способный индуцировать апоптоз ядросодержащих клеток крови, содержащих IAP человека.The inventors conducted an intensive study regarding the use of monoclonal antibodies against human IAP as a therapeutic agent in blood diseases and obtained single-chain Fv having a single-chain Fv fragment capable of inducing apoptosis of nucleated blood cells containing human IAP.
С другой стороны, были разработаны модифицированные антитела, в частности, антитела с уменьшенным молекулярным размером, например, одноцепочечные Fv, для улучшения проникновения в ткани и опухоли посредством уменьшения молекулярного размера и для получения рекомбинантым способом. Недавно димеры одноцепочечных Fv, в частности, биспецифические димеры, использовали для сшивания клеток. Типичными примерами таких димеров являются гетеродимеры одноцепочечных Fv, узнающие антигены раковых клеток и антигены клеток-хозяев, подобных NK-клеткам (естественным киллерам), и нейтрофилам (Kipriyanov et al., Int. J. Cancer, 77, 9763-9772, 1998). Они были получены способом конструирования одноцепочечных Fv в виде модифицированных антител, которые являются более эффективными в лечении раков посредством индуцирования межклеточных сшивок. Считалось, что межклеточное сшивание индуцируется антителами и их фрагментами (например, Fab-фрагментом), биспецифическими модифицированными антителами и даже димерами одноцепочечных Fv, которые являются моноспецифическими.On the other hand, modified antibodies have been developed, in particular, antibodies with reduced molecular size, for example, single-chain Fv, to improve penetration into tissues and tumors by reducing molecular size and to obtain a recombinant method. Recently, single chain Fv dimers, in particular bispecific dimers, have been used to cross-link cells. Typical examples of such dimers are single chain Fv heterodimers that recognize cancer cell antigens and host cell antigens similar to NK cells (natural killers) and neutrophils (Kipriyanov et al., Int. J. Cancer, 77, 9763-9772, 1998) . They were obtained by the method of constructing single-chain Fvs in the form of modified antibodies that are more effective in treating cancers by inducing intercellular crosslinking. It was believed that intercellular crosslinking is induced by antibodies and their fragments (e.g., Fab fragment), bispecific modified antibodies, and even single chain Fv dimers that are monospecific.
В качестве антител, способных передавать сигнал сшиванием молекулы (молекул) клеточной поверхности, известны антитело против ЕРО-рецептора, участвующего в дифференцировке и пролиферации клеток (JP-A 2000-95800), антитело против MuSK-рецептора (Xie et al., Nature Biotech. 15, 768-771, 1997) и другие. Однако, не было сообщений о модифицированных антителах уменьшенного молекулярного размера.As antibodies capable of transmitting a signal by crosslinking the cell surface molecule (s), an anti-EPO receptor involved in the differentiation and proliferation of cells (JP-A 2000-95800), an anti-MuSK receptor antibody (Xie et al., Nature Biotech 15, 768-771, 1997) and others. However, there have been no reports of modified antibodies of reduced molecular size.
Обратив внимание на то, что одноцепочечные Fv-мономеры, полученные из антитела MABL-1 и антитела MABL-2, не индуцируют апоптоз клеток, тогда как димеры одноцепочечных Fv индуцируют апоптоз клеток, содержащих IAP, авторы данного изобретения обнаружили, что они сшивают (димеризуют) IAP-рецептор на клеточной поверхности, вследствие чего сигнал передается в эти клетки и, как результат, индуцируется апоптоз. Это предполагает, что моноспецифические одноцепочечные Fv-димеры сшивают молекулу (молекулы) клеточной поверхности (например, рецептор) и передают сигнал подобно лиганду, выполняя таким образом роль агониста.Noting that single-chain Fv monomers derived from the MABL-1 antibody and the MABL-2 antibody do not induce cell apoptosis, while single-chain Fv dimers induce apoptosis of cells containing IAP, the inventors found that they cross-link (dimerizate ) IAP receptor on the cell surface, as a result of which the signal is transmitted to these cells and, as a result, apoptosis is induced. This suggests that monospecific single chain Fv dimers crosslink the cell surface molecule (s) (e.g., receptor) and transmit a signal like a ligand, thus acting as an agonist.
Сосредоточившись на межклеточном сшивании, авторы изобретения обнаружили, что вышеупомянутые одноцепочечные димеры Fv не вызывают гемагглютинации, тогда как вышеупомянутые моноклональные антитела вызывают гемагглютинацию. Тот же самый результат наблюдали также с одноцепочечными бивалентными антителами (одноцепочечными полипептидами, содержащими две V-области Н-цепи и две V-области L-цепи). Это предполагает, что моноклональные антитела могут образовывать межклеточные сшивки, тогда как модифицированные антитела, подобные одноцепочечным Fv-димерам и одноцепочечным бивалентным антителам, сшивают молекулу (молекулы) клеточной поверхности, но не образуют межклеточных сшивок.By focusing on intercellular crosslinking, the inventors found that the aforementioned single chain Fv dimers do not cause hemagglutination, while the aforementioned monoclonal antibodies cause hemagglutination. The same result was also observed with single chain bivalent antibodies (single chain polypeptides containing two H chain V regions and two L chain V regions). This suggests that monoclonal antibodies can form intercellular cross-links, while modified antibodies, like single-chain Fv dimers and single-chain bivalent antibodies, cross-link the cell surface molecule (s), but do not form intercellular cross-links.
На основе этих наблюдений авторы изобретения впервые обнаружили, что модифицированные антитела, такие как одноцепочечные Fv-димеры и одноцепочечные бивалентные антитела, сшивают молекулу (молекулы) клеточной поверхности или внутриклеточную молекулу (молекулы) одной и той же клетки, наряду с известным межклеточным сшиванием, и пригодны в качестве лиганда такой молекулы (молекул) (в частности, в качестве лиганда, который имитирует действие природного лиганда).Based on these observations, the inventors first discovered that modified antibodies, such as single chain Fv dimers and single chain bivalent antibodies, crosslink a cell surface molecule (s) or an intracellular molecule (s) of the same cell, along with known intercellular crosslinking, and suitable as a ligand for such a molecule (s) (in particular, as a ligand that mimics the action of a natural ligand).
Обнаружением дополнительно того, что молекула антитела (цельный IgG) может быть модифицирована в одноцепочечные Fv-димеры, одноцепочечные бивалентные антитела и т.п., которые сшивают молекулу (молекулы) клеточной поверхности, с уменьшением тем самым побочных действий, вызываемых межклеточным сшиванием, и обеспечением новых лекарственных средств, индуцирующих только желательное действие на клетку, авторы завершили данное изобретение. Модифицированные антитела данного изобретения имеют необыкновенно высокую активность в сравнении с природными лигандами, такими как ТРО (тромбопоэтин), ЕРО (эритропоэтин) или G-CSF (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор), или цельными антителами (IgG), имеющими ту же самую V-область, что и модифицированные антитела. Они имеют улучшенную проницаемость в ткани вследствие уменьшенного молекулярного размера в сравнении с молекулами антител и отсутствия константных областей.By detecting further that the antibody molecule (whole IgG) can be modified into single chain Fv dimers, single chain bivalent antibodies and the like, which crosslink the cell surface molecule (s), thereby reducing side effects caused by intercellular crosslinking, and the provision of new drugs that induce only the desired effect on the cell, the authors completed this invention. The modified antibodies of the invention have unusually high activity compared to natural ligands such as TPO (thrombopoietin), EPO (erythropoietin) or G-CSF (granulocyte colony stimulating factor), or whole antibodies (IgG) having the same V region, as modified antibodies. They have improved tissue permeability due to the reduced molecular size compared to antibody molecules and the absence of constant regions.
Сущность изобретенияSUMMARY OF THE INVENTION
Целью данного изобретения является обеспечение агонистических модифицированных антител малого молекулярного размера, которые содержат две или более V-областей Н-цепи и две или более V-областей L-цепи моноклональных антител и обладают агонистическим действием посредством сшивания молекулы (молекул) клеточной поверхности или внутриклеточной молекулы (молекул).The aim of this invention is the provision of agonistic modified antibodies of small molecular size, which contain two or more V-regions of the H-chain and two or more V-regions of the L-chain of monoclonal antibodies and have an agonistic effect by crosslinking the molecule (s) of the cell surface or intracellular molecule (molecules).
Таким образом, данное изобретение относится к модифицированным антителам, которые содержат две или более V-областей Н-цепи и две или более V-областей L-цепи, предпочтительно от 2 до 6 каждой, особенно предпочтительно от 2 до 4 каждой, наиболее предпочтительно две каждой из них и обнаруживают агонистическую активность посредством сшивания молекулы (молекул) клеточной поверхности или внутриклеточной молекулы (молекул).Thus, the present invention relates to modified antibodies that contain two or more V-regions of the H chain and two or more V-regions of the L chain, preferably from 2 to 6 each, particularly preferably from 2 to 4 each, most preferably two each of them exhibits agonistic activity by crosslinking the molecule (s) of the cell surface or the intracellular molecule (s).
Термин "модифицированные антитела" в этом описании означает любые вещества, которые содержат две или более V-областей Н-цепи и две или более V-областей L-цепи, где указанные V-области объединены непосредственно или через линкер посредством ковалентной связи или нековалентной связи, например, полипептиды и соединения, получаемые объединением каждой V-области антитела через пептидный линкер или химический сшивающий агент, и т.п. Две или более V-областей Н-цепи и две или более V-областей L-цепи, используемые в данном изобретении, могут быть получены из одного и того же антитела или из различных антител.The term "modified antibodies" in this description means any substance that contains two or more V-regions of the H-chain and two or more V-regions of the L-chain, where these V-regions are combined directly or via a linker via a covalent bond or non-covalent bond for example, polypeptides and compounds obtained by combining each V region of an antibody via a peptide linker or chemical crosslinking agent, and the like. Two or more V-regions of the H chain and two or more V-regions of the L chain used in this invention can be obtained from the same antibody or from different antibodies.
Предпочтительными примерами модифицированных антител данного изобретения являются мультимеры, такие как димеры, тримеры или тетрамеры одноцепочечного Fv-фрагмента, содержащего V-область Н-цепи и V-область L-цепи, или одноцепочечные полипептиды, содержащие две или более V-областей Н-цепи и две или более V-областей L-цепи. Когда модифицированные антитела данного изобретения являются мультимерами одноцепочечных Fv, такими как димеры, тримеры, тетрамеры и т.п., содержащими V-область Н-цепи и V-область L-цепи, предпочтительно, чтобы V-область Н-цепи и V-область L-цепи, находящиеся в одной и той же цепи, не ассоциировались с образованием антигенсвязывающего сайта.Preferred examples of the modified antibodies of the present invention are multimers, such as dimers, trimers or tetramers of a single chain Fv fragment containing the V region of the H chain and V region of the L chain, or single chain polypeptides containing two or more V regions of the H chain and two or more V-regions of the L chain. When the modified antibodies of the present invention are single chain Fv multimers, such as dimers, trimers, tetramers and the like, containing the H chain V region and the L chain V region, it is preferred that the H chain V region and V the region of the L chain located in the same chain was not associated with the formation of an antigen binding site.
Более предпочтительными примерами являются димеры одноцепочечных Fv, которые содержат V-область Н-цепи и V-область L-цепи, или одноцепочечный полипептид, содержащий две V-области Н-цепи и две V-области L-цепи. V-область Н-цепи и V-область L-цепи соединены предпочтительно через линкер в этих модифицированных антителах.More preferred examples are single chain Fv dimers that contain an H chain V region and an L chain V region, or a single chain polypeptide comprising two H chain V regions and two L chain V regions. The V region of the H chain and the V region of the L chain are preferably connected via a linker in these modified antibodies.
"Агонистическое действие" в этом описании означает биологическое действие, происходящее в клетке (клетках), в которые сигнал передается посредством сшивания молекулы (молекул) клеточной поверхности или внутриклеточной молекулы (молекул), например, индукция апоптоза, индукция пролиферации клеток, индукция дифференцировки клеток, индукция клеточного деления или регуляция клеточного цикла."Agonistic action" in this description means the biological action that occurs in the cell (s) into which the signal is transmitted by crosslinking the molecule (s) of the cell surface or intracellular molecule (s), for example, induction of apoptosis, induction of cell proliferation, induction of cell differentiation, induction of cell division or regulation of the cell cycle.
ED50 агонистического действия в данном изобретении определяют известными способами, используемыми для измерения агонистического действия. Примерами являются детектирование агонист-специфической гибели клеток или пролиферации клеток, детектирование экспрессии белков, специфических для дифференцировки клеток (например, специфических антигенов) или измерение киназной активности, специфической для клеточного цикла. ED50 является дозой, требующейся для достижения 50% от максимального эффекта, принятого за 100% на кривой доза-ответ.The agonistic action ED50 in this invention is determined by known methods used to measure agonistic activity. Examples are the detection of agonist-specific cell death or cell proliferation, the detection of expression of proteins specific for cell differentiation (e.g., specific antigens), or the measurement of kinase activity specific for the cell cycle. ED50 is the dose required to achieve 50% of the maximum effect, taken as 100% on the dose-response curve.
Предпочтительные модифицированные антитела данного изобретения обладают агонистическим действием (ED50), эквивалентным или лучшим, чем агонистическое действие антитела, имеющего тот же самый антигенсвязывающий район, что и модифицированное антитело, а именно цельного антитела, такого как IgG (далее называемого "исходным антителом"), имеющего ту же самую пару V-области Н-цепи и V-области L-цепи, что и пара V-области Н-цепи и V-области L-цепи, образующая антигенсвязывающий район модифицированного антитела. Более предпочтительными являются антитела, имеющие агонистическое действие (ED50), более чем в два раза превышающее агонистическое действие исходного антитела, более предпочтительно - более чем в 5 раз, наиболее предпочтительно - более чем в 10 раз. Данное изобретение включает в себя модифицированные антитела с агонистическим действием, содержащие V-область Н-цепи и V-область L-цепи, образующие тот же самый антигенсвязывающий район, что и исходное антитело, которое связывается с молекулой-мишенью (молекулами-мишенями) клеточной поверхности или внутриклеточной молекулой (молекулами), но не обладает агонистическим действием на эту молекулу.Preferred modified antibodies of the present invention have an agonistic effect (ED50) equivalent to or better than the agonistic effect of an antibody having the same antigen binding region as the modified antibody, namely a whole antibody such as IgG (hereinafter referred to as the "parent antibody"), having the same pair of the V region of the H chain and the V region of the L chain as the pair of the V region of the H chain and the V region of the L chain, forming the antigen binding region of the modified antibody. More preferred are antibodies having an agonistic effect (ED50) of more than two times the agonistic effect of the parent antibody, more preferably more than 5 times, most preferably more than 10 times. The present invention includes modified agonist antibodies containing the V region of the H chain and the V region of the L chain, forming the same antigen binding region as the original antibody that binds to the target molecule (target molecules) of the cell surface or intracellular molecule (s), but does not have an agonistic effect on this molecule.
Соединения, содержащие две или более V-областей Н-цепи и две или более V-областей L-цепи данного изобретения могут быть любыми соединениями, которые содержат две или более V-областей Н-цепи и две или более V-областей L-цепи антитела и обнаруживают агонистическое действие (ED50), эквивлентное или лучшее, чем агонистическое действие природного лиганда, связывающегося с молекулой (молекулами) клеточной поверхности или внутриклеточной молекулой (молекулами). Предпочтительными являются соединения, имеющие агонистическое действие (ED50), более чем в два раза превышающее агонистическое действие природного лиганда, более предпочтительно - более чем в 5 раз, наиболее предпочтительно - более чем в 10 раз.Compounds containing two or more H chain V regions and two or more L chain V regions of the present invention can be any compounds that contain two or more H chain V regions and two or more L chain V regions antibodies and exhibit an agonistic effect (ED50), equivalent to or better than the agonistic effect of a natural ligand that binds to the cell surface molecule (s) or intracellular molecule (s). Preferred are compounds having an agonistic effect (ED50) of more than two times the agonistic effect of a natural ligand, more preferably more than 5 times, most preferably more than 10 times.
"Соединения", упоминаемые здесь, включают в себя не только модифицированные антитела данного изобретения, но также любые соединения, содержащие два или более, предпочтительно от 2 до 6, более предпочтительно от 2 до 4, наиболее предпочтительно 2 антигенсвязывающих района, такие как цельные антитела или F(ab')2.The “compounds” referred to here include not only the modified antibodies of the invention, but also any compounds containing two or more, preferably from 2 to 6, more preferably from 2 to 4, most preferably 2 antigen binding regions, such as whole antibodies or F (ab ') 2 .
Модифицированные антитела или соединения данного изобретения, содержащие две или более V-областей Н-цепи и две или более V-областей L-цепи антитела, предпочтительно не имеют существенного межклеточного адгезионного действия. Когда V-область Н-цепи и V-область L-цепи модифицированных антител данного изобретения происходят из одного и того же антитела, они предпочтительно имеют межклеточное адгезионное действие (ED50) не более 1/10 в сравнении с исходным антителом.Modified antibodies or compounds of this invention containing two or more V-regions of the H chain and two or more V-regions of the L chain of the antibody, preferably do not have significant intercellular adhesive action. When the V region of the H chain and the V region of the L chain of the modified antibodies of the present invention are derived from the same antibody, they preferably have an intercellular adhesion action (ED50) of not more than 1/10 compared to the original antibody.
ED50 межклеточного адгезионного действия определяют в данном изобретении известными способами для измерения агонистического действия, например, измерением агломерирующего действия клеток, экспрессирующих указанную молекулу клеточной поверхности, таким как тест гемагглютинации.An intercellular adhesion action ED50 is determined in this invention by known methods for measuring agonistic action, for example, by measuring the agglomerating effect of cells expressing said cell surface molecule, such as a hemagglutination test.
Данное изобретение относится к ДНК, которые кодируют эти модифицированные антитела.This invention relates to DNA that encodes these modified antibodies.
Данное изобретение относится к клеткам животных или микроорганизмам, которые продуцируют эти модифицированные антитела.This invention relates to animal cells or microorganisms that produce these modified antibodies.
Данное изобретение относится к применению модифицированных антител в качестве агониста.This invention relates to the use of modified antibodies as an agonist.
Данное изобретение относится к способу передачи сигнала в клетки посредством сшивания молекулы клеточной поверхности или внутриклеточной молекулы с использованием модифицированного антитела и тем самым индуцирования агонистического действия на клетки, такого как индукция апоптоза, индукция пролиферации клеток, индукция дифференцировки клеток, индукция клеточного деления или действие на регуляцию клеточного цикла.This invention relates to a method for transmitting a signal to cells by crosslinking a cell surface molecule or an intracellular molecule using a modified antibody and thereby inducing an agonistic effect on cells, such as inducing apoptosis, inducing cell proliferation, inducing cell differentiation, inducing cell division or regulating effects cell cycle.
Данное изобретение относится к лекарственному средству, содержащему модифицированное антитело.This invention relates to a medicament containing a modified antibody.
Данное изобретение относится к применению модифицированного антитела в качестве лекарственного средства.This invention relates to the use of a modified antibody as a medicine.
Данное изобретение относится к способу скрининга или измерения модифицированного антитела, которое содержит две или более V-областей Н-цепи и две или более V-областей L-цепи антитела и обнаруживает агонистическое действие посредством сшивания молекулы клеточной поверхности или внутриклеточной молекулы, включающему 1) получение модифицированного антитела, содержащего две или более V-областей Н-цепи и две или более V-областей L-цепи антитела и связывающего специфически указанную молекулу, 2) контактирование модифицированного антитела с клетками, экспрессирующими указанную молекулу, и 3) измерение агонистического действия, вызываемого сшиванием указанной молекулы, которое имеет место в этих клетках. Этот способ измерения применим для контроля качества при получении модифицированных антител данного изобретения в качестве лекарственного средства и для других целей.This invention relates to a method for screening or measuring a modified antibody, which contains two or more V-regions of the H chain and two or more V-regions of the L chain of the antibody and exhibits an agonistic effect by crosslinking a cell surface molecule or an intracellular molecule, including 1) obtaining a modified antibody containing two or more V-regions of the H chain and two or more V-regions of the L chain of the antibody and binding a specific molecule, 2) contacting the modified antibody with glue tissues expressing the specified molecule, and 3) measuring the agonistic effect caused by crosslinking of the specified molecule, which takes place in these cells. This measurement method is applicable for quality control in obtaining the modified antibodies of the present invention as a medicine and for other purposes.
Вышеупомянутый одноцепочечный Fv-димер включает в себя димер, образованный через нековалентную связь, димер, образованный через ковалентную связь через сшивающий радикал, и димер, образованный через сшивающий реагент (антитело, фрагмент антитела или бивалентное модифицированное антитело). Обычные сшивающие радикалы, используемые для образования поперечных связей в пептидах, могут быть использованы в качестве сшивающих радикалов для образования этих димеров. Примерами являются дисульфидные поперечные связи с участием остатка цистеина, другие сшивающие радикалы, такие как С4-С10-алкилены (например, тетраметилен, пентаметилен, гексаметилен, гептаметилен и октаметилен и т.д.) или С4-С10-алкенилены (цис/транс-3-бутенилен, цис/транс-2-пентенилен, цис/транс-3-пентенилен, цис/транс-3-гексенилен и т.д.).The aforementioned single chain Fv dimer includes a dimer formed through a non-covalent bond, a dimer formed through a covalent bond through a crosslinking radical, and a dimer formed through a crosslinking reagent (antibody, antibody fragment or bivalent modified antibody). Conventional crosslinking radicals used to crosslink peptides can be used as crosslinking radicals to form these dimers. Examples are disulfide cross-links involving a cysteine residue, other crosslinking radicals such as C 4 -C 10 alkylenes (e.g. tetramethylene, pentamethylene, hexamethylene, heptamethylene and octamethylene, etc.) or C 4 -C 10 alkenylene ( cis / trans-3-butenylene, cis / trans-2-pentenylene, cis / trans-3-pentenylene, cis / trans-3-hexenylene, etc.).
Кроме того, сшивающим реагентом, который может объединяться с одноцепочечным Fv, является, например, аминокислотная последовательность, которая может быть необязательно введена в Fv, например, антитело против последовательности FLAG и т.п. или его фрагмент, или модифицированное антитело, происходящее из этого антитела, например, одноцепочечный Fv.In addition, a crosslinking reagent that can be combined with a single chain Fv is, for example, an amino acid sequence that can optionally be introduced into the Fv, for example, an antibody against the FLAG sequence and the like. or a fragment thereof, or a modified antibody derived from this antibody, for example, single chain Fv.
Данное изобретение относится также к способу индукции агонистического действия в отношении клеток путем введения первого лиганда и второго лиганда, которые объединяются с молекулой (молекулами) клеточной поверхности или внутриклеточной молекулой (молекулами), и введением вещества, которое соединяется с первым и вторым лигандами и образует поперечную связь между первым и вторым лигандами. Первый и второй лиганды могут быть любыми веществами, которые содержат сайт связывания для указанной молекулы и могут индуцировать агонистическое действие, будучи сшитыми поперечной связью. Предпочтительными примерами являются моновалентные модифицированные антитела, такие, как тот же самый или иной одноцепочечный Fv-мономер, фрагмент антитела и т.д. Веществом для сшивания вышеупомянутого лиганда могут быть любые вещества, которые индуцируют агонистическое действие в отношении клеток посредством образования поперечной связи между первым лигандом и вторым лигандом. Предпочтительными примерами являются антитела, фрагменты антител, (Fab)2 или бивалентные модифицированные антитела. Примерами бивалентных антител являются (Fab)2, димеры одноцепочечного Fv, содержащего одну V-область Н-цепи и одну V-область L-цепи, и одноцепочечные полипептиды, содержащие две V-области Н-цепи и две V-области L-цепи. Этот способ является эффективным для исследования рецепторов, которые передают сигнал в клетки посредством образования поперечных сшивок, ожидается, что он может быть использован для DDS для доставки лекарственного средства к клеткам-мишеням, и является также применимым в качестве системы доставки лекарственного средства, которая подавляет побочное действие и позволяет лекарственному средству становиться эффективным в желаемое время и в течение желаемого периода времени.The present invention also relates to a method for inducing an agonistic effect on cells by introducing a first ligand and a second ligand that combine with a cell surface molecule (s) or an intracellular molecule (s), and introducing a substance that binds to the first and second ligands and forms a transverse the relationship between the first and second ligands. The first and second ligands can be any substances that contain a binding site for the specified molecule and can induce an agonistic effect, being crosslinked. Preferred examples are monovalent modified antibodies, such as the same or a different single chain Fv monomer, antibody fragment, etc. The substance for crosslinking the aforementioned ligand can be any substance that induces an agonistic effect on cells by means of crosslinking between the first ligand and the second ligand. Preferred examples are antibodies, antibody fragments, (Fab) 2, or bivalent modified antibodies. Examples of bivalent antibodies are (Fab) 2 , single chain Fv dimers containing one H chain V region and one L chain V region, and single chain polypeptides containing two H chain V regions and two L chain V regions . This method is effective for studying receptors that transmit a signal to cells through cross-linking, it is expected that it can be used for DDS to deliver drugs to target cells, and is also useful as a drug delivery system that suppresses side effects. action and allows the drug to become effective at the desired time and for the desired period of time.
Модифицированные антитела данного изобретения могут быть любыми веществами, которые содержат V-область Н-цепи и V-область L-цепи антитела (например, антитела MABL-1, антитела MABL-2, антитела 12 В5, антитела 12Е10 и т.д.) и которые специфически узнают молекулу (молекулы) клеточной поверхности или внутриклеточную молекулу (молекулы), например, белок (рецептор или белок, участвующий в передаче сигнала) или углеводную цепь вышеупомянутого белка или белка клеточной мембраны и сшивают указанные молекулы клеточной поверхности, передавая тем самым сигнал в клетки. Включены также модифицированные антитела, в которых часть аминокислотной последовательности V-области была изменена.The modified antibodies of the present invention can be any substance that contains the V region of the H chain and V region of the L chain of the antibody (for example, MABL-1 antibodies, MABL-2 antibodies, 12 B5 antibodies, 12E10 antibodies, etc.) and which specifically recognize the cell surface molecule (s) or intracellular molecule (s), for example, a protein (receptor or protein involved in signal transduction) or the carbohydrate chain of the aforementioned protein or cell membrane protein and crosslink these cell surface molecules, thereby transmitting a signal VK letki. Modified antibodies are also included in which a portion of the amino acid sequence of the V region has been changed.
В зависимости от характеристик молекулы клеточной поверхности или внутриклеточной молекулы, подлежащих объединению, например, структуры молекулы или механизма действий, модифицированные антитела могут быть моноспецифическими или полиспецифическими, например, биспецифическими. Когда модифицированное антитело соединяется с рецепторной молекулой, которая гомодимеризуется и передает сигнал в клетки (например, рецептором эритропоэтина, рецептором тромбопоэтина, G-CSF-рецептором, SCF-рецептором, EGF-рецептором, IAP (CD47) и т.п.), предпочтительным является моноспецифическое модифицированное антитело. Когда оно соединяется с рецепторной молекулой, которая гетеродимеризуется и передает сигнал в клетки (например, IL-6-рецептором, LIF-рецептором, IL-11-рецептором), предпочтительным является биспецифическое модифицированное антитело. Когда оно соединяется с рецепторной молекулой, которая гетеротримеризуется и передает сигнал в клетки (например, IL-2-рецептором, CNTF-рецептором, OSM-рецептором), предпочтительным является триспецифическое модифицированное антитело. Способ получения биспецифических одноцепочечных Fv-димеров описан в W094/13804 и т.п.Depending on the characteristics of the cell surface molecule or intracellular molecule to be combined, for example, the structure of the molecule or the mechanism of action, the modified antibodies can be monospecific or multispecific, for example, bispecific. When a modified antibody binds to a receptor molecule that homodimerizes and transmits a signal to cells (e.g., erythropoietin receptor, thrombopoietin receptor, G-CSF receptor, SCF receptor, EGF receptor, IAP (CD47), etc.), preferred is a monospecific modified antibody. When it binds to a receptor molecule that heterodimerizes and transmits a signal to cells (e.g., IL-6 receptor, LIF receptor, IL-11 receptor), a bispecific modified antibody is preferred. When it binds to a receptor molecule that heterotrimers and transmits a signal to cells (e.g., IL-2 receptor, CNTF receptor, OSM receptor), a trispecific modified antibody is preferred. A method for producing bispecific single chain Fv dimers is described in W094 / 13804 and the like.
Данное изобретение относится также к модифицированным антителам, V-область Н-цепи и/или V-область L-цепи которых является V-областью Н-цепи, полученной из антитела человека, и/или V-областью L-цепи, полученной из антитела человека. V-область Н-цепи и/или V-область L-цепи, полученные из антитела человека, могут быть получены скринингом библиотеки моноклональных антител человека, как описано в W099/10494. Включены также V-область Н-цепи и V-область L-цепи, полученные из моноклональных антител человека.The present invention also relates to modified antibodies, the V region of the H chain and / or the V region of the L chain of which is the V region of the H chain derived from a human antibody, and / or the V region of the L chain derived from the antibody person. The V region of the H chain and / or the V region of the L chain obtained from a human antibody can be obtained by screening a library of human monoclonal antibodies, as described in W099 / 10494. Also included are the V region of the H chain and the V region of the L chain derived from human monoclonal antibodies.
Далее данное изобретение относится к модифицированным антителам, V-область Н-цепи и/или V-область L-цепи которых являются гуманизированными V-областями Н-цепи и/или гуманизированными V-областями L-цепи. Конкретно, гуманизированные модифицированные антитела состоят из гуманизированной V-области L-цепи, которая содержит каркасные области (FR), происходящие из V-области L-цепи моноклонального антитела человека, и определяющих комплементарность (гипервариабельных) участков (далее называемых "CDR"), происходящих из V-области L-цепи моноклонального антитела млекопитающего, отличного от человека (например, мыши, крысы, коровы, овцы, обезьяны), и/или гуманизированной V-области Н-цепи, которая содержит FR, происходящие из V-области Н-цепи моноклонального антитела человека, и CDR, происходящие из V-области Н-цепи моноклонального антитела млекопитающего, отличного от человека, (например, мыши, крысы, коровы, овцы, обезьяны). В этом случае аминокислотная последовательность CDR и FR может быть частично изменена, например, делетирована, заменена или дополнена.The invention further relates to modified antibodies, the V region of the H chain and / or the V region of the L chain of which are the humanized V regions of the H chain and / or the humanized V regions of the L chain. Specifically, humanized modified antibodies consist of a humanized V region of an L chain that contains framework regions (FR) originating from the V region of the L chain of a human monoclonal antibody and determining complementarity of the (hypervariable) regions (hereinafter referred to as “CDRs”) originating from the V region of the L chain of a non-human mammalian monoclonal antibody (e.g., mouse, rat, cow, sheep, monkey), and / or a humanized V region of the H chain that contains FRs originating from the V region of H monoclonal chains ntitela human and CDR, originating from the V-region of the H chain of a monoclonal antibody of a mammal other than human (e.g., mouse, rat, cow, sheep, monkeys). In this case, the amino acid sequence of CDR and FR can be partially changed, for example, deleted, replaced or supplemented.
V-области Н-цепи и/или V-области L-цепи модифицированных антител данного изобретения могут быть V-областью Н-цепи и/или V-областью L-цепи, происходящими из моноклональных антител животных, иных чем человек (таких как мышь, крыса, корова, овца, обезьяна, курица и т.п.). В этом случае аминокислотная последовательность CDR и FR может быть частично изменена, например, делетирована, заменена или дополнена.The V regions of the H chain and / or the V regions of the L chain of the modified antibodies of the present invention may be the V region of the H chain and / or the V region of the L chain derived from monoclonal antibodies of animals other than humans (such as a mouse , rat, cow, sheep, monkey, chicken, etc.). In this case, the amino acid sequence of CDR and FR can be partially changed, for example, deleted, replaced or supplemented.
Данное изобретение относится также к ДНК, кодирующим различные модифицированные антитела, упоминаемые выше, и способам генетической инженерии для получения рекомбинантных векторов, содержащих такие ДНК.The present invention also relates to DNA encoding the various modified antibodies mentioned above, and genetic engineering methods for producing recombinant vectors containing such DNA.
Данное изобретение относится также к клеткам-хозяевам, трансформированным этими рекомбинантными векторами. Примерами клеток-хозяев являются клетки животных, такие как клетки человека, клетки мыши или т.п., и микроорганизмы, такие как Е.coli. Bacillus subtilis, дрожжи или т.п.This invention also relates to host cells transformed with these recombinant vectors. Examples of host cells are animal cells, such as human cells, mouse cells or the like, and microorganisms, such as E. coli. Bacillus subtilis, yeast or the like
Данное изобретение относится к способу получения модифицированных антител, включающему культивирование вышеупомянутых хозяев и экстракцию модифицированных антител из их культуры.This invention relates to a method for producing modified antibodies, comprising culturing the aforementioned hosts and extracting the modified antibodies from their culture.
Данное изобретение относится далее к способу получения димера одноцепочечного Fv, включающему культивирование клеток-хозяев животного, продуцирующих одноцепочечный Fv, в бессывороточной среде для секреции одноцепочечного Fv в эту среду и выделение димера одноцепочечного Fv, образовавшегося в среде.The present invention further relates to a method for producing a single-chain Fv dimer comprising culturing single-chain Fv-producing animal host cells in a serum-free medium to secrete single-chain Fv into this medium and isolating the single-chain Fv dimer formed in the medium.
Данное изобретение относится также к применению модифицированных антител в качестве агониста, т.е. оно относится к агонисту передачи сигнала, который содержит в качестве активного ингредиента вышеупомянутое модифицированное антитело. Поскольку модифицированными антителами, используемыми в данном изобретении, являются модифицированные антитела, которые образуют поперечные сшивки между молекулой (молекулами) клеточной поверхности или внутриклеточной молекулой (молекулами) и индуцируют передачу сигнала, такая молекула может быть любой молекулой, которая олигомеризуется, например, димеризуется, посредством соединения с лигандом и тем самым передает сигнал в клетки.The present invention also relates to the use of modified antibodies as an agonist, i.e. it relates to a signaling agonist that contains the aforementioned modified antibody as an active ingredient. Since the modified antibodies used in this invention are modified antibodies that form cross-links between the cell surface molecule (s) or intracellular molecule (s) and induce signal transmission, such a molecule can be any molecule that oligomerizes, for example, dimerizes, by compounds with the ligand and thereby transmits a signal to the cells.
Такая молекула клеточной поверхности включает в себя рецепторы гормонов и рецепторы цитокинов. Рецепторы гормонов включают в себя, например, рецептор эстрогена. Рецептор цитокинов и т.п. включает в себя рецептор гемопоэтического фактора, рецептор лимфокина, рецептор фактора роста, рецептор фактора регуляции дифференцировки и т.п. Примерами рецепторов цитокинов являются рецептор эритропоэтина (ЕРО), рецептор тромбопоэтина (ТРО), рецептор гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF), рецептор макрофагального колониестимулирующего фактора (M-CSF), рецептор гранулоцитарного-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF), рецептор фактора некроза опухолей (TNF), рецептор интерлейкина-1 (IL-1), рецептор интерлейкина-2 (IL-2), рецептор интерлейкина-3 (IL-3), рецептор интерлейкина-4 (IL-4), рецептор интерлейкина-5 (IL-5), рецептор интерлейкина-6 (IL-6), рецептор интерлейкина-7 (IL-7), рецептор интерлейкина-9 (IL-9), рецептор интерлейкина-10 (IL-10), рецептор интерлейкина-11 (IL-11), рецептор интерлейкина-12 (IL-12), рецептор интерлейкина-13 (IL-13), рецептор интерлейкина-15 (IL-15), рецептор интерферона-альфа (IFN-альфа), рецептор интерферона-бета (IFN-бета), рецептор интерферона-гамма (IFN-гамма), рецептор гормона роста (GH), рецептор инсулина, рецептор фактора пролиферации стволовых клеток крови (SCF), рецептор фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), рецептор эпидермального фактора роста (EGF), рецептор фактора роста нервов (NGF), рецептор фактора роста фибробластов (FGF), рецептор тромбоцитарного фактора роста (PDGF), рецептор трансформирующего фактора роста бета (TGF-бета), рецептор фактора ингибирования миграции лейкоцитов (LIF), рецептор цилиарного нейротрофического фактора (CNTF), рецептор онкостатина М (OSM), рецептор Notch-семейства (семейства больших трансмембранных рецепторов) и т.п.Such a cell surface molecule includes hormone receptors and cytokine receptors. Hormone receptors include, for example, an estrogen receptor. Cytokine receptor, etc. includes a hematopoietic factor receptor, a lymphokine receptor, a growth factor receptor, a differentiation regulation receptor, and the like. Examples of cytokine receptors are erythropoietin receptor (EPO), thrombopoietin receptor (TPO), granulocyte colony stimulating factor receptor (G-CSF), macrophage colony stimulating factor receptor (M-CSF), granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM) receptor, GM receptor tumor necrosis (TNF), interleukin-1 receptor (IL-1), interleukin-2 receptor (IL-2), interleukin-3 receptor (IL-3), interleukin-4 receptor (IL-4), interleukin-5 receptor (IL-5), interleukin-6 receptor (IL-6), interleukin-7 receptor (IL-7), interleukin-9 receptor (IL-9), interleukin-10 receptor (IL-10), interleukin-11 receptor (IL-11), interleukin-12 receptor (IL-12), interleukin-13 receptor (IL-13), interleukin-15 receptor (IL-15), interferon-alpha receptor (IFN-alpha), interferon-beta receptor (IFN-beta), interferon-gamma receptor (IFN-gamma), growth hormone receptor (GH), insulin receptor, blood stem cell proliferation factor receptor (SCF), vascular endothelial growth factor receptor (VEGF), epidermal growth factor receptor (EGF), nerve growth factor receptor (NGF), fibrobl growth factor receptor astov (FGF), platelet growth factor receptor (PDGF), transforming growth factor beta receptor (TGF-beta), leukocyte migration inhibition factor receptor (LIF), ciliary neurotrophic factor receptor (CNTF), oncostatin M receptor (OSM), Notch receptor -families (families of large transmembrane receptors), etc.
Молекула внутриклеточной поверхности включает ТАК1, ТАВ1 и т.п. ТАК1 и ТАВ1 функционируют в пути передачи сигнала TGF-β, активируют МАР-киназу путем образования гетеродимера и передают ряд сигналов. Многие раковые клетки имеют мутацию рецептора TGF-β, который репрессирует рост рака и, следовательно, сигнал TGF-β не передается. Модифицированные антитела, которые могут передавать сигнал посредством образования поперечных связей между ТАК1 и ТАВ1, могут индуцировать этот сигнал TGF-β через агонистическое действие посредством соединения ТАК1/TAB1. Такие модифицированные антитела данного изобретения могут ингибировать рост TGF-β-устойчивых раковых клеток и обеспечивают новый способ для терапии рака. Другими примерами внутриклеточной молекулы являются гомодимер фактора транскрипции E2F и гетеродимер E2F/DP1, обладающие пролиферативным действием на клетки. Модифицированные антитела данного изобретения могут индуцировать агонистическое действие также на эти молекулы и, следовательно, могут быть использованы для лечения различных связанных с пролиферацией клеток (клеточно-пролиферативных) заболеваний. Модифицированные антитела данного изобретения могут индуцировать агонистическое действие посредством образования поперечных сшивок внутриклеточного фактора, участвующего в передаче сигнала, связанного с индукцией апоптоза, и, следовательно, индуцировать апоптозную гибель раковых клеток или связанных с аутоиммунным заболеванием клеток.The intracellular surface molecule includes TAK1, TAB1, and the like. TAK1 and TAB1 function in the TGF-β signal transmission pathway, activate MAP kinase by forming a heterodimer, and transmit a series of signals. Many cancer cells have a TGF-β receptor mutation that represses cancer growth and, therefore, no TGF-β signal is transmitted. Modified antibodies, which can transmit a signal through crosslinking between TAK1 and TAB1, can induce this TGF-β signal through an agonist action through the TAK1 / TAB1 compound. Such modified antibodies of the present invention can inhibit the growth of TGF-β-resistant cancer cells and provide a new method for the treatment of cancer. Other examples of an intracellular molecule are the homodimer of transcription factor E2F and the heterodimer E2F / DP1, which have a proliferative effect on cells. The modified antibodies of the present invention can also induce an agonistic effect on these molecules and, therefore, can be used to treat various cell proliferation (cell-proliferative) diseases. The modified antibodies of the present invention can induce an agonistic effect by cross-linking the intracellular factor involved in signal transmission associated with the induction of apoptosis and, therefore, induce apoptotic death of cancer cells or autoimmune disease-related cells.
Для обеспечения взаимодействия модифицированных антител данного изобретения с внутриклеточной молекулой, пептиды, способные проникать через клеточную мембрану, (например, Пегелин, Пенетратин), могут быть использованы для транспорта модифицированных антител в клетки (Martine Mazel et al., Doxorubicin-peptide conjugates overcome multidrug resistance. Anti-Cancer Drugs 2001, 12, Dccrossi D. et al., The third helix of the antennapedia homeodomain translocates through biological membranes, J. Biol. Chem. 1994, 269, 10444-10450).To allow the modified antibodies of this invention to interact with the intracellular molecule, peptides capable of penetrating the cell membrane (e.g., Pegelin, Penetratin) can be used to transport the modified antibodies to cells (Martine Mazel et al., Doxorubicin-peptide conjugates overcome multidrug resistance Anti-Cancer Drugs 2001, 12, Dccrossi D. et al., The third helix of the antennapedia homeodomain translocates through biological membranes, J. Biol. Chem. 1994, 269, 10444-10450).
Таким образом, фармацевтические препараты, содержащие агонистическое модифицированное антитело в качестве активного ингредиента, применимы в качестве профилактических средств и/или лечебных средств и т.д. для различных заболеваний, таких как раки, воспаление, гормональные нарушения, заболевания крови и аутоиммунные заболевания.Thus, pharmaceutical preparations containing an agonist modified antibody as an active ingredient are useful as prophylactic agents and / or therapeutic agents, etc. for various diseases, such as cancers, inflammation, hormonal disorders, blood diseases and autoimmune diseases.
Олигомеры, которые могут быть образованы рецепторными белками, могут быть гомо-олигомерами или гетеро-олигомерами и любыми олигомерами, такими как димеры, тримеры и тетрамеры. Известно, например, что рецептор эритропоэтина, рецептор тромбопоэтина, рецептор G-CSF, рецептор SCF, рецептор EGF и т.п. образуют гомодимеры, что рецептор IL-6, рецептор LIF и рецептор IL-11 образуют гетеродимеры и что рецептор IL-2, рецептор CNTF, рецептор OSM образуют гетеротримеры.The oligomers that can be formed by receptor proteins can be homo-oligomers or hetero-oligomers and any oligomers such as dimers, trimers and tetramers. For example, erythropoietin receptor, thrombopoietin receptor, G-CSF receptor, SCF receptor, EGF receptor and the like are known. form homodimers, that IL-6 receptor, LIF receptor and IL-11 receptor form heterodimers and that IL-2 receptor, CNTF receptor, OSM receptor form heterotrimers.
Модифицированные антитела данного изобретения содержат две или более V-областей Н-цепи и две или более V-областей L-цепи, происходящие из моноклональных антител. Структура этих модифицированных антител может быть представлена димером одноцепочечного Fv, содержащего одну V-область Н-цепи и одну V-область L-цепи, или полипептидом, содержащим две V-области Н-цепи и две V-области L-цепи. В модифицированных антителах данного изобретения V-области Н-цепи и L-цепи предпочтительно связаны через пептидный линкер, который состоит из одной или более аминокислот.Полученные модифицированные антитела содержат вариабельные области антител и связываются с антигеном с такой же специфичностью, что и специфичность исходных моноклональных антител.Modified antibodies of the present invention contain two or more V regions of the H chain and two or more V regions of the L chain derived from monoclonal antibodies. The structure of these modified antibodies can be represented by a single chain Fv dimer containing one H chain V region and one L chain V region, or a polypeptide containing two H chain V regions and two L chain V regions. In the modified antibodies of the present invention, the V regions of the H chain and L chain are preferably linked via a peptide linker that consists of one or more amino acids. The obtained modified antibodies contain variable regions of antibodies and bind to the antigen with the same specificity as the specificity of the original monoclonal antibodies.
V-область Н-цепиH chain V region
В данном изобретении V-область Н-цепи, полученная из антитела, узнает молекулу (молекулы) клеточной поверхности или внутриклеточную молекулу (молекулы), например, белок (рецептор или связанный с передачей сигнала белок) или углеводную цепь этого белка или на клеточной мембране и олигомеризует, например, димеризует указанную молекулу через образование поперечных сшивок и тем самым трансдуцирует сигнал в клетки. V-область Н-цепи данного изобретения включает в себя V-области Н-цепи, происходящие из млекопитающего (например, человека, мыши, крысы, коровы, овцы, обезьяны и т.д.), и V-области Н-цепи, имеющие частично модифицированные аминокислотные последовательности V-областей Н-цепи. Более предпочтительной является гуманизированная V-область Н-цепи, содержащая FR V-области Н-цепи моноклонального антитела человека и CDR V-области Н-цепи моноклонального антитела мыши. Также предпочтительной является V-область Н-цепи, имеющая аминокислотную последовательность, происходящую из человека, которая может быть получена рекомбинантным способом. V-область Н-цепи данного изобретения может быть фрагментом V-области Н-цепи, который сохраняет антигенсвязывающую способность.In the present invention, the H chain V region derived from an antibody recognizes a cell surface molecule (s) or an intracellular molecule (s), for example, a protein (receptor or signal transduction protein) or a carbohydrate chain of that protein or on a cell membrane and oligomerizes, for example, dimerizes the specified molecule through the formation of cross-linking and thereby transduces the signal into cells. The H chain V region of the present invention includes H chain V regions derived from a mammal (e.g., human, mouse, rat, cow, sheep, monkey, etc.), and H chain V regions, having partially modified amino acid sequences of H chain V regions. More preferred is a humanized H chain V region containing the FR of the H chain V region of the human monoclonal antibody and the CDR of the H chain V region of the mouse monoclonal antibody. Also preferred is the V region of the H chain having an amino acid sequence derived from a human that can be obtained recombinantly. The V region of the H chain of the present invention may be a fragment of the V region of the H chain that retains antigen binding capacity.
V-область L-цепиL chain V region
В данном изобретении V-область L-цепи узнает молекулу (молекулы) клеточной поверхности или внутриклеточную молекулу (молекулы), например, белок (рецептор или связанный с трансдукцией сигнала белок) или углеводную цепь этого белка или на клеточной мембране и олигомеризует, например, димеризует указанную молекулу через образование поперечных сшивок и тем самым трансдуцирует сигнал в клетки. V-область L-цепи данного изобретения включает в себя V-области L-цепи данного изобретения, происходящие из млекопитающего (например, человека, мыши, крысы, коровы, овцы, обезьяны и т.д.), и V-области L-цепи, имеющие частично модифицированные аминокислотные последовательности V-областей L-цепи. Более предпочтительной является гуманизированная V-область L-цепи, содержащая FR V-области L-цепи моноклонального антитела человека и CDR V-области L-цепи моноклонального антитела мыши. Также предпочтительной является V-область L-цепи, имеющая аминокислотную последовательность, происходящую из антитела человека, которая может быть получена рекомбинантным способом. V-области L-цепи данного изобретения могут быть фрагментами вышеупомянутой V-области L-цепи, которые сохраняют антигенсвязывающую способность.In the present invention, the L chain V region recognizes a cell surface molecule (s) or an intracellular molecule (s), for example, a protein (receptor or signal transduction-related protein) or a carbohydrate chain of this protein or on a cell membrane and oligomerizes, for example, dimerizes the specified molecule through the formation of cross-linking and thereby transduces the signal into cells. The L chain V region of the present invention includes the L chain V regions of the present invention originating from a mammal (e.g., human, mouse, rat, cow, sheep, monkey, etc.), and the L- V region chains having partially modified amino acid sequences of the V regions of the L chain. More preferred is a humanized V region of the L chain containing the FR of the V region of the L chain of a human monoclonal antibody and the CDR of the V region of the L chain of a mouse monoclonal antibody. Also preferred is the V region of the L chain having an amino acid sequence derived from a human antibody, which can be obtained recombinantly. V-regions of the L chain of the present invention can be fragments of the aforementioned V-region of the L chain, which retain antigen binding ability.
Определяющий комплементарность (гипервариабельный) участок (CDR)Complementarity determining (hypervariable) region (CDR)
Каждая V-область L-цепи и Н-цепи образует антигенсвязывающий сайт. Вариабельная область L- и Н-цепей состоит из сравнительно консервативных четырех общих каркасных областей, соединенных с тремя гипервариабельными участками, или определяющими комплементарность участками (CDR) (Kabat, E.A. et al., "Sequence of Protein of Immunological Interest", US Dept. Health and Human Services, 1983).Each V region of the L chain and H chain forms an antigen binding site. The variable region of L and H chains consists of relatively conservative four common framework regions connected to three hypervariable regions, or complementarity determining regions (CDRs) (Kabat, EA et al., "Sequence of Protein of Immunological Interest", US Dept. Health and Human Services, 1983).
Основные части этих четырех каркасных областей (FR) образуют β-складчатые структуры и три CDR, таким образом, образуют петлю. В определенных случаях CDR могут образовывать часть этой β-складчатой структуры. Эти три CDR удерживаются в стерически близком положении относительно друг друга посредством каркасной области FR, которая вносит вклад в образование антигенсвязывающего сайта вместе с тремя CDR.The main parts of these four framework regions (FR) form β-folded structures and three CDRs, thus forming a loop. In certain instances, CDRs may form part of this β-fold structure. These three CDRs are kept in sterically close position relative to each other through the FR framework region, which contributes to the formation of the antigen binding site together with the three CDRs.
Эти CDR могут быть идентифицированы сравнением аминокислотной последовательности V-области полученного антитела с известными аминокислотными последовательностями V-областей известных антител в соответствии с эмпирическим правилом Kabat, E.A. et al., "Sequence of Protein of Immunological Interest".These CDRs can be identified by comparing the amino acid sequence of the V region of the obtained antibody with the known amino acid sequences of the V regions of the known antibodies in accordance with the rule of thumb Kabat, E.A. et al., "Sequence of Protein of Immunological Interest".
Одноцепочечный Fv-фрагментSingle chain Fv fragment
Одноцепочечный Fv-фрагмент является полипептидным мономером, содержащим связанные друг с другом V-область Н-цепи и V-область L-цепи, которые происходят из моноклональных антител. Полученные одноцепочечные Fv содержат вариабельные области исходных ("родительских") антител и сохраняют их определяющий комплементарность район и, следовательно, одноцепочечные Fv связываются с антигеном с той же самой специфичностью, что и специфичность исходных моноклональных антител (Патентная заявка Японии JP-Appl. 11-63557). Часть вариабельной области и/или CDR одноцепочечного Fv данного изобретения может быть частично изменена, например, делетирована, заменена или дополнена. V-область Н-цепи и V-область L-цепи, составляющие одноцепочечный Fv данного изобретения, упоминаются выше и могут быть связаны непосредственно или через линкер, предпочтительно через пептидный линкер. Строение одноцепочечного Fv может быть следующим: [V-область Н-цепи]-[V-область L-цепи] или [V-область L-цепи]-[V-область Н-цепи]. В данном изобретении можно добиться того, чтобы одноцепочечный Fv образовывал димер, тример или тетрамер, из которых может быть получено модифицированное антитело данного изобретения.A single chain Fv fragment is a polypeptide monomer containing H-chain V region and L chain V region that are derived from monoclonal antibodies. The obtained single-chain Fvs contain the variable regions of the original (“parental”) antibodies and retain their complementarity determining region and, therefore, single-chain Fvs bind to the antigen with the same specificity as the specificity of the original monoclonal antibodies (JP-Appl. Patent Application. 11- 63557). Part of the variable region and / or CDR of a single chain Fv of the present invention can be partially changed, for example, deleted, replaced or supplemented. The V region of the H chain and the V region of the L chain constituting the single chain Fv of the present invention are mentioned above and can be linked directly or via a linker, preferably through a peptide linker. The structure of a single-chain Fv can be as follows: [V-region of the H-chain] - [V-region of the L-chain] or [V-region of the L-chain] - [V-region of the H-chain]. In the present invention, it is possible to ensure that a single chain Fv forms a dimer, trimer or tetramer, from which a modified antibody of the invention can be obtained.
Одноцепочечное модифицированное антителоSingle chain modified antibody
Одноцепочечные модифицированные антитела данного изобретения, содержащие две или более V-областей Н-цепи и две или более V-областей L-цепи, предпочтительно две-четыре каждой, особенно предпочтительно две каждой, содержат две или более V-областей Н-цепи и V-областей L-цепи, как упоминалось выше. Каждая область этого пептида должна быть расположена таким образом, что модифицированное одноцепочечное антитело образует специфическую стерическую структуру, конкретно имитирующую стерическую структуру, образуемую димером одноцепочечного Fv.Single chain modified antibodies of the present invention containing two or more V regions of an H chain and two or more V regions of an L chain, preferably two to four each, particularly preferably two of each, contain two or more V regions of an H chain and V -regions of the L chain, as mentioned above. Each region of this peptide must be positioned so that the modified single chain antibody forms a specific steric structure, specifically mimicking the steric structure formed by the single chain Fv dimer.
Например, V-области размещают в следующем порядке:For example, V-regions are placed in the following order:
[V-область Н-цепи]-[V-область L-цепи]-[V-область Н-цепи]-[V-область L-цепи] или [V-область L-цепи]-[V-область Н-цепи]-[V-область L-цепи]-[V-область Н-цепи], где эти области соединены через пептидный линкер, соответственно.[V region of the H chain] - [V region of the L chain] - [V region of the H chain] - [V region of the L chain] or [V region of the L chain] - [V region of H -chains] - [V-region of the L-chain] - [V-region of the H-chain], where these regions are connected via a peptide linker, respectively.
ЛинкерLinker
В данном изобретении линкеры для соединения между V-областью Н-цепи и V-областью L-цепи могут быть любым пептидным линкером, который может быть введен методом генетической инженерии, или любым химически синтезированным линкером. Например, в данном изобретении могут быть использованы линкеры, описанные в литературе, например, Protein Engineering, 9(3), 299-305, 1996. Эти линкеры могут быть одинаковыми или различными в одной и той же молекуле. Если необходимы пептидные линкеры, в качестве примеров линкеров приводятся следующие:In the present invention, linkers for connecting between the V region of the H chain and the V region of the L chain can be any peptide linker that can be introduced by genetic engineering, or any chemically synthesized linker. For example, linkers described in the literature, for example, Protein Engineering, 9 (3), 299-305, 1996, can be used in the present invention. These linkers can be the same or different in the same molecule. If peptide linkers are needed, the following are given as examples of linkers:
SerSer
Gly-SerGly-ser
Gly-Gly-SerGly-gly-ser
Ser-Gly-GlySer-gly-gly
Gly-Gly-Gly-SerGly-Gly-Gly-Ser
Ser-Gly-Gly-GlySer-Gly-Gly-Gly
Gly-Gly-Gly-Gly-SerGly-Gly-Gly-Gly-Ser
Ser-Gly-Gly-Gly-GlySer-Gly-Gly-Gly-Gly
Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-SerGly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-GlySer-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly
Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-SerGly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-GlySer-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly
(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) n
(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)n (Ser-Gly-Gly-Gly-Gly) n
где n равно целому числу не менее 1. Предпочтительная длина линкерного пептида варьируется в зависимости от рецептора, который служит антигеном, в случае одноцепочечных Fv обычно предпочтительным является диапазон 1-20 аминокислот. В случае одноцепочечных модифицированных антител, содержащих две или более V-областей Н-цепи и две или более V-областей L-цепи, пептидные линкеры, соединяющие области, образующие один и тот же антигенсвязывающий сайт, содержащий [V-область Н-цепи]-[V-область L-цепи] (или [V-область L-цепи]-[V-область Н-цепи]), имеют длины 1-30 аминокислот, предпочтительно, 1-20 аминокислот, более предпочтительно 3-18 аминокислот. Пептидные линкеры, соединяющие области, не образующие один и тот же антигенсвязывающий сайт, содержащий [V-область Н-цепи]-[V-область L-цепи] (или [V-область L-цепи]-[V-область Н-цепи]), имеют длины 1-40 аминокислот, предпочтительно 3-30 аминокислот, более предпочтительно 5-20 аминокислот. Способ введения этих линкеров будет описан в объяснении для ДНК-конструкций, кодирующих модифицированные антитела данного изобретения.where n is an integer of at least 1. The preferred length of the linker peptide varies depending on the receptor that serves as an antigen, in the case of single chain Fv, a range of 1-20 amino acids is usually preferred. In the case of single chain modified antibodies containing two or more V regions of the H chain and two or more V regions of the L chain, peptide linkers connecting the regions forming the same antigen binding site containing the [V region of the H chain] - [V-region of the L chain] (or [V-region of the L chain] - [V-region of the H chain]), have lengths of 1-30 amino acids, preferably 1-20 amino acids, more preferably 3-18 amino acids . Peptide linkers connecting regions that do not form the same antigen binding site containing the [V region of the H chain] - [V region of the L chain] (or [V region of the L chain] - [V region of H chains]) have lengths of 1-40 amino acids, preferably 3-30 amino acids, more preferably 5-20 amino acids. The method of introducing these linkers will be described in the explanation for DNA constructs encoding the modified antibodies of the present invention.
Химически синтезированные линкеры, т.е. химические агенты, образующие поперечные связи, в соответствии с данным изобретением могут быть любыми линкерами, обычно используемыми для соединения пептидов. Примеры этих линкеров могут включать в себя N-гидроксисукцинимид (NHS), дисукцинимидилсуберат (DSS), бис(сульфосукцинимидил)суберат (BS3), дитиобис(сукцинимидилпропионат) (DSP), дитиобис(сульфосукцинимидилпропионат) (DTSSP), этиленгликольбис(сукцинимидилсукцинат) (EGS), этиленгликольбис(сульфосукцинимидилсукцинат) (сульфо-EGS), дисукцинимидилтартрат (DST), дисульфосукцинимидилтартрат (сульфо-DST), бис[2-(сукцинимидооксикарбонилокси)этил]сульфон (BSOCOES), бис[2-(сульфосукцинимидооксикарбонилокси)этил]сульфон (сульфо-BSOCOES) или т.п. Они являются коммерчески доступными. В случае химических линкеров предпочтительно, чтобы они имели длину, эквивалентную длине пептидных линкеров.Chemically synthesized linkers, i.e. the crosslinking chemical agents of this invention may be any linkers commonly used to link peptides. Examples of these linkers may include N-hydroxysuccinimide (NHS), disuccinimidyl suberate (DSS), bis (sulfosuccinimidyl) suberate (BS 3 ), dithiobis (succinimidyl propionate) (DSP), dithiobis (sulfosuccinimidyl propionate) (DTS) (DTS) (DTS) EGS), ethylene glycolbis (sulfosuktsinimidilsuktsinat) (sulfo-EGS), disuccinimidyl tartarate (DST), disulfosuktsinimidiltartrat (sulfo-DST), bis [2- (suktsinimidooksikarboniloksi) ethyl] sulfone (BSOCOES), bis [2- (sulfosuktsinimidooksikarboniloksi) ethyl] sulfone ( sulfo-BSOCOES) or the like. They are commercially available. In the case of chemical linkers, it is preferred that they have a length equivalent to the length of the peptide linkers.
Для образования димера одноцепочечного Fv предпочтительно выбирать линкер, подходящий для димеризации в растворе, таком как культуральная среда, более чем 20%, предпочтительно более чем 50%, еще более предпочтительно более чем 80%, наиболее предпочтительно более чем 90% одноцепочечного Fv, продуцируемого в клетках-хозяевах. Конкретно, предпочтительным являются линкер, состоящий из 2-12 аминокислот, предпочтительно 3-10 аминокислот, или другие линкеры, соответствующие им.To form a single-chain Fv dimer, it is preferable to choose a linker suitable for dimerization in solution, such as culture medium, more than 20%, preferably more than 50%, even more preferably more than 80%, most preferably more than 90% of the single-chain Fv produced in host cells. Specifically, a linker consisting of 2-12 amino acids, preferably 3-10 amino acids, or other linkers corresponding to them are preferred.
Получение модифицированных антителObtaining modified antibodies
Модифицированные антитела могут быть получены соединением через вышеупомянутый линкер, V-области Н-цепи и V-области L-цепи, полученных из известных или новых моноклональных антител, специфически связывающихся с молекулой (молекулами) клеточной поверхности. В качестве примеров одноцепочечных Fv приводятся MABL1-scFv и MABL2-scFv, содержащие V-область Н-цепи и V-область L-цепи, происходящие из антитела MABL-1 и антитела MABL-2, соответственно. В качестве примеров одноцепочечных полипептидов, содержащих две V-области Н-цепи и две V-области L-цепи, приводятся MABL1-sc(Fv)2 и MABL2-sc(Fv)2, содержащие V-область Н-цепи и V-область L-цепи, происходящие из вышеупомянутых антител.Modified antibodies can be prepared by coupling through the aforementioned linker, H chain V regions and L chain V regions derived from known or new monoclonal antibodies that specifically bind to a cell surface molecule (s). As examples of single chain Fvs, MABL1-scFv and MABL2-scFv are provided containing the H chain V region and the L chain V region derived from the MABL-1 antibody and the MABL-2 antibody, respectively. As examples of single chain polypeptides containing two V regions of an H chain and two V regions of an L chain, MABL1-sc (Fv) 2 and MABL2-sc (Fv) 2 containing the V region of the H chain and V- L chain region derived from the aforementioned antibodies.
Для получения полипептида к N-концу этого полипептида может быть присоединен сигнальный пептид, если желательно, чтобы данный полипептид был секретируемым пептидом. Хорошо известная аминокислотная последовательность, пригодная для очистки полипептида, такая как FLAG-последовательность, может быть присоединена для эффективной очистки этого полипептида. В этом случае димер может быть образован с использованием анти-FLAG-антитела.To produce a polypeptide, a signal peptide may be attached to the N-terminus of the polypeptide if the polypeptide is desired to be a secreted peptide. A well-known amino acid sequence suitable for purification of a polypeptide, such as a FLAG sequence, can be attached to effectively purify this polypeptide. In this case, a dimer can be formed using an anti-FLAG antibody.
Для получения модифицированного антитела данного изобретения необходимо получить ДНК, т.е. ДНК, кодирующую одноцепочечный Fv, или ДНК, кодирующую реконструированный одноцепочечный полипептид. Эти ДНК, в частности, для MABL1-scFv, MABL2-scFv, MABLl-sc(Fv)2 и/или MABL2-sc(Fv)2, могут быть получены из ДНК, кодирующих V-область Н-цепи и V-область L-цепи, происходящие из указанного Fv. Они могут быть также получены способом полимеразной цепной реакцией (ПЦР) с использованием этих ДНК в качестве матрицы и амплификацией части содержащейся в ней ДНК, кодирующей желаемую аминокислотную последовательность, с использованием пары праймеров, соответствующих обоим концам ДНК.In order to obtain a modified antibody of the invention, it is necessary to obtain DNA, i.e. DNA encoding a single chain Fv or DNA encoding a reconstructed single chain polypeptide. These DNAs, in particular for MABL1-scFv, MABL2-scFv, MABLl-sc (Fv) 2 and / or MABL2-sc (Fv) 2 , can be obtained from DNA encoding the V region of the H chain and V region L chains originating from the indicated Fv. They can also be prepared by the polymerase chain reaction (PCR) method using these DNAs as a template and amplifying a portion of the DNA contained therein encoding the desired amino acid sequence using a pair of primers corresponding to both ends of the DNA.
В том случае, когда желательной является каждая V-область, имеющая частично модифицированную аминокислотную последовательность, V-области, в которых одна или несколько аминокислот являются модифицированными, т.е. делетированными, замененными или добавленными, могут быть получены процедурой, известной в данной области, с использованием ПЦР. Часть аминокислотной последовательности в V-области является предпочтительно модифицированной при помощи ПЦР, известной в данной области, для получения модифицированного антитела, которое является достаточно активным против специфического антигена.In the case where each V region having a partially modified amino acid sequence is desired, V regions in which one or more amino acids are modified, i.e. deleted, substituted or added, can be obtained by a procedure known in the art using PCR. Part of the amino acid sequence in the V region is preferably modified by PCR known in the art to produce a modified antibody that is sufficiently active against a specific antigen.
Для определения праймеров для ПЦР-амплификации необходимо определить тип Н-цепи и L-цепи желаемых антител. Однако в случае антитела MABL-1 и антитела MABL-2 сообщалось, что антитело MABL-1 имеет L-цепи к-типа и Н-цепи γ1-типа, а антитело MABL-2 имеет L-цепи к-типа и Н-цепи γ2а-типа (Патентная заявка Японии JP-Appl. 11-63557). Для ПЦР-амплификации ДНК, кодирующей Н-цепь и L-цепь антитела MABL-1 и/или антитела MABL-2, могут быть использованы праймеры, описанные Jones, S.T. et al., Bio/Technology, 9, 88-89, 1991.To determine the primers for PCR amplification, it is necessary to determine the type of H chain and L chain of the desired antibodies. However, in the case of the MABL-1 antibody and the MABL-2 antibody, it was reported that the MABL-1 antibody has k-type L chains and γ1-type H chains, and the MABL-2 antibody has k-type L chains and H-chains γ2a type (Japanese Patent Application JP-Appl. 11-63557). For PCR amplification of DNA encoding the H chain and L chain of the MABL-1 antibody and / or the MABL-2 antibody, primers described by Jones, S.T. can be used. et al., Bio / Technology, 9, 88-89, 1991.
Для амплификации V-областей L-цепей антитела MABL-1 и антитела MABL-2 при помощи ПЦР были выбраны 5'-концевой и 3'-концевой олигонуклеотидные праймеры, как упоминалось ранее. Таким же образом, были выбраны 5'-концевой и 3'-концевой олигонуклеотидные праймеры для амплификации V-областей Н-цепей антитела MABL-1 и антитела MABL-2.To amplify the V regions of the L chains of the MABL-1 antibody and the MABL-2 antibody by PCR, the 5'-terminal and 3'-terminal oligonucleotide primers were selected, as previously mentioned. In the same way, 5'-terminal and 3'-terminal oligonucleotide primers were selected to amplify the V regions of the H chains of the MABL-1 antibody and the MABL-2 antibody.
В вариантах данного изобретения использовали 5'-концевые праймеры, которые содержат последовательность "GANTC", обеспечивающую сайт узнавания рестриктазы Hinfl вблизи их 5'-конца, и 3'-концевые праймеры, которые содержат нуклеотидную последовательность "CCCGGG", обеспечивающую сайт узнавания рестриктазы Xmal вблизи их 5'-конца. Другой сайт узнавания рестриктазы может быть использован вместо этих сайтов, пока они используются для субклонирования желаемого ДНК-фрагмента в клонирующий вектор.In embodiments of the invention, 5'-terminal primers that contain the "GANTC" sequence providing the Hinfl restriction enzyme recognition site near their 5'-end and 3'-terminal primers that contain the "CCCGGG" nucleotide sequence providing the Xmal restriction enzyme recognition site are used near their 5'-end. Another restriction enzyme recognition site can be used instead of these sites while they are used to subclone the desired DNA fragment into a cloning vector.
Сконструированные специфическим образом ПЦР-праймеры используют для обеспечения подходящих нуклеотидных последовательностей на 5'-конце и 3'-конце кДНК, кодирующих V-области антител MABL-1 и MABL-2 таким образом, что эти кДНК легко встраиваются в экспрессионный вектор и правильно функционируют в этом экспрессионном векторе (например, данное изобретение предусматривает увеличение эффективности трансляции за счет встраивания последовательности Козака). V-области антител MABL-1 и MABL-2, полученные амплификацией при помощи ПЦР с использованием этих праймеров, встраивают в экспрессионный вектор HEF, содержащий желаемую С-область человека (см. WO 92/19759). Клонированные ДНК могут быть секвенированы с использованием общепринятого способа, например, при помощи автоматического ДНК-секвенатора (Applied Biosystems).Specifically designed PCR primers are used to provide suitable nucleotide sequences at the 5'-end and 3'-end of the cDNA encoding the V regions of the MABL-1 and MABL-2 antibodies so that these cDNAs are easily inserted into the expression vector and function correctly in this expression vector (for example, this invention provides for an increase in translation efficiency by embedding the Kozak sequence). The V regions of the antibodies MABL-1 and MABL-2, obtained by PCR amplification using these primers, are inserted into the HEF expression vector containing the desired human C region (see WO 92/19759). Cloned DNA can be sequenced using a conventional method, for example, using an automatic DNA sequencer (Applied Biosystems).
Линкер, такой как пептидный линкер, может быть введен в модифицированное антитело данного изобретения следующим образом. Конструируют праймеры, которые имеют частично комплементарную последовательность с праймерами для V-областей Н-цепей и V-областей L-цепей, описанных выше, и которые кодируют N-конец и С-конец линкера. Затем проводят процедуру ПЦР с использованием этих праймеров для получения ДНК, кодирующей пептидный линкер, имеющий желаемую аминокислотную последовательность и длину. ДНК, кодирующие V-область Н-цепи и V-область L-цепи, могут быть соединены через полученную ДНК для получения ДНК, кодирующей модифицированное антитело данного изобретения, которое имеет желаемый пептидный линкер. После получения ДНК, кодирующей одно из модифицированных антител, ДНК, кодирующие модифицированные антитела с желаемым пептидным линкером или без пептидного линкера, могут быть легко получены путем конструирования различных праймеров для этого линкера и затем проведения ПЦР с использованием этих праймеров и вышеупомянутой ДНК в качестве матрицы.A linker, such as a peptide linker, can be introduced into the modified antibody of the present invention as follows. Primers are designed that have a partially complementary sequence with primers for the V regions of the H chains and V regions of the L chains described above, and which encode the N-terminus and C-terminus of the linker. A PCR procedure is then performed using these primers to obtain DNA encoding a peptide linker having the desired amino acid sequence and length. DNAs encoding the V region of the H chain and the V region of the L chain can be linked via the obtained DNA to obtain DNA encoding a modified antibody of the invention that has the desired peptide linker. After obtaining a DNA encoding one of the modified antibodies, DNA encoding the modified antibodies with the desired peptide linker or without the peptide linker can be easily obtained by constructing various primers for this linker and then performing PCR using these primers and the aforementioned DNA as a template.
Каждая V-область модифицированного антитела данного изобретения может быть гуманизирована с использованием общепринятых способов (например, Sato, К. et al., Cancer Res., 53, 1-6 (1993)). После получения ДНК, кодирующей каждый из гуманизированных Fv, гуманизированный одноцепочечный Fv, фрагмент гуманизированного одноцепочечного Fv, гуманизированное моноклональное антитело и фрагмент гуманизированного моноклонального антитела могут быть легко получены в соответствии с общепринятыми способами. Предпочтительно, аминокислотные последовательности их V-областей могут быть частично модифицированными, если требуется.Each V region of the modified antibody of the present invention can be humanized using conventional methods (e.g., Sato, K. et al., Cancer Res., 53, 1-6 (1993)). After obtaining the DNA encoding each of the humanized Fv, the humanized single chain Fv, the fragment of the humanized single chain Fv, the humanized monoclonal antibody, and the fragment of the humanized monoclonal antibody can be easily obtained in accordance with conventional methods. Preferably, the amino acid sequences of their V regions can be partially modified, if desired.
Кроме того, ДНК, полученная из другого млекопитающего, например, ДНК, кодирующая V-области антитела человека, может быть получена таким же способом, как при получении ДНК, кодирующей V-область Н-цепи и V-область L-цепи, происходящие из мыши, общепринятыми способами, как упоминалось выше. Полученная ДНК может быть использована для получения V-области Н-цепи и V-области L-цепи другого млекопитающего, в частности, происходящих из антитела человека, одноцепочечного Fv, происходящего из человека, и его фрагмента, и моноклонального антитела человеческого происхождения и его фрагмента.In addition, DNA obtained from another mammal, for example, DNA encoding the V regions of a human antibody, can be obtained in the same way as when obtaining DNA encoding the V region of the H chain and the V region of the L chain derived from mice in conventional ways, as mentioned above. The obtained DNA can be used to obtain the V region of the H chain and the V region of the L chain of another mammal, in particular, derived from a human antibody, single chain Fv derived from humans, and a fragment thereof, and a monoclonal antibody of human origin and its fragment .
В том случае, когда модифицированные антитела данного изобретения являются биспецифическими модифицированными антителами, они могут быть получены известными способами (например, способом, описанным в WO 94/13804).In the case where the modified antibodies of the present invention are bispecific modified antibodies, they can be obtained by known methods (for example, by the method described in WO 94/13804).
Как упоминалось выше, когда получают целевые ДНК, кодирующие V-области модифицированных антител и V-области гуманизированных модифицированных антител, экспрессионные вектора, содержащие их, и хозяева, трансформированные этими векторами, могут быть получены в соответствии с общепринятыми способами. Далее эти хозяева могут культивироваться в соответствии с общепринятым способом для получения реконструированного одноцепочечного Fv, реконструированного гуманизированного одноцепочечного Fv, гуманизированных моноклональных антител и их фрагментов. Они могут быть выделены из клеток или среды и могут быть очищены до гомогенной массы. Для этой цели могут быть использованы в комбинации любые способы выделения и очистки, обычно используемые для белков, например, хроматография, ультрафильтрация, высаливание и диализ, если необходимо, без ограничения.As mentioned above, when target DNAs encoding the V regions of the modified antibodies and the V regions of the humanized modified antibodies are obtained, expression vectors containing them and hosts transformed with these vectors can be obtained in accordance with conventional methods. Further, these hosts can be cultured in accordance with the generally accepted method for producing reconstructed single chain Fv, reconstructed humanized single chain Fv, humanized monoclonal antibodies and fragments thereof. They can be isolated from cells or the medium and can be purified to a homogeneous mass. For this purpose, any isolation and purification methods commonly used for proteins can be used in combination, for example, chromatography, ultrafiltration, salting out and dialysis, if necessary, without limitation.
При получении реконструированного одноцепочечного Fv данного изобретения культивированием клеток животного, таких как клетки COS7 или клетки СНО, предпочтительно клетки СНО, в бессывороточной среде, димер указанного одноцепочечного Fv, образованный в этой среде, может быть стабильно извлечен и очищен с высоким выходом. Очищенный таким образом димер может стабильно сохраняться в течение продолжительного периода. Бессывороточной средой, используемой в данном изобретении, может быть любая среда, обычно используемая для получения рекомбинантного белка, без ограничений.In the preparation of the reconstituted single chain Fv of the present invention by culturing animal cells, such as COS7 cells or CHO cells, preferably CHO cells, in a serum free medium, the dimer of said single chain Fv formed in this medium can be stably removed and purified in high yield. The dimer thus purified can be stably maintained for an extended period. The serum-free medium used in this invention can be any medium commonly used to produce a recombinant protein, without limitation.
Для получения модифицированных антител данного изобретения могут использоваться любые экспрессионные системы, например, эукариотические клетки, такие как клетки животных, например, адаптированные клеточные линии млекопитающих, нитчатые грибы и дрожжи, и прокариотические клетки, такие как бактериальные клетки, например, Е.coli. Предпочтительно, модифицированные антитела данного изобретения экспрессируют в клетках млекопитающих, например, клетках COS7 или клетках СНО.Any expression system, for example, eukaryotic cells, such as animal cells, for example, adapted mammalian cell lines, filamentous fungi and yeast, and prokaryotic cells, such as bacterial cells, for example, E. coli, can be used to produce the modified antibodies of the present invention. Preferably, the modified antibodies of the invention are expressed in mammalian cells, for example, COS7 cells or CHO cells.
В этих случаях могут быть использованы общепринятые промоторы, применимые для экспрессии в клетках млекопитающих. Предпочтительно, используют немедленно ранний промотор цитомегаловируса человека (HCMV). Экспрессионные вектора, содержащие промотор HCMV, включают в себя HCMV-VH-HCγ1, HCMV-VL-HCK и т.п., которые получены из pSV2neo (WO 92/19759).In these cases, conventional promoters useful for expression in mammalian cells can be used. Preferably, the immediate early promoter of human cytomegalovirus (HCMV) is used. Expression vectors containing the HCMV promoter include HCMV-VH-HCγ1, HCMV-VL-HCK and the like, which are derived from pSV2neo (WO 92/19759).
Дополнительно, другие промоторы, которые могут быть использованы для экспрессии генов в клетках млекопитающих в данном изобретении, включают в себя вирусные промоторы, полученные из ретровируса, полиомавируса, аденовируса и обезьяньего вируса 40 (SV40), и промоторы, происходящие из млекопитающих, такие как промотор фактора-1α элонгации полипептидной цепи человека (HEF-1α). Промотор SV40 может быть легко использован в соответствии со способом Mulligan, R.C., et al. (Nature 277, 108-114 (1979)), а промотор HEF-12 может быть также использован в соответствии со способами Mizushima, S. et al. (Nucleic Acids Research, 18, 5322 (1990)).Additionally, other promoters that can be used to express genes in mammalian cells in this invention include viral promoters derived from retrovirus, polyomavirus, adenovirus and monkey virus 40 (SV40), and promoters originating from mammals, such as the promoter factor-1α elongation of the human polypeptide chain (HEF-1α). The SV40 promoter can be easily used in accordance with the method of Mulligan, R.C., et al. (Nature 277, 108-114 (1979)), and the HEF-12 promoter can also be used in accordance with the methods of Mizushima, S. et al. (Nucleic Acids Research, 18, 5322 (1990)).
Сайт инициации репликации (ориджин репликации) (ori), который может быть использован в данном изобретении, включает в себя ori, происходящий из SV40, полиомавируса, аденовируса, папилломавируса крупного рогатого скота (BPV) и т.п. Экспрессионный вектор может содержать в качестве селективного маркера ген II или I (пео) фосфотрансферазы АРН (3'), ген тимидинкиназы (ТК), ген ксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы (ECOGPT) Е.coli или ген дигидрофолатредуктазы (DHFR).The origin of replication (origin of replication) (ori) that can be used in this invention includes ori derived from SV40, polyomavirus, adenovirus, bovine papillomavirus (BPV), and the like. The expression vector may contain, as a selective marker, the APH gene II or I (peo) phosphotransferase (3 '), the thymidine kinase (TK) gene, the E. coli xanthine guanine phosphoribosyl transferase (ECOGPT) gene, or the dihydrofolate reductase gene (DHFR).
Антигенсвязывающая активность модифицированного антитела, полученного, как описано выше, может оцениваться общепринятым способом, таким как радиоиммуноанализ (РИА), твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) или поверхностный плазменный резонанс. Она может также оцениваться с использованием способности исходных антител к связыванию-ингибированию в качестве индекса, например, по отсутствию или присутствию зависимого от концентрации ингибирования связывания указанного моноклонального антитела с антигеном.The antigen binding activity of a modified antibody obtained as described above can be evaluated by a conventional method, such as radioimmunoassay (RIA), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), or surface plasma resonance. It can also be evaluated using the ability of the original antibodies to bind-inhibition as an index, for example, by the absence or presence of a concentration-dependent inhibition of the binding of the indicated monoclonal antibody to the antigen.
Более конкретно, культивируют клетки животных, трансформированные экспрессионным вектором, содержащим ДНК, кодирующую модифицированное антитело данного изобретения, например, клетки COS7 или клетки СНО. Культивированные клетки и/или супернатант среды или модифицированное антитело, очищенное из них, используют для определения связывания с антигеном. В качестве контроля используют супернатант культуральной среды, в которой культивировали клетки, трансформированные только экспрессионным вектором. В случае антигена, например, антитело MABL-1 и антитело MABL-2, исследуемый образец модифицированного антитела данного изобретения или супернатант контроля добавляют к линии клеток мышиного лейкоза, клеткам L1210, экспрессирующим IAP человека, и затем проводят анализ, такой как проточная цитометрия, для оценки антигенсвязывающей активности.More specifically, animal cells are cultured transformed with an expression vector containing DNA encoding a modified antibody of the invention, for example, COS7 cells or CHO cells. Cultured cells and / or medium supernatant or a modified antibody purified from them are used to determine antigen binding. As a control, the supernatant of the culture medium in which cells transformed only with the expression vector were cultured was used. In the case of an antigen, for example, an MABL-1 antibody and an MABL-2 antibody, a test sample of a modified antibody of the present invention or a control supernatant is added to the mouse leukemia cell line, L1210 cells expressing human IAP, and then an analysis such as flow cytometry is performed to estimates of antigen binding activity.
Оценку in vitro эффекта трансдукции сигнала (эффекта индукции апоптоза в случаях антител MABL-1 и антител MABL-2) проводят следующим образом: анализируемый образец модифицированного, как описано выше, антитела добавляют к клеткам, которые экспрессируют антитело, или клеткам, в которые был введен ген антитела, и оценивают изменения, вызываемые трансдукцией сигнала, например, индуцируется ли гибель клеток специфическим для IAP-антигена человека образом, с использованием общепринятых способов.An in vitro evaluation of the effect of signal transduction (the effect of induction of apoptosis in cases of MABL-1 antibodies and MABL-2 antibodies) is carried out as follows: the analyzed sample modified as described above, the antibodies are added to cells that express the antibody, or to cells into which it was introduced an antibody gene, and changes caused by signal transduction are evaluated, for example, whether cell death is induced in a manner specific for the human IAP antigen using conventional methods.
Оценку in vivo эффекта индукции апоптоза, например, в случае, когда модифицированное антитело узнает IAP человека (например, модифицированные антитела - производные антитела MABL-1 и антитела MABL-2), проводят следующим образом: получают мышиную модель миеломы человека. Мышам вводят внутривенно моноклональное антитело или модифицированное антитело данного изобретения, которое индуцирует апоптоз ядросодержащих клеток крови, содержащих IAP. Мышам контрольной группы вводят только фосфатно-солевой буферный раствор (PBS).An in vivo evaluation of the effect of apoptosis induction, for example, in the case when the modified antibody recognizes human IAP (for example, modified antibodies derived from MABL-1 antibodies and MABL-2 antibodies), is carried out as follows: a murine model of human myeloma is obtained. The mice are injected intravenously with a monoclonal antibody or a modified antibody of the invention, which induces apoptosis of nucleated blood cells containing IAP. The mice in the control group are administered only phosphate-buffered saline (PBS).
Индукцию апоптоза оценивают по противоопухолевому действию на основе изменения содержания IgG человека в сыворотке мышей и времени их выживания.Apoptosis induction is evaluated by antitumor activity based on changes in the human IgG content in the serum of mice and their survival time.
Как упоминалось выше, модифицированные антитела данного изобретения могут быть получены путем создания модифицированных антител, которые содержат две или более V-областей Н-цепи и две или более V-областей L-цепи и специфически связываются с молекулой-мишенью клеточной поверхности или внутриклеточной молекулой, и скрининга этих модифицированных антител с оценкой in vivo и in vitro, как описано выше.As mentioned above, the modified antibodies of the present invention can be obtained by creating modified antibodies that contain two or more V regions of the H chain and two or more V regions of the L chain and specifically bind to the target molecule of the cell surface or intracellular molecule, and screening these modified antibodies with in vivo and in vitro scores as described above.
Модифицированные антитела данного изобретения, которые содержат две или более V-областей Н-цепи и две или более V-областей L-цепи, предпочтительно две-четыре каждой, более предпочтительно две каждой, могут быть димером одноцепочечного Fv, содержащего одну V-область Н-цепи и одну V-область L-цепи, или одноцепочечным полипептидом, в котором соединены две или более V-областей Н-цепи и две или более V-областей L-цепи. Предполагается, что вследствие такой конструкции этот пептид имитирует трехмерную структуру природного лиганда и, следовательно, сохраняет превосходную антигенсвязывающую способность и агонистическую активность.Modified antibodies of the present invention that contain two or more V regions of an H chain and two or more V regions of an L chain, preferably two to four each, more preferably two each, can be a dimer of a single chain Fv containing one V region of H chains and one V region of the L chain, or a single chain polypeptide in which two or more V regions of the H chain and two or more V regions of the L chain are connected. It is believed that due to this design, this peptide mimics the three-dimensional structure of a natural ligand and, therefore, retains excellent antigen binding capacity and agonistic activity.
Модифицированные антитела данного изобретения имеют значительно уменьшенный молекулярный размер в сравнении с молекулой антитела (цельного IgG) и, следовательно, лучшую способность проникновения в ткани и опухоли и более высокую активность, чем исходные агонистические моноклональные антитела. Таким образом, правильный выбор исходного антитела позволяет трансдуцировать различные сигналы в клетки и индуцировать различные действия в этих клетках, такие как индукция апоптоза, индукция пролиферации клеток, индукция дифференцировки клеток, индукция клеточного деления или действие на регуляцию клеточного цикла. Фармацевтические препараты, содержащие их, применимы для лечения заболеваний, которые могут излечиваться индукцией трансдукции сигнала, например, раков, воспаления, гормональных нарушений, аутоиммунных заболеваний, а также патологического изменения крови, например, лейкоза, злокачественной лимфомы, апластической анемии, синдрома миелодисплазии и красной, или истинной полицитемии. Ожидается также, что антитело данного изобретения может быть использовано в качестве контрастного агента посредством RI-мечения. Этот эффект может быть усилен присоединением к RI-соединению или токсину.The modified antibodies of the present invention have a significantly reduced molecular size in comparison with the antibody molecule (whole IgG) and, therefore, better penetration into tissues and tumors and higher activity than the original agonistic monoclonal antibodies. Thus, the right choice of the initial antibody allows you to transduce various signals into cells and induce various actions in these cells, such as induction of apoptosis, induction of cell proliferation, induction of cell differentiation, induction of cell division or the effect on the regulation of the cell cycle. Pharmaceutical preparations containing them are useful for treating diseases that can be treated by inducing signal transduction, for example, cancers, inflammation, hormonal disorders, autoimmune diseases, as well as pathological changes in the blood, for example, leukemia, malignant lymphoma, aplastic anemia, myelodysplasia syndrome and red , or true polycythemia. It is also expected that the antibody of the present invention can be used as a contrast agent by RI-labeling. This effect may be enhanced by attachment to an RI compound or toxin.
Перечень фигурList of figures
Фиг.1 показывает результат проточной цитометрии, иллюстрирующий, что IgG-антитело человека не связывается с клетками L1210, экспрессирующими IAP человека (hIAP/L1210).Figure 1 shows the result of flow cytometry, illustrating that the human IgG antibody does not bind to L1210 cells expressing human IAP (hIAP / L1210).
Фиг.2 показывает результат проточной цитометрии, иллюстрирующий, что химерное антитело MABL-1 специфически связывается с клетками L1210, экспрессирующими IAP человека (hIAP/L1210).Figure 2 shows the result of flow cytometry, illustrating that the chimeric antibody MABL-1 specifically binds to L1210 cells expressing human IAP (hIAP / L1210).
Фиг.3 показывает результат проточной цитометрии, иллюстрирующий, что химерное антитело MABL-2 специфически связывается с клетками L1210, экспрессирующими IAP человека (hIAP/L1210).Figure 3 shows the result of flow cytometry, illustrating that the chimeric antibody MABL-2 specifically binds to L1210 cells expressing human IAP (hIAP / L1210).
Фиг.4 схематически иллюстрирует способ получения одноцепочечного Fv в соответствии с данным изобретением.Figure 4 schematically illustrates a method for producing a single chain Fv in accordance with this invention.
Фиг.5 иллюстрирует структуру экспрессионной плазмиды, которая может быть использована для экспрессии ДНК, кодирующей одноцепочечный Fv данного изобретения, в Е.coli.Figure 5 illustrates the structure of an expression plasmid that can be used to express DNA encoding the single-chain Fv of the present invention in E. coli.
Фиг.6 иллюстрирует структуру экспрессионной плазмиды, которая используется для экспрессии ДНК, кодирующей одноцепочечный Fv данного изобретения, в клетках млекопитающх.Fig. 6 illustrates the structure of an expression plasmid that is used to express DNA encoding the single-chain Fv of the present invention in mammalian cells.
Фиг.7 показывает результат вестерн-блоттинга примера 5.4. Слева направо, маркер молекулярных масс (который соответствует 97,4, 66, 45, 31, 21,5 и 14,5 кДа сверху вниз), культуральный супернатант клеток COS7 с введенной рСНО1 и культуральный супернатант клеток COS7 с введенной рСНОМ2. Он иллюстрирует, что реконструированный одноцепочечный Fv антитела MABL-2 (показан стрелкой) содержится в культуральном супернатанте клеток с введенной рСНОМ2.7 shows the result of Western blotting of Example 5.4. From left to right, a molecular weight marker (which corresponds to 97.4, 66, 45, 31, 21.5 and 14.5 kDa from top to bottom), the culture supernatant of COS7 cells with introduced pCHO1 and the culture supernatant of COS7 cells with introduced pCHO2. It illustrates that the reconstructed single chain Fv of the MABL-2 antibody (shown by arrow) is contained in the cell culture supernatant with pCOM2 introduced.
Фиг.8 показывает результат проточной цитометрии, иллюстрирующий, что антитело из культурального супернатанта клеток pCHO1/COS7 в качестве контроля не связывается с клетками pCOS1/L1210 в качестве контроля.Fig. 8 shows a flow cytometry result illustrating that an antibody from the culture supernatant of pCHO1 / COS7 cells as a control does not bind to pCOS1 / L1210 cells as a control.
Фиг.9 показывает результат проточной цитометрии, иллюстрирующий, что антитело из культурального супернатанта клеток MABL2-scFv/COS7 не связывается с клетками pCOS1/L1210 в качестве контроля.Figure 9 shows the result of flow cytometry, illustrating that the antibody from the culture supernatant of MABL2-scFv / COS7 cells does not bind to pCOS1 / L1210 cells as a control.
Фиг.10 показывает результат проточной цитометрии, иллюстрирующий, что антитело из культурального супернатанта клеток pCOS1/COS7 не связывается с клетками hIAP/L1210.Figure 10 shows the result of flow cytometry, illustrating that the antibody from the culture supernatant of pCOS1 / COS7 cells does not bind to hIAP / L1210 cells.
Фиг.11 показывает результат проточной цитометрии, иллюстрирующий, что антитело из культурального супернатанта клеток MABL2-scFv/COS7 специфически связывается с клетками hIAP/L1210.11 shows the result of flow cytometry, illustrating that an antibody from the culture supernatant of MABL2-scFv / COS7 cells specifically binds to hIAP / L1210 cells.
Фиг.12 показывает результат конкурентного ELISA в примере 5.6, где связывающая активность одноцепочечного Fv данного изобретения (MABL2-scFv) в отношении антигена выявляется по ингибированию связывания мышиного моноклонального антитела MABL-2 с этим антигеном в качестве показателя, в сравнении с культуральным супернатантом клеток pCHO1/COS7 в качестве контроля.12 shows the result of a competitive ELISA in Example 5.6, where the binding activity of the single chain Fv of the present invention (MABL2-scFv) against an antigen is detected by inhibition of binding of the murine monoclonal antibody MABL-2 to this antigen as an indicator, in comparison with the pCHO1 cell culture supernatant / COS7 as a control.
Фиг.13 показывает результаты апоптоз-индуцирующего действия в примере 5.7, иллюстрирующие, что антитело из культурального супернатанта клеток pCHO1/COS7 в качестве контроля не индуцирует апоптоз клеток pCOS1/L1210 в качестве контроля.13 shows the results of the apoptosis-inducing action in Example 5.7, illustrating that an antibody from the pCHO1 / COS7 cell culture supernatant as a control does not induce apoptosis of pCOS1 / L1210 cells as a control.
Фиг.14 показывает результаты апоптоз-индуцирующего действия в примере 5.7, иллюстрирующие, что антитело из культурального супернатанта клеток MABL2-scFv/COS7 не индуцирует апоптоз клеток pCOS1/L1210 в качестве контроля.Fig. 14 shows the results of the apoptosis-inducing action in Example 5.7, illustrating that an antibody from the MABL2-scFv / COS7 cell culture supernatant does not induce apoptosis of pCOS1 / L1210 cells as a control.
Фиг.15 показывает результаты апоптоз-индуцирующего действия в примере 5.7, иллюстрирующие, что антитело из культурального супернатанта клеток pCHO1/COS7 в качестве контроля не индуцирует апоптоз клеток hIAP/L1210.15 shows the results of the apoptosis-inducing action in Example 5.7, illustrating that an antibody from the pCHO1 / COS7 cell culture supernatant does not induce apoptosis of hIAP / L1210 cells as a control.
Фиг.16 показывает результаты апоптоз-индуцирующего действия в примере 5.7, иллюстрирующие, что антитело из культурального супернатанта клеток MABL2-scFv/COS7 специфически индуцирует апоптоз клеток hIAP/L1210.Fig. 16 shows the results of the apoptosis inducing action in Example 5.7, illustrating that an antibody from the MABL2-scFv / COS7 cell culture supernatant specifically induces apoptosis of hIAP / L1210 cells.
Фиг.17 показывает результаты апоптоз-индуцирующего действия в примере 5.7, иллюстрирующие, что антитело из культурального супернатанта клеток pCHO1/COS7 в качестве контроля не индуцирует апоптоз клеток CCRF-CEM (в конечной концентрации 50%).17 shows the results of the apoptosis-inducing action in Example 5.7, illustrating that an antibody from the pCHO1 / COS7 cell culture supernatant does not induce apoptosis of CCRF-CEM cells (at a final concentration of 50%) as a control.
Фиг.18 показывает результаты апоптоз-индуцирующего действия в примере 5.7, иллюстрирующие, что антитело из культурального супернатанта клеток MABL2-scFv/COS7 специфически индуцирует апоптоз клеток CCRF-CEM (в конечной концентрации 50%).Fig. 18 shows the results of apoptosis-inducing action in Example 5.7, illustrating that an antibody from the MABL2-scFv / COS7 cell culture supernatant specifically induces apoptosis of CCRF-CEM cells (at a final concentration of 50%).
Фиг.19 показывает хроматограмму, полученную при очистке одноцепочечного Fv, происходящего из антитела MABL-2, продуцируемого клетками СНО в примере 5.9, иллюстрирующую, что фракция А и фракция В были получены в качестве основных пиков при очистке фракции после колонки с Blue-Sepharose на гидроксиапатитной колонки.Fig. 19 shows a chromatogram obtained by purifying a single-chain Fv derived from the MABL-2 antibody produced by CHO cells in Example 5.9, illustrating that fraction A and fraction B were obtained as the main peaks when purifying the fraction after the Blue-Sepharose column on hydroxyapatite column.
Фиг.20 показывает результаты очистки гель-фильтрацией фракции А и фракции В, полученных в примере 5.9-(2), иллюстрирующие, что основные пики (AI и BI, соответственно) элюировались в случае фракции А при кажущейся молекулярной массе приблизительно 36 кД, а в случае фракции В при приблизительно 76 кД.Fig. 20 shows the gel filtration results of fraction A and fraction B obtained in Example 5.9- (2), illustrating that the main peaks (AI and BI, respectively) were eluted in case of fraction A at an apparent molecular weight of approximately 36 kD, and in the case of fraction B at approximately 76 kD.
Фиг.21 является анализом электрофореза в ДСН-ПААГ фракций, полученных при очистке одноцепочечного Fv, происходящего из антитела MABL-2, продуцируемого клетками СНО, в примере 5.9, иллюстрирующим, что единственная полоса с молекулярной массой около 35 кД наблюдалась в обеих фракциях.Fig.21 is an analysis of SDS-PAGE electrophoresis of fractions obtained by purification of a single chain Fv derived from MABL-2 antibody produced by CHO cells in Example 5.9, illustrating that a single band with a molecular weight of about 35 kD was observed in both fractions.
Фиг.22 показывает результаты анализа фракций AI и BI, полученных гель-фильтрацией при очистке одноцепочечного Fv, происходящего из антитела MABL-2, продуцируемого клетками СНО, где фракция AI содержит мономер, а фракция BI содержит димер.Figure 22 shows the results of the analysis of the AI and BI fractions obtained by gel filtration by purification of a single chain Fv derived from the MABL-2 antibody produced by CHO cells, where the AI fraction contains a monomer and the BI fraction contains a dimer.
Фиг.23 иллюстрирует структуру экспрессионной плазмиды, которая может быть использована для экспрессии ДНК, кодирующей одноцепочечный Fv данного изобретения, в Е.coli.23 illustrates the structure of an expression plasmid that can be used to express DNA encoding the single chain Fv of the present invention in E. coli.
Фиг.24 показывает очистку на гель-фильтрационной колонке неочищенных продуктов одноцепочечного полипептида Fv, происходящего из антитела MABL-2, продуцируемого Е.coli, полученных в примере 5.12, где каждый пик соответствует мономеру или димеру, соответственно, одноцепочечного Fv, продуцируемого Е.coli.24 shows purification on a gel filtration column of crude products of a single chain Fv polypeptide derived from a MABL-2 antibody produced by E. coli obtained in Example 5.12, where each peak corresponds to a monomer or dimer, respectively, of a single chain Fv produced by E. coli .
Фиг.25 показывает результаты апоптоз-индуцирующего действия в примере 5.13, иллюстрирующие, что мышиное IgG-антитело в качестве контроля не индуцирует апоптоз клеток hIAP/L1210 (конечная концентрация 3 мкг/мл).Fig. 25 shows the results of the apoptosis-inducing action in Example 5.13, illustrating that the mouse IgG antibody does not induce apoptosis of hIAP / L1210 cells (final concentration of 3 μg / ml) as a control.
Фиг.26 показывает результаты апоптоз-индуцирующего действия в примере 5.13, иллюстрирующие, что димер MABL2-scFv, продуцируемый клетками СНО, в сильной степени индуцирует апоптоз клеток hIAP/L1210 (конечная концентрация 3 мкг/мл).Fig. 26 shows the results of the apoptosis-inducing action in Example 5.13, illustrating that the MABL2-scFv dimer produced by CHO cells strongly induces apoptosis of hIAP / L1210 cells (
Фиг.27 показывает результаты апоптоз-индуцирующего действия в примере 5.13, иллюстрирующие, что димер MABL2-scFv, продуцируемый Е.coli, в сильной степени индуцирует апоптоз клеток hIAP/L1210 (конечная концентрация 3 мкг/мл).27 shows the results of the apoptosis-inducing action in Example 5.13, illustrating that the E. coli-produced MABL2-scFv dimer strongly induces apoptosis of hIAP / L1210 cells (
Фиг.28 показывает результаты апоптоз-индуцирующего действия в примере 5.13, иллюстрирующие, что индукция апоптоза в отношении клеток hIAP/L1210 мономером MABL2-scFv, продуцируемым клетками СНО, находится на том же уровне, что и в контроле (конечная концентрация 3 мкг/мл).Fig. 28 shows the results of the apoptosis-inducing action in Example 5.13, illustrating that the induction of apoptosis on hIAP / L1210 cells by the MABL2-scFv monomer produced by CHO cells is at the same level as in the control (
Фиг.29 показывает результаты апоптоз-индуцирующего действия в примере 5.13, иллюстрирующие, что индукция апоптоза в отношении клеток hIAP/L1210 мономером MABL2-scFv, продуцируемым Е.coli, находится на том же уровне, что и в контроле (конечная концентрация 3 мкг/мл).Fig. 29 shows the results of the apoptosis-inducing action in Example 5.13, illustrating that the induction of apoptosis on hIAP / L1210 cells with the MABL2-scFv monomer produced by E. coli is at the same level as in the control (
Фиг.30 показывает результаты апоптоз-индуцирующего действия в примере 5.13, иллюстрирующие, что мышиное IgG-антитело, используемое в качестве контроля, не индуцирует апоптоз клеток hIAP/L1210 даже при добавлении анти-FLAG-атитела (конечная концентрация 3 мкг/мл).30 shows the results of the apoptosis inducing action in Example 5.13, illustrating that the mouse IgG antibody used as a control does not induce apoptosis of hIAP / L1210 cells even when anti-FLAG antibody is added (
Фиг.31 показывает результаты апоптоз-индуцирующего действия в примере 5.13, иллюстрирующие, что мономер MABL2-scFv, продуцируемый клетками СНО, в сильной степени индуцирует апоптоз клеток hIAP/L1210 при добавлении анти-FLAG-антитела (конечная концентрация 3 мкг/мл).Fig. 31 shows the results of the apoptosis inducing action in Example 5.13, illustrating that the MABL2-scFv monomer produced by CHO cells strongly induces apoptosis of hIAP / L1210 cells when anti-FLAG antibody is added (
Фиг.32 показывает результаты количественного измерения IgG человека в сыворотке мыши, в которую трансплантировали клеточную линию КРММ2 миеломы человека, показывающие количества IgG человека, продуцирумого клетками миеломы человека в этой мыши. Эта фигура иллюстрирует, что димер scFv/CHO в сильной степени ингибирует рост клеток КРММ2.Fig. 32 shows the results of a quantitative measurement of human IgG in mouse serum into which human myeloma KPMM2 cell line was transplanted, showing the amounts of human IgG produced by human myeloma cells in this mouse. This figure illustrates that the scFv / CHO dimer strongly inhibits the growth of CRMM2 cells.
Фиг.33 показывает время выживания мыши после трансплантации опухоли, иллюстрируя, что время выживания в группе мышей с введенным димером scFv/CHO было значительно большим.Fig. 33 shows the survival time of the mouse after tumor transplantation, illustrating that the survival time in the group of mice with the scFv / CHO dimer introduced was significantly longer.
Фиг.34 иллюстрирует структуру экспрессионной плазмиды, которая экспрессирует модифицированное антитело [sc(Fv)2], содержащее две V-области Н-цепи и две V-области L-цепи, происходящее из антитела MABL-2.Fig. 34 illustrates the structure of an expression plasmid that expresses a modified antibody [sc (Fv) 2 ] containing two H chain V regions and two L chain V regions derived from an MABL-2 antibody.
Фиг.35 иллюстрирует структуру плазмиды, которая экспрессирует scFv (HL-типа).Fig. 35 illustrates the structure of a plasmid that expresses scFv (HL type).
где V-области соединены по типу [Н-цепь]-[L-цепь] без пептидного линкера.where the V-regions are connected by the type of [H-chain] - [L-chain] without a peptide linker.
Фиг.36 иллюстрирует структуру полипептида HL-типа и аминокислотные последовательности пептидных линкеров.Fig. 36 illustrates the structure of an HL-type polypeptide and the amino acid sequences of peptide linkers.
Фиг.37 иллюстрирует структуру плазмиды, которая экспрессирует scFv (LH-типа), где V-области соединены по типу [L-цепь]-[Н-цепь] без пептидного линкера.Fig. 37 illustrates the structure of a plasmid that expresses scFv (LH type), where V regions are connected as [L chain] - [H chain] without a peptide linker.
Фиг.38 иллюстрирует структуру полипептида LH-типа и аминокислотные последовательности пептидных линкеров.Fig. 38 illustrates the structure of an LH-type polypeptide and the amino acid sequences of peptide linkers.
Фиг.39 показывает результаты вестерн-блоттинга в примере 6.4, иллюстрирующие, что экспрессируются модифицированное антитело sc(Fv)2, содержащее две V-области Н-цепи и две V-области L-цепи, и MABL2-scFv, содержащие пептидные линкеры разной длины.Fig. 39 shows the results of Western blotting in Example 6.4, illustrating that a modified sc (Fv) 2 antibody containing two V regions of an H chain and two V regions of an L chain, and MABL2-scFv containing different peptide linkers are expressed lengths.
Фиг.40а и 40b показывают результаты проточной цитометрии с использованием культуральных супернатантов клеток COS7, полученных в примере 6.3 (1), иллюстрирующие, что MABL2-scFv и sc(Fv)2, содержащие пептидные линкеры различной длины, имеют высокое сродство к IAP человека.40a and 40b show flow cytometry results using the culture supernatants of COS7 cells obtained in Example 6.3 (1), illustrating that MABL2-scFv and sc (Fv) 2 containing peptide linkers of different lengths have a high affinity for human IAP.
Фиг.41 а и 41b показывают результаты апоптоз-индуцирующего действия в примере 6.6, иллюстрирующие, что scFv <HL3, 4, 6, 7, LH3, 4, 6 и 7> и sc(Fv)2 в сильной степени индуцируют гибель клеток hIAP/L1210.41 a and 41 b show the results of the apoptosis inducing action in Example 6.6, illustrating that scFv <HL3, 4, 6, 7, LH3, 4, 6 and 7> and sc (Fv) 2 strongly induce hIAP cell death / L1210.
Фиг.42 показывает результаты оценки антигенсвязывающей способности в примере 6.10, иллюстрирующие, что димер scFv <HL5> и sc(Fv)2 имеют высокое сродство к IAP человека.Fig. 42 shows the results of the evaluation of antigen binding capacity in Example 6.10, illustrating that the scFv <HL5> and sc (Fv) 2 dimers have a high affinity for human IAP.
Фиг.43 показывает результаты апоптоз-индуцирующего действия in vitro в примере 6.11, иллюстрирующие, что димер scFv <HL5> и sc(Fv)2 индуцируют апоптоз клеток hIAP/L1210 и клеток CCRF-CEM зависимым от концентрации образом.Fig. 43 shows the results of the in vitro apoptosis-inducing action in Example 6.11, illustrating that the scFv <HL5> dimer and sc (Fv) 2 dimer induce apoptosis of hIAP / L1210 cells and CCRF-CEM cells in a concentration-dependent manner.
Фиг.44 показывает результаты количественного измерения М-белка, продуцируемого клеточной линией миеломы человека КРММ2, в сыворотке мыши с трансплантированными клетками миеломы человека. Эта фигура иллюстрирует, что димер scFv <HL5> и sc(Fv)2 в сильной степени ингибировали рост клеток КРММ2.Fig. 44 shows the results of a quantitative measurement of the M protein produced by the human BMPM2 cell line in mouse serum with transplanted human myeloma cells. This figure illustrates that the scFv <HL5> dimer and sc (Fv) 2 dimer strongly inhibited the growth of CRMM2 cells.
Фиг.45 показывает время выживания (дни) мышей после трансплантации опухоли, иллюстрируя, что время выживания группы мышей с введенным scFv <HL5> было значительно увеличено.Fig. 45 shows the survival time (days) of mice after tumor transplantation, illustrating that the survival time of a group of mice injected with scFv <HL5> was significantly increased.
Фиг.46 показывает время выживания (дни) мышей после трансплантации опухоли, иллюстрируя, что время выживания группы мышей с введенным sc(Fv)2 было значительно увеличено.Fig. 46 shows the survival time (days) of mice after tumor transplantation, illustrating that the survival time of a group of mice injected with sc (Fv) 2 was significantly increased.
Фиг.47 является схемой, показывающей способ конструирования ДНК-фрагмента, кодирующего реконструированный одноцепочечный Fv 12B5, содержащий линкерную последовательность, состоящую из 15 аминокислот, и его структуру.Fig. 47 is a diagram showing a method of constructing a DNA fragment encoding a reconstructed single chain Fv 12B5 containing a linker sequence of 15 amino acids and its structure.
Фиг.48 показывает результат очистки каждого одноцепочечного Fv 12B5 гель-фильтрацией, полученного в примере 7.5 (1), иллюстрирующий, что sc12B5 разделялся на два пика (фракции А и В).48 shows the result of purification of each single chain Fv 12B5 gel filtration obtained in Example 7.5 (1), illustrating that sc12B5 was split into two peaks (fractions A and B).
Фиг.49 показывает результат анализа каждой фракции А и В электрофорезом в ДСН-ПААГ, проведенного в примере 7.5 (2).Fig. 49 shows the result of the analysis of each fraction A and B by SDS-PAGE electrophoresis carried out in Example 7.5 (2).
Фиг.50 показывает результат анализа каждой фракции А и В способом хроматографии на колонке Superdex 200, проведенного в примере 7.5 (2), иллюстрирующий, что основной пик фракции А элюировался при кажущейся молекулярной массе около 44 кД, как показано в (а), и что основной пик фракции В элюировался при кажущейся молекулярной массе около 22 кД в (b).Fig. 50 shows the result of the analysis of each fraction A and B by chromatography on a
Фиг.51 показывает результат измерения ТРО-подобной агонистической активности sc12B5 и антитела 12B5 (IgG, Fab), иллюстрирующий, что 12B5IgG и моновалентный одноцепочечный Fv (sc12B5) обнаруживали ТРО-подобную агонистическую активность, зависящую от концентрации.Fig. 51 shows a measurement result of TPO-like agonistic activity of sc12B5 and antibody 12B5 (IgG, Fab), illustrating that 12B5IgG and monovalent single chain Fv (sc12B5) showed concentration-dependent TPO-like agonistic activity.
Фиг.52 показывает результат измерения ТРО-подобной агонистической активности мономера и димера sc12B5, иллюстрирующий, что одноцепочечный Fv (димер sc12B5), имеющий бивалентный антигенсвязывающий сайт, имел агонистическую активность, приблизительно в 400 раз более высокую, чем моновалентный sc12B5, и что эта эффективность является эквивалентной или более высокой, чем эффективность ТРО человека.Fig. 52 shows a measurement result of TPO-like agonistic activity of sc12B5 monomer and dimer, illustrating that a single-chain Fv (sc12B5 dimer) having a bivalent antigen binding site had an agonistic activity approximately 400 times higher than the monovalent sc12B5, and that this efficiency is equivalent to or higher than the effectiveness of human TPO.
Фиг.53 показывает результат очистки полученного одноцепочечного антитела sc12E10 гель-фильтрационной хроматографией с использованием колонки Superdex 200HR, иллюстрирующий, что sc12E10 разделялся на два пика (фракции А и В).Fig. 53 shows the result of purification of the obtained single-chain antibody sc12E10 by gel filtration chromatography using a Superdex 200HR column, illustrating that sc12E10 was separated into two peaks (fractions A and B).
Фиг.54 показывает результат очистки полученного одноцепочечного антитела db12T10 гель-фильтрационной хроматографией с использованием колонки Superdex 200HR, иллюстрирующий, что db12E10 разделялся на два пика (фракции С и D).Fig. 54 shows the result of purification of the obtained db12T10 single chain antibody by gel filtration chromatography using a Superdex 200HR column, illustrating that db12E10 was separated into two peaks (fractions C and D).
Фиг.55 показывает электрофоретический анализ в ДСН-ПААГ фракций А и В (sc12E10) и фракций С и D (db12E10) в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях.Fig. 55 shows electrophoretic analysis in SDS-PAGE of fractions A and B (sc12E10) and fractions C and D (db12E10) under reducing and non-reducing conditions.
Фиг.56 показывает результат анализа фракций А и В гель-фильтрационной хроматографией с использованием колонки Superdex 200HR, иллюстрирующий, что (1) основной пик фракции А элюировался с кажущейся молекулярной массой около 42 кДа, а (2) основной пик фракции В элюировался с кажущейся молекулярной массой около 20 кДа.56 shows the result of the analysis of fractions A and B by gel filtration chromatography using a Superdex 200HR column, illustrating that (1) the main peak of fraction A was eluted with an apparent molecular weight of about 42 kDa, and (2) the main peak of fraction B was eluted with an apparent molecular weight of about 20 kDa.
Фиг.57 показывает результат анализа фракций С и D гель-фильтрационной хроматографией с использованием колонки Superdex 200HR, иллюстрирующий, что (1) основной пик фракции С элюировался с кажущейся молекулярной массой около 69 кДа, а (2) главный пик фракции D элюировался с кажущейся молекулярной массой около 41 кДа.Fig. 57 shows the result of the analysis of fractions C and D by gel filtration chromatography using a Superdex 200HR column, illustrating that (1) the main peak of fraction C was eluted with an apparent molecular weight of about 69 kDa, and (2) the main peak of fraction D was eluted with an apparent molecular weight of about 41 kDa.
Фиг.58 является графиком, показывающим агонистическую активность различных вариантов молекул антитела 12Е10 на MPL, иллюстрирующим, что одноцепочечные Fv (sc12E10, db12E10) обнаруживали ТРО-подобную агонистическую активность, тогда как 12Е10 IgG и 12Е10 Fab не обнаруживали.Fig. 58 is a graph showing agonistic activity of various variants of 12E10 antibody molecules on MPL, illustrating that single chain Fvs (sc12E10, db12E10) showed TPO-like agonistic activity, while 12E10 IgG and 12E10 Fab were not detected.
Фиг.59 является графиком, показывающим агонистическую активность мономера и димера sc12E10 и димера и тримера db12E10 на MPL, иллюстрирующим, что димер sc12E10 и димер и тример db12E10 обнаруживали ТРО-подобную агонистическую активность, более высокую, чем активность ТРО.Fig. 59 is a graph showing agonistic activity of sc12E10 monomer and dimer and db12E10 dimer and trimer on MPL, illustrating that sc12E10 dimer and db12E10 dimer and trimer showed TPO-like agonistic activity higher than TPO activity.
Сведения, подтвержающие возможность осуществления изобретенияInformation confirming the possibility of carrying out the invention
Данное изобретение будет иллюстрировано конкретно со ссылкой на следующие примеры, которые никоим образом не ограничивают объем данного изобретения.The invention will be illustrated specifically with reference to the following examples, which in no way limit the scope of the invention.
Для иллюстрации способа получения модифицированных антител данного изобретения ниже приведены примеры получения одноцепочечных Fv. В этих примерах получения модифицированных антител использовали мышиные антитела против IAP человека, MABL-1 и MABL-2. Гибридомы MABL-1 и MABL-2, продуцирующие их, соответственно, депонировали в уполномоченном международном депозитарии микроорганизмов (National Institute of Bioscience and Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Minister of International Trade and Industry (1-3 Higasi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan)) 11 сентября 1997 как PERM BP-6100 и FERM BP-6101.To illustrate the method for producing the modified antibodies of the present invention, examples of the preparation of single chain Fv are given below. In these examples of the preparation of modified antibodies, murine antibodies against human IAP, MABL-1 and MABL-2 were used. Hybridomas MABL-1 and MABL-2 producing them, respectively, were deposited with an authorized international depository of microorganisms (National Institute of Bioscience and Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Minister of International Trade and Industry (1-3 Higasi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan)) September 11, 1997 as PERM BP-6100 and FERM BP-6101.
ПримерыExamples
Пример 1 (Клонирование ДНК, кодирующих V-область мышиных моноклональных антител к IAP человека)Example 1 (Cloning of DNA encoding the V region of murine monoclonal antibodies to human IAP)
ДНК, кодирующие вариабельные районы мышиных моноклональных антител к IAP человека, MABL-1 и MABL-2, клонировали следующим образом.DNAs encoding the variable regions of murine monoclonal antibodies to human IAP, MABL-1 and MABL-2, were cloned as follows.
1.1 Получение матричной РНК(мРНК)1.1 Obtaining messenger RNA (mRNA)
мРНК гибридом MABL-1 и MABL-2 выделяли с использованием набора mRNA Purification Kit (Pharmacia Biotech).mRNA hybridomas MABL-1 and MABL-2 were isolated using the mRNA Purification Kit (Pharmacia Biotech).
1.2 Синтез двухцепочечной кДНК1.2 Synthesis of double-stranded cDNA
Двухцепочечную кДНК синтезировали из приблизительно 1 мкг мРНК с использованием набора Marathon cDNA Amplification Kit (Clontech) и присоединяли к ней адаптер.Double-stranded cDNA was synthesized from approximately 1 μg mRNA using the Marathon cDNA Amplification Kit (Clontech) and an adapter was attached to it.
1.3 ПЦР-амплификация генов, кодирующих вариабельные районы антитела1.3 PCR amplification of genes encoding the variable regions of the antibody
ПЦР проводили с использованием термоциклера Thermal Cycler (Perkin Elmer).PCR was performed using a Thermal Cycler thermal cycler (Perkin Elmer).
(1) Амплификация гена, кодирующего V-область L-цепи MABL-1(1) Amplification of a gene encoding the V region of the L chain of MABL-1
Праймерами, используемыми для ПЦР-способа, являются адапторный праймер-1 (Clontech), представленный SEQ ID NO 1, который гибридизуется с частью последовательности адаптера, и МКС-праймер (Mouse Kappa Constant) (Bio/Technology, 9, 88-89, 1991), представленный SEQ ID NO 2, который гибридизуется с V-областью L-цепи типа каппа мыши.The primers used for the PCR method are adapter primer-1 (Clontech) represented by
50 мкл ПЦР-раствора содержат 5 мкл 10-кратного ПЦР-буфера II, 2 мМ MgCl2, 0,16 мМ dNTP (dATP, dGTP, dCTP и dTTP), 2,5 единиц ДНК-полимеразы AmpliTaq Gold (Perkin Elmer), 0,2 мкМ адапторный праймер SEQ ID NO 1, 0,2 мкМ МКС-праймер SEQ ID NO 2 и 0,1 мкг двухцепочечной кДНК, полученной из MABL-1. Этот раствор предварительно нагревали при начальной температуре 94°С в течение 9 минут и затем нагревали при 94°С в течение 1 минуты, при 60°С в течение 1 минуты и при 72°С в течение 1 минуты 20 секунд в указанной последовательности. Этот температурный цикл повторяли 35 раз и затем реакционную смесь дополнительно нагревали при 72°С в течение 10 минут.50 μl of PCR solution contain 5 μl of 10-fold PCR buffer II, 2 mm MgCl 2 , 0.16 mm dNTP (dATP, dGTP, dCTP and dTTP), 2.5 units of AmpliTaq Gold DNA polymerase (Perkin Elmer), 0.2 μM adapter primer
(2) Амплификация кДНК, кодирующей У-область Н-цепи MABL-1(2) Amplification of cDNA Encoding the Y-Region of the H Chain of MABL-1
Адапторный праймер-1, представленный SEQ ID NO 1, и MHC-γ1-праймер (Mouse Heavy Constant) (Bio/Technology, 9, 88-89, 1991), представленный SEQ ID NO 3, использовали в качестве праймеров для ПЦР.The adapter primer-1 represented by
Амплификацию кДНК выполняли в соответствии со способом амплификации гена V-области L-цепи, который описан в Примере 1.3-(1), за исключением использования 0,2 мкМ MHC-γ1-праймера вместо 0,2 мкМ МКС-праймера.Amplification of cDNA was performed in accordance with the method of amplification of the V-region gene of the L chain, which is described in Example 1.3- (1), with the exception of using 0.2 μM MHC-γ1 primer instead of 0.2 μM MKS primer.
(3) Амплификация кДНК, кодирующей V-область L-цепи MABL-2(3) Amplification of cDNA encoding the MABL-2 L chain V region
Адапторный праймер-1, представленный SEQ ID NO 1, и МКС-праймер, представленный SEQ ID NO 2, использовали в качестве праймеров для ПЦР.The adapter primer-1 represented by
Амплификацию кДНК выполняли в соответствии со способом амплификации гена V-области L-цепи гена MABL-1, который описан в Примере 1.3-(1), за исключением использования 0,1 мкг двухцепочечной кДНК, полученной из MABL-2, вместо 0,1 мкг двухцепочечной кДНК из MABL-1.Amplification of cDNA was carried out in accordance with the method of amplification of the V-region gene of the L chain of the MABL-1 gene, which is described in Example 1.3- (1), except for using 0.1 μg of double-stranded cDNA obtained from MABL-2, instead of 0.1 μg double-stranded cDNA from MABL-1.
(4) Амплификация кДНК, кодирующей V-область Н-цепи MABL-2(4) Amplification of cDNA Encoding the V Region of the H Chain of MABL-2
Адапторный праймер-1, представленный SEQ ID NO 1, и МНС-γ2а-праймер (Bio/Technology, 9, 88-89, 1991), представленный SEQ ID NO 4, использовали в качестве праймеров для ПЦР.The adapter primer-1 represented by
Амплификацию кДНК выполняли в соответствии со способом амплификации гена V-области L-цепи, который описан в Примере 1.3-(3), за исключением использования 0,2 мкМ МНС-γ2-праймера вместо 0,2 мкМ МКС-праймера.Amplification of cDNA was carried out in accordance with the method of amplification of the V-region gene of the L chain, which is described in Example 1.3- (3), except for using 0.2 μM MHC-γ2 primer instead of 0.2 μM MKS primer.
1.4 Очистка ПЦР-продуктов1.4 Purification of PCR products
ДНК-фрагмент, амплифицированный при помощи ПЦР, как описано выше, очищали с использованием набора QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) и растворяли в 10 мМ Трис-HCl (рН 8,0), содержащем 1 мМ ЭДТА.The PCR amplified DNA fragment as described above was purified using the QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) and dissolved in 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) containing 1 mM EDTA.
1.5 Лигирование и трансформация1.5 Ligation and transformation
Приблизительно 140 нг ДНК-фрагмента, содержащего ген, кодирующий мышиную V-область L-цепи типа каппа, полученный из MABL-1, как описано выше, лигировали с 50 нг вектора pGEM-T Easy (Promega) в реакционном буфере, содержащем 30 мМ Трис-HCl (рН 7,8), 10 мМ MgCl2, 10 мМ дитиотреитол, 1 мМ АТФ и 3 единицы ДНК-лигазы Т4 (Promega), при 15°С в течение 3 часов.Approximately 140 ng of the DNA fragment containing the gene encoding the kappa type L mouse murine V region obtained from MABL-1 as described above was ligated with 50 ng of the pGEM-T Easy (Promega) vector in a reaction buffer containing 30 mM Tris-HCl (pH 7.8), 10 mM MgCl 2 , 10 mM dithiothreitol, 1 mM ATP and 3 units of T4 DNA ligase (Promega), at 15 ° C for 3 hours.
Затем 1 мкл этой реакционной смеси добавляли к 50 мкл компетентных клеток Е.coli DH5α (Toyobo Inc.). и клетки выдерживали на льду в течение 30 минут, инкубировали при 42°С в течение 1 минуты и опять выдерживали на льду в течение 2 минут. Добавляли 100 мкл среды SOC (Gibco BRL). Клетки Е.coli высевали на (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Press, 1989) агаризованную среду LB, содержащую 100 мкг/мл ампициллина (Sigma) и культивировали при 37°С в течение ночи для получения трансформантов Е.coli.Then, 1 μl of this reaction mixture was added to 50 μl of competent E. coli DH5α cells (Toyobo Inc.). and the cells were kept on ice for 30 minutes, incubated at 42 ° C for 1 minute, and again kept on ice for 2 minutes. 100 μl of SOC medium (Gibco BRL) was added. E. coli cells were seeded on (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Press, 1989) LB agar medium containing 100 μg / ml ampicillin (Sigma) and cultured at 37 ° C. overnight to obtain transformants of E. coli.
Трансформант культивировали в 3 мл среды LB, содержащей 50 мкг/мл ампициллина, при 37°С в течение ночи, и плазмидную ДНК выделяли из этой культуры с использованием набора QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen).The transformant was cultured in 3 ml LB medium containing 50 μg / ml ampicillin at 37 ° C. overnight, and plasmid DNA was isolated from this culture using the QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen).
Полученная плазмида, содержащая ген, кодирующий мышиную V-область L-цепи типа каппа, происходящий из гибридомы MABL-1, была обозначена pGEM-M1L.The resulting plasmid containing the gene encoding the kappa mouse L chain V region derived from the MABL-1 hybridoma was designated pGEM-M1L.
В соответствии с описанным выше способом плазмиду, содержащую ген, кодирующий V-область Н-цепи мыши, происходящий из гибридомы MABL-1, получали с использованием очищенного ДНК-фрагмента и обозначали как pGEM-M1H.According to the method described above, a plasmid containing a gene encoding the mouse H chain V region derived from the MABL-1 hybridoma was obtained using a purified DNA fragment and designated pGEM-M1H.
Плазмиду, содержащую ген, кодирующий V-область L-цепи типа каппа мыши, происходящий из гибридомы MABL-2, получали с использованием очищенного ДНК-фрагмента и обозначали как pGEM-M2L.A plasmid containing the gene encoding the mouse Kappa type L chain V region derived from the MABL-2 hybridoma was obtained using a purified DNA fragment and designated pGEM-M2L.
Плазмиду, содержащую ген, кодирующий V-область Н-цепи мыши, происходящий из гибридомы MABL-2, получали с использованием очищенного ДНК-фрагмента и обозначали как pGEM-M2H.A plasmid containing the gene encoding the mouse H chain V region V originating from the MABL-2 hybridoma was obtained using a purified DNA fragment and designated as pGEM-M2H.
Пример 2 (Секвенирование ДНК)Example 2 (DNA Sequencing)
Нуклеотидную последовательность областей, кодирующих кДНК в вышеупомянутых плазмидах, определяли с использованием автоматического ДНК-секвенатора (Applied Biosystems) и набора для секвенирования ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems) в соответствии с протоколом изготовителя.The nucleotide sequence of the cDNA encoding regions in the above plasmids was determined using an automatic DNA sequencer (Applied Biosystems) and an ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems) sequencing kit according to the manufacturer's protocol.
Нуклеотидная последовательность гена, кодирующего V-область L-цепи мышиного антитела MABL-1, которая встроена в плазмиду pGEM-M1L, показана в SEQ ID NO 5.The nucleotide sequence of the gene encoding the V region of the L chain of the murine MABL-1 antibody, which is inserted into the pGEM-M1L plasmid, is shown in
Нуклеотидная последовательность гена, кодирующего V-область Н-цепи мышиного антитела MABL-1, которая встроена в плазмиду pGEM-M1H, показана в SEQ ID NO 6.The nucleotide sequence of the gene encoding the V region of the H chain of the murine MABL-1 antibody, which is inserted into the plasmid pGEM-M1H, is shown in
Нуклеотидная последовательность гена, кодирующего V-область L-цепи мышиного антитела MABL-2, которая встроена в плазмиду pGEM-M2L, показана в SEQ ID NO 7.The nucleotide sequence of the gene encoding the V region of the L chain of the murine MABL-2 antibody, which is inserted into the pGEM-M2L plasmid, is shown in
Нуклеотидная последовательность гена, кодирующего V-область Н-цепи мышиного антитела MABL-2, которая встроена в плазмиду pGEM-M2H, показана в SEQ ID NO 8.The nucleotide sequence of a gene encoding the V region of the H chain of the murine MABL-2 antibody, which is inserted into the pGEM-M2H plasmid, is shown in
Пример 3 (Определение CDR)Example 3 (Definition of CDR)
V-области L-цепи и Н-цепи обычно имеют сходное строение, и каждые четыре каркасные области в них связаны тремя гипервариабельными участками, т.е. определяющими комплементарность районами (CDR). Аминокислотная последовательность этой каркасной части является относительно консервативной, тогда как аминокислотная последовательность CDR имеет чрезвычайно высокую изменчивость (Kabat, E.A. et al., "Sequence of Protein of Immunological Interest", US Dept. Health and Human Services, 1983).The V regions of the L chain and the H chain usually have a similar structure, and every four frame regions in them are connected by three hypervariable regions, i.e. complementarity determining regions (CDRs). The amino acid sequence of this skeleton is relatively conserved, while the amino acid sequence of the CDR has extremely high variability (Kabat, E. A. et al., "Sequence of Protein of Immunological Interest", US Dept. Health and Human Services, 1983).
На основании этих фактов аминокислотные последовательности вариабельных районов мышиных моноклональных антител к IAP человека сравнивали с базой данных аминокислотных последовательностей антител, полученной Kabat et al., на предмет выявления гомологии. CDR-районы определяли на основе гомологии, как показано в таблице 1.Based on these facts, the amino acid sequences of the variable regions of murine monoclonal antibodies to human IAP were compared with the database of amino acid sequences of antibodies obtained by Kabat et al., For the identification of homology. CDR regions were determined based on homology, as shown in table 1.
Пример 4 (Идентификация экспрессии клонированной кДНК. Получение химерного антитела MABL-1 и химерного антитела MABL-2)Example 4 (Identification of the expression of cloned cDNA. Obtaining chimeric antibodies MABL-1 and chimeric antibodies MABL-2)
4.1 Получение векторов, экспрессирующих химерное антитело MABL-14.1 Obtaining vectors expressing the chimeric antibody MABL-1
кДНК-клоны, pGEM-M1L и pGEM-M1H, кодирующие V-области L-цепи и Н-цепи мышиного антитела MABL-1, соответственно, модифицировали при помощи ПЦР-способа и вводили в экспрессионный вектор HEF (WO 92/19759) для получения векторов, экспрессирующих химерное антитело MABL-1.cDNA clones, pGEM-M1L and pGEM-M1H encoding the V regions of the L chain and H chain of the murine MABL-1 antibody, respectively, were modified by PCR and introduced into the HEF expression vector (WO 92/19759) for for preparing vectors expressing the chimeric MABL-1 antibody.
Прямой праймер MLS (SEQ ID NO 9) для V-области L-цепи и прямой праймер MHS (SEQ ID NO 10) для V-области Н-цепи конструировали так, чтобы они гибридизовались с ДНК, кодирующей начало лидерной последовательности каждой V-области, и содержали консенсусную последовательность Козака (J.Mol. Biol., 196, 947-950, 1987) и сайт рестриктазы HindIII. Обратный праймер MLAS (SEQ ID NO 11) для V-области L-цепи и обратный праймер MHAS (SEQ ID NO 12) для V-области Н-цепи конструировали так, чтобы они гибридизовались с ДНК, кодирующей конец J-сегмента, и содержали последовательность донорного сайта сплайсинга и сайт рестриктазы BamHI.The MLS forward primer (SEQ ID NO 9) for the L chain V region and the MHS forward primer (SEQ ID NO 10) for the H chain V region were designed to hybridize with DNA encoding the start of the leader sequence of each V region , and contained the Kozak consensus sequence (J. Mol. Biol., 196, 947-950, 1987) and the HindIII restriction site. The reverse primer MLAS (SEQ ID NO 11) for the V region of the L chain and the reverse primer MHAS (SEQ ID NO 12) for the V region of the H chain were designed to hybridize with DNA encoding the end of the J segment and contain the sequence of the splicing donor site and the BamHI restriction site.
100 мкл ПЦР-раствора, содержащего 10 мкл 10-кратного ПЦР-буфера II, 2 мМ MgCl2, 0,16 мМ dNTP (dATP, dGTP, dCTP и dTTP), 5 единиц ДНК-полимеразы AmpliTaq Gold, 0,4 мкМ каждого из праймеров и 8 нг ДНК-матрицы (pGEM-M1L или pGEM-M1H), предварительно нагревали при начальной температуре 94°С в течение 9 минут и затем нагревали при 94°С в течение 1 минуты, при 60°С в течение 1 минуты и при 72°С в течение 1 минуты 20 секунд в указанной последовательности. Этот температурный цикл повторяли 35 раз и затем реакционную смесь дополнительно нагревали при 72°С в течение 10 минут.100 μl of PCR solution containing 10 μl of 10-fold PCR buffer II, 2 mM MgCl 2 , 0.16 mM dNTP (dATP, dGTP, dCTP and dTTP), 5 units of AmpliTaq Gold DNA polymerase, 0.4 μM each of primers and 8 ng of the DNA template (pGEM-M1L or pGEM-M1H), were pre-heated at an initial temperature of 94 ° C for 9 minutes and then heated at 94 ° C for 1 minute, at 60 ° C for 1 minute and at 72 ° C for 1
ПЦР-продукт очищали с использованием набора QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) и затем расщепляли HindIII и BamHI. Продукт из V-области L-цепи клонировали в экспрессионный вектор HEF, HEF-κ, а продукт из V-области Н-цепи клонировали в экспрессионный вектор HEF, HEF-γ. После секвенирования ДНК, плазмиды, содержащие ДНК-фрагмент с правильной ДНК-последовательностью, обозначали как HEF-M1L и HEF-M1H, соответственно.The PCR product was purified using a QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) and then digested with HindIII and BamHI. The product from the L chain V region was cloned into the HEF, HEF-κ expression vector, and the product from the H chain V region was cloned into the HEF expression, HEF-γ. After DNA sequencing, plasmids containing the DNA fragment with the correct DNA sequence were designated as HEF-M1L and HEF-M1H, respectively.
4.2 Получение векторов, экспрессирующих химерные антитела MABL-24.2 Obtaining vectors expressing chimeric antibodies MABL-2
Модификацию и клонирование кДНК выполняли таким же образом, как описано в примере 4.1, за исключением того, что использовали pGEM-M2L и pGEM-M2H в качестве ДНК-матрицы вместо pGEM-M1L и pGEM-M1H. После секвенирования ДНК плазмиды, содержащие ДНК-фрагменты с правильными ДНК-последовательностями, обозначали как HEF-M2L и HEF-M2H, соответственно.Modification and cloning of cDNA was performed in the same manner as described in Example 4.1, except that pGEM-M2L and pGEM-M2H were used as the DNA template instead of pGEM-M1L and pGEM-M1H. After DNA sequencing, plasmids containing DNA fragments with the correct DNA sequences were designated as HEF-M2L and HEF-M2H, respectively.
4.3 Трансфекция в клетки COS74.3 Transfection into COS7 cells
Вышеупомянутые экспрессионные вектора тестировали в клетках COS7 для наблюдения временной экспрессии химерных антител MABL-1 и MABL-2.The above expression vectors were tested in COS7 cells to observe the transient expression of chimeric antibodies MABL-1 and MABL-2.
(1) Трансфекция генами химерного антитела MABL-1(1) Transfection with genes of the chimeric antibody MABL-1
Клетки COS7 котрансформировали векторами HEF-M1L и HEF-M1H электропорацией с использованием устройства Gene Pulser (BioRad). Каждую ДНК (10 мкг) и 0,8 мл PBS, содержащего 1×107 клеток/мл, добавляли в кювету. Смесь обрабатывали импульсом при 1,5 кВ, при электрической емкости 25 мкФ.COS7 cells were co-transformed with the HEF-M1L and HEF-M1H vectors by electroporation using a Gene Pulser (BioRad) device. Each DNA (10 μg) and 0.8 ml of PBS containing 1 × 10 7 cells / ml was added to the cuvette. The mixture was treated with a pulse at 1.5 kV, with an electric capacitance of 25 μF.
После "восстановления" в течение 10 минут при комнатной температуре электропорированные клетки переносили в культуральную среду Игла в модификации Дульбекко (DMEM, Gibco BRL), содержащую 10% свободной от γ-глобулина фетальной телячьей сыворотки. После культивирования в течение 72 часов супернатант собирали, центрифугировали для удаления клеточных фрагментов и отделяли.After “reconstitution” for 10 minutes at room temperature, the electroporated cells were transferred to the Eagle culture medium in the Dulbecco modification (DMEM, Gibco BRL) containing 10% γ-globulin-free fetal calf serum. After culturing for 72 hours, the supernatant was collected, centrifuged to remove cell fragments, and separated.
(2) Трансфекция генами, кодирующими химерное антитело MABL-2(2) Transfection with genes encoding the chimeric antibody MABL-2
Котрансфекцию клеток COS7 генами, кодирующими химерное антитело MABL-2, проводили таким же образом, как описано в примере 4.3-(1), за исключением того, что использовали вектора HEF-M2L и HEF-M2H вместо векторов HEF-M1L и HEF-M1H. Супернатант получали таким же образом.The co-transfection of COS7 cells with genes encoding the chimeric MABL-2 antibody was performed in the same manner as described in Example 4.3- (1), except that the vectors HEF-M2L and HEF-M2H were used instead of the vectors HEF-M1L and HEF-M1H . Supernatant was obtained in the same manner.
4.4 Проточная цитометрия4.4 Flow cytometry
Проточную цитометрию проводили с использованием вышеупомянутого культурального супернатанта клеток COS7 для измерения связывания с антигеном. Культуральный супернатант клеток COS7, экспрессирующих химерное антитело MABL-1, или клеток COS7, экспрессирующих химерное антитело MABL-2, или IgG-антитело человека (Sigma) в качестве контроля добавляли к 4×105 клеток линии клеток мышиного лейкоза L1210, экспрессирующей IAP человека, и инкубировали на льду. После промывки к ним добавляли FITC-меченное антитело против IgG человека (Cappel). После инкубации и промывки измеряли интенсивность флуоресценции с использованием прибора FACScan (Becton Dickinson).Flow cytometry was performed using the aforementioned COS7 cell culture supernatant to measure antigen binding. The culture supernatant of COS7 cells expressing the chimeric MABL-1 antibody, or COS7 cells expressing the chimeric MABL-2 antibody or human IgG antibody (Sigma) was added as a control to 4 × 10 5 cells of the murine leukemia L1210 cell line expressing human IAP , and incubated on ice. After washing, FITC-labeled anti-human IgG antibody (Cappel) was added thereto. After incubation and washing, fluorescence intensity was measured using a FACScan instrument (Becton Dickinson).
Поскольку химерные антитела MABL-1 и MABL-2 специфически связывались с клетками L1210, экспрессирующими IAP человека, было подтверждено, что эти химерные антитела имели правильные структуры V-областей мышиных моноклональных антител MABL-1 и MABL-2, соответственно (фигуры 1-3).Since the chimeric antibodies MABL-1 and MABL-2 specifically bind to L1210 cells expressing human IAP, it was confirmed that these chimeric antibodies had the correct structure of the V regions of the murine monoclonal antibodies MABL-1 and MABL-2, respectively (figures 1-3 )
Пример 5 (Получение реконструированного одноцепочечного Fv (scFv) антитела MABL-1 и антитела MABL-2)Example 5 (Obtaining reconstructed single-chain Fv (scFv) antibodies MABL-1 and antibodies MABL-2)
5.1 Получение реконструированного одноцепочечного Fv антитела MABL-15.1 Obtaining a reconstructed single chain Fv antibody MABL-1
Реконструированный одноцепочечный Fv антитела MABL-1 получали следующим образом. V-область H-цепи и V-область L-цепи антитела MABL-1 и линкер соответственно амплифицировали при помощи ПЦР-способа и соединяли для получения реконструированного одноцепочечного Fv антитела MABL-1. Способ получения иллюстрируется на фиг.4. Для получения одноцепочечного Fv антитела MABL-1 использовали шесть праймеров (A-F). Праймеры А, С и Е содержат смысловую последовательность, а праймеры В, D и F содержат антисмысловую последовательность.Reconstructed single chain Fv MABL-1 antibodies were prepared as follows. The V region of the H chain and the V region of the L chain of the MABL-1 antibody and linker, respectively, were amplified by the PCR method and coupled to obtain a reconstructed single chain Fv antibody MABL-1. The production method is illustrated in figure 4. Six primers (A-F) were used to obtain a single chain Fv MABL-1 antibody. Primers A, C, and E contain a sense sequence, and primers B, D, and F contain an antisense sequence.
Прямой праймер VHS для V-области Н-цепи (Праймер A, SEQ ID NO 13) конструировали так, чтобы он гибридизовался с ДНК, кодирующей N-конец V-области Н-цепи, и содержал сайт узнавания рестриктазы NcoI. Обратный праймер VHAS для V-области Н-цепи (Праймер В, SEQ ID NO 14) конструировали так, чтобы он гибридизовался с ДНК, кодирующей С-конец V-области Н-цепи, и перекрывался с линкером.The VHS forward primer for the H chain V region (Primer A, SEQ ID NO 13) was designed to hybridize with DNA encoding the N-terminus of the H chain V region and contain an NcoI restriction enzyme recognition site. The VHAS reverse primer for the H chain V region (Primer B, SEQ ID NO 14) was designed to hybridize with DNA encoding the C-terminus of the H chain V region and overlap with the linker.
Прямой праймер LS для линкера (Праймер С, SEQ ID NO 15) конструировали так, чтобы он гибридизовался с ДНК, кодирующей N-конец линкера, и перекрывался с ДНК, кодирующей С-конец V-области Н-цепи. Обратный праймер LAS для линкера (Праймер D, SEQ ID NO 16) конструировали так, чтобы он гибридизовался с ДНК, кодирующей С-конец линкера, и перекрывался с ДНК, кодирующей N-конец V-области L-цепи.The LS direct primer for the linker (Primer C, SEQ ID NO 15) was designed to hybridize with DNA encoding the N-terminus of the linker and overlap with DNA encoding the C-terminus of the V region of the H chain. The LAS reverse linker primer (Primer D, SEQ ID NO 16) was designed to hybridize with DNA encoding the C-terminus of the linker and overlap with DNA encoding the N-terminus of the V region of the L chain.
Прямой праймер VLS для V-области L-цепи (Праймер Е, SEQ ID NO 17) конструировали так, чтобы он гибридизовался с ДНК, кодирующей С-конец линкера, и перекрывался с ДНК, кодирующей N-конец V-области L-цепи. Обратный праймер VLAS-FLAG для V-области L-цепи (Праймер F, SEQ ID NO 18) конструировали так, чтобы он гибридизовался с ДНК, кодирующей С-конец V-области L-цепи, и содержал последовательность, кодирующую пептид FLAG (Hopp N.P. et al., Bio/Technology, 6, 1204-1210, 1988), два стоп-кодона и сайт узнавания рестриктазы EcoRI.The forward VLS primer for the V region of the L chain (Primer E, SEQ ID NO 17) was designed to hybridize with DNA encoding the C-terminus of the linker and overlap with DNA encoding the N-terminus of the V region of the L chain. The VLAS-FLAG reverse primer for the L chain V region (Primer F, SEQ ID NO 18) was designed to hybridize with DNA encoding the C-terminus of the L chain V region and contain a sequence encoding the FLAG peptide (Hopp NP et al., Bio / Technology, 6, 1204-1210, 1988), two stop codons and an EcoRI restriction enzyme recognition site.
На первой стадии ПЦР проводили три реакции: А-В, C-D и E-F, и полученные ПЦР-продукты очищали. Три ПЦР-продукта, полученные из этой первой стадии ПЦР, состыковывали на основе их комплементарности. Затем добавляли праймеры А и F и амплифицировали полноразмерную ДНК, кодирующую реконструированный одноцепочечный Fv антитела MABL-1 (вторая ПЦР). В первой ПЦР в качестве матрицы использовали плазмиду pGEM-M1H, кодирующую V-область Н-цепи антитела MABL-1 (см. пример 2), плазмиду pSC-DPI, которая содержит ДНК-последовательность, кодирующую район линкера, содержащий: Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser (SEQ ID NO 19) (Huston, J.S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5879-5883, 1988), и плазмиду pGEM-MIL, кодирующую V-область L-цепи антитела MABL-1 (см. пример 2), соответственно.In the first stage of PCR, three reactions were performed: AB, C-D, and E-F, and the resulting PCR products were purified. The three PCR products obtained from this first step of PCR were docked based on their complementarity. Then primers A and F were added and the full-length DNA encoding the reconstructed single chain Fv antibody MABL-1 (second PCR) was amplified. In the first PCR, plasmid pGEM-M1H encoding the V region of the H chain of the MABL-1 antibody (see Example 2), plasmid pSC-DPI, which contains the DNA sequence encoding the linker region, containing: Gly Gly Gly was used as a template Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser (SEQ ID NO 19) (Huston, JS, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5879-5883, 1988), and plasmid pGEM- MIL encoding the V region of the L chain of the MABL-1 antibody (see Example 2), respectively.
50 мкл раствора для первой стадии ПЦР содержат 5 мкл 10-кратного ПЦР-буфера II, 2 мМ MgCl2, 0,16 мМ dNTP, 2,5 единицы ДНК-полимеразы AmpliTaq Gold (Perkin Elmer), 0,4 мкМ каждого из праймеров и 5 нг каждой из ДНК-матриц. ПЦР-раствор предварительно нагревали при начальной температуре 94°С в течение 9 минут и затем нагревали при 94°С в течение 1 минуты, при 65°С в течение 1 минуты и при 72°С в течение 1 минуты 20 секунд в указанной последовательности. Этот температурный цикл повторяли 35 раз и затем реакционную смесь дополнительно нагревали при 72°С в течение 7 минут.50 μl of the solution for the first PCR stage contain 5 μl of 10-fold PCR buffer II, 2 mM MgCl 2 , 0.16 mm dNTP, 2.5 units of AmpliTaq Gold DNA polymerase (Perkin Elmer), 0.4 μM of each of the primers and 5 ng of each of the DNA templates. The PCR solution was preheated at an initial temperature of 94 ° C for 9 minutes and then heated at 94 ° C for 1 minute, at 65 ° C for 1 minute, and at 72 ° C for 1
ПЦР-продукты А-В (371 п.о.), C-D (63 п.о.) и E-F (384 п.о.) очищали с использованием набора для очистки QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) и проводили сборку во второй ПЦР. Во второй ПЦР 98 мкл ПЦР-раствора, содержащего 120 нг продукта первой ПЦР А-В, 20 нг ПЦР-продукта C-D и 120 нг ПЦР-продукта E-F, 10 мкл 10-кратного ПЦР-буфера II, 2 мМ MgCl2, 0,16 мМ dNTP, 5 единиц ДНК-полимеразы AmpliTaq Gold (Perkin Elmer) предварительно нагревали при начальной температуре 94°С в течение 8 минут и затем нагревали при 94°С в течение 2 минут, при 65°С в течение 2 минут и при 72°С в течение 2 минут в указанной последовательности. Этот температурный цикл повторяли дважды и затем в реакцию добавляли 0,4 мкМ каждого из праймеров А и F, соответственно. Эту смесь предварительно нагревали при начальной температуре 94°С в течение 1 минуты и затем нагревали при 94°С в течение 1 минуты, при 65°С в течение 1 минуты и при 72°С в течение 1 минуты 20 секунд в указанной последовательности. Этот температурный цикл повторяли 35 раз и затем реакционную смесь дополнительно нагревали при 72°С в течение 7 минут.PCR products AB (371 bp), CD (63 bp) and EF (384 bp) were purified using the QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) and assembled into a second PCR . In the second PCR, 98 μl of PCR solution containing 120 ng of the first PCR product A-B, 20 ng of PCR product CD and 120 ng of PCR product EF, 10 μl of 10-fold PCR buffer II, 2 mM MgCl 2 , 0, 16 mM dNTP, 5 AmpliTaq Gold DNA polymerase units (Perkin Elmer) were preheated at an initial temperature of 94 ° C for 8 minutes and then heated at 94 ° C for 2 minutes, at 65 ° C for 2 minutes, and at 72 ° C for 2 minutes in the indicated sequence. This temperature cycle was repeated twice and then 0.4 μM of each of primers A and F were added to the reaction, respectively. This mixture was preheated at an initial temperature of 94 ° C for 1 minute and then heated at 94 ° C for 1 minute, at 65 ° C for 1 minute, and at 72 ° C for 1
ДНК-фрагмент 843 п.о., полученный во второй ПЦР, очищали и расщепляли NcoI и EcoRI. Полученный ДНК-фрагмент клонировали в вектор pSCFVT7. Экспрессионный вектор pSCFVT7 содержит сигнальную последовательность pelB, пригодную для периплазматической экспрессионной системы Е.coli (Lei, S.P., et al., J.Bacteriology, 169, 4379-4383, 1987). После секвенирования ДНК плазмиду, содержащую ДНК-фрагмент, кодирующий правильную аминокислотную последовательность реконструированного одноцепочечного Fv антитела MABL-1, обозначали как "pscM1" (см. фиг.5). Нуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность этого реконструированного одноцепочечного Fv антитела MABL-1, содержащегося в плазмиде pscM1, приведены в SEQ ID NO 20.The 843 bp DNA fragment obtained in the second PCR was purified and digested with NcoI and EcoRI. The resulting DNA fragment was cloned into pSCFVT7 vector. The expression vector pSCFVT7 contains a pelB signal sequence suitable for the periplasmic expression system of E. coli (Lei, S.P., et al., J. Bacteriology, 169, 4379-4383, 1987). After DNA sequencing, a plasmid containing a DNA fragment encoding the correct amino acid sequence of the reconstructed single chain Fv antibody MABL-1 was designated as "pscM1" (see FIG. 5). The nucleotide sequence and amino acid sequence of this reconstructed single-chain Fv antibody MABL-1 contained in the plasmid pscM1 are shown in
Вектор pscM1 модифицировали при помощи ПЦР-способа для получения вектора, экспрессирующего реконструированный одноцепочечный Fv антитела MABL-1 в клетках млекопитающих. Полученный ДНК-фрагмент вводили в экспрессионный вектор pCHO1. Этот экспрессионный вектор, pCHO1, получали расщеплением DHFR-ΔE-rvH-PM1-f (WO 92/19759) EcoRI и SmaI для исключения гена антитела и присоединением к нему EcoRI-NotI-BamHI-адаптора (Takara Shuzo).The pscM1 vector was modified using the PCR method to obtain a vector expressing the reconstructed single chain Fv antibody MABL-1 in mammalian cells. The resulting DNA fragment was introduced into the pCHO1 expression vector. This expression vector, pCHO1, was obtained by digestion of DHFR-ΔE-rvH-PM1-f (WO 92/19759) EcoRI and SmaI to exclude the antibody gene and attach the EcoRI-NotI-BamHI adapter (Takara Shuzo) to it.
В качестве прямого праймера для ПЦР праймер Sal-VHS, показанный в SEQ ID NO 21, конструировали так, чтобы он гибридизовался с ДНК, кодирующей N-конец V-области Н-цепи, и содержал сайт узнавания рестриктазы SalI. В качестве обратного праймера для ПЦР праймер FRHlanti, показанный в SEQ ID NO 22, конструировали так, чтобы он гибридизовался с ДНК, кодирующей конец первой каркасной последовательности.As a direct PCR primer, the Sal-VHS primer shown in SEQ ID NO 21 was designed to hybridize with DNA encoding the N-terminus of the V region of the H chain and contain a SalI restriction enzyme recognition site. As a reverse primer for PCR, the FRHlanti primer shown in SEQ ID NO 22 was designed to hybridize with DNA encoding the end of the first frame sequence.
100 мкл ПЦР-раствора, содержащего 10 мкл 10-кратного ПЦР-буфера II, 2 мМ MgCl2, 0,16 мМ dNTP, 5 единиц ДНК-полимеразы AmpliTaq Gold, 0,4 мкМ каждого праймера и 8 нг ДНК-матрицы (pscMl), предварительно нагревали при начальной температуре 95°С в течение 9 минут и затем нагревали при 95°С в течение 1 минуты, при 60°С в течение 1 минуты и при 72°С в течение 1 минуты 20 секунд в указанной последовательности. Этот температурный цикл повторяли 35 раз и затем реакционную смесь дополнительно нагревали при 72°С в течение 7 минут.100 μl of PCR solution containing 10 μl of 10-fold PCR buffer II, 2 mM MgCl 2 , 0.16 mM dNTP, 5 units of AmpliTaq Gold DNA polymerase, 0.4 μM of each primer and 8 ng of DNA template (pscMl ), preheated at an initial temperature of 95 ° C for 9 minutes and then heated at 95 ° C for 1 minute, at 60 ° C for 1 minute and at 72 ° C for 1
ПЦР-продукт очищали с использованием набора QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) и затем расщепляли SaiI и MboII для получения ДНК-фрагмента, кодирующего N-конец реконструированного одноцепочечного Fv антитела MABL-1. Вектор pscMl расщепляли MboII и EcoRI с получением ДНК-фрагмента, кодирующего С-конец реконструированного одноцепочечного Fv антитела MABL-1. SalI-MboII-фрагмент ДНК и MboII-EcoRI-фрагмент ДНК клонировали в вектор pCHO1-Igs. После секвенирования ДНК плазмиду, содержащую желаемую ДНК-последовательность, обозначали как "рСНОМ1" (см. фиг.6). Экспрессионный вектор pCHO1-Igs содержит сигнальную последовательность мышиного IgG1, пригодную для системы экспрессии-секреции в клетках млекопитающих (Nature, 322, 323-327, 1988). Нуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность реконструированного одноцепочечного Fv антитела MABL-1, содержащегося в плазмиде pCHOMI, показаны в SEQ ID NO 23.The PCR product was purified using the QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) and then digested with SaiI and MboII to obtain a DNA fragment encoding the N-terminus of the reconstructed single chain Fv antibody MABL-1. The pscMl vector was digested with MboII and EcoRI to obtain a DNA fragment encoding the C-terminus of the reconstructed single chain Fv antibody MABL-1. The SalI-MboII DNA fragment and the MboII-EcoRI DNA fragment were cloned into the pCHO1-Igs vector. After DNA sequencing, a plasmid containing the desired DNA sequence was designated as “pCOM1" (see FIG. 6). The expression vector pCHO1-Igs contains a mouse IgG1 signal sequence suitable for an expression-secretion system in mammalian cells (Nature, 322, 323-327, 1988). The nucleotide sequence and amino acid sequence of the reconstructed single-chain Fv of the MABL-1 antibody contained in the pCHOMI plasmid are shown in SEQ ID NO 23.
5.2 Получение реконструированного одноцепочечного Fv антитела MABL-25.2 Obtaining a reconstructed single chain Fv antibody MABL-2
Реконструированный одноцепочечный Fv антитела MABL-2 получали в соответствии с вышеописанным примером 5.1. На первой стадии ПЦР использовали плазмиду pGEM-M2H, кодирующую V-область Н-цепи MABL-2 (см. пример 2), вместо pGEM-M1H, и плазмиду pGEM-M2L, кодирующую V-область L-цепи MABL-2 (см. пример 2), вместо pGEM-M1L, для получения плазмиды pscM2, которая содержит ДНК-фрагмент, кодирующий желаемую аминокислотную последовательность одноцепочечного Fv антитела MABL-2. Нуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность реконструированного одноцепочечного Fv антитела MABL-2, содержащегося в плазмиде pscM21, показаны в SEQ ID NO 24.Reconstructed single-chain Fv antibodies MABL-2 were obtained in accordance with the above example 5.1. In the first PCR step, the plasmid pGEM-M2H encoding the V region of the MABL-2 H chain (see Example 2) was used instead of pGEM-M1H and the plasmid pGEM-M2L encoding the V region of the MABL-2 L chain (see Example 2), instead of pGEM-M1L, to obtain the plasmid pscM2, which contains a DNA fragment encoding the desired amino acid sequence of the single-chain Fv antibody MABL-2. The nucleotide sequence and the amino acid sequence of the reconstructed single chain Fv of the MABL-2 antibody contained in the plasmid pscM21 are shown in SEQ ID NO 24.
Вектор pscM2 модифицировали при помощи ПЦР-способа для получения вектора, рСНОМ2, для экспрессии в клетках млекопитающих, который содержит ДНК-фрагмент, кодирующий правильную аминокислотную последовательность реконструированного одноцепочечного Fv антитела MABL-2. Нуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность реконструированного одноцепочечного Fv антитела MABL-2, содержащегося в плазмиде рСНОМ2, показаны в SEQ ID NO 25.The pscM2 vector was modified using the PCR method to obtain a vector, pCHOM2, for expression in mammalian cells, which contains a DNA fragment encoding the correct amino acid sequence of the reconstructed single-chain Fv antibody MABL-2. The nucleotide sequence and amino acid sequence of the reconstructed single-chain Fv of the MABL-2 antibody contained in the plasmid pCOM2 are shown in
5.3 Трансфекция в клетки COS75.3 Transfection into COS7 cells
Вектор рСНОМ2 тестировали в клетках COS7 для наблюдения временной экспрессии реконструированного одноцепочечного Fv антитела MABL-2.The pCHOM2 vector was tested in COS7 cells to observe the transient expression of the reconstructed single chain Fv antibody MABL-2.
Клетки COS7 трансформировали вектором рСНОМ2 электропорацией с использованием устройства Gene Pulser (BioRad). ДНК (10 мкг) и 0,8 мл PBS, содержащего 1×107 клеток/мл, добавляли в кювету. Смесь обрабатывали импульсом при 1,5 кВ при электрической емкости 25 мкФ.COS7 cells were transformed with the pCHOM2 vector by electroporation using a Gene Pulser device (BioRad). DNA (10 μg) and 0.8 ml of PBS containing 1 × 10 7 cells / ml were added to the cuvette. The mixture was treated with a pulse at 1.5 kV at an electric capacitance of 25 μF.
После "восстановления" в течение 10 минут при комнатной температуре электропорированные клетки переносили в культуральную среду IMDM (Gibco BRL), содержащую 10% фетальную телячью сыворотку. После культивирования в течение 72 часов супернатант собирали, центрифугировали для удаления клеточных фрагментов и отбирали.After "reconstitution" for 10 minutes at room temperature, the electroporated cells were transferred to IMDM culture medium (Gibco BRL) containing 10% fetal calf serum. After culturing for 72 hours, the supernatant was collected, centrifuged to remove cell fragments, and collected.
5.4 Детектирование реконструированного одноцепочечного Fv антитела MABL-2 в культуральном супернатанте клеток COS75.4 Detection of reconstructed single chain Fv antibody MABL-2 in the culture supernatant of COS7 cells
Присутствие одноцепочечного Fv антитела MABL-2 в культуральном супернатанте клеток COS7, которые были трансфицированы вектором рСНОМ2, подтверждали способом Вестерн-блоттинга.The presence of the single chain Fv antibody MABL-2 in the culture supernatant of COS7 cells that were transfected with the pCHOM2 vector was confirmed by Western blotting.
Культуральный супернатант клеток COS7, трансфицированных вектором рСНОМ2, и культуральный супернатант клеток COS7, трансфицированных pCHO1, в качестве контроля подвергали ДСН-электрофорезу и переносили на мембрану REINFORCED NC (Schleicher & Schuell). Мембрану блокировали 5% обезжиренным молоком (Morinaga Nyu-guo), отмывали 0,05% Твин 20-PBS и смешивали с анти-FLAG-антителом (Sigma). Мембрану инкубировали при комнатной температуре, промывали и добавляли конъюгированное со щелочной фосфатазой антитело против мышиного IgG (Zymed). После инкубирования и промывания при комнатной температуре добавляли раствор субстрата (Kirkegaard Perry Laboratories) для развития окраски (фиг.7).The culture supernatant of COS7 cells transfected with the pCHOM2 vector and the culture supernatant of COS7 cells transfected with pCHO1 were subjected to SDS electrophoresis as a control and transferred onto a REINFORCED NC membrane (Schleicher & Schuell). The membrane was blocked with 5% skim milk (Morinaga Nyu-guo), washed with 0.05% Tween 20-PBS and mixed with anti-FLAG antibody (Sigma). The membrane was incubated at room temperature, washed and alkaline phosphatase conjugated anti-mouse IgG antibody (Zymed) was added. After incubation and washing at room temperature, a substrate solution (Kirkegaard Perry Laboratories) was added to develop color (Fig. 7).
Белок, дававший специфическую реакцию на FLAG-пептид, обнаруживали только в культуральном супернатанте клеток COS7 с введенным вектором рСНОМ2, и, следовательно, было подтверждено, что реконструированный одноцепочечный Fv антитела MABL-2 секретировался в этот культуральный супернатант.The protein giving a specific reaction to the FLAG peptide was found only in the culture supernatant of COS7 cells with the introduced pCHOM2 vector, and therefore it was confirmed that the reconstructed single chain Fv of the MABL-2 antibody was secreted into this culture supernatant.
5.5 Проточная цитометрия5.5 Flow cytometry
Проточную цитометрию проводили с использованием вышеупомянутого культурального супернатанта клеток COS7 для измерения связывания с антигеном. Культуральный супернатант клеток COS7, экспрессирующих реконструированный одноцепочечный Fv антитела MABL-2, или культуральный супернатант клеток COS7, трансформированных вектором pCHO1 в качестве контроля, добавляли к 2×105 клеток клеточной линии мышиного лейкоза L1210, экспрессирующей интегрин-ассоциированный белок (IAP) человека, или клеточной линии L1210, трансформированной pCOSI, в качестве контроля. После инкубирования на льду и промывания добавляли мышиное анти-FLAG-антитело (Sigma). Затем клетки инкубировали и промывали. Затем к ним добавляли FITC-меченное антитело против мышиного IgG (Becton Dickinson) и клетки опять инкубировали и промывали. Затем измеряли интенсивность флуоресценции с использованием прибора FACScan (Becton Dickinson).Flow cytometry was performed using the aforementioned COS7 cell culture supernatant to measure antigen binding. The culture supernatant of COS7 cells expressing the reconstructed single-chain Fv of the MABL-2 antibody, or the culture supernatant of COS7 cells transformed with the pCHO1 vector as a control was added to 2 × 10 5 cells of the murine L1210 mouse leukemia cell line expressing human integrin-associated protein (IAP), or pCOSI transformed L1210 cell line as a control. After incubation on ice and washing, a murine anti-FLAG antibody (Sigma) was added. Then the cells were incubated and washed. Then, a FITC-labeled anti-mouse IgG antibody (Becton Dickinson) was added thereto, and the cells were again incubated and washed. Then, the fluorescence intensity was measured using a FACScan instrument (Becton Dickinson).
Поскольку одноцепочечный Fv антитела MABL-2- специфически связывался с клетками L1210, экспрессирующими IAP человека, было подтверждено, что реконструированный одноцепочечный Fv антитела MABL-2 обладает сродством к интегрин-ассоциированному белку (IAP) человека (см. фиг.8-11).Since the single-chain Fv of the MABL-2 antibody specifically binds to L1210 cells expressing human IAP, it was confirmed that the reconstructed single-chain Fv of the MABL-2 antibody has an affinity for the human integrin-associated protein (IAP) (see FIGS. 8-11).
5.6 Конкурентный анализ ELISA5.6 Competitive ELISA
Связывающую активность реконструированного одноцепочечного Fv антитела MABL-2 измеряли на основе ингибирующей активности против связывания мышиных моноклональных антител с антигеном.The binding activity of the reconstructed single chain Fv antibody MABL-2 was measured based on the inhibitory activity against binding of murine monoclonal antibodies to the antigen.
Анти-FLAG-антитело, доведенное до концентрации 1 мкг/мл, добавляли в каждую лунку 96-луночного планшета и инкубировали при 37°С в течение 2 часов. После промывания проводили блокирование 1% БСА-PBS. После инкубирования и промывания при комнатной температуре культуральный супернатант клеток COS7, в который был введен ген антигена IAP человека секреторного типа (SEQ ID NO 26), разбавляли PBS до двукратного объема и добавляли в каждую лунку. После инкубирования и промывания при комнатной температуре в каждую лунку добавляли смесь 50 мкл биотинилированного антитела MABL-2, доведенного до концентрации 100 нг/мл, и 50 мкл последовательно разведенного супернатанта клеток COS7, экспрессирующих реконструированный одноцепочечный Fv антитела MABL-2. После инкубирования и промывания при комнатной температуре в каждую лунку добавляли конъюгированный со щелочной фосфатазой стрептавидин (Zymed). После инкубирования и промывания при комнатной температуре добавляли раствор субстрата (Sigma) и измеряли оптическую плотность реакционной смеси в каждой лунке при 405 нм.An anti-FLAG antibody, adjusted to a concentration of 1 μg / ml, was added to each well of a 96-well plate and incubated at 37 ° C for 2 hours. After washing, 1% BSA-PBS was blocked. After incubation and washing at room temperature, the culture supernatant of COS7 cells, into which the secretory type human IAP antigen gene (SEQ ID NO 26) was introduced, was diluted with PBS to a double volume and added to each well. After incubation and washing at room temperature, a mixture of 50 μl of biotinylated MABL-2 antibody, adjusted to a concentration of 100 ng / ml, and 50 μl of sequentially diluted supernatant of COS7 cells expressing the reconstructed single-chain Fv of MABL-2 antibody was added to each well. After incubation and washing at room temperature, alkaline phosphatase conjugated streptavidin (Zymed) was added to each well. After incubation and washing at room temperature, a substrate solution (Sigma) was added and the optical density of the reaction mixture in each well was measured at 405 nm.
Результаты показали, что реконструированный одноцепочечный Fv антитела MABL-2 (MABL2-scFv) явно ингибировал зависимым от концентрации образом связывание мышиного антитела MABL-2 с антигеном IAP человека по сравнению с культуральным супернатантом клеток COS7 с введенной рСНО1 в качестве контроля (фиг.12). Таким образом, предполагается, что реконструированный одноцепочечный Fv антитела MABL-2 имеет правильную структуру каждой из V-областей мышиного моноклонального антитела MABL-2.The results showed that the reconstructed single-chain Fv of the MABL-2 antibody (MABL2-scFv) clearly inhibited a concentration dependent binding of the murine MABL-2 antibody to the human IAP antigen compared to the COS7 cell culture supernatant with pCHO1 introduced as a control (Fig. 12) . Thus, it is assumed that the reconstructed single chain Fv of the MABL-2 antibody has the correct structure for each of the V regions of the murine monoclonal antibody MABL-2.
5.7 Индуцирующее апоптоз действие in vitro5.7 Inductive apoptosis in vitro
Индуцирующее апоптоз действие реконструированного одноцепочечного Fv антитела MABL-2 исследовали методом окрашивания Аннексином-V (Boehringer Mannheim) с использованием клеток L1210, трансфицированных геном IAP человека, клеток L1210, трансфицированных вектором pCOS2, в качестве контроля, и клеток CCRF-СЕМ.The apoptosis inducing effect of the reconstructed single-chain Fv antibody MABL-2 was investigated by annexin-V staining (Boehringer Mannheim) using L1210 cells transfected with the human IAP gene, L1210 cells transfected with pCOS2 vector as a control, and CCRF-CEM cells.
К 1×105 клеток каждой из указанных выше линий клеток добавляли культуральный супернатант клеток COS7, экспрессирующих реконструированный одноцепочечный Fv антитела MABL-2, или культуральный супернатант клеток COS7, трансфицированных вектором pCHO1, в качестве контроля в конечной концентрации 50% и эти смеси культивировали в течение 24 часов. Затем проводили окрашивание Аннексином-V и измеряли интенсивность флуоресценции при помощи прибора FACScan (Becton Dickinson).To 1 × 10 5 cells of each of the above cell lines, a culture supernatant of COS7 cells expressing the reconstructed single chain Fv antibody MABL-2 or culture supernatant of COS7 cells transfected with pCHO1 vector was added as a control at a final concentration of 50% and these mixtures were cultured in within 24 hours. Annexin-V staining was then performed and the fluorescence intensity was measured using a FACScan instrument (Becton Dickinson).
Результаты окрашивания Аннексином-V показаны на фиг.13-18, соответственно. Точки в левом нижнем квадранте представляют живые клетки, точки в правом нижнем квадранте представляют клетки на ранней стадии апоптоза и точки в правом верхнем квадранте представляют клетки на поздней стадии апоптоза. Эти результаты показывают, что реконструированный одноцепочечный Fv антитела MABL-2 (MABL2-scFv) в значительной мере индуцировал гибель клеток L1210, специфических в отношении антигена IAP человека (фигуры 13-16), и что реконструированный одноцепочечный Fv индуцировал также значительную гибель клеток CCRF-CEM в сравнении с контролем (фигуры 17-18).Annexin-V staining results are shown in FIGS. 13-18, respectively. The dots in the lower left quadrant represent living cells, the dots in the lower right quadrant represent cells in the early stage of apoptosis, and the dots in the upper right quadrant represent cells in the early stage of apoptosis. These results show that the reconstructed single-chain Fv of the MABL-2 antibody (MABL2-scFv) significantly induced the death of L1210 cells specific for the human IAP antigen (FIGS. 13-16), and that the reconstructed single-chain Fv also induced significant death of CCRF-β cells. CEM in comparison with control (figures 17-18).
5.8 Экспрессия происходящего из MABL-2 одноцепочечного Fv в клетках СНО5.8 Expression of MABL-2-derived single chain Fv in CHO cells
Клетки СНО трансфицировали вектором рСНОМ2 для получения линии клеток СНО, которая константно экспрессирует одноцепочечный Fv (полипептид), происходящий из антитела MABL-2.CHO cells were transfected with the pCHOM2 vector to obtain a CHO cell line that constant expression of single-chain Fv (polypeptide) derived from the MABL-2 antibody.
Клетки СНО трансформировали вектором рСНОМ2 электропорацией с использованием устройства Gene Pulser (BioRad). Смесь ДНК (10 мкг) и 0,7 мл PBS, содержащего клетки СНО (1×107 клеток/мл), добавляли в кювету. Смесь обрабатывали импульсом при 1,5 кВ при электрической емкости 25 мкФ. После "восстановления" в течение 10 минут при комнатной температуре электропорированные клетки переносили в свободную от нуклеиновых кислот культуральную среду α-МЕМ (Gibco BRL), содержащую 10% фетальную телячью сыворотку, и культивировали. Экспрессию желаемого белка в полученных клонах подтверждали электрофорезом в ДСН-ПААГ, и клон с высоким уровнем экспрессии отбирали в качестве клеточной линии, продуцирующей одноцепочечный Fv, происходящий из антитела MABL-2. Эту клеточную линию культивировали в бессывороточной среде CHO-S-SEM II (Gibco BRL), содержащей 10 нМ метотрексат (Sigma). Затем культуральный супернатант собирали, центрифугировали для удаления клеточных фрагментов и отбирали.CHO cells were transformed with the pCHOM2 vector by electroporation using a Gene Pulser device (BioRad). A mixture of DNA (10 μg) and 0.7 ml of PBS containing CHO cells (1 × 10 7 cells / ml) was added to the cuvette. The mixture was treated with a pulse at 1.5 kV at an electric capacitance of 25 μF. After "reconstitution" for 10 minutes at room temperature, the electroporated cells were transferred to a nucleic acid-free α-MEM culture medium (Gibco BRL) containing 10% fetal calf serum and cultured. The expression of the desired protein in the obtained clones was confirmed by SDS-PAGE electrophoresis, and a high expression clone was selected as a cell line producing single chain Fv derived from MABL-2 antibody. This cell line was cultured in serum-free medium CHO-S-SEM II (Gibco BRL) containing 10 nM methotrexate (Sigma). Then, the culture supernatant was collected, centrifuged to remove cell fragments, and selected.
5.9 Очистка происходящего из MABL-2 одноцепочечного Fv, продуцируемого в клетках СНО5.9 Purification of single-chain Fv derived from MABL-2 produced in CHO cells
Культуральный супернатант клеточной линии СНО, экспрессирующей одноцепочечный Fv, полученный в примере 5.8, концентрировали в двадцать раз с использованием кассеты для искусственного диализа (PAN130SF, ASAHI MEDICALS). Концентрированный раствор хранили при -20°С и оттаивали перед очисткой.The culture supernatant of the CHO cell line expressing single chain Fv obtained in Example 5.8 was concentrated twenty times using an artificial dialysis cassette (PAN130SF, ASAHI MEDICALS). The concentrated solution was stored at -20 ° C and thawed before cleaning.
Очистку одноцепочечного Fv из культурального супернатанта клеток СНО выполняли с использованием трех типов хроматографии, т.е. Blue-Sepharose, гидроксиапатита и гель-фильтрации.Purification of single chain Fv from the CHO cell culture supernatant was performed using three types of chromatography, i.e. Blue-Sepharose, Hydroxyapatite and Gel Filtration.
(1) Колоночная хроматография на Blue-Sepharose(1) Column Chromatography on Blue-Sepharose
Концентрированный супернатант разбавляли в десять раз 20 мМ ацетатным буфером (рН 6,0) и центрифугировали для удаления нерастворимых веществ (10000 (об/мин, 30 минут). Этот супернатант наносили на колонку Blue-Sepharose (20 мл), уравновешенную тем же самым буфером. После промывания колонки тем же самым буфером белки, адсорбированные на колонке, элюировали ступенчатым градиентом NaCl в том же самом буфере, 0,1, 0,2, 0,3, 0,5 и до 1,0 М. Сошедшую в свободном объеме фракцию и каждую из элюированных фракций анализировали электрофорезом в ДСН-ПААГ. Фракции, в которых было обнаружено присутствие одноцепочечного Fv (эти фракции элюировались при 0,1-0,3 М NaCl), объединяли и концентрировали приблизительно в 20 раз с использованием CentriPrep 10 (Amicon).The concentrated supernatant was diluted ten times with 20 mM acetate buffer (pH 6.0) and centrifuged to remove insoluble matter (10,000 (rpm, 30 minutes). This supernatant was applied to a Blue-Sepharose column (20 ml) equilibrated with the same After washing the column with the same buffer, the proteins adsorbed on the column were eluted with a stepwise NaCl gradient in the same buffer, 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, and up to 1.0 M. Converted in free volume fraction and each of the eluted fractions were analyzed by SDS-PAGE by electrophoresis. the presence of single-chain Fv was detected (these fractions were eluted with 0.1-0.3 M NaCl), combined and concentrated approximately 20 times using CentriPrep 10 (Amicon).
(2) Гидроксиапатит(2) Hydroxyapatite
Концентрированный раствор, полученный в (1), разбавляли в 10 раз 10 мМ фосфатным буфером (рН 7,0) и наносили на гидроксиапатитную колонку (20 мл, BioRad). Колонку промывали 60 мл 10 мМ фосфатного буфера (рН 7,0). Затем белки, адсорбированные на колонке, элюировали линейным градиентом натрий-фосфатного буфера до 200 мМ (см. фиг.19). Анализ каждой фракции при помощи электрофореза в ДСН-ПААГ подтвердил присутствие одноцепочечного Fv во фракции А и фракции В.The concentrated solution obtained in (1) was diluted 10 times with 10 mM phosphate buffer (pH 7.0) and applied to a hydroxyapatite column (20 ml, BioRad). The column was washed with 60 ml of 10 mM phosphate buffer (pH 7.0). Then, the proteins adsorbed on the column were eluted with a linear gradient of sodium phosphate buffer to 200 mM (see FIG. 19). Analysis of each fraction by SDS-PAGE electrophoresis confirmed the presence of single chain Fv in fraction A and fraction B.
(3) Гель-фильтрация(3) Gel Filtration
Каждую из фракций А и В, полученных в (2), по отдельности концентрировали с использованием CentriPrep-10 и наносили на колонку TSKgel G3000SWG (21,5×600 мм), уравновешенную 20 мМ ацетатным буфером (рН 6,0), содержащим 0,15 М NaCl. Хроматограммы показаны на фиг.20. Анализ этих фракций электрофорезом в ДСН-ПААГ подтвердил, что оба мажорных пика (AI и BI) являются желаемым одноцепочечным Fv. В этом гель-фильтрационном анализе фракция А элюировалась с кажущейся молекулярной массой 36 кДа, а фракция В элюировалась с кажущейся молекулярной массой 76 кДа. Очищенные одноцепочечные Fv (AI, BI) анализировали с использованием 15% ДСН-полиакриламидного геля. Образцы обрабатывали в отсутствие или в присутствии восстановителя, и электрофорез проводили в соответствии со способом Лэммли. Затем белок окрашивали Кумасси бриллиантовым синим. Как показано на фиг.21, как AI, так и BI давали единственную полосу с кажущейся молекулярной массой 35 кДа, независимо от отсутствия или присутствия восстановителя. Из вышеописанного сделали вывод, что AI является мономером одноцепочечного Fv, a BI является нековалентно связанным димером одноцепочечного Fv. Гель-фильтрационный анализ фракций AI и BI с колонкой TSKgel G3000SWG (7,5×60 мм) показал, что пик мономера детектируется только во фракции AI, а пик димера детектируется только во фракции BI (фиг.22). Фракция димера (фракция BI) составляла 4 процента общего количества одноцепочечных Fv. Более чем 90% этого димера во фракции димера стабильно сохранялись в течение более чем месяца при 4°С.Each of the fractions A and B obtained in (2) was separately concentrated using CentriPrep-10 and applied to a TSKgel G3000SWG column (21.5 × 600 mm) balanced with 20 mM acetate buffer (pH 6.0) containing 0 , 15 M NaCl. Chromatograms are shown in FIG. Analysis of these fractions by SDS-PAGE electrophoresis confirmed that both major peaks (AI and BI) are the desired single chain Fv. In this gel filtration analysis, fraction A was eluted with an apparent molecular weight of 36 kDa, and fraction B was eluted with an apparent molecular weight of 76 kDa. Purified single chain Fv (AI, BI) was analyzed using 15% SDS-polyacrylamide gel. Samples were processed in the absence or presence of a reducing agent, and electrophoresis was carried out in accordance with the Laemmli method. Then the protein was stained with Coomassie brilliant blue. As shown in FIG. 21, both AI and BI gave a single band with an apparent molecular weight of 35 kDa, regardless of the absence or presence of a reducing agent. From the above, it was concluded that AI is a monomer of a single chain Fv, and BI is a non-covalently linked dimer of a single chain Fv. Gel-filtration analysis of the AI and BI fractions with TSKgel G3000SWG column (7.5 × 60 mm) showed that the peak of the monomer is detected only in the AI fraction, and the peak of the dimer is detected only in the BI fraction (Fig. 22). The dimer fraction (BI fraction) was 4 percent of the total number of single chain Fv. More than 90% of this dimer in the dimer fraction was stably maintained for more than a month at 4 ° C.
5.10 Конструирование вектора, экспрессирующего одноцепочечный Fv, происходящий из антитела MABL-2, в клетке Е.coli5.10 Construction of a vector expressing single-chain Fv derived from MABL-2 antibody in an E. coli cell
Вектор pscM2 модифицировали ПЦР-способом для получения вектора, эффективно экспрессирующего одноцепочечный Fv антитела MABL-2 в клетках Е.coli. Полученный ДНК-фрагмент встраивали в экспрессионный вектор pSCFVT7.The pscM2 vector was modified by PCR to obtain a vector that efficiently expresses the single-chain Fv of the MABL-2 antibody in E. coli cells. The resulting DNA fragment was inserted into the expression vector pSCFVT7.
В качестве прямого праймера для ПЦР праймер Nde-VHSm02, показанный в SEQ ID NO 27, конструировали так, чтобы он гибридизовался с ДНК, кодирующей N-конец V-области Н-цепи, и содержал стартовый кодон и сайт узнавания рестриктазы NdeI. В качестве обратного праймера для ПЦР, праймер VLAS, показанный в SEQ ID NO 28, конструировали так, чтобы он гибридизовался с ДНК, кодирующей С-конец V-области L-цепи, и содержал два стоп-кодона и сайт узнавания рестриктазы EcoRI. Прямой праймер Nde-VHSm02 содержит пять точковых мутаций в части, гибридизующейся с ДНК, кодирующей N-конец V-области Н-цепи, для эффективной экспрессии в Е.coli.As a direct PCR primer, the Nde-VHSm02 primer shown in SEQ ID NO 27 was designed to hybridize with DNA encoding the N-terminus of the V region of the H chain and contain a start codon and an NdeI restriction enzyme recognition site. As a reverse primer for PCR, the VLAS primer shown in SEQ ID NO 28 was designed to hybridize with DNA encoding the C-terminus of the V region of the L chain and contain two stop codons and an EcoRI restriction enzyme recognition site. The Nde-VHSm02 forward primer contains five point mutations in the portion hybridizing to DNA encoding the N-terminus of the V region of the H chain for efficient expression in E. coli.
100 мкл ПЦР-раствора, содержащего 10 мкл 10-кратного ПЦР-буфера №1,1 мМ MgCl2, 0,2 мМ dNTP, 5 единиц ДНК-полимеразы KOD (все от Toyobo), 1 мкМ каждого праймера и 100 нг ДНК-матрицы (pscM2), нагревали при 98°С в течение 15 секунд, при 65°С в течение 2 секунд и при 72°С в течение 30 секунд в указанной последовательности. Этот температурный цикл повторяли 25 раз.100 μl of a PCR solution containing 10 μl of a 10-fold PCR buffer No. 1.1 mm MgCl 2 , 0.2 mm dNTP, 5 units of KOD DNA polymerase (all from Toyobo), 1 μm of each primer and 100 ng of DNA matrices (pscM2) were heated at 98 ° C for 15 seconds, at 65 ° C for 2 seconds, and at 72 ° C for 30 seconds in the sequence shown. This temperature cycle was repeated 25 times.
ПЦР-продукт очищали с использованием набора QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) и затем расщепляли NdeI и EcoRI и затем полученный ДНК-фрагмент клонировали в вектор pSCFVT7, из которого была удалена сигнальная последовательность pelB расщеплением NdeI и EcoRI. После секвенирования ДНК полученная плазмида, содержащая ДНК-фрагмент с желаемой ДНК-последовательностью, обозначали как "pscM2DEm02" (см. фиг.23). Нуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность одноцепочечного Fv, происходящего из антитела MABL-2, содержащегося в плазмиде pscM2DEm02, показаны в SEQ ID NO 29.The PCR product was purified using a QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) and then NdeI and EcoRI were digested and then the resulting DNA fragment was cloned into the pSCFVT7 vector from which the pelB signal sequence was removed by digestion with NdeI and EcoRI. After DNA sequencing, the resulting plasmid containing the DNA fragment with the desired DNA sequence was designated as “pscM2DEm02” (see FIG. 23). The nucleotide sequence and the amino acid sequence of a single chain Fv derived from the MABL-2 antibody contained in the plasmid pscM2DEm02 are shown in SEQ ID NO 29.
5.11 Экспрессия одноцепочечного Fv, происходящего из антитела MABL-2, в клетках Е.coli5.11 Expression of single-chain Fv derived from MABL-2 antibody in E. coli cells
Е.coli BL21(DE3)pLysS (Stratagene) трансформировали вектором pscM2DEm02 с получением штамма Е.coli, экспрессирующего одноцепочечный Fv, происходящий из антитела MABL-2. Полученные клоны анализировали на экспрессию желаемого белка методом электрофореза в ДСН-ПААГ, и клон с высоким уровнем экспрессии отбирали в качестве штамма, продуцирующего одноцепочечный Fv, происходящий из антитела MABL-2.E. coli BL21 (DE3) pLysS (Stratagene) was transformed with the pscM2DEm02 vector to obtain an E. coli strain expressing single chain Fv derived from MABL-2 antibody. The obtained clones were analyzed for expression of the desired protein by SDS-PAGE electrophoresis, and a clone with a high expression level was selected as a strain producing single-chain Fv originating from the MABL-2 antibody.
5.12 Очистка одноцепочечного Fv, происходящего из антитела MABL-2, продуцируемого в Е.coli5.12 Purification of Single Chain Fv Derived from MABL-2 Antibody Produced in E. coli
Отдельную колонию Е.coli, полученную трансформацией, культивировали в 3 мл среды LB при 28°С в течение 7 часов и затем в 70 мл среды LB при 28°С в течение ночи. Эту предварительную культуру переносили в 7 л среды LB и культивировали при 28°С при перемешивании при 300 об/мин с использованием Jar-ферментера. Когда поглощение среды достигало O.D. = 1,5, бактерии индуцировали 1 мМ IPTG и затем культивировали в течение 3 часов.A single E. coli colony obtained by transformation was cultured in 3 ml of LB medium at 28 ° C for 7 hours and then in 70 ml of LB medium at 28 ° C overnight. This pre-culture was transferred to 7 L of LB medium and cultured at 28 ° C. with stirring at 300 rpm using a Jar fermenter. When the absorption of the medium reached O.D. = 1.5, bacteria induced 1 mM IPTG and then cultured for 3 hours.
Культуральную среду центрифугировали (10000×g, 10 минут), и собирали осажденные бактерии. К этим бактериям добавляли 50 мМ Трис-HCl-буфер (рН 8,0), содержащий ЭДТА, 0,1 М NaCl и 1% Тритон Х-100 и бактерии разрушали обработкой ультразвуком (мощность: 4, рабочий цикл: 70%, 1 минута ×10 раз). Суспензию разрушенных бактерий центрифугировали (12000×g, 10 минут) для осаждения телец включения. Выделенные тельца включения смешивали с 50 мМ Трис-HCl-буфером (рН 8,0), содержащим 5 мМ ЭДТА, 0,1 М NaCl и 4% Тритон Х-100, и вновь обрабатывали ультразвуком (мощность: 4, рабочий цикл: 50%, 30 секунд × 2 раза) и центрифугировали (12000×g, 10 минут) для выделения желаемого белка в виде осадка и для удаления примесных белков, находящихся в супернатанте.The culture medium was centrifuged (10,000 × g, 10 minutes), and the precipitated bacteria were collected. To these bacteria, 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing EDTA, 0.1 M NaCl and 1% Triton X-100 was added and the bacteria were destroyed by sonication (power: 4, duty cycle: 70%, 1 minute × 10 times). A suspension of the destroyed bacteria was centrifuged (12000 × g, 10 minutes) to precipitate inclusion bodies. The isolated inclusion bodies were mixed with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 5 mM EDTA, 0.1 M NaCl and 4% Triton X-100, and again treated with ultrasound (power: 4, duty cycle: 50 %, 30 seconds × 2 times) and centrifuged (12000 × g, 10 minutes) to isolate the desired protein as a precipitate and to remove impurity proteins in the supernatant.
Тельца включения, содержащие желаемый белок, лизировали в 50 мМ Трис-HCl-буфере (рН 8,0), содержащем 6 М мочевину, 5 мМ ЭДТА, 0,1 М NaCl, и наносили на гель-фильтрационную колонку Sephacryl S-300 (5×90 см, Amersham Pharmacia), уравновешенную 50 мМ Трис-HCl-буфером (рН 8,0), содержащим 4 М мочевину, 5 мМ ЭДТА, 0,1 М NaCl и 10 мМ меркаптоэтанол, при скорости подачи 5 мл/мин для удаления ассоциированных одноцепочечных Fv с высокой молекулярной массой. Полученные фракции анализировали электрофорезом в ДСН-ПААГ и фракции с высокой чистотой данного белка разбавляли буфером, используемым при гель-фильтрации, до O.D.280=0,25. Затем эти фракции диализовали три раза против 50 мМ Трис-HCl-буфера (рН 8,0), содержащего 5 мМ ЭДТА, 0,1 М NaCl, 0,5 М Arg, 2 мМ глутатион в восстановленной форме и 0,2 мМ глутатион в окисленной форме, для того, чтобы произошла повторная укладка белка. Далее эту фракцию диализовали три раза против 20 мМ ацетатного буфера (рН 6,0), содержащего 0,15 М NaCl, для смены буфера.Inclusion bodies containing the desired protein were lysed in 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 6 M urea, 5 mM EDTA, 0.1 M NaCl, and loaded onto a Sephacryl S-300 gel filtration column ( 5 × 90 cm, Amersham Pharmacia) equilibrated with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 4 M urea, 5 mM EDTA, 0.1 M NaCl and 10 mM mercaptoethanol, at a flow rate of 5 ml / min to remove associated single-chain Fv with high molecular weight. The obtained fractions were analyzed by SDS-PAGE and high purity fractions of this protein were diluted with the buffer used in gel filtration to OD 280 = 0.25. These fractions were then dialyzed three times against 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 5 mM EDTA, 0.1 M NaCl, 0.5 M Arg, 2 mM glutathione in reduced form and 0.2 mM glutathione in oxidized form, so that protein folding occurs. Further, this fraction was dialyzed three times against 20 mM acetate buffer (pH 6.0) containing 0.15 M NaCl to change the buffer.
Диализованный продукт наносили на гель-фильтрационную колонку Superdex 200 pg (2,6×60 см, Amersham Pharmacia), уравновешенную 20 мМ ацетатным буфером (рН 6,0), содержащим 0,15 NaCl, для удаления небольшого количества высокомолекулярного белка, который межмолекулярно сшивался связями S-S. Как показано на фиг.24, два пика, основной и минорный пики, элюировались после широких пиков, которые предположительно относятся к агрегату с высокой молекулярной массой. Анализ при помощи электрофореза в ДСН-ПААГ (см. фиг.21) и положения элюции этих двух пиков при гель-фильтрационном анализе предполагают, что основной пик соответствует мономеру одноцепочечного Fv, а минорный пик соответствует нековалентно связанному димеру одноцепочечного Fv. Нековалентно связанный димер составляет 4 процента общего количества одноцепочечных Fv.The dialyzed product was applied to a 200 pg Superdex gel filtration column (2.6 × 60 cm, Amersham Pharmacia), equilibrated with 20 mM acetate buffer (pH 6.0) containing 0.15 NaCl to remove a small amount of high molecular weight protein that is intermolecular stitched together SS. As shown in FIG. 24, two peaks, the main and minor peaks, were eluted after broad peaks, which are thought to be of high molecular weight aggregate. Analysis by SDS-PAGE electrophoresis (see FIG. 21) and elution positions of these two peaks by gel filtration analysis suggest that the main peak corresponds to the single chain Fv monomer, and the minor peak corresponds to the non-covalently bound single chain Fv dimer. Non-covalently bound dimer accounts for 4 percent of the total number of single chain Fv.
5.13 Апопотоз-индуцирующая активность in vitro одноцепочечного Fv, происходящего из антитела MABL-25.13 Apopotosis-inducing in vitro activity of single chain Fv derived from MABL-2 antibody
Апоптоз-индуцирующую активность одноцепочечного Fv антитела MABL-2 (MABL2-scFv), продуцируемого клетками СНО и Е.coli, исследовали в соответствии с двумя протоколами методом окрашивания Аннексином-V (Boehringer Mannheim) с использованием клеток L1210 (hIAP/L1210), в которые был введен ген IAP человека.The apoptosis-inducing activity of the single-chain Fv antibody MABL-2 (MABL2-scFv) produced by CHO and E. coli cells was examined in accordance with two protocols by the Annexin-V staining method (Boehringer Mannheim) using L1210 cells (hIAP / L1210), in that the human IAP gene was introduced.
В первом протоколе образцы антитела в конечной концентрации 3 мкг/мл добавляли к 5×104 клеткам клеточной линии hIAP/L1210 и культивировали в течение 24 часов. Анализировали образцы антитела, т.е. мономер и димер одноцепочечного Fv MABL-2 из клеток СНО, полученные в 5.9, мономер и димер одноцепочечного Fv MABL-2 из Е.coli, полученные в примере 5.12, и мышиное IgG-антитело в качестве контроля. После культивирования проводили окрашивание Аннексином-V и измеряли интенсивность флуоресценции с использованием прибора FACScan (Becton Dickinson).In the first protocol, antibody samples at a final concentration of 3 μg / ml were added to 5 × 10 4 hIAP / L1210 cell line cells and cultured for 24 hours. Antibody samples were analyzed, i.e. monomer and dimer of single-chain Fv MABL-2 from CHO cells obtained in 5.9, monomer and dimer of single-chain Fv MABL-2 from E. coli obtained in example 5.12, and mouse IgG antibody as a control. After cultivation, annexin-V staining was performed and the fluorescence intensity was measured using a FACScan instrument (Becton Dickinson).
Во втором протоколе образцы антитела в конечной концентрации 3 мкг/мл добавляли к 5×104 клеткам клеточной линии hIAP/L1210, культивировали в течение 2 часов и смешивали с анти-FLAG-антителом (Sigma) в конечной концентрации 15 мкг/мл и дополнительно культивировали в течение 22 часов. Анализировали образцы антитела, представленного мономером одноцепочечного Fv MABL-2 из клеток СНО, полученным в 5.9, и мышиное IgG антитело в качестве контроля. После культивирования проводили окрашивание Аннексином-V и измеряли интенсивность флуоресценции с использованием прибора FACScan.In the second protocol, antibody samples at a final concentration of 3 μg / ml were added to 5 × 10 4 hIAP / L1210 cell line cells, cultured for 2 hours and mixed with anti-FLAG antibody (Sigma) at a final concentration of 15 μg / ml and additionally cultivated for 22 hours. Analyzed samples of the antibody represented by the monomer single-chain Fv MABL-2 from CHO cells obtained in 5.9, and mouse IgG antibody as a control. After cultivation, annexin-V staining was performed and fluorescence intensity was measured using a FACScan instrument.
Результаты анализа методом окрашивания на Аннексин-V показаны на фигурах 25-31. Эти результаты показывают, что димеры одноцепочечного полипептида Fv MABL-2, продуцируемые в клетках СНО и Е.coli, в сильной степени индуцировали гибель клеток (фигуры 26, 27) по сравнению с контролем (фиг.25), в то время как апоптоз-индуцирующее действие не наблюдали в случае мономеров одноцепочечного полипептида Fv MABL-2, продуцируемых в клетках СНО и Е.coli (фигуры 28, 29). Когда совместно использовали анти-FLAG-антитело, мономер одноцепочечного полипептида Fv, происходящего из антитела MABL-2, продуцируемый в клетках СНО, в сильной степени индуцировал гибель клеток (фиг.31) в сравнении с контролем (фиг.30).The results of the analysis by staining for Annexin-V are shown in figures 25-31. These results show that dimers of the single-chain Fv MABL-2 polypeptide produced in CHO and E. coli cells strongly induced cell death (FIGS. 26, 27) compared to the control (FIG. 25), while apoptosis no inducing effect was observed in the case of monomers of the single-chain Fv MABL-2 polypeptide produced in CHO and E. coli cells (figures 28, 29). When the anti-FLAG antibody was shared, the monomer of the single chain Fv polypeptide derived from the MABL-2 antibody produced in CHO cells strongly induced cell death (FIG. 31) compared to the control (FIG. 30).
5.14 Противоопухолевое действие мономера и димера полипептида scFv/CHO на мышиной модели миеломы человека5.14 Antitumor effect of the monomer and dimer of the scFv / CHO polypeptide in a murine model of human myeloma
(1) Количественное определени IgG человека в мышиной сыворотке(1) Quantification of Human IgG in Mouse Serum
Измерение IgG человека (М-белка), продуцируемого миеломными клетками человека и содержащегося в мышиной сыворотке, проводили при помощи ELISA следующим образом. 100 мкл козьих антител против IgG человека (Biosource, Lot#902), разбавленных до 1 мкг/мл 0,1% бикарбонатным буфером (рН 9,6), добавляли в каждую лунку 96-луночного планшета (Nunc) и инкубировали при 4°С в течение ночи, так что эти антитела иммобилизовались. После блокирования в каждую лунку добавляли 100 мкл ступенчато разведенной мышиной сыворотки или IgG человека (Cappel, Lot#00915) в качестве стандарта и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре. После промывания добавляли 100 мкл меченного щелочной фосфатазой антитела против IgG человека (Biosource, Lot#6202), которое было разведено в 5000 раз, и инкубирование проводили в течение 1 часа при комнатной температуре. После промывания добавляли раствор субстрата. После инкубирования измеряли поглощение при 405 нм с использованием Microplate Reader Model 3550 (BioRad). Концентрацию IgG человека в мышиной сыворотке рассчитывали из калибровочной кривой, построенной на основании величин поглощения, полученных с IgG человека в качестве стандарта.Measurement of human IgG (M protein) produced by human myeloma cells and contained in mouse serum was performed using ELISA as follows. 100 μl of goat anti-human IgG antibodies (Biosource, Lot # 902) diluted to 1 μg / ml with 0.1% bicarbonate buffer (pH 9.6) was added to each well of a 96-well plate (Nunc) and incubated at 4 ° C during the night, so that these antibodies are immobilized. After blocking, 100 μl of stepwise diluted mouse serum or human IgG (Cappel, Lot # 00915) was added to each well as standard and incubated for 2 hours at room temperature. After washing, 100 μl of alkaline phosphatase-labeled anti-human IgG antibody (Biosource, Lot # 6202) was added which was diluted 5,000 times and incubated for 1 hour at room temperature. After washing, a substrate solution was added. After incubation, absorbance was measured at 405 nm using a Microplate Reader Model 3550 (BioRad). The concentration of human IgG in mouse serum was calculated from a calibration curve based on the absorbance values obtained from human IgG as a standard.
(2) Получение антител для введения(2) Obtaining antibodies for administration
Мономер и димер полипептида scFv/CHO в день введения разводили, соответственно, до концентрации 0,4 мг/мл или 0,25 мг/мл стерилизованным фильтрованием PBS(-) для получения проб для введения.The monomer and dimer of the scFv / CHO polypeptide on the day of administration were diluted, respectively, to a concentration of 0.4 mg / ml or 0.25 mg / ml by sterile filtration with PBS (-) to obtain samples for administration.
(3) Получение мышиной модели миеломы человека(3) Obtaining a murine model of human myeloma
Мышиную модель миеломы человека получали следующим образом. Клетки КРММ2, пассированные in vivo (Заявка на патент Японии (JP-Appl. 7-236475) с использованием мышей линии SCID (Japan Clare), суспендировали в среде RPMI1640 (Gibco BRL), содержащей 10% фетальную телячью сыворотку (Gibco BRL), и доводили до 3×107 клеток/мл. 200 мкл суспензии клеток КРММ2 (6×106 клеток/мышь) трансплантировали в мышь SCID (самцы, в возрасте 6 недель) через хвостовую вену, которой за день до трансплантации инъецировали подкожно асиало-GM1-антитело (Wako Junyaku, 1 флакон, растворенный в 5 мл).A murine model of human myeloma was obtained as follows. In vivo KPMM2 cells (Japanese Patent Application (JP-Appl. 7-236475) using SCID mice (Japan Clare) were suspended in RPMI1640 medium (Gibco BRL) containing 10% fetal calf serum (Gibco BRL), and brought to 3 × 10 7 cells / ml, 200 μl of a suspension of CRMM2 cells (6 × 10 6 cells / mouse) were transplanted into a SCID mouse (males, 6 weeks old) through the tail vein, which was injected subcutaneously asio- the day before the transplantation GM1 antibody (Wako Junyaku, 1 vial, dissolved in 5 ml).
(4) Введение антител(4) Introduction of antibodies
Образцы антител, приготовленные в (2): мономер (250 мкл) и димер (400 мкл), вводили мыши-модели миеломы человека, полученной в (3), через хвостовую вену. Введение начинали спустя три дня после трансплантации клеток КРММ2 и проводили дважды в день в течение трех дней. В качестве контроля 200 мкл стерилизованного фильтрованием PBS(-) вводили таким же образом дважды в день в течение трех дней через хвостовую вену. Каждая группа состояла из семи мышей.Antibody samples prepared in (2): monomer (250 μl) and dimer (400 μl) were injected with mouse models of human myeloma obtained in (3) through the tail vein. Administration was started three days after transplantation of CRMM2 cells and was performed twice daily for three days. As a control, 200 μl of filter-sterilized PBS (-) was administered in the same manner twice daily for three days through the tail vein. Each group consisted of seven mice.
(5) Оценка противоопухолевого действия мономера и димера полипептида scFv/CHO с использованием мышиной модели миеломы человека(5) Evaluation of the antitumor effect of the monomer and dimer of the scFv / CHO polypeptide using a mouse model of human myeloma
Противоопухолевое действие мономера и димера полипептида scFv/CHO с использованием мышиной модели миеломы человека оценивали по изменению концентрации IgG человека (М-белка) в мышиной сыворотке и времени выживания мыши. Изменение концентрации IgG человека определяли измерением ее в мышиной сыворотке, собранной спустя 24 дня после трансплантации клеток КРММ2, методом ELISA, описанным выше в (1). Количество сывороточного IgG человека (М-белка) в сыворотке группы (контроль), которой вводили PBS(-), увеличивалось до приблизительно 8500 мкг/мл, тогда как количество IgG человека в группе, которой вводили димер scFv/CHO, было значительно более низким, т.е. 1/10 или меньше от количества в контрольной группе. Таким образом, эти результаты показывают, что димер scFv/CHO сильно ингибирует рост клеток КРММ2 (фигура 32). Как показано на фиг.33, значительное увеличение времени выживания наблюдали в получавшей димер scFv/CHO группе в сравнении с получавшей PBS(-) группой.The antitumor effect of the monomer and dimer of the scFv / CHO polypeptide using a mouse model of human myeloma was evaluated by changing the concentration of human IgG (M protein) in mouse serum and mouse survival time. The change in the concentration of human IgG was determined by measuring it in mouse serum collected 24 days after transplantation of CRMM2 cells, using the ELISA method described above in (1). The amount of human serum IgG (M-protein) in the serum of the group (control) that was injected with PBS (-) increased to about 8500 μg / ml, while the amount of human IgG in the group that was injected with the scFv / CHO dimer was significantly lower , i.e. 1/10 or less of the amount in the control group. Thus, these results show that the scFv / CHO dimer strongly inhibits the growth of CRMM2 cells (Figure 32). As shown in FIG. 33, a significant increase in survival time was observed in the scFv / CHO dimer-treated group compared to the PBS (-) -received group.
Вышеописанное подтверждает, что димер scFv/CHO обладает противоопухолевым действием на мышиной модели миеломы человека. Считается, что противоопухолевое действие димера scFv/CHO, модифицированного антитела данного изобретения, является результатом апоптоз-индуцирующего действия этого модифицированного антитела.The above confirms that the scFv / CHO dimer has an antitumor effect in a murine model of human myeloma. It is believed that the antitumor effect of the scFv / CHO dimer, a modified antibody of the present invention, is the result of the apoptosis-inducing action of this modified antibody.
5.15 Тест гемагглютинации5.15 Hemagglutination Test
Тест гемагглютинации и определение гемагглютинации проводили в соответствии с "Immuno-Biochemical Investigation", Zoku-Seikagaku Jikken Koza, edited by the Biochemical Society of Japan, published by Tokio Kagaku Dojin.A hemagglutination test and determination of hemagglutination was carried out in accordance with Immuno-Biochemical Investigation, Zoku-Seikagaku Jikken Koza, edited by the Biochemical Society of Japan, published by Tokio Kagaku Dojin.
Кровь брали из здорового донора с использованием обработанных гепарином шприцов и промывали PBS(-) три раза и затем готовили суспензию эритроцитов с конечной концентрацией 2% в PBS(-). Опытными образцами были антитело MABL-2, мономер и димер одноцепочечного полипептида Fv, продуцируемого клетками СНО, и мономер и димер одноцепочечного полипептида Fv, продуцируемого Е.coli, и контролем был IgG мыши (Zymed). Для исследования эффекта гемагглютинации использовали круглодонные 96-луночные планшеты, доступные от Falcon. Добавляли 50 мкл на лунку вышеупомянутых образцов антител и 50 мкл 2% суспензии эритроцитов и смешивали в лунках. После инкубирования в течение 2 часов при 37°С реакционные смеси выдерживали при 4°С в течение ночи и определяли в них гемагглютинацию. В качестве контроля использовали 50 мкл на лунку PBS(-) и тест гемагглютинации проводили таким же образом. Мышиный IgG и антитело MABL-2 использовали в конечной концентрации антител 0,01, 0,1, 1,0, 10,0 или 100,0 мкг/мл. Одноцепочечные Fv использовали в конечной концентрации 0,004, 0,04, 0,4, 4,0, 40,0 или 80,0 мкг/мл и дополнительно 160 мкг/мл только в случае димера этого полипептида, продуцируемого Е.coli. Результаты показаны в таблице 2. В случае антитела MABL-2 гемагглютинацию наблюдали при концентрации более, чем 0,1 мкг/мл, тогда как гемагглютинации не наблюдали как для мономера, так и для димера одноцепочечного Fv.Blood was taken from a healthy donor using heparin-treated syringes and washed with PBS (-) three times and then a suspension of red blood cells was prepared with a final concentration of 2% in PBS (-). The test samples were the MABL-2 antibody, the monomer and dimer of the single chain Fv polypeptide produced by CHO cells, and the monomer and dimer of the single chain Fv polypeptide produced by E. coli, and control was mouse IgG (Zymed). To study the effect of hemagglutination, round-bottom 96-well plates, available from Falcon, were used. 50 μl per well of the above antibody samples and 50 μl of a 2% suspension of red blood cells were added and mixed in the wells. After incubation for 2 hours at 37 ° C, the reaction mixtures were kept at 4 ° C overnight and their hemagglutination was determined. As a control, 50 μl per well of PBS (-) was used and the hemagglutination test was carried out in the same way. Mouse IgG and the MABL-2 antibody were used at a final antibody concentration of 0.01, 0.1, 1.0, 10.0, or 100.0 μg / ml. Single chain Fv was used at a final concentration of 0.004, 0.04, 0.4, 4.0, 40.0 or 80.0 μg / ml and an additional 160 μg / ml only in the case of a dimer of this polypeptide produced by E. coli. The results are shown in Table 2. In the case of the MABL-2 antibody, hemagglutination was observed at a concentration of more than 0.1 μg / ml, while hemagglutination was not observed for both the monomer and the single chain Fv dimer.
Пример 6 Модифицированное антитело sc(Fv)2, содержащее две V-области Н-цепи и две V-области L-цепи, и scFv антитела MABL-2, имеющие линкеры различной длиныExample 6 Modified sc (Fv) 2 antibody containing two H chain V regions and two L chain V regions and scFv antibodies MABL-2 having linkers of different lengths
6.1 Конструирование плазмиды, экспрессирующей sc(Fv)2 антитела MABL-26.1 Construction of a plasmid expressing sc (Fv) 2 antibodies MABL-2
Для получения плазмиды, экспрессирующей модифицированное антитело [sc(Fv)2], которое содержит две V-области Н-цепи и две V-области L-цепи, происходящие из антитела MABL-2, вышеупомянутую плазмиду рСНОМ2, которая содержит ДНК, кодирующую scFv, происходящий из MABL-2, описанный выше, модифицировали способом ПЦР, как описывается ниже, и полученный ДНК-фрагмент встраивали в рСНОМ2.To obtain a plasmid expressing the modified antibody [sc (Fv) 2 ], which contains two V-regions of the H chain and two V-regions of the L chain, derived from the antibody MABL-2, the aforementioned plasmid pCHOM2, which contains DNA encoding scFv derived from MABL-2 described above was modified by PCR, as described below, and the resulting DNA fragment was inserted into pCHOM2.
Праймерами, используемыми для ПЦР, являются праймер EF1 (SEQ ID NO 30) в качестве смыслового праймера, который конструируют так, чтобы он гибридизовался с ДНК, кодирующей EF1α, и антисмысловой праймер (SEQ ID NO 19), который конструируют так, чтобы он гибридизовался с ДНК, кодирующей С-конец V-области L-цепи, и содержал ДНК-последовательность, кодирующую линкерный участок, и праймер VLLAS, содержащий сайт узнавания рестриктазы SaIl (SEQ ID NO 31).The primers used for PCR are EF1 primer (SEQ ID NO 30) as a sense primer that is designed to hybridize with DNA encoding EF1α, and an antisense primer (SEQ ID NO 19) that is designed to hybridize with DNA encoding the C-terminus of the V region of the L chain, and contained the DNA sequence encoding the linker region, and the VLLAS primer containing the restriction enzyme recognition site SaIl (SEQ ID NO 31).
100 мкл ПЦР-раствора содержат 10 мкл 10-кратного ПЦР-буфера №1, 1 мМ MgCl2, 0,2 мМ dNTP (dATP, dGTP, dCTP и dTTP), 5 единиц ДНК-полимеразы KOD (Toyobo, Inc.), 1 мкМ каждого из праймеров и 100 нг ДНК-матрицы (рСНОМ2). ПЦР-раствор нагревали при 94°С в течение 30 секунд, при 50°С в течение 30 секунд и при 74°С в течение 1 минуты в указанном порядке. Этот температурный цикл повторяли 30 раз.100 μl of PCR solution contain 10 μl of 10-fold PCR buffer No. 1, 1 mm MgCl 2 , 0.2 mm dNTP (dATP, dGTP, dCTP and dTTP), 5 units of KOD DNA polymerase (Toyobo, Inc.), 1 μM of each of the primers and 100 ng of the DNA template (pCOM2). The PCR solution was heated at 94 ° C for 30 seconds, at 50 ° C for 30 seconds, and at 74 ° C for 1 minute in that order. This temperature cycle was repeated 30 times.
ПЦР-продукт очищали с использованием набора QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) и расщепляли SalI. Полученный ДНК-фрагмент клонировали в вектор pBlueScript KS+(Toyobo, Inc.). После секвенирования ДНК плазмиду, содержащую желаемую ДНК-последовательность, расщепляли SalI и полученный ДНК-фрагмент соединяли с использованием набора Rapid DNA Ligation Kit (Boehringer Mannheim) с рСНОМ2, расщепленной SalI. После ДНК-секвенирования ДНК плазмиду, содержащую желаемую ДНК-последовательность, обозначали как "pCHOM2(Fv)2" (см. фиг.34). Нуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность района sc(Fv)2 антитела MABL-2, содержащегося в плазмиде pCHOM2(Fv)2, показаны в SEQ ID NO 32.The PCR product was purified using a QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) and SalI was digested. The resulting DNA fragment was cloned into the pBlueScript KS + vector (Toyobo, Inc.). After DNA sequencing, a plasmid containing the desired DNA sequence was digested with SalI and the resulting DNA fragment was coupled using the Rapid DNA Ligation Kit (Boehringer Mannheim) with pCHOM2 digested with SalI. After DNA sequencing, a plasmid containing the desired DNA sequence was designated as “pCHOM2 (Fv) 2 ” (see FIG. 34). The nucleotide sequence and amino acid sequence of the sc (Fv) 2 region of the MABL- 2 antibody contained in the plasmid pCHOM2 (Fv) 2 are shown in
6.2 Получение плазмиды, экспрессирующей scFv антитела MABL-2, имеющие линкеры разной длины6.2 Obtaining a plasmid expressing scFv antibodies MABL-2 having linkers of different lengths
Полипептиды scFv, содержащие линкеры различной длины и V-области, которые расположены в следующем порядке [Н-цепь]-[L-цепь] (далее называемые "HL") или [L-цепь]-[Н-цепь] (далее называемые "LH"), получали с использованием в качестве матрицы кДНК, кодирующих Н-цепь и L-цепь, происходящие из MABL-2, как упоминалось выше.ScFv polypeptides containing linkers of various lengths and V regions, which are arranged in the following order [H chain] - [L chain] (hereinafter referred to as “HL”) or [L chain] - [H chain] (hereinafter referred to as “LH”) was prepared using cDNA encoding the H chain and L chain derived from MABL-2 as a template, as mentioned above.
Для конструирования scFv HL-типа ПЦР-процедуру проводили с использованием pCHOM2(Fv)2 в качестве матрицы. На ПЦР-стадии использовали пару праймеров CFHL-Fl (SEQ ID NO 33) и CFHL-R2 (SEQ ID NO 34) или пару праймеров CFHL-F2 (SEQ ID NO 35) и CFHL-R1 (SEQ ID NO 36) и ДНК-полимеразу KOD. ПЦР-процедуру проводили путем повторения 30 раз температурного цикла, состоящего из 94°С в течение 30 секунд, 60°С в течение 30 секунд и 72°С в течение 1 минуты в указанном порядке для получения кДНК для Н-цепи, содержащей лидерную последовательность на 5'-конце, или кДНК для L-цепи, содержащей FLAG-последовательность на ее 3'-конце. Полученные кДНК для Н-цепи и L-цепи смешивали и ПЦР проводили путем повторения 5 раз температурного цикла, состоящего из 94°С в течение 30 секунд, 60°С в течение 30 секунд и 72°С в течение 1 минуты в указанном порядке с использованием этой смеси в качестве матрицы и полимеразы KOD. К этой реакционной смеси добавляли праймеры CFHL-F1 и CFHL-R1 и затем проводили ПЦР-реакцию путем повторения 30 раз вышеупомянутого температурного цикла для получения кДНК для HL-0-типа без линкера.To construct an HL-type scFv, the PCR procedure was performed using pCHOM2 (Fv) 2 as a template. In the PCR step, a pair of primers CFHL-Fl (SEQ ID NO 33) and CFHL-R2 (SEQ ID NO 34) or a pair of primers CFHL-F2 (SEQ ID NO 35) and CFHL-R1 (SEQ ID NO 36) and DNA were used -polymerase KOD. The PCR procedure was carried out by repeating 30 times the temperature cycle, consisting of 94 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 1 minute in that order to obtain cDNA for the H chain containing the leader sequence at the 5'-end, or cDNA for the L chain containing the FLAG sequence at its 3'-end. The obtained cDNAs for the H chain and L chain were mixed and PCR was performed by repeating 5 times the temperature cycle consisting of 94 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 1 minute in that order with using this mixture as a KOD matrix and polymerase. Primers CFHL-F1 and CFHL-R1 were added to this reaction mixture and then a PCR reaction was carried out by repeating the above-mentioned
Для конструирования scFv LH-типа ПЦР-реакцию проводили с использованием в качестве матрицы pGEM-M2L и pGEM-M2H, которые содержат кДНК, кодирующие V-область L-цепи и V-область Н-цепи антитела MABL-2, соответственно (см. Заявку на патент Японии JP-Appl. 11-63557). Использовали пару праймеров Т7 (SEQ ID NO 37) и CFLH-R2 (SEQ ID NO 38) или пару праймеров CFLH-F2 (SEQ ID NO 39) и CFLH-R1 (SEQ ID NO 40) и полимеразу KOD (Toyobo, Inc.). ПЦР-реакцию выполняли повторением 30 раз температурного цикла, состоящего из 94°С в течение 30 секунд, 60°С в течение 30 секунд и 72°С в течение 1 минуты в указанном порядке для получения кДНК L-цепи, содержащей лидерную последовательность на 5'-конце, или кДНК Н-цепи, содержащей FLAG-последовательность на ее 3'-конце. Полученные кДНК L-цепи и Н-цепи смешивали и ПЦР проводили с использованием этой смеси в качестве матрицы и полимеразы KOD повторением 5 раз температурного цикла, состоящего из 94°С в течение 30 секунд, 60°С в течение 30 секунд и 72°С в течение 1 минуты в указанном порядке. К этой реакционной смеси добавляли праймеры Т7 и CFHL-R1 и проводили реакцию повторением 30 раз вышеупомянутого температурного цикла. Продукт реакции использовали в качестве матрицы и ПЦР проводили с использованием пары праймеров CFLH-F4 (SEQ ID NO 41) и CFLH-R1 повторением 30 раз температурного цикла, состоящего из 94°С в течение 30 секунд, 60°С в течение 30 секунд и 72°С в течение 1 минуты в указанном порядке для получения кДНК LH-0-типа без линкера.To construct an LH-type scFv, the PCR reaction was performed using pGEM-M2L and pGEM-M2H as a template, which contain cDNAs encoding the V region of the L chain and the V region of the H chain of the MABL-2 antibody, respectively (see Japanese Patent Application JP-Appl. 11-63557). Used a pair of primers T7 (SEQ ID NO 37) and CFLH-R2 (SEQ ID NO 38) or a pair of primers CFLH-F2 (SEQ ID NO 39) and CFLH-R1 (SEQ ID NO 40) and KOD polymerase (Toyobo, Inc. ) The PCR reaction was performed by repeating 30 times the temperature cycle, consisting of 94 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 1 minute in this order to obtain cDNA L-chain containing a leader sequence of 5 '-end, or cDNA of the H chain containing the FLAG sequence at its 3'-end. The resulting cDNA of the L chain and H chain were mixed and PCR was performed using this mixture as a KOD template and KOD polymerase by repeating 5 times the temperature cycle consisting of 94 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 30 seconds and 72 ° C within 1 minute in that order. Primers T7 and CFHL-R1 were added to this reaction mixture and the reaction was carried out by repeating 30 times of the above temperature cycle. The reaction product was used as a template and PCR was performed using a pair of primers CFLH-F4 (SEQ ID NO 41) and CFLH-R1 by repeating 30 times the temperature cycle consisting of 94 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 1 minute in the indicated order to obtain LH-0 type cDNA without a linker.
Полученные кДНК типов LH-0 и HL-0 расщепляли рестриктазами EcoRI и BamHI (Takara Shuzo) и расщепленные кДНК встраивали в экспрессионную плазмиду INPEP4 для клеток млекопитающих с использованием набора Ligation High (Toyobo Inc.), соответственно. Компетентные клетки Е.coli JM109 (Nippon Gene) трансформировали каждой плазмидой и желаемые плазмиды выделяли из трансформированных Е.coli с использованием набора QIAGEN Plasmid Maxi Kit (Qiagen). Таким образом получали плазмиды pCF2LH-0 и pCF2HL-0.The obtained cDNAs of types LH-0 and HL-0 were digested with restriction enzymes EcoRI and BamHI (Takara Shuzo) and the cleaved cDNAs were inserted into the mammalian expression plasmid INPEP4 using the Ligation High kit (Toyobo Inc.), respectively. Competent E. coli JM109 cells (Nippon Gene) were transformed with each plasmid and the desired plasmids were isolated from transformed E. coli using the QIAGEN Plasmid Maxi Kit (Qiagen). Thus, plasmids pCF2LH-0 and pCF2HL-0 were obtained.
Для конструирования экспрессионных плазмид HL-типа, содержащих линкеры различного размера, использовали pCF2LH-0 в качестве матрицы и CFHL-X3 (SEQ ID NO 42), CFHL-X4 (SEQ ID NO 43), CFHL-X5 (SEQ ID NO 44), CFHL-X6 (SEQ ID NO 45) или CFHL-X7 (SEQ ID NO 46) в качестве смыслового праймера и праймер BGH-1 (SEQ ID NO 47) в качестве антисмыслового праймера, который комплементарен векторной последовательности. ПЦР-реакции проводили с использованием полимеразы KOD повторением 30 раз температурного цикла, состоящего из 94°С в течение 30 секунд, 60°С в течение 30 секунд и 72°С в течение 1 минуты в указанном порядке и продукты реакции расщепляли рестриктазами XhoI и BamHI (Takara Shuzo). Расщепленные фрагменты встраивали между сайтами XhoI и BamHI в pCF2HL-0 с использованием набора Ligation High (Toyobo Inc.), соответственно. Компетентные клетки Е.coli JM109 трансформировали каждой плазмидой и желаемые плазмиды выделяли из трансформированных Е.coli с использованием набора Qiagen Plasmid Maxi Kit. Таким образом получали экспрессионные плазмиды pCF2HL-3, pCF2HL-4, pCF2HL-5, pCF2HL-6 и pCF2HL-7.To construct HL-type expression plasmids containing linkers of various sizes, pCF2LH-0 as a matrix and CFHL-X3 (SEQ ID NO 42), CFHL-X4 (SEQ ID NO 43), CFHL-X5 (SEQ ID NO 44) were used , CFHL-X6 (SEQ ID NO 45) or CFHL-X7 (SEQ ID NO 46) as a sense primer and BGH-1 primer (SEQ ID NO 47) as an antisense primer that is complementary to a vector sequence. PCR reactions were performed using KOD polymerase by repeating 30 times the temperature cycle consisting of 94 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 1 minute in this order, and the reaction products were digested with restriction enzymes XhoI and BamHI (Takara Shuzo). Cleaved fragments were inserted between the XhoI and BamHI sites in pCF2HL-0 using the Ligation High kit (Toyobo Inc.), respectively. Competent E. coli JM109 cells were transformed with each plasmid and the desired plasmids were isolated from transformed E. coli using the Qiagen Plasmid Maxi Kit. Thus, expression plasmids pCF2HL-3, pCF2HL-4, pCF2HL-5, pCF2HL-6 and pCF2HL-7 were obtained.
Для конструирования экспрессионной плазмиды для временной экспрессии в клетках COS7 плазмиды pCF2HL-0, pCF2HL-3, pCF2HL-4, pCF2HL-5, pCF2HL-6 и pCF2HL-7 расщепляли рестриктазами EcoRI и BamHI (Takara Shuzo) и полученные фрагменты размером около 800 п.о. очищали электрофорезом в агарозном геле. Полученные фрагменты встраивали между сайтами EcoRI и BamHI в экспрессионной плазмиде pCOSI для экспрессии в клетках млекопитающих с использованием набора Ligation High (Toyobo Inc.), соответственно. Компетентные клетки Е.coli DH5α (Toyobo Inc.) трансформировали каждой плазмидой и желаемые плазмиды выделяли из трансформированных Е.coli с использованием набора Qiagen Plasmid Maxi Kit. Таким образом получали плазмиды CF2HL-0/pCOS1, CF2HL-3/pCOS1, CF2HL-4/pCOS1, CF2HL-5/pCOS1, CF2HL-6/pCOS1 и CF2HL-7/pCOS1.To construct an expression plasmid for transient expression in COS7 cells, plasmids pCF2HL-0, pCF2HL-3, pCF2HL-4, pCF2HL-5, pCF2HL-6 and pCF2HL-7 were digested with restriction enzymes EcoRI and BamHI (Takara fragments of size 800 and about .about. purified by agarose gel electrophoresis. The resulting fragments were inserted between the EcoRI and BamHI sites in the pCOSI expression plasmid for expression in mammalian cells using the Ligation High kit (Toyobo Inc.), respectively. Competent E. coli DH5α cells (Toyobo Inc.) were transformed with each plasmid and the desired plasmids were isolated from transformed E. coli using the Qiagen Plasmid Maxi Kit. Thus, plasmids CF2HL-0 / pCOS1, CF2HL-3 / pCOS1, CF2HL-4 / pCOS1, CF2HL-5 / pCOS1, CF2HL-6 / pCOS1 and CF2HL-7 / pCOS1 were obtained.
В качестве типичного примера этих плазмид конструкция плазмиды CF2HL-0/pCOS1 показана на фиг.35, а нуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность MABL2-scFv <HL-0>, содержащегося в этой плазмиде, показаны в SEQ ID NO 48. Нуклеотидные последовательности и аминокислотные последовательности линкерных участков в этих плазмидах также показаны на фиг.36.As a typical example of these plasmids, the construction of the plasmid CF2HL-0 / pCOS1 is shown in FIG. 35, and the nucleotide sequence and amino acid sequence of the MABL2-scFv <HL-0> contained in this plasmid are shown in SEQ ID NO 48. The nucleotide sequences and amino acid the sequence of linker sites in these plasmids is also shown in Fig.36.
Для конструирования экспрессионных плазмид LH-типа, содержащих линкеры различного размера, использовали pCF2LH-0 в качестве матрицы и CFLH-X3 (SEQ ID NO 49), CFLH-X4 (SEQ ID NO 50), CFLH-X5 (SEQ ID NO 51), CFLH-X6 (SEQ ID NO 52) или CFLH-X7 (SEQ ID NO 53) в качестве смыслового праймера и праймер BGH-1 в качестве антисмыслового праймера, который комплементарен векторной последовательности. ПЦР-реакцию проводили с использованием полимеразы KOD повторением 30 раз температурного цикла, состоящего из 94°С в течение 30 секунд, 60°С в течение 30 секунд и 72°С в течение 1 минуты в указанном порядке и продукты реакции расщепляли рестриктазами XhoI и BamHI. Расщепленные фрагменты встраивали между сайтами XhoI и BamHI в pCF2LH-0 с использованием набора Ligation High, соответственно. Компетентные клетки Е.coli DH5α (Toyobo Inc.) трансформировали каждой плазмидой и желаемые плазмиды выделяли из трансформированных Е.coli с использованием набора Qiagen Plasmid Maxi Kit. Таким образом получали плазмиды pCF2LH-3, pCF2LH-4, pCF2LH-5, pCF2LH-6 и pCF2LH-7.To construct LH-type expression plasmids containing linkers of various sizes, pCF2LH-0 as the template and CFLH-X3 (SEQ ID NO 49), CFLH-X4 (SEQ ID NO 50), CFLH-X5 (SEQ ID NO 51) were used , CFLH-X6 (SEQ ID NO 52) or CFLH-X7 (SEQ ID NO 53) as a sense primer and BGH-1 primer as an antisense primer that is complementary to a vector sequence. The PCR reaction was performed using KOD polymerase by repeating 30 times the temperature cycle consisting of 94 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 1 minute in this order, and the reaction products were digested with restriction enzymes XhoI and BamHI . Cleaved fragments were inserted between the XhoI and BamHI sites in pCF2LH-0 using the Ligation High kit, respectively. Competent E. coli DH5α cells (Toyobo Inc.) were transformed with each plasmid and the desired plasmids were isolated from transformed E. coli using the Qiagen Plasmid Maxi Kit. Thus, plasmids pCF2LH-3, pCF2LH-4, pCF2LH-5, pCF2LH-6 and pCF2LH-7 were obtained.
Для конструирования экспрессионной плазмиды для временной экспрессии в клетках COS7 плазмиды pCF2LH-0, pCF2LH-3, pCF2LH-4, pCF2LH-5, pCF2LH-6 и pCF2LH-7 расщепляли рестриктазами EcoRI и BamHI (Takara Shuzo) и полученные фрагменты размером около 800 п.о. очищали электрофорезом в агарозном геле. Полученные фрагменты вводили между сайтами EcoRI и BamHI в экспрессионной плазмиде pCOS1 для экспрессии в клетках млекопитающих с использованием набора Ligation High, соответственно. Компетентные клетки Е.coli DH5α (Toyobo Inc.) трансформировали каждой плазмидой и желаемые плазмиды выделяли из трансформированных Е.coli с использованием набора Qiagen Plasmid Maxi Kit. Таким образом получали плазмиды CF2LH-0/pCOS1, CF2LH-3/pCOS1, CF2LH-4/pCOS1, CF2LH-5/pCOS1, CF2LH-6/pCOS1 и CF2LH-7/pCOS1.To construct an expression plasmid for transient expression in COS7 cells, plasmids pCF2LH-0, pCF2LH-3, pCF2LH-4, pCF2LH-5, pCF2LH-6, and pCF2LH-7 were digested with restriction enzymes EcoRI and BamHI (Takara Shuzo fragments of size about 800 and .about. purified by agarose gel electrophoresis. The resulting fragments were introduced between EcoRI and BamHI sites in the expression plasmid pCOS1 for expression in mammalian cells using the Ligation High kit, respectively. Competent E. coli DH5α cells (Toyobo Inc.) were transformed with each plasmid and the desired plasmids were isolated from transformed E. coli using the Qiagen Plasmid Maxi Kit. Thus, plasmids CF2LH-0 / pCOS1, CF2LH-3 / pCOS1, CF2LH-4 / pCOS1, CF2LH-5 / pCOS1, CF2LH-6 / pCOS1 and CF2LH-7 / pCOS1 were obtained.
В качестве типичного примера этих плазмид конструкция плазмиды CF2LH-0/pCOS1 показана на фиг.37, а нуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность MABL2-scFv <LH-0>, содержащегося в этой плазмиде, показаны в SEQ ID NO 54. Нуклеотидные последовательности и аминокислотные последовательности линкерных участков в этих плазмидах также показаны на фиг.38.As a typical example of these plasmids, the construction of the plasmid CF2LH-0 / pCOS1 is shown in FIG. 37, and the nucleotide sequence and amino acid sequence of MABL2-scFv <LH-0> contained in this plasmid are shown in SEQ ID NO 54. The nucleotide sequences and amino acid the sequence of linker sites in these plasmids is also shown in Fig.38.
6.3 Экспрессия scFv и sc(Fv)2 в клетках COS76.3 Expression of scFv and sc (Fv) 2 in COS7 cells
(1) Получение культурального супернатанта с использованием сывороточной культуральной среды(1) Obtaining a culture supernatant using serum culture medium
scFv и sc(Fv)2 HL-типа и LH-типа временно экспрессировали в клетках COS7 (JCRB9127, Japan Health Sciences Foundation). Клетки COS7 субкультивировали в среде DMEM (Gibco BRL), содержащей 10% фетальную телячью сыворотку (HyClone), при 37°С в СО2-инкубаторе. Клетки COS7 трансфицировали CF2HL-0, 3~7/pCOS1, или CF2LH-0, 3~7/pCOS1, полученными в примере 6.2, или вектором pCHOM2(Fv)2 электропорацией с использованием прибора Gene Pulser (BioRad). ДНК (10 мкг) и 0,25 мл суспензии 2×107 клеток/мл в культуральной среде DMEM, содержащей 10% фетальную телячью сыворотку (ФТС) и 5 мМ BES (Sigma), добавляли в кювету. После выдерживания в течение 10 минут эти смеси обрабатывали импульсом при 0,17 кВ, при электрической емкости 950 мкФ. После "восстановления" в течение 10 минут при комнатной температуре электропорированные клетки переносили в культуральную среду DMEM (10% ФТС) в колбе на 75 мл. После культивирования в течение 72 часов культуральный супернатант собирали и центрифугировали для удаления клеточных фрагментов. Культуральный супернатант подвергали фильтрованию с использованием надеваемого на горло колбы фильтра с размером пор 0,22 мкм (Falcon) с получением культурального супернатанта (далее называемого "СМ").scFv and sc (Fv) 2 of HL type and LH type were temporarily expressed in COS7 cells (JCRB9127, Japan Health Sciences Foundation). COS7 cells were subcultured in DMEM medium (Gibco BRL) containing 10% fetal calf serum (HyClone) at 37 ° C in a CO 2 incubator. COS7 cells were transfected with CF2HL-0, 3 ~ 7 / pCOS1, or CF2LH-0, 3 ~ 7 / pCOS1, obtained in Example 6.2, or with pCHOM2 (Fv) 2 vector by electroporation using a Gene Pulser (BioRad) device. DNA (10 μg) and 0.25 ml of a suspension of 2 × 10 7 cells / ml in DMEM culture medium containing 10% fetal calf serum (FCS) and 5 mM BES (Sigma) were added to the cuvette. After holding for 10 minutes, these mixtures were treated with a pulse at 0.17 kV, with an electric capacitance of 950 μF. After "reconstitution" for 10 minutes at room temperature, the electroporated cells were transferred to DMEM culture medium (10% FCS) in a 75 ml flask. After culturing for 72 hours, the culture supernatant was collected and centrifuged to remove cell fragments. The culture supernatant was subjected to filtration using a 0.22 μm (Falcon) filter placed on the neck of the flask to obtain a culture supernatant (hereinafter referred to as "CM").
(2) Получение культурального супернатанта с использованием бессывороточной культуральной среды(2) Obtaining culture supernatant using serum-free culture medium
Клетки, трансфицированные так же, как в (1), переносили в среду DMEM (10% ФТС) в колбе на 75 мл и культивировали в течение ночи. После культивирования супернатант выбрасывали и клетки промывали PBS и затем добавляли к среде CHO-S-SFM II (Gibco BRL). После культивирования в течение 72 часов культуральный супернатант собирали, центрифугировали для удаления клеточных фрагментов и фильтровали с использованием надеваемого на колбу фильтра с размером пор 0,22 мкм (Falcon) с получением СМ.Cells transfected as in (1) were transferred to DMEM medium (10% FCS) in a 75 ml flask and cultured overnight. After cultivation, the supernatant was discarded and the cells were washed with PBS and then added to CHO-S-SFM II medium (Gibco BRL). After culturing for 72 hours, the culture supernatant was collected, centrifuged to remove cell fragments and filtered using a 0.22 μm (Falcon) filter-worn flask to obtain CM.
6.4 Детектирование scFv и sc(Fv)2 в СМ клеток COS76.4 Detection of scFv and sc (Fv) 2 in CM COS7 cells
Различные MABL2-scFv и sc(Fv)2 в СМ клеток COS7, полученные в вышеупомянутом примере 6.3 (2), детектировали методом Вестерн-блоттинга.Various MABL2-scFv and sc (Fv) 2 in the CM of COS7 cells obtained in the above Example 6.3 (2) were detected by Western blotting.
Каждый СМ (супернатант) COS7 подвергали электрофорезу в ДСН-ПААГ и переносили на мембрану REINFORCED NC (Schleicher & Schuell). Мембрану блокировали 5% обезжиренным молоком (Morinaga Nyu-guo) и промывали забуференным Трис солевым раствором (TBS). Затем к ней добавляли анти-FLAG-антитело (Sigma). Мембрану инкубировали при комнатной температуре и промывали. Добавляли меченное пероксидазой мышиное IgG-антитело (Jackson ImmunoResearch). После инкубирования и промывания при комнатной температуре добавляли раствор субстрата (Kirkegaard Perry Laboratories) для развития окраски (фиг.39).Each COS7 CM (supernatant) was subjected to SDS-PAGE and transferred to a REINFORCED NC membrane (Schleicher & Schuell). The membrane was blocked with 5% skim milk (Morinaga Nyu-guo) and washed with Tris buffered saline (TBS). Then, an anti-FLAG antibody (Sigma) was added to it. The membrane was incubated at room temperature and washed. Peroxidase-labeled murine IgG antibody (Jackson ImmunoResearch) was added. After incubation and washing at room temperature, a substrate solution (Kirkegaard Perry Laboratories) was added to develop color (Fig. 39).
6.5 Проточная цитометрия6.5 Flow cytometry
Проточную цитометрию проводили с использованием культуральных супернатантов клеток COS7, полученных в примере 6.3 (1), для измерения связывания MABL2-scFv и sc(Fv)2 с IAP-антигеном (интегрин-ассоциированным белком) человека. Культуральные супернатанты, подлежащие тестированию, или культуральный супернатант клеток COS7 в качестве контроля добавляли к 2×105 клеток клеточной линии мышиного лейкоза L1210, экспрессирующей интегрин-ассоциированный белок (IAP) человека. После инкубирования на льду и промывания к ним добавляли 10 мкг/мл мышиного анти-FLAG-антитела (Sigma), и затем эти клетки инкубировали и промывали.Flow cytometry was performed using the culture supernatants of COS7 cells obtained in Example 6.3 (1) to measure the binding of MABL2-scFv and sc (Fv) 2 to the human IAP antigen (integrin-associated protein). The culture supernatants to be tested, or the culture supernatant of COS7 cells, were added as control to 2 × 10 5 cells of the murine L1210 mouse leukemia cell line expressing human integrin-associated protein (IAP). After incubation on ice and washing, 10 μg / ml of mouse anti-FLAG antibody (Sigma) was added thereto, and then these cells were incubated and washed.
Затем к ним добавляли FITC-меченное антитело против мышиного IgG (Becton Dickinson), и клетки опять инкубировали и промывали. Затем измеряли интенсивность флуоресценции с использованием прибора FACScan (Becton Dickinson). Результаты проточной цитометрии показывают, что MABL2-scFv, имеющие линкеры различной длины, и sc(Fv)2 в культуральных супернатантах клеток COS7 имеют высокое сродство к IAP человека (см. фиг.40а и 40b).Then, a FITC-labeled anti-mouse IgG antibody (Becton Dickinson) was added thereto, and the cells were again incubated and washed. Then, the fluorescence intensity was measured using a FACScan instrument (Becton Dickinson). Flow cytometry results show that MABL2-scFv having linkers of different lengths and sc (Fv) 2 in the culture supernatants of COS7 cells have a high affinity for human IAPs (see FIGS. 40a and 40b).
6.6 Апоптоз-индуцирующее действие in vitro6.6 Apoptosis inducing effect in vitro
Апоптоз-индуцирующее действие культуральных супернатантов COS7, полученных в примере 6.3 (1), исследовали методом окрашивания Аннексином-V (Boehringer Mannheim) с использованием клеток L1210, трансфицированных геном IAP человека (hIAP/L 1210).The apoptosis-inducing effect of the COS7 culture supernatants obtained in Example 6.3 (1) was investigated by Annexin-V staining (Boehringer Mannheim) using L1210 cells transfected with the human IAP gene (hIAP / L 1210).
К 5×104 клеток hIAP/L1210 добавляли культуральные супернатанты клеток COS7, трансфицированных каждым из векторов, или культуральный супернатант клеток COS7 в качестве контроля в конечной концентрации 10% и смеси культивировали в течение 24 часов. Затем проводили окрашивание Аннексином-V/PI и измеряли интенсивность флуоресценции с использованием прибора FACScan (Becton Dickinson). Результаты показали, что scFv <HL3, 4, 6, 7, LH3, 4, 6, 7> и sc(Fv)2 в СМ клеток COS7 индуцировали в сильной степени гибель клеток hIAP/L1210. Эти результаты показаны на фиг.41.To 5 × 10 4 hIAP / L1210 cells, culture supernatants of COS7 cells transfected with each of the vectors or culture supernatant of COS7 cells were added as a control at a final concentration of 10% and the mixture was cultured for 24 hours. Annexin-V / PI staining was then performed and the fluorescence intensity was measured using a FACScan instrument (Becton Dickinson). The results showed that scFv <HL3, 4, 6, 7, LH3, 4, 6, 7> and sc (Fv) 2 in the CM of COS7 cells strongly induced hIAP / L1210 cell death. These results are shown in FIG.
6.7 Конструирование векторов для экспрессии scFv и sc(Fv)2 в клетках СНО6.7 Construction of vectors for expression of scFv and sc (Fv) 2 in CHO cells
Для выделения и очистки MABL2-scFv и sc(Fv)2 из культурального супернатанта конструировали экспрессионные вектора для экспрессии в клетках СНО, как описано ниже.To isolate and purify MABL2-scFv and sc (Fv) 2 from the culture supernatant, expression vectors for expression in CHO cells were constructed as described below.
EcoRI-BamHI-фрагменты pCF2HL-0, 3~7 и pCF2LH-0, 3~7, полученные в примере 6.2, встраивали между сайтами EcoRI и BamHI в экспрессионный вектор рСНО1 для клеток СНО с использованием набора Ligation High. Компетентные клетки Е.coli DH5α трансформировали каждой плазмидой. Плазмиды выделяли из трансформированной Е.coli с использованием набора Qiagen Plasmid Midi kit (Qiagen) с получением экспрессионных плазмид pCHOM2HL-0, 3~7 и pCHOM2LH-0, 3~7.The EcoRI-BamHI fragments pCF2HL-0, 3 ~ 7 and pCF2LH-0, 3 ~ 7, obtained in Example 6.2, were inserted between the EcoRI and BamHI sites into the pCHO1 expression vector for CHO cells using the Ligation High kit. Competent E. coli DH5α cells were transformed with each plasmid. Plasmids were isolated from transformed E. coli using the Qiagen Plasmid Midi kit (Qiagen) to obtain expression plasmids pCHOM2HL-0, 3 ~ 7 and pCHOM2LH-0, 3 ~ 7.
6.8 Получение клеток СНО, экспрессирующих MABL2-scFv <HL-0, 3~7>, MABL2-scFv <LH-0, 3~7> и sc(Fv)2, и получение их культуральных супернатантов6.8 Obtaining CHO cells expressing MABL2-scFv <HL-0, 3 ~ 7>, MABL2-scFv <LH-0, 3 ~ 7> and sc (Fv) 2 , and obtaining their culture supernatants
Клетки СНО трансформировали каждой из экспрессионных плазмид pCHOM2HL-0, 3~7 и pCHOM2LH-0, 3~7, сконструированных в примере 6.7, и вектором pCHOM2(Fv)2 с получением клеток СНО, стабильно экспрессирующих каждое модифицированное антитело. В качестве типичного примера получение клеток СНО, стабильно экспрессирующих MABL2-scFv <HL-5> или sc(Fv)2, иллюстрируется далее.CHO cells were transformed with each of the pCHOM2HL-0, 3 ~ 7 and pCHOM2LH-0, 3 ~ 7 expression plasmids constructed in Example 6.7 and the pCHOM2 (Fv) 2 vector to produce CHO cells stably expressing each modified antibody. As a typical example, the preparation of CHO cells stably expressing MABL2-scFv <HL-5> or sc (Fv) 2 is illustrated below.
Экспрессионные плазмиды pCHOM2HL-5 и pCHOM2(Fv)2 линеаризовали расщеплением рестриктазой PvuI и подвергали трансфекции в клетки СНО электропорацией с использованием прибора Gene Pulser (BioRad). ДНК (10 мкг) и 0,75 мл PBS, содержащего 1×107 клеток/мл, добавляли в кювету и обрабатывали импульсом при 1,5 кВ, при электрической емкости 25 мкФ. После «восстановления» в течение 10 минут при комнатной температуре электропорированные клетки переносили в содержащую нуклеиновую кислоту культуральную среду α-МЕМ (Gibco BRL), содержащую 10% фетальную телячью сыворотку, и культивировали. После культивирования в течение ночи супернатант отбрасывали. Клетки промывали PBS и добавляли в свободную от нуклеиновых кислот культуральную среду α-МЕМ (Gibco BRL), содержащую 10% фетальную телячью сыворотку. После культивирования в течение двух недель клетки культивировали в среде, содержащей 10 нМ (конечная концентрация) метотрексат (Sigma), затем 50 нМ и 100 нМ метотрексат. Полученные клетки культивировали в бессывороточной среде CHO-S-SFM II (Gibco BRL) в роллерных флаконах. Культуральный супернатант собирали, центрифугировали для удаления клеточных фрагментов и фильтровали с использованием фильтра с размером пор 0,22 мкм с получением СМ, соответственно.Expression plasmids pCHOM2HL-5 and pCHOM2 (Fv) 2 were linearized by PvuI restriction enzyme digestion and transfected into CHO cells by electroporation using a Gene Pulser (BioRad) instrument. DNA (10 μg) and 0.75 ml of PBS containing 1 × 10 7 cells / ml were added to the cuvette and treated with a pulse at 1.5 kV, with an electric capacitance of 25 μF. After “reconstitution” for 10 minutes at room temperature, the electroporated cells were transferred to α-MEM culture medium containing nucleic acid (Gibco BRL) containing 10% fetal calf serum and cultured. After culturing overnight, the supernatant was discarded. Cells were washed with PBS and α-MEM culture medium (Gibco BRL) containing 10% fetal calf serum was added to the nucleic acid-free culture medium. After culturing for two weeks, the cells were cultured in a medium containing 10 nM (final concentration) methotrexate (Sigma), then 50 nM and 100 nM methotrexate. The resulting cells were cultured in serum-free medium CHO-S-SFM II (Gibco BRL) in roller bottles. The culture supernatant was collected, centrifuged to remove cell fragments and filtered using a filter with a pore size of 0.22 μm to obtain CM, respectively.
Согласно вышеописанному, получали клетки СНО, которые стабильно экспрессируют MABL2-scFv<HL-0, -3, -4, -6, -7, и <LH-0, -3, -4, -5, -6, -7>, и СМ из них.As described above, CHO cells were obtained that stably express MABL2-scFv <HL-0, -3, -4, -6, -7, and <LH-0, -3, -4, -5, -6, -7 >, and SM of them.
6.9 Очистка димера MABL2-scFv <HL-5> и sc(Fv)2 6.9 Purification of MABL2-scFv <HL-5> and sc (Fv) 2 dimer
MABL2-scFv <HL-5> и sc(Fv)2 очищали из CM, полученных в примере 6.8, с использованием двух способов очистки, описанных ниже.MABL2-scFv <HL-5> and sc (Fv) 2 were purified from CM obtained in Example 6.8 using the two purification methods described below.
<Способ очистки 1><
HL-5 и sc(Fv)2 очищали аффинной хроматографией на колонке с анти-FLAG-антителами с использованием FLAG-последовательности, локализованной на С-конце полипептидов, и гель-фильтрацией. Один литр СМ, полученного в 6.8, наносили на колонку (7,9 мл), заполненную анти-FLAG М2-аффинным гелем (Sigma), уравновешенную 50 мМ Трис-HCl-буфером (TBS, рН 7,5), содержащим 150 мМ NaCl. После промывания колонки TBS scFv элюировали 0,1 М глицин-HCl-буфером, рН 3,5. Полученные фракции анализировали электрофорезом в ДСН-ПААГ, и была подтверждена элюция scFv. Фракцию scFv смешивали с Твином 20 до конечной концентрации 0,01% и концентрировали с использованием Centricon-10 (Millipore). Концентрат наносили на колонку TSKgel G3000SWG (7,5×600 мм), уравновешенную 20 мМ ацетатным буфером (рН 6,0), содержащим 150 мМ NaCl и 0,01% Твин 20. При скорости подачи 0,4 мл/мин scFv детектировали по поглощению при 280 нм. HL-5 элюировался в виде основной фракции в положении, соответствующем димеру, a sc(Fv)2 элюировался в положении, соответствующем мономеру.HL-5 and sc (Fv) 2 were purified by affinity chromatography on an anti-FLAG antibody column using the FLAG sequence localized at the C-terminus of the polypeptides and gel filtration. One liter of CM obtained in 6.8 was applied to a column (7.9 ml) filled with anti-FLAG M2 affinity gel (Sigma), equilibrated with 50 mM Tris-HCl buffer (TBS, pH 7.5) containing 150 mM NaCl. After washing the TBS scFv column, it was eluted with 0.1 M glycine-HCl buffer, pH 3.5. The resulting fractions were analyzed by SDS-PAGE, and scFv elution was confirmed. The scFv fraction was mixed with
<Способ очистки 2><
HL-5 и sc(Fv)2 очищали с использованием трех стадий, включающих ионообменную хроматографию, хроматографию на гидроксиапатите и гель-фильтрацию. При ионообменной хроматографии использовали колонку Q sepharose fast flow (Pharmacia) для HL-5, а колонку SP-sepharose fast flow использовали для sc(Fv)2. Начиная со второй стадии, HL-5 и sc(Fv)2 обрабатывали с использованием одной и той же процедуры.HL-5 and sc (Fv) 2 were purified using three steps, including ion exchange chromatography, hydroxyapatite chromatography, and gel filtration. For ion exchange chromatography, a Q sepharose fast flow column (Pharmacia) for HL-5 was used, and a SP-sepharose fast flow column was used for sc (Fv) 2 . Starting from the second stage, HL-5 and sc (Fv) 2 were processed using the same procedure.
Первая стадия для HL-5Stage One for HL-5
СМ (супернатант) HL-5 разбавляли в два раза 20 мМ Трис-HCl-буфером (рН 9,0), содержащим 0,02% Твин 20, и затем рН доводили до 9,0 1 М Трис. Раствор наносили на колонку Q sepharose fast flow, уравновешенную 20 мМ Трис-HCl-буфером (рН 8,5), содержащим 0,02% Твин 20. Полипептид, адсорбированный на колонке, элюировали линейным градиентом NaCl в том же самом буфере, от 0,1 до 0,55 М. Анализируя элюированные фракции при помощи электрофореза в ДСН-ПААГ, собирали фракции, содержащие HL-5, и подвергали хроматографии с гидроксиапатитом на второй стадии.CM (supernatant) HL-5 was diluted twice with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 9.0) containing 0.02
Первая стадия для sc(Fv)2 Stage One for sc (Fv) 2
CM sc(Fv)2 разбавляли в два раза 20 мМ ацетатным буфером (рН 5,5), содержащим 0,02% Твин 20, и затем рН доводили до 5,5 1 М уксусной кислотой. Раствор наносили на колонку SP-Sepharose fast flow, уравновешенную 20 мМ ацетатным буфером (рН 5,5), содержащим 0,02% Твин 20. Полипептид, адсорбированный на колонке, элюировали линейным градиентом NaCl в том же самом буфере, от 0 до 0,5 М. Анализируя элюированные фракции при помощи электрофореза в ДСН-ПААГ, собирали фракции, содержащие sc(Fv)2, и подвергали хроматографии с гидроксиапатитом на второй стадии.CM sc (Fv) 2 was diluted twice with 20 mM acetate buffer (pH 5.5) containing 0.02
Вторая стадия: Хроматография HL-5 и sc(Fv)2 на гидроксиапатитеSecond stage: Chromatography of HL-5 and sc (Fv) 2 on hydroxyapatite
Фракции HL-5 и sc(Fv)2, полученные на первой стадии, по отдельности наносили на гидроксиапатитную колонку (Типа I, BioRad), уравновешенную 10 мМ фосфатным буфером, содержащим 0,02% Твин 20, рН 7,0. После промывания колонки тем же самым буфером полипептиды, адсорбированные на колонке, элюировали линейным градиентом фосфатного буфера до 0,5 М. Анализируя элюированные фракции при помощи электрофореза в ДСН-ПААГ, собирали фракции, содержащие желаемые полипептиды.The HL-5 and sc (Fv) 2 fractions obtained in the first stage were separately applied to a hydroxyapatite column (Type I, BioRad) equilibrated with 10 mM phosphate buffer containing 0.02
Третья стадия: Гель-фильтрация HL-5 и sc(Fv)2 Stage Three: Gel Filtration of HL-5 and sc (Fv) 2
Каждую фракцию, полученную на второй стадии, отдельно концентрировали с использованием CentriPrep-10 (Millipore) и наносили наносили на колонку Superdex 200 (2,6×60 см, Pharmacia), уравновешенную 20 мМ ацетатным буфером (рН 6,0), содержащим 0,02% Твин 20 и 0,15 М NaCl. HL-5 элюировался в положении, соответствующем димеру, a sc(Fv)HL-5 и sc(Fv)2 элюировались в виде основного пика в положении, соответствующем мономеру, соответственно.Each fraction obtained in the second stage was separately concentrated using CentriPrep-10 (Millipore) and applied to a
Поскольку мономер HL-5 почти не детектировался ни при одном из двух способов очистки, это показало, что димеры одноцепочечных Fv образовывались с высокими выходами, когда линкер для одноцепочечного Fv содержит около 5 аминокислот. Кроме того, димер HL-5 и sc(Fv)2 стабильно сохранялись в течение месяца при 4°С после очистки.Since HL-5 monomer was hardly detected in either of the two purification methods, this showed that single chain Fv dimers were formed in high yields when the single chain Fv linker contains about 5 amino acids. In addition, the HL-5 dimer and sc (Fv) 2 were stably maintained for a month at 4 ° C after purification.
6.10 Оценка связывающей активности очищенных димера scFv<HL-5> и sc(Fv)2 в отношении антигена6.10 Evaluation of the binding activity of purified scFv <HL-5> and sc (Fv) 2 dimers against antigen
Проточную цитометрию проводили с использованием очищенного димера MABL2-scFv <HL-5> и очищенного sc(Fv)2 для оценки связывания с IAP-антигеном (интегрин-ассоциированным белком) человека. 10 мкг/мл очищенного димера MABL2-scFv <HL-5>, очищенного sc(Fv)2, антитела MABL-2 в качестве положительного контроля или мышиного IgG (Zymed) в качестве отрицательного контроля добавляли к 2×105 клеток мышиной клеточной линии лейкоза L1210, экспрессирующей IAP человека (hIAP/L1210), или клеточной линии L1210, трансформированной pCOS1 (pCOS1/L1210) в качестве контроля. После инкубирования на льду и промывания добавляли 10 мкг/мл мышиного анти-FLAG-антитела (Sigma) и затем клетки инкубировали и промывали. Добавляли FITC-меченое антитело против мышиного IgG (Becton Dickinson) и клетки опять инкубировали и промывали. Затем измеряли интенсивность флуоресценции с использованием прибора FACScan (Becton Dickinson).Flow cytometry was performed using purified MABL2-scFv <HL-5> dimer and purified sc (Fv) 2 to evaluate binding to the human IAP antigen (integrin-associated protein). 10 μg / ml of purified MABL2-scFv <HL-5> dimer, purified sc (Fv) 2 , MABL-2 antibodies as a positive control or mouse IgG (Zymed) as a negative control were added to 2 × 10 5 mouse cell line cells leukemia L1210 expressing human IAP (hIAP / L1210), or the L1210 cell line transformed with pCOS1 (pCOS1 / L1210) as a control. After incubation on ice and washing, 10 μg / ml of mouse anti-FLAG antibody (Sigma) was added and then the cells were incubated and washed. FITC-labeled anti-mouse IgG antibody (Becton Dickinson) was added and the cells were again incubated and washed. Then, the fluorescence intensity was measured using a FACScan instrument (Becton Dickinson).
Поскольку очищенный димер MABL2-scFv <HL-5> и очищенный sc(Fv)2 специфически связывались с клетками hIAP/L1210, было подтверждено, что димер scFv <HL-5> и sc(Fv)2 обладают высоким сродством к IAP человека (см. фиг.42).Since the purified MABL2-scFv <HL-5> dimer and purified sc (Fv) 2 specifically bind to hIAP / L1210 cells, it was confirmed that the scFv <HL-5> dimer and sc (Fv) 2 have a high affinity for human IAP ( see Fig. 42).
6.11 Апоптоз-индуцирующая активность очищенного димера scFv <HL-5> и sc(Fv)2 in vitro6.11 Apoptosis inducing activity of purified scFv <HL-5> dimer and sc (Fv) 2 in vitro
Апоптоз-индуцирующее действие очищенного димера MABL2-scFv <HL-5> и очищенного sc(Fv)2 испытывали по окрашиванию Аннексином-V (Boehringer Mannheim) с использованием клеток L1210 (hIAP/L1210), в которые был введен ген IAP человека, и клеток клеточной линии лейкоза человека CCRF-CEM.The apoptosis inducing effect of the purified MABL2-scFv <HL-5> dimer and purified sc (Fv) 2 was tested by staining with Annexin-V (Boehringer Mannheim) using L1210 cells (hIAP / L1210) into which the human IAP gene was introduced, and human leukemia cell line cells CCRF-CEM.
Различные концентрации очищенного димера MABL2-scFv <HL-5>, очищенного MABL2-sc(Fv)2, антитела MABL-2 в качестве положительного контроля или мышиного IgG в качестве отрицательного контроля добавляли к 5×104 клеток клеточной линии hIAP/L1210 или 1×105 клеток клеточной линии CCRF-CEM. После культивирования в течение 24 часов проводили окрашивание Аннексином-V и интенсивность флуоресценции измеряли с использованием прибора FACScan (Becton Dickinson). В результате димер MABL2-scFv <HL-5> и MABL2-sc(Fv)2 в сильной степени индуцировали гибель клеток hIAP/L1210 и CCRF-CEM зависимым от концентрации образом (см. фиг.43). В результате было показано, что димер MABL2-scFv <HL-5> и MABL2-sc(Fv)2 с лучшей эффективностью индуцировали апоптоз в сравнении с исходным антителом MABL-2.Various concentrations of purified MABL2-scFv <HL-5> dimer, purified MABL2-sc (Fv) 2 , MABL-2 antibodies as a positive control or mouse IgG as a negative control were added to 5 × 10 4 cells of the hIAP / L1210 cell line or 1 × 10 5 cells of the cell line CCRF-CEM. After culturing for 24 hours, annexin-V staining was performed and the fluorescence intensity was measured using a FACScan instrument (Becton Dickinson). As a result, the dimer MABL2-scFv <HL-5> and MABL2-sc (Fv) 2 strongly induced the death of hIAP / L1210 and CCRF-CEM cells in a concentration-dependent manner (see FIG. 43). As a result, it was shown that the dimer MABL2-scFv <HL-5> and MABL2-sc (Fv) 2 induced apoptosis with better efficiency compared to the original antibody MABL-2.
6.12 Тест гемагглютинации с использованием очищенных димера scFv <HL-5> и sc(Fv)2 6.12 Hemagglutination test using purified scFv <HL-5> and sc (Fv) 2 dimers
Тест гемагглютинации проводили с использованием различных концентраций очищенного димера scFv <HL-5> и очищенного sc(Fv)2 в соответствии с примером 5.15.A hemagglutination test was carried out using various concentrations of purified scFv dimer <HL-5> and purified sc (Fv) 2 in accordance with Example 5.15.
Гемагглютинацию наблюдали с антителом MABL-2 в качестве положительного контроля, тогда как гемагглютинацию не наблюдали как с одноцепочечным антителом MABL2-sc(Fv)2, так и с MABL2-scFv <HL-5>. Кроме того, не было существенного различия в гемагглютинации между двумя буферами, используемыми с антителом MABL-2. Эти результаты показаны в Таблице 3.Hemagglutination was observed with the MABL-2 antibody as a positive control, while hemagglutination was not observed with either the single-chain MABL2-sc (Fv) 2 antibody or MABL2-scFv <HL-5>. In addition, there was no significant difference in hemagglutination between the two buffers used with the MABL-2 antibody. These results are shown in Table 3.
Тест гемагглютинации Разбавитель: PBS (мкг/мл)Table 3
Hemagglutination Test Thinner: PBS (μg / ml)
6.13 Противоопухолевое действие очищенных димера scFv <HL-5> и sc(Fv)2 на мышиной модели миеломы человека6.13 Antitumor effect of purified scFv <HL-5> and sc (Fv) 2 dimers in a mouse model of human myeloma
Противоопухолевые эффекты тестировали для димера scFv <HL-5> и sc(Fv)2, полученных и очищенных в примерах 6.8 и 6.9. Тест проводили с использованием мышиной модели миеломы человека, полученной в примере 5.1, путем определения количества М-белка, продуцируемого клетками миеломы человека, в мышиной сыворотке при помощи ELISA и изучения времени выживания мышей. Затем противоопухолевые эффекты димера scFv <HL-5> и sc(Fv)2 оценивали по изменению количества М-белка в мышиной сыворотке и времени выживания мышей.The antitumor effects were tested for the dimer scFv <HL-5> and sc (Fv) 2 , obtained and purified in examples 6.8 and 6.9. The test was performed using the mouse model of human myeloma obtained in Example 5.1, by determining the amount of M protein produced by human myeloma cells in mouse serum using ELISA and studying the survival time of mice. Then, the antitumor effects of scFv <HL-5> and sc (Fv) 2 dimer were evaluated by changing the amount of M protein in mouse serum and the survival time of mice.
В этом тесте HL-5 и sc(Fv)2 использовали в виде раствора с концентрацией 0,01, 0,1 или 1 мг/мл в растворителе, содержащем 150 мМ NaCl, 0,02% Твин и 20 мМ ацетатный буфер, рН 6,0, и вводили мышам в дозе 0,1, 1 или 10 мг/кг. Контрольной группе мышей вводили только растворитель.In this test, HL-5 and sc (Fv) 2 were used as a solution with a concentration of 0.01, 0.1 or 1 mg / ml in a solvent containing 150 mM NaCl, 0.02% Tween and 20 mM acetate buffer, pH 6.0, and was administered to mice at a dose of 0.1, 1 or 10 mg / kg. The control group of mice was administered only solvent.
Сыворотку мышей собирали спустя 26 дней после трансплантации миеломных клеток человека и количество М-белка в сыворотке измеряли при помощи ELISA в соответствии с примером 5.14. В результате количество М-белка в сыворотке обеих групп мышей, которым вводили HL-5, димер и sc(Fv)2, уменьшалось зависимым от дозы образом (см. фиг.44). Кроме того, наблюдали значительное удлинение времени выживания в обеих группах, которым вводили HL-5 (фиг.45) и sc(Fv)2 (фиг.46), в сравнении с контрольной группой, которой вводили растворитель. Эти результаты показывают, что HL-5 и sc(Fv)2 данного изобретения проявляют превосходное противоопухолевое действие in vivo.Mouse serum was collected 26 days after transplantation of human myeloma cells and the amount of M protein in serum was measured by ELISA in accordance with Example 5.14. As a result, the amount of M protein in the serum of both groups of mice injected with HL-5, dimer, and sc (Fv) 2 decreased in a dose-dependent manner (see FIG. 44). In addition, a significant lengthening of the survival time was observed in both groups that were injected with HL-5 (Fig. 45) and sc (Fv) 2 (Fig. 46), in comparison with the control group, which was administered with a solvent. These results show that the HL-5 and sc (Fv) 2 of this invention exhibit excellent in vivo antitumor activity.
Пример 7Example 7
Одноцепочечный Fv, содержащий V-область Н-цепи и V-область L-цепи человеческого антитела 12В5 против MPL человекаSingle chain Fv containing the V region of the H chain and the V region of the L chain of human anti-human MPL antibody 12B5
ДНК, кодирующую V-области человеческого моноклонального антитела 12В5 против MPL человека, конструировали следующим образом:DNA encoding the V region of the human monoclonal antibody 12B5 against human MPL was constructed as follows:
7.1 Конструирование гена, кодирующего V-область Н-цепи 12В57.1 Construction of a gene encoding the V region of the H-chain 12V
Ген, кодирующий V-область Н-цепи человеческого антитела12В5, связывающегося с MPL человека, конструировали присоединением нуклеотидной последовательности этого гена (SEQ ID NO 55) по 5'-концу к лидерной последовательности (SEQ ID NO 56), происходящей из гена человеческого антитела (Eur. J. Immunol. 1996; 26: 63-69). Сконструированную нуклеотидную последовательность разделяли на четыре олигонуклеотида, имеющих перекрывающиеся последовательности из 15 п.о. каждый (12B5VH-1, 12B5VH-2, 12B5VH-3, 12B5VH-4). 12B5VH-1 (SEQ ID NO 57) и 12B5VH-3 (SEQ ID NO 59) синтезировали в смысловой ориентации, а 12B5VH-2 (SEQ ID NO 58) и 12B5VH-4 (SEQ ID NO 60) - в антисмысловой ориентации, соответственно. После сборки синтезированных олигонуклеотидов на основе взаимной комплементарности, добавляли внешние праймеры 12B5VH-S и 12B5VH-A) для амплификации полноразмерного гена. 12B5VH-S (SEQ ID NO 61) конструировали так, чтобы он как прямой праймер гибридизовался с 5'-концом лидерной последовательности и содержал сайт узнавания рестриктазы HindIII и последовательность Козака, а 12B5VH-A (SEQ ID NO 62) конструировали так, чтобы он как обратный праймер гибридизовался с нуклеотидной последовательностью, кодирующей С-конец V-области Н-цепи, и содержал донорный сайт сплайсинга и сайт узнавания рестриктазы BamHI, соответственно.A gene encoding the V region of the H chain of a human 12B5 antibody binding to human MPL was constructed by attaching the nucleotide sequence of this gene (SEQ ID NO 55) at the 5'-end to the leader sequence (SEQ ID NO 56) derived from the human antibody gene ( Eur. J. Immunol. 1996; 26: 63-69). The constructed nucleotide sequence was divided into four oligonucleotides having overlapping 15 bp sequences. each (12B5VH-1, 12B5VH-2, 12B5VH-3, 12B5VH-4). 12B5VH-1 (SEQ ID NO 57) and 12B5VH-3 (SEQ ID NO 59) were synthesized in the sense orientation, and 12B5VH-2 (SEQ ID NO 58) and 12B5VH-4 (SEQ ID NO 60) in the antisense orientation, respectively . After assembly of the synthesized oligonucleotides based on mutual complementarity, external primers 12B5VH-S and 12B5VH-A) were added to amplify the full-sized gene. 12B5VH-S (SEQ ID NO 61) was designed so that it, as a direct primer, hybridized to the 5'-end of the leader sequence and contained the HindIII restriction enzyme recognition site and Kozak sequence, and 12B5VH-A (SEQ ID NO 62) was designed so that it how the reverse primer hybridized to the nucleotide sequence encoding the C-terminus of the V region of the H chain and contained a donor splicing site and a BamHI restriction enzyme recognition site, respectively.
100 мкл ПЦР-раствора, содержащего 10 мкл 10-кратного ПЦР-буфера Gold II, 1,5 мМ MgCl2, 0,08 мМ dNTP (dATP, dGTP, dCTP и dTTP), 5 единиц ДНК-полимеразы AmpliTaq Gold (все от Perkin Elmer) и по 2,5 пмоль каждого из синтезированных олигонуклеотидов 12B5VH-1 - 4), нагревали при начальной температуре 94°С в течение 9 минут, при 94°С в течение 2 минут, при 55°С в течение 2 минут и при 72°С в течение 2 минут. После повторения этого цикла два раза добавляли 100 пмоль внешних праймеров 12B5VH-S и 12B5VH-A. Смесь подвергали 35 циклам, состоящим из нагревания при 94°С в течение 30 секунд, при 55°С в течение 30 секунд и 72°С в течение 1 минуты, и нагревали при 72°С в течение дополнительных 5 минут.100 μl of a PCR solution containing 10 μl of a 10-fold Gold II PCR buffer, 1.5 mM MgCl 2 , 0.08 mm dNTP (dATP, dGTP, dCTP and dTTP), 5 units of AmpliTaq Gold DNA polymerase (all from Perkin Elmer) and 2.5 pmol of each of the synthesized oligonucleotides 12B5VH-1-4) were heated at an initial temperature of 94 ° C for 9 minutes, at 94 ° C for 2 minutes, at 55 ° C for 2 minutes, and at 72 ° C for 2 minutes. After repeating this cycle, 100 pmol of external primers 12B5VH-S and 12B5VH-A were added twice. The mixture was subjected to 35 cycles of heating at 94 ° C for 30 seconds, at 55 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 1 minute, and heated at 72 ° C for an additional 5 minutes.
ПЦР-продукт очищали с использованием 1,5% геля легкоплавкой агарозы (Sigma), расщепляли рестриктазами BamHI и HindIII и клонировали в экспрессионный вектор HEF-gγ1 для Н-цепи человека. После определения последовательности ДНК плазмида, содержащая правильную ДНК-последовательность, была обозначена как HEF-12B5H-gγ1.The PCR product was purified using a 1.5% gel of low-melting agarose (Sigma) gel, digested with restriction enzymes BamHI and HindIII and cloned into the expression vector HEF-gγ1 for the human H chain. After determining the DNA sequence, a plasmid containing the correct DNA sequence was designated as HEF-12B5H-gγ1.
HEF-12B5H-gγ1 расщепляли рестриктазами EcoRI и BamHI с получением гена, кодирующего 12B5VH, который затем клонировали в экспрессионный вектор pCOS-Fd для Fab Н-цепи человека с получением pFd-12B5H. Экспрессионный вектор для Fab Н-цепи человека конструировали путем амплификациии ДНК (SEQ ID NO 63), содержащей участок интрона, находящийся между генами, кодирующими V-область Н-цепи и константную область антитела человека, и ген, кодирующий часть константной области Н-цепи человека, при помощи ПЦР и встраивания этого ПЦР-продукта в экспрессионный вектор для клеток животных pCOS1. Константную область Н-цепи человека амплифицировали для этого гена в условиях, описанных выше, с использованием в качестве матрицы HEF-gγ1, в качестве прямого праймера G1CH1-S (SEQ ID NO 64), который конструировали так, чтобы он гибридизовался с 5'-концевой последовательностью интрона 1 и содержал сайт узнавания рестриктаз EcoRI и BamHI, и в качестве обратного праймера G1CH1-A (SEQ ID NO 65), который конструировали таким образом, чтобы он гибридизовался с 3'-концом ДНК домена CHl константной области Н-цепи человека и содержал последовательность, кодирующую часть шарнирной области, два стоп-кодона и сайт узнавания рестриктазы BglII.HEF-12B5H-gγ1 was digested with restriction enzymes EcoRI and BamHI to give a gene encoding 12B5VH, which was then cloned into the pCOS-Fd expression vector for the human Fab N chain to give pFd-12B5H. An expression vector for the human H chain Fab was constructed by amplification of DNA (SEQ ID NO 63) containing an intron portion between genes encoding the H chain V region and the constant region of a human antibody, and a gene encoding a portion of the H chain constant region human, using PCR and embedding this PCR product in the expression vector for animal cells pCOS1. The constant region of the human H chain was amplified for this gene under the conditions described above, using HEF-gγ1 as the template, as the direct primer G1CH1-S (SEQ ID NO 64), which was designed to hybridize with 5'- the end sequence of
Нуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность реконструированной вариабельной области Н-цепи 12В5, которая была встроена в плазмиды HEF-12B5H-gγ1 и pFd-12B5H, показаны в SEQ ID NO 66.The nucleotide sequence and amino acid sequence of the reconstituted variable region of the 12B5 H chain that was inserted into the plasmids HEF-12B5H-gγ1 and pFd-12B5H are shown in
7.2 Конструирование гена, кодирующего V-область L-цепи 12В57.2 Construction of the gene encoding the V region of the L-chain 12V
Ген, кодирующий V-область L-цепи человеческого антитела 12В5, связывающегося с MPL человека, конструировали присоединением нуклеотидной последовательности этого гена (SEQ ID NO 67) по 5'-концу к лидерной последовательности (SEQ ID NO 68), происходящей из гена человеческого антитела 3D6 (Nuc. Acid Res. 1990; 18: 4927). Таким же образом, как описано выше, эту сконструированную нуклеотидную последовательность разделяли на четыре олигонуклеотида, имеющих перекрывающиеся последовательности из 15 п.о. каждый (12B5VL-1, 12B5VL-2, 12B5VL-3, 12B5VL-4), и синтезировали соответственно. 12B5VL-1 (SEQ ID NO 69) и 12B5VL-3 (SEQ ID NO 71) имели смысловую ориентацию, а 12B5VL-2 (SEQ ID NO 70) и 12B5VL-4 (SEQ ID NO 72) имели антисмысловую ориентацию, соответственно. Синтезированные олигонуклеотиды состыковывали на основе взаимной комплементарности и смешивали с внешними праймерами 12B5VL-S и 12B5VL-A) для амплификации полноразмерного гена. 12B5VL-S (SEQ ID NO 73) конструировали так, чтобы он как прямой праймер гибридизовался с 5'-концом лидерной последовательности и содержал сайт узнавания рестриктазы HindIII и последовательность Козака. 12B5VL-A (SEQ ID NO 74) конструировали так, чтобы он как обратный праймер гибридизовался с нуклеотидной последовательностью, кодирующей С-конец V-области L-цепи, и содержал донорный сайт сплайсинга и сайт узнавания рестриктазы BamHI.A gene encoding the V region of the L chain of the human 12B5 antibody binding to human MPL was constructed by attaching the nucleotide sequence of this gene (SEQ ID NO 67) at the 5'-end to the leader sequence (SEQ ID NO 68) derived from the human antibody gene 3D6 (Nuc. Acid Res. 1990; 18: 4927). In the same manner as described above, this engineered nucleotide sequence was divided into four oligonucleotides having 15 bp overlapping sequences. each (12B5VL-1, 12B5VL-2, 12B5VL-3, 12B5VL-4), and were synthesized, respectively. 12B5VL-1 (SEQ ID NO 69) and 12B5VL-3 (SEQ ID NO 71) had a sense orientation, and 12B5VL-2 (SEQ ID NO 70) and 12B5VL-4 (SEQ ID NO 72) had an antisense orientation, respectively. The synthesized oligonucleotides were docked on the basis of mutual complementarity and mixed with external primers 12B5VL-S and 12B5VL-A) for amplification of the full-sized gene. 12B5VL-S (SEQ ID NO 73) was designed to hybridize as a direct primer to the 5'-end of the leader sequence and contain the HindIII restriction enzyme recognition site and the Kozak sequence. 12B5VL-A (SEQ ID NO 74) was designed to hybridize with the reverse primer to the nucleotide sequence encoding the C-terminus of the V region of the L chain and contain a splicing donor site and a BamHI restriction enzyme recognition site.
После проведения ПЦР, как описано выше, ПЦР-продукт очищали с использованием 1,5% геля легкоплавкой агарозы (Sigma), расщепляли рестриктазами BamHI и HindIII и клонировали в экспрессионный вектор HEF-gκ для L-цепи человека. После определения последовательности ДНК плазмида, содержащая правильную ДНК-последовательность, была обозначена как HEF-12B5L-gκ. Нуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность реконструированной V-области L-цепи 12В5, которая была встроена в плазмиду HEF-12B5L-gκ, показаны в SEQ ID NO 75.After PCR, as described above, the PCR product was purified using a 1.5% gel of low melting agarose (Sigma), digested with restriction enzymes BamHI and HindIII and cloned into the human L-chain expression vector HEF-gκ. After determining the DNA sequence, a plasmid containing the correct DNA sequence was designated as HEF-12B5L-gκ. The nucleotide sequence and amino acid sequence of the reconstructed V region of the 12B5 L chain, which was inserted into the HEF-12B5L-gκ plasmid, are shown in
7.3 Получение реконструированного одноцепочечного Fv 12B5 (scFv)7.3 Preparation of Reconstructed Single Chain Fv 12B5 (scFv)
Реконструированный одноцепочечный Fv антитела 12B5 конструировали так, чтобы он имел структуру 12В5VН-линкер-12В5VL и содержал FLAG-последовательность (SEQ ID NO 76) на С-конце для облегчения детекции и очистки. Реконструированный одноцепочечный Fv 12B5 (sc12B5) конструировали с использованием линкерной последовательности, состоящей из 15 аминокислот, представленной (Gly4Ser)3.The reconstructed 12B5 single chain Fv antibodies were designed to have a 12B5VH-linker-12B5VL structure and contain a FLAG sequence (SEQ ID NO 76) at the C-terminus for ease of detection and purification. The reconstructed single chain Fv 12B5 (sc12B5) was constructed using the linker sequence consisting of 15 amino acids represented by (Gly 4 Ser) 3 .
(1) Получение реконструированного одноцепочечного Fv 12B5 с использованием линкерной последовательности, состоящей из 15 аминокислот(1) Obtaining a reconstructed single chain Fv 12B5 using a linker sequence of 15 amino acids
Ген, кодирующий реконструированный одноцепочечный Fv антитела 12B5, который содержал линкерную последовательность, состоящую из 15 аминокислот, конструировали соединением V-области Н-цепи 12B5, линкерного участка и V-области L-цепи 12B5, с амплификацией этого продукта при помощи ПЦР, соответственно. Этот способ изображен схематически на фиг.47. Для получения этого реконструированного одноцепочечного Fv 12B5 использовали шесть праймеров (A-F). Праймеры А, С и Е имели смысловые последовательности, а праймеры В, D и F имели антисмысловые последовательности.The gene encoding the reconstructed single chain Fv of antibody 12B5, which contained a linker sequence of 15 amino acids, was constructed by connecting the V region of the 12B5 H chain, the linker region and the V region of the 12B5 L chain, amplifying this product by PCR, respectively. This method is depicted schematically in FIG. Six primers (A-F) were used to obtain this reconstructed single chain Fv 12B5. Primers A, C, and E had sense sequences, and primers B, D, and F had antisense sequences.
Прямой праймер 12B5-S (Праймер A, SEQ ID NO 77) для V-области Н-цепи конструировали так, чтобы он гибридизовался с 5'-концом лидерной последовательности Н-цепи и содержал сайт узнавания рестриктазы EcoRI. Обратный праймер HuVHJ3 (Праймер В, SEQ ID NO 78) для V-области Н-цепи конструировали так, чтобы он гибридизовался с ДНК, кодирующей С-конец V-области Н-цепи.Direct primer 12B5-S (Primer A, SEQ ID NO 77) for the V region of the H chain was designed to hybridize to the 5'-end of the H chain leader sequence and contain the EcoRI restriction enzyme recognition site. The HuVHJ3 reverse primer (Primer B, SEQ ID NO 78) for the V region of the H chain was designed to hybridize with DNA encoding the C-terminus of the V region of the H chain.
Прямой праймер RHuJH3 (Праймер С, SEQ ID NO 79) для линкера конструировали так, чтобы он гибридизовался с ДНК, кодирующей N-конец линкера, и перекрывался с ДНК, кодирующей С-конец V-области Н-цепи. Обратный праймер RHuVK1 (Праймер D, SEQ ID NO 80) для линкера конструировали так, чтобы он гибридизовался с ДНК, кодирующей С-конец линкера, и перекрывался с ДНК, кодирующей N-конец V-области L-цепи.The RHuJH3 direct primer (Primer C, SEQ ID NO 79) for the linker was designed to hybridize with DNA encoding the N-terminus of the linker and overlap with DNA encoding the C-terminus of the V region of the H chain. The reverse primer RHuVK1 (Primer D, SEQ ID NO 80) for the linker was designed to hybridize with DNA encoding the C-terminus of the linker and overlap with DNA encoding the N-terminus of the V region of the L chain.
Прямой праймер HuVK-1.2 (Праймер Е, SEQ ID NO 81) для V-области L-цепи конструировали так, чтобы он гибридизовался с ДНК, кодирующей N-конец V-области L-цепи. Обратный праймер 12B5F-A для V-области L-цепи (Праймер F, SEQ ID NO 82) конструировали так, чтобы он гибридизовался с ДНК, кодирующей С-конец V-области L-цепи, и содержал последовательность, кодирующую пептид FLAG (Hopp N.P. et al., Bio/Technology, 6, 1204-1210, 1988), два транскрипционных стоп-кодона и сайт узнавания рестриктазы NotI.The HuVK-1.2 forward primer (Primer E, SEQ ID NO 81) for the V region of the L chain was designed to hybridize with DNA encoding the N terminus of the V region of the L chain. The reverse primer 12B5F-A for the V region of the L chain (Primer F, SEQ ID NO 82) was designed to hybridize with DNA encoding the C-terminus of the V region of the L chain and contain a sequence encoding a FLAG peptide (Hopp NP et al., Bio / Technology, 6, 1204-1210, 1988), two transcriptional stop codons and a NotI restriction enzyme recognition site.
На первой стадии ПЦР проводили три реакции А-В, C-D и E-F, и три ПЦР-продукта, полученные на первой стадии ПЦР, состыковывали на основе взаимной комплементарности. После добавления праймеров А и F амплифицировали полноразмерную ДНК, кодирующую реконструированный одноцепочечный Fv 12B5, содержащий линкер, состоящий из 15 аминокислот (вторая ПЦР). В ПЦР первой стадии в качестве матриц использовали плазмиду HEF-12B5H-gγ1 (см. пример 7.1), кодирующую реконструированную V-область Н-цепи 12B5, pSCFVT-hM21 (гуманизированное антитело ONS-M21) (Ohtomo et al., Anticancer Res. 18 (1998), 4311-4316), содержащую ДНК (SEQ ID NO 83), кодирующую линкерный участок, состоящий из Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser (Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5879-5883, 1988), и плазмиду HEF-12B5L-gκ (см. пример 7.2), кодирующую реконструированную V-область L-цепи 12B5, соответственно.In the first PCR step, three AB, C-D, and E-F reactions were performed, and the three PCR products obtained in the first PCR step were docked based on mutual complementarity. After the addition of primers A and F, the full-length DNA encoding the reconstructed single-stranded Fv 12B5 containing a linker consisting of 15 amino acids was amplified (second PCR). In the first-stage PCR, the plasmid HEF-12B5H-gγ1 (see Example 7.1) encoding the reconstructed V region of the 12B5 H chain, pSCFVT-hM21 (ONS-M21 humanized antibody) (Ohtomo et al., Anticancer Res. 18 (1998), 4311-4316) containing DNA (SEQ ID NO 83) encoding a linker region consisting of Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser (Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5879-5883, 1988), and the plasmid HEF-12B5L-gκ (see Example 7.2) encoding the reconstructed V region of the 12B5 L chain, respectively.
50 мкг ПЦР-раствора для первой стадии ПЦР содержали 5 мкл 10-кратного ПЦР-буфера Gold II, 1,5 мМ MgCl2, 0,08 мМ dNTP, 5 единиц ДНК-полимеразы AmpliTaq Gold (все от Perkin Elmer), no 100 пмоль каждого праймера и 100 нг каждой ДНК-матрицы. ПЦР-раствор нагревали при начальной температуре 94°С в течение 9 минут, затем при 94°С в течение 30 секунд, при 55°С в течение 30 секунд и при 72°С в течение 1 минуты. После повторения этого цикла 35 раз реакционную смесь дополнительно нагревали при 72°С в течение 7 минут.50 μg of the PCR solution for the first PCR stage contained 5 μl of 10-fold Gold II PCR buffer, 1.5 mM MgCl 2 , 0.08 mM dNTP, 5 units of AmpliTaq Gold DNA polymerase (all from Perkin Elmer), No. 100 pmol of each primer and 100 ng of each DNA template. The PCR solution was heated at an initial temperature of 94 ° C for 9 minutes, then at 94 ° C for 30 seconds, at 55 ° C for 30 seconds, and at 72 ° C for 1 minute. After repeating this cycle 35 times, the reaction mixture was further heated at 72 ° C. for 7 minutes.
ПЦР-продукты А-В, C-D и E-F состыковывали при помощи второй ПЦР. Раствор ПЦР-смеси для второй стадии в объеме 98 мкл, содержащий в качестве матрицы 1 мкл ПЦР-продукта А-В первой стадии, 0,5 мкл ПЦР-продукта C-D и 1 мкл ПЦР-продукта C-D и 1 мкл ПЦР-продукта E-F, 10 мкл 10-кратного ПЦР-буфера Gold II, 1,5 мМ MgCl2, 0,08 мМ dNTP, 5 единиц ДНК-полимеразы AmpliTaq Gold (все от Perkin Elmer), нагревали при начальной температуре 94°С в течение 9 минут, затем при 94°С в течение 2 минут, при 65°С в течение 2 минут и при 72°С в течение 2 минут.После повторения этого цикла два раза добавляли по 100 пмоль каждого из праймеров А и F. После повторения цикла, состоящего из нагревания при 94°С в течение 30 секунд, при 55°С в течение 30 секунд и при 72°С в течение 1 минуты, 35 раз реакционную смесь нагревали при 72°С в течение 5 минут.PCR products AB, CD and EF were docked using the second PCR. A solution of the PCR mixture for the second stage in a volume of 98 μl, containing as a
ДНК-фрагменты, полученные в результате второй ПЦР, очищали с использованием 1,5% геля легкоплавкой агарозы, расщепляли EcoRI и NotI и клонировали в вектор рСНО1 и вектор pCOS1 (Патентная заявка Японии №8-255196). Экспрессионный вектор pCHO1 представлял собой вектор, полученный делецией гена антитела из DHFR-ΔE-rv-PM1-f (см. WO 92/19759) в результате расщепления EcoRI и SmaI и присоединением EcoRI-NotI-BamHI-адаптора (Takara Shuzo). После определения последовательности ДНК плазмиды, содержащие ДНК-фрагмент, кодирующий правильную аминокислотную последовательность реконструированного одноцепочечного Fv 12B5, были обозначены как pCHO-sc12B5 и pCOS-sc12B5. Нуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность реконструированного одноцепочечного Fv антитела 12B5, включенного в плазмиды pCHO-sc12B5 и pCOS-sc12B5, показаны в SEQ ID NO 84.The DNA fragments obtained by the second PCR were purified using a 1.5% low-melting agarose gel, digested with EcoRI and NotI, and cloned into the pCHO1 vector and pCOS1 vector (Japan Patent Application No. 8-255196). The expression vector pCHO1 was a vector obtained by deletion of the antibody gene from DHFR-ΔE-rv-PM1-f (see WO 92/19759) by digestion of EcoRI and SmaI and attachment of an EcoRI-NotI-BamHI adapter (Takara Shuzo). After determining the DNA sequence, plasmids containing the DNA fragment encoding the correct amino acid sequence of the reconstructed single chain Fv 12B5 were designated pCHO-sc12B5 and pCOS-sc12B5. The nucleotide sequence and amino acid sequence of the reconstructed single chain Fv antibody 12B5 included in the plasmids pCHO-sc12B5 and pCOS-sc12B5 are shown in SEQ ID NO 84.
7.4 Экспрессия антитела 12B5 (IgG, Fab) и одноцепочечного полипептида Fv клеткой животного7.4 Expression of 12B5 Antibody (IgG, Fab) and Single Chain Fv Polypeptide by Animal Cell
Антитело 12B5 (IgG, Fab) и одноцепочечный Fv, полученный из антитела 12B5, экспрессировали с использованием клеток COS7 или клеток СНО.Antibody 12B5 (IgG, Fab) and single chain Fv derived from antibody 12B5 were expressed using COS7 cells or CHO cells.
Временную экспрессию с использованием клеток COS7 осуществляли следующим образом. Трансфекцию проводили способом электропорации с применением устройства Gene Pulser (BioRad). Для экспрессии антитела 12В5 (IgG) добавляли по 10 мкг вышеупомянутых экспрессионных векторов HEF-12B5H-gγ1 и HEF-12B5L-gκ, для экспрессии 12В5 Fab-фрагмента добавляли по 10 мкг pFd-12B5H и HEF-12B5L-gκ и для экспрессии одноцепочечного Fv 10 мкг pCOS-sc12B5 добавляли к клеткам COS7 (1×107 клеткам/мл), суспендированным в 0,8 мл PBS. Смесь, находящуюся в кювете, обрабатывали импульсом 1,5 кВ, при электрической емкости 25 мкФ. После "восстановления" в течение 10 минут при комнатной температуре электропорированные клетки добавляли в культуральную среду DMEM (Gibco BRL), содержащую 10% фетальную телячью сыворотку, и культивировали. После культивирования в течение ночи клетки промывали один раз PBS, добавляли в бессывороточную среду CHO-S-SFM II и культивировали в течение 2 дней. Культуральную среду центрифугировали для удаления клеточного дебриса (остатков клеток) и фильтровали через фильтр с размером пор 0,22 мкм для получения культурального супернатанта.Temporary expression using COS7 cells was carried out as follows. Transfection was performed by electroporation using a Gene Pulser device (BioRad). For the expression of 12B5 antibody (IgG), 10 μg of the aforementioned HEF-12B5H-gγ1 and HEF-12B5L-gκ expression vectors were added; for the expression of the 12B5 Fab fragment, 10 μg of pFd-12B5H and HEF-12B5L-gκ were added for the expression of single-
Для получения клеточной линии СНО, стабильно экспрессирующей одноцепочечный Fv (полипептид), происходящий из антитела 12В5, экспрессионный вектор pCHO-sc12B5 вводили в клетки СНО следующим образом.To obtain a CHO cell line stably expressing a single chain Fv (polypeptide) derived from 12B5 antibody, the pCHO-sc12B5 expression vector was introduced into CHO cells as follows.
Экспрессионный вектор вводили в клетки СНО электропорацией с использованием прибора Gene Pulser (BioRad). Линеаризованную ДНК (100 мкг), полученную расщеплением рестриктазой Pvul, и клетки СНО (1×107 клеток/мл), суспендированные в 0,8 мл PBS, смешивали в кювете, оставляли без перемешивания на льду на 10 минут и обрабатывали импульсом 1,5 кВ, при электрической емкости 25 мкФ. После "восстановления" в течение 10 минут при комнатной температуре электропорированные клетки добавляли в среду CHO-S-SFM II (Gibco BRL), содержащую 10% фетальную телячью сыворотку, и культивировали. После культивирования в течение 2 дней культивирование продолжали в CHO-S-SFM II (Gibco BRL), содержащей 5 нМ метотрексат (Sigma) и 10% фетальную телячью сыворотку. Из полученных таким образом клонов отбирали клон с высокой скоростью экспрессии в качестве клеточной линии-продуцента одноцепочечного Fv 12B5. После культивирования в бессывороточной среде CHO-S-SFM II (Gibco BRL), содержащей 5 нМ метотрексат (Sigma), получали культуральный супернатант центрифугированием для отделения клеточного дебриса.The expression vector was introduced into CHO cells by electroporation using a Gene Pulser instrument (BioRad). Linearized DNA (100 μg) obtained by digestion with Pvul restrictase and CHO cells (1 × 10 7 cells / ml) suspended in 0.8 ml of PBS were mixed in a cuvette, left without stirring on ice for 10 minutes and treated with
7.5 Очистка одноцепочечного Fv, происходящего из 12B5, продуцируемого клетками СНО7.5 Purification of single chain Fv originating from 12B5 produced by CHO cells
Культуральный супернатант клеточной линии СНО, экспрессирующей одноцепочечный Fv 12B5, полученный в 7.4, очищали с использованием колонки с анти-FLAG-антителом и гель-фильтрационной колонки.The culture supernatant of the CHO cell line expressing single chain Fv 12B5 obtained in 7.4 was purified using an anti-FLAG antibody column and a gel filtration column.
(1) Колонка с анти-FLAG-антителом(1) Column with anti-FLAG antibody
Культуральный супернатант добавляли к анти-FLAG М2-аффинному гелю (Sigma), уравновешенному PBS. После промывания этой колонки тем же самым буфером белки, адсорбированные на колонке, элюировали 0,1 М глицин-HCl-буфером (рН 3,5). Элюированные фракции незамедлительно нейтрализовали добавлением 1 М буфера Трис-HCl (рН 8,0). Элюированные фракции анализировали электрофорезом в ДСН-ПААГ, и фракцию, которая, как было подтверждено, содержала одноцепочечный Fv, концентрировали с использованием Centricon-10 (Millipore).The culture supernatant was added to anti-FLAG M2 affinity gel (Sigma) equilibrated with PBS. After washing this column with the same buffer, the proteins adsorbed on the column were eluted with 0.1 M glycine-HCl buffer (pH 3.5). The eluted fractions were immediately neutralized by the addition of 1 M Tris-HCl buffer (pH 8.0). Eluted fractions were analyzed by SDS-PAGE and the fraction that was confirmed to contain single chain Fv was concentrated using Centricon-10 (Millipore).
(2) Гель-фильтрация(2) Gel Filtration
Концентрированный раствор, полученный в (1), наносили на колонку Superdex 200 (10×300 мм, Amersham Pharmacia), уравновешенную PBS, содержащим 0,01% Твин 20. Продукт sc12B5 элюировался в виде двух пиков (А, В) (см. фиг.48). Фракции А и В анализировали при помощи электрофореза в 14% ДСН-полиакриламидном геле. Электрофорез образцов проводили в присутствии и в отсутствие восстанавливающего агента согласно способу Лэммли и окрашивали Кумасси бриллиантовым синим после электрофореза. Как показано на фиг.49, фракции А и В, независимо от присутствия восстанавливающего агента, давали единственную полосу, имеющую кажущуюся молекулярную массу около 31 кДа. При анализе фракций А и В гель-фильтрацией с использованием Superdex 200 PC 3.2/30 (3,2×300 мм, Amersham Pharmacia), фракция А давала элюированный продукт с кажущейся молекулярной массой около 44 кДа, а фракция В давала продукт с кажущейся молекулярной массой 22 кДа (см. фиг.50а и b). Эти результаты показывают, что фракция А является связанным нековалентно димером одноцепочечного Fv sc12B5, а В является мономером.The concentrated solution obtained in (1) was applied onto a
7.6 Измерение ТРО-подобной агонистической активности различных одноцепочечных Fv7.6 Measurement of TPO-like agonistic activity of various single chain Fv
ТРО-подобную активность анти-MPL-одноцепочечного антитела оценивали путем определения пролиферативного действия на клетки Ba/F3 (BaF/MpI), экспрессирующие ТРО-рецептор человека (MPL). После промывания клеток BaF/MpI два раза культуральной средой RPMI1640 (Gibco), содержащей 10% фетальную телячью сыворотку (Gibco), клетки суспендировали в культуральной среде при плотности клеток 5×105 клеток/мл. Анти-MPL-одноцепочечное антитело и ТРО человека (R & D System) разбавляли этой культуральной средой, соответственно. 50 мкл клеточной суспензии и 50 мкл разведенного антитела или ТРО человека добавляли в 96-луночный планшет (плоскодонный) (Falcon) и культивировали в СО2-инкубаторе (концентрация CO2: 5%) в течение 24 часов. После инкубирования добавляли 10 мкл реагента WST-8 (реагента для определения числа живых клеток SF: Nacalai Tesque) и поглощение немедленно измеряли при длине волны измерения 450 нм и при опорной длине волны 620 нм с использованием флуоресцентно-абсорбционного фотометра SPECTRA Fluor (Tecan). После инкубирования в СО2-инкубаторе (концентрация CO2: 5%) в течение 2 часов оптическую плотность при длине волны измерения 450 нм и опорной длине волны 620 нм опять измеряли при помощи SPECTRA Fluor. Поскольку реагент WST-8 развивал окраску при длине волны 450 нм в зависимости от числа живых клеток, пролиферативную активность BaF/Mp1 на основе изменения оптической плотности через 2 часа оценивали по ED50, рассчитываемой следующим образом. На кривой реакции пролиферации, где оптическую плотность откладывали по оси ординат против концентрации антитела по оси абсцисс, оптическая плотность на плато принималась за 100% скорость реакции. Получив формулу аппроксимации по способу линейной аппроксимации на основе отложенных величин, близких к 50% скорости реакции, рассчитывали концентрацию антител, соответствующую 50% скорости реакции, и принимали ее за ED50.The TPO-like activity of the anti-MPL single chain antibody was evaluated by determining the proliferative effect on Ba / F3 cells (BaF / MpI) expressing human TPO receptor (MPL). After washing the BaF / MpI cells twice with RPMI1640 culture medium (Gibco) containing 10% fetal calf serum (Gibco), the cells were suspended in the culture medium at a cell density of 5 × 10 5 cells / ml. Anti-MPL single chain antibody and human TPO (R & D System) were diluted with this culture medium, respectively. 50 μl of cell suspension and 50 μl of diluted human antibody or TPO were added to a 96-well plate (flat-bottomed) (Falcon) and cultured in a CO 2 incubator (CO 2 concentration: 5%) for 24 hours. After incubation, 10 μl of WST-8 reagent (SF: Nacalai Tesque live cell reagent) was added and absorption was immediately measured at a measurement wavelength of 450 nm and at a reference wavelength of 620 nm using a SPECTRA Fluor (Tecan) fluorescence-absorption photometer. After incubation in a CO 2 incubator (CO 2 concentration: 5%) for 2 hours, the optical density at a measurement wavelength of 450 nm and a reference wavelength of 620 nm was again measured with SPECTRA Fluor. Since the reagent WST-8 developed color at a wavelength of 450 nm depending on the number of living cells, the proliferative activity of BaF / Mp1 based on the change in optical density after 2 hours was evaluated by ED50 calculated as follows. On the proliferation reaction curve, where the optical density was plotted along the ordinate against the concentration of the antibody along the abscissa, the optical density on the plateau was taken as the 100% reaction rate. Having obtained the approximation formula by the linear approximation method on the basis of pending values close to 50% of the reaction rate, the antibody concentration corresponding to 50% of the reaction rate was calculated and taken as ED50.
Результаты агонистической активности в отношении MPL, измеренные с использованием культуральных супернатантов клеток COS7, экспрессирующих различные варианты молекулы антитела 12В5, обнаружили, как иллюстрируется на фиг.51, что антитело 12B5IgG, имеющее бивалентный антигенсвязывающий сайт, увеличивало оптическую плотность зависимым от концентрации образом и имело ТРО-подобную агонистическую активность (ED50; 29 нМ), тогда как агонистическая активность антитела 12B5Fab, имеющего моновалентный антигенсвязывающий сайт, была очень слабой (ED50; 34724 нМ). В противоположность этому, одноцепочечный Fv (sc12D5), имеющий моновалентный антигенсвязывающий сайт, как и Fab, обнаруживал сильную агонистическую активность при величине ED50 75 нМ. Однако было известно, что вариабельные области Н-цепи и L-цепи одноцепочечного Fv связаны через нековалентную связь, и, следовательно, каждая вариабельная область диссоциирована в растворе и может быть ассоциирована с вариабельной областью другой молекулы с образованием мультимеров, таких как димеры. При измерении молекулярной массы sc12B5, очищенного гель-фильтрацией, было подтверждено существование молекул, которые были признаны как мономер и димер (см. фиг.48). Затем выделяли мономер sc12B5 и димер sc12B5 (см. фиг.50) и измеряли их агонистическую активность в отношении MPL. Как показано на фиг.51 и 52, ED50 мономера sc12B5 была 4438,7 нМ, что подтверждало, что агонистическая активность была меньше в сравнении с результатом, полученным с использованием культурального супернатанта клеток COS7. В противоположность этому одноцепочечный Fv (димер sc12B5), имеющий бивалентный антигенсвязывающий сайт, показал приблизительно в 400 раз более сильную агонистическую активность (ED50; 10,1 нМ) в сравнении с моновалентным sc12B5. Кроме того, бивалентный одноцепочечный Fv обнаружил агонистическую активность, эквивалентную или более высокую, чем агонистическая активность ТРО и 12B5IgG человека.The results of agonistic activity against MPL, measured using cultural supernatants of COS7 cells expressing different variants of the 12B5 antibody molecule, found, as illustrated in FIG. 51, that the 12B5IgG antibody having a bivalent antigen binding site increased the optical density in a concentration-dependent manner and had TPO -like agonistic activity (ED50; 29 nM), while the agonistic activity of 12B5Fab antibody having a monovalent antigen-binding site was very weak (ED50; 34724 nM). In contrast, a single chain Fv (sc12D5) having a monovalent antigen binding site, like Fab, showed strong agonistic activity at an ED50 of 75 nM. However, it was known that the variable regions of the H chain and L chain of a single chain Fv are linked via a non-covalent bond, and therefore, each variable region is dissociated in solution and can be associated with the variable region of another molecule to form multimers such as dimers. When measuring the molecular weight of sc12B5 purified by gel filtration, the existence of molecules that were recognized as monomers and dimers was confirmed (see FIG. 48). Then, sc12B5 monomer and sc12B5 dimer (see FIG. 50) were isolated and their agonistic activity against MPL was measured. As shown in FIGS. 51 and 52, the ED50 of sc12B5 monomer was 4438.7 nM, which confirmed that the agonistic activity was less compared to the result obtained using the COS7 cell culture supernatant. In contrast, a single chain Fv (sc12B5 dimer) having a bivalent antigen binding site showed approximately 400 times stronger agonistic activity (ED50; 10.1 nM) compared to monovalent sc12B5. In addition, bivalent single-chain Fv showed agonistic activity equivalent to or higher than the agonistic activity of TPO and human 12B5IgG.
Пример 8Example 8
Конструирование гена, кодирующего вариабельную область человеческого антитела 12Е10 против MPL человекаConstruction of the gene encoding the variable region of the human antibody 12E10 against human MPL
ДНК, кодирующую вариабельную область человеческого моноклонального антитела 12Е10 против MPL человека, конструировали следующим образом.DNA encoding the variable region of the human monoclonal antibody 12E10 against human MPL was constructed as follows.
8.1 Конструирование гена, кодирующего V-область Н-цепи 12Е108.1 Construction of the gene encoding the V region of the H-chain 12E10
Нуклеотидную последовательность SEQ ID NO 86 конструировали как ген, кодирующий V-область Н-цепи человеческого антитела 12Е10, связывающегося с MPL человека, на основе аминокислотной последовательности, описанной в WO 99/10494 (SEQ ID NO 85). Полноразмерную нуклеотидную последовательность конструировали присоединением к ее 5'-концу лидерной последовательности (SEQ ID NO 87), происходящей из гена человеческого антитела (номер доступа GenBank AF062252). Сконструированную нуклеотидную последовательность разделяли на четыре олигонуклеотида, имеющих перекрывающиеся последовательности из 15 п.о. каждая (12E10VH-1, 12E10VH-2, 12E10VH-3, 12E10VH-4). 12E10VH-1 (SEQ ID NO 88) и 12E10VH-3 (SEQ ID NO 90) синтезировали в смысловой ориентации, а 12E10VH-2 (SEQ ID NO 89) и 12E10VH-4 (SEQ ID NO 91) в антисмысловой ориентации, соответственно. После состыковки синтезированных олигонуклеотидов на основе взаимной комплементарности, внешние праймеры 12E10VH-S и 12E10VH-A) добавляли для амплификации полноразмерного гена. 12E10VH-S (SEQ ID NO 92) конструировали так, чтобы он как прямой праймер гибридизовался с 5'-концом лидерной последовательности и содержал сайт узнавания рестриктазы HindIII и последовательность Козака, a 12E10VH-А (SEQ ID NO 93) конструировали так, чтобы он как обратный праймер гибридизовался с нуклеотидной последовательностью, кодирующей С-конец V-области Н-цепи, и содержал донорноый сайт сплайсинга и сайт узнавания рестриктазы BamHI, соответственно.The nucleotide sequence of SEQ ID NO 86 was constructed as a gene encoding the V region of the H chain of the human 12E10 antibody binding to human MPL based on the amino acid sequence described in WO 99/10494 (SEQ ID NO 85). A full-length nucleotide sequence was constructed by attaching to its 5'end of the leader sequence (SEQ ID NO 87) derived from the human antibody gene (GenBank accession number AF062252). The constructed nucleotide sequence was divided into four oligonucleotides having overlapping 15 bp sequences. each (12E10VH-1, 12E10VH-2, 12E10VH-3, 12E10VH-4). 12E10VH-1 (SEQ ID NO 88) and 12E10VH-3 (SEQ ID NO 90) were synthesized in the sense orientation, and 12E10VH-2 (SEQ ID NO 89) and 12E10VH-4 (SEQ ID NO 91) in the antisense orientation, respectively. After docking the synthesized oligonucleotides based on mutual complementarity, external primers 12E10VH-S and 12E10VH-A) were added to amplify the full-sized gene. 12E10VH-S (SEQ ID NO 92) was designed to hybridize with the 5'-end of the leader sequence as a direct primer and contain the HindIII restriction enzyme recognition site and Kozak sequence, and 12E10VH-A (SEQ ID NO 93) was designed to how the reverse primer hybridized with the nucleotide sequence encoding the C-terminus of the V region of the H chain and contained a donor splicing site and a BamHI restriction enzyme recognition site, respectively.
100 мкл ПЦР-раствора, содержащего 10 мкл 10-кратного ПЦР-буфера Gold II, 1,5 мМ MgCl2 0,08 мМ dNTP (dATP, dGTP, dCTP и dTTP), 5 единиц ДНК-полимеразы AmpliTaq Gold (все от Perkin Elmer) и по 2,5 пмоль каждого из синтезированных олигонуклеотидов 12E10VH-1-4), нагревали при начальной температуре 94°С в течение 9 минут, затем при 94°С в течение 2 минут, при 55°С в течение 2 минут и при 72°С в течение 2 минут. После повторения этого цикла два раза добавляли 100 пмоль внешних праймеров 12E10VH-S и 12E10VH-A. Смесь подвергали циклу, состоящему из нагревания при 94°С в течение 30 секунд, при 55°С в течение 30 секунд и 72°С в течение 1 минуты, 35 раз и нагревали при 72°С в течение дополнительных 5 минут.100 μl of a PCR solution containing 10 μl of a 10-fold Gold II PCR buffer, 1.5 mM MgCl 2 0.08 mm dNTP (dATP, dGTP, dCTP and dTTP), 5 units of AmpliTaq Gold DNA polymerase (all from Perkin Elmer) and 2.5 pmol of each of the synthesized oligonucleotides 12E10VH-1-4) were heated at an initial temperature of 94 ° C for 9 minutes, then at 94 ° C for 2 minutes, at 55 ° C for 2 minutes, and at 72 ° C for 2 minutes. After repeating this cycle, 100 pmol of external primers 12E10VH-S and 12E10VH-A were added twice. The mixture was subjected to a cycle consisting of heating at 94 ° C for 30 seconds, at 55 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 1 minute, 35 times and heated at 72 ° C for an additional 5 minutes.
ПЦР-продукт очищали с использованием 1,5% геля легкоплавкой агарозы (Sigma), расщепляли рестриктазами BamHI и HindIII и клонировали в экспрессионный вектор HEF-gγ1 для Н-цепи человека. После определения ДНК-последовательности плазмида, содержащая правильную ДНК-последовательность, была названа HEF-12E10H-gγ1.The PCR product was purified using a 1.5% gel of low-melting agarose (Sigma) gel, digested with restriction enzymes BamHI and HindIII and cloned into the expression vector HEF-gγ1 for the human H chain. After determining the DNA sequence, a plasmid containing the correct DNA sequence was named HEF-12E10H-gγ1.
HEF-12E10H-gγ1 расщепляли рестриктазами EcoRI и BamHI с получением гена, кодирующего 12E10VH, который затем клонировали в экспрессионный вектор pCOS-Fd для Fab Н-цепи человека для получения pFd-12E10H. Экспрессионный вектор для Fab Н-цепи человека конструировали путем амплификации ДНК (SEQ ID NO 63), содержащей участок интрона, находящийся между генами, кодирующими V-область Н-цепи и константную область антитела человека, и ген, кодирующий часть константной области Н-цепи человека, при помощи ПЦР и встраивания этого ПЦР-продукта в экспрессионный вектор для клеток животного pCOS1. Константную область Н-цепи человека амплифицировали для этого гена в условиях, описанных выше, с использованием в качестве матрицы HEF-gγ1, в качестве прямого праймера G1CH1-S (SEQ ID NO 64), который конструировали так, чтобы он гибридизовался с 5'-концевой последовательностью интрона 1 и содержал сайты узнавания рестриктаз EcoRI и BamHI, и в качестве обратного праймера G1CH1-A (SEQ ID NO 65), который конструировали так, чтобы он гибридизовался с 3'-концом ДНК домена СН1 константной области Н-цепи человека и содержал последовательность, кодирующую часть шарнирной области, два стоп-кодона и сайт узнавания рестриктазы BgIII.HEF-12E10H-gγ1 was digested with restriction enzymes EcoRI and BamHI to give a gene encoding 12E10VH, which was then cloned into the pCOS-Fd expression vector for the human Fab H chain to produce pFd-12E10H. An expression vector for a human H chain Fab was constructed by amplification of DNA (SEQ ID NO 63) containing a portion of an intron between genes encoding the V region of the H chain and the constant region of a human antibody, and a gene encoding a portion of the constant region of the H chain human, using PCR and embedding this PCR product in the expression vector for animal cells pCOS1. The constant region of the human H chain was amplified for this gene under the conditions described above, using HEF-gγ1 as the template, as the direct primer G1CH1-S (SEQ ID NO 64), which was designed to hybridize with 5'- the end sequence of
Нуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность реконструированной вариабельной области Н-цепи 12Е10Н, которая была включена в плазмиды HEF-12E10H-gγ1 и pFd-12E10H, показаны в SEQ ID NO 94.The nucleotide sequence and amino acid sequence of the reconstructed variable region of the 12E10H H chain, which was included in the plasmids HEF-12E10H-gγ1 and pFd-12E10H, are shown in SEQ ID NO 94.
8.2 Конструирование гена, кодирующего V-область L-цепи 12Е108.2 Construction of the gene encoding the V region of the L-chain 12E10
Нуклеотидную последовательность SEQ ID NO 96 конструировали как ген, кодирующий V-область L-цепи человеческого антитела 12Е10, связывающегося с MPL человека, на основе аминокислотной последовательности, описанной в WO 99/10494 (SEQ ID NO 95). Дополнительно конструкцией было предусмотрено присоединение к ее 5'-концу лидерной последовательности (SEQ ID NO 97), происходящей из гена человеческого антитела (Mol. Immunol. 1992; 29: 1515-1518). Таким же образом, как описано выше, эту сконструированную нуклеотидную последовательность разделяли на четыре олигонуклеотида, имеющих перекрывающиеся последовательности из 15 п.о. каждая (12E10VL1, 12E10VL2, 12E10VL3, 12E10VL4), и синтезировали соответственно. 12E10VL1 (SEQ ID NO 98) и 12E10VL3 (SEQ ID NO 100) имели смысловую ориентацию, а 12E10VL2 (SEQ ID NO 99) и 12E10VL4 (SEQ ID NO 101) имели антисмысловую ориентацию, соответственно. Каждый из синтезированных олигонуклеотидов состыковывали на основе взаимной комплементарности и смешивали с внешними праймерами (12E10VLS и 12E10VLA) для амплификации полноразмерного гена. 12E10VLS (SEQ ID NO 102) конструировали так, чтобы он как прямой праймер гибридизовался с 5'-концом лидерной последовательности и содержал сайт узнавания рестриктазы EcoRI и последовательность Козака. 12E10VLA (SEQ ID NO 103) конструировали так, чтобы он как обратный праймер гибридизовался с нуклеотидной последовательностью, кодирующей С-конец V-области L-цепи, и содержал донорный сайт сплайсинга и сайт узнавания рестриктазы BlnI.The nucleotide sequence of SEQ ID NO 96 was constructed as a gene encoding the V region of the L chain of the human 12E10 antibody binding to human MPL based on the amino acid sequence described in WO 99/10494 (SEQ ID NO 95). Additionally, the design provided for the attachment to its 5'-end of the leader sequence (SEQ ID NO 97), derived from the human antibody gene (Mol. Immunol. 1992; 29: 1515-1518). In the same manner as described above, this engineered nucleotide sequence was divided into four oligonucleotides having 15 bp overlapping sequences. each (12E10VL1, 12E10VL2, 12E10VL3, 12E10VL4), and were synthesized, respectively. 12E10VL1 (SEQ ID NO 98) and 12E10VL3 (SEQ ID NO 100) had a sense orientation, and 12E10VL2 (SEQ ID NO 99) and 12E10VL4 (SEQ ID NO 101) had an antisense orientation, respectively. Each of the synthesized oligonucleotides was docked on the basis of mutual complementarity and mixed with external primers (12E10VLS and 12E10VLA) to amplify the full-sized gene. 12E10VLS (SEQ ID NO 102) was designed to hybridize as the direct primer to the 5'-end of the leader sequence and contain the EcoRI restriction enzyme recognition site and the Kozak sequence. 12E10VLA (SEQ ID NO 103) was designed to hybridize as a reverse primer to a nucleotide sequence encoding the C-terminus of the V region of the L chain and contain a donor splicing site and a BlnI restriction enzyme recognition site.
После проведения ПЦР, как описано выше, ПЦР-продукт очищали с использованием 1,5% геля легкоплавкой агарозы (Sigma), расщепляли рестриктазами EcoRI и BlnI и клонировали в вектор pUC19, содержащий ген для константной области лямбда-цепи человека. После определения ДНК-последовательности плазмиду, содержащую правильную ДНК-последовательность, расщепляли EcoRI для получения гена, кодирующего V-область L-цепи 12Е10 и константную область лямбда-цепи человека, и затем встраивали в экспрессионный вектор pCOS1. Плазмида, содержащая ген L-цепи 12Е10 (SEQ ID NO 104), была обозначена как pCOS-12E10L.After PCR, as described above, the PCR product was purified using 1.5% gel of low melting agarose (Sigma), digested with restriction enzymes EcoRI and BlnI, and cloned into pUC19 vector containing the gene for the constant region of the human lambda chain. After determining the DNA sequence, a plasmid containing the correct DNA sequence was digested with EcoRI to generate a gene encoding the 12E10 L chain V region and the human lambda chain constant region, and then inserted into the pCOS1 expression vector. A plasmid containing the 12E10 L chain gene (SEQ ID NO 104) was designated as pCOS-12E10L.
8.3 Получение реконструированного одноцепочечного Fv 12E108.3 Obtaining a reconstructed single chain Fv 12E10
Реконструированный одноцепочечный Fv антитела 12E10 конструировали так, чтобы его структура была представлена 12Е10VН-линкер-12Е10VL и содержала FLAG-последовательность (SEQ ID NO 105) на С-конце для облегчения детекции и очистки. Реконструированные одноцепочечные Fv 12E10 (sc 12E10 и db 12E10) конструировали с использованием линкерных последовательностей, состоящих из 15 аминокислот, представленных (Gly4Ser)3, или 5 аминокислот, представленных (Gly4Ser)1.The reconstructed 12E10 single chain Fv antibodies were designed so that their structure was represented by a 12E10VH linker-12E10VL and contained the FLAG sequence (SEQ ID NO 105) at the C-terminus for easy detection and purification. Reconstructed single chain Fv 12E10 (sc 12E10 and db 12E10) were constructed using linker sequences consisting of 15 amino acids represented by (Gly 4 Ser) 3 , or 5 amino acids represented by (Gly 4 Ser) 1 .
(1) Получение реконструированного одноцепочечного Fv 12E10 с использованием линкерной последовательности, состоящей из 5 аминокислот(1) Obtaining a reconstructed single chain Fv 12E10 using a linker sequence consisting of 5 amino acids
Ген, кодирующий реконструированный одноцепочечный Fv 12E10, который содержал линкерную последовательность, состоящую из 5 аминокислот, конструировали введением нуклеотидной последовательности для этого линкера (Gly4Ser)1 с 3'-конца гена, кодирующего V-область Н-цепи 12Е10, и с 5'-конца гена, кодирующего V-область L-цепи 12E10, амплификацией полученного таким образом гена при помощи ПЦР и состыковкой амплифицированных генов. Для получения реконструированного одноцепочечного Fv 12Е10 использовали четыре праймера (A-D). Праймеры А и С имели смысловые последовательности, а праймеры В и D имели антисмысловые последовательности.The gene encoding the reconstructed single-chain Fv 12E10, which contained a 5-amino acid linker sequence, was constructed by introducing the nucleotide sequence for this linker (Gly 4 Ser) 1 from the 3'-end of the gene encoding the 12E10 H chain V region and with 5 the 'end of the gene encoding the V region of the 12E10 L chain, amplification of the thus obtained gene by PCR and docking of the amplified genes. Four primers (AD) were used to obtain the reconstructed single chain Fv 12E10. Primers A and C had sense sequences, and primers B and D had antisense sequences.
Прямым праймером для V-области Н-цепи был 12E10S (Праймер A, SEQ ID NO 106). Обратный праймер DB2 (Праймер В, SEQ ID NO 107) для V-области Н-цепи конструировали так, чтобы он гибридизовался с ДНК, кодирующей С-конец V-области Н-цепи, и содержал нуклеотидную последовательность, кодирующую линкер (Gly4Ser)1, и нуклеотидную последовательность, кодирующую N-конец V-области L-цепи.The direct primer for the V region of the H chain was 12E10S (Primer A, SEQ ID NO 106). The DB2 reverse primer (Primer B, SEQ ID NO 107) for the V region of the H chain was designed to hybridize with DNA encoding the C-terminus of the V region of the H chain and contain the nucleotide sequence encoding the linker (Gly 4 Ser ) 1 , and the nucleotide sequence encoding the N-terminus of the V region of the L chain.
Прямой праймер DB1 (Праймер С, SEQ ID NO 108) для V-области L-цепи конструировали так, чтобы он гибридизовался с ДНК, кодирующей N-конец V-области L-цепи, и содержал нуклеотидную последовательность, кодирующую линкер (Gly4Ser)1, и нуклеотидную последовательность, кодирующую С-конец V-области Н-цепи. Обратный праймер 12E10FA для V-области L-цепи (Праймер D, SEQ ID NO 109) конструировали так, чтобы он гибридизовался с ДНК, кодирующей С-конец V-области L-цепи, и содержал последовательность, кодирующую FLAG, и сайт узнавания рестриктазы NotI.The direct primer DB1 (Primer C, SEQ ID NO 108) for the V region of the L chain was designed to hybridize with DNA encoding the N-terminus of the V region of the L chain and contain the nucleotide sequence encoding the linker (Gly 4 Ser ) 1 , and the nucleotide sequence encoding the C-terminus of the V region of the H chain. The 12E10FA reverse primer for the L chain V region (Primer D, SEQ ID NO 109) was designed to hybridize with DNA encoding the C-terminus of the L chain V region and contain a FLAG coding sequence and restriction enzyme recognition site NotI.
На первой стадии ПЦР проводили две реакции А-В и C-D, и два ПЦР-продукта, полученные на первой стадии ПЦР, состыковывали на основе взаимной комплементарности. После добавления праймеров А и D амплифицировали полноразмерную ДНК, кодирующую реконструированный одноцепочечный Fv 12E10, содержащий линкер, состоящий из 5 аминокислот (вторая ПЦР). В ПЦР первой стадии в качестве матрицы использовали плазмиды HEF-12E10H-gγ1 (см. пример 8.1), кодирующую реконструированную V-область Н-цепи 12E10, и pCOS-12E10L (см. пример 8.2), кодирующую реконструированную V-область L-цепи 12E10, соответственно.In the first stage of PCR, two reactions A-B and C-D were carried out, and two PCR products obtained in the first stage of PCR were docked on the basis of mutual complementarity. After the addition of primers A and D, a full-length DNA encoding the reconstructed single-stranded Fv 12E10 containing a linker consisting of 5 amino acids was amplified (second PCR). In the first-stage PCR, plasmids HEF-12E10H-gγ1 (see Example 8.1) encoding the reconstructed V region of the H chain 12E10 and pCOS-12E10L (see Example 8.2) encoding the reconstructed V region of the L chain were used as a matrix 12E10, respectively.
50 мкл ПЦР-раствора для первой стадии содержали 5 мкл 10-кратного ПЦР-буфера Gold II, 1,5 мМ MgCl2, 0,08 мМ dNTP, 5 единиц ДНК-полимеразы AmpliTaq Gold (все от Perkin Elmer), no 100 пмоль каждого праймера и 100 нг каждой ДНК-матрицы. ПЦР-раствор нагревали при начальной температуре 94°С в течение 9 минут, затем при 94°С в течение 30 секунд, при 55°С в течение 30 секунд и при 72°С в течение 1 минуты. После повторения этого цикла 35 раз реакционную смесь нагревали при 72°С дополнительно в течение 5 минут.50 μl of the PCR solution for the first stage contained 5 μl of Gold II 10-fold PCR buffer, 1.5 mM MgCl 2 , 0.08 mM dNTP, 5 AmpliTaq Gold DNA polymerase units (all from Perkin Elmer), no. 100 pmol each primer and 100 ng of each DNA template. The PCR solution was heated at an initial temperature of 94 ° C for 9 minutes, then at 94 ° C for 30 seconds, at 55 ° C for 30 seconds, and at 72 ° C for 1 minute. After repeating this cycle 35 times, the reaction mixture was heated at 72 ° C for an additional 5 minutes.
ПЦР-продукты А-В (429 п.о.) и C-D (395 п.н.) состыковывали при помощи второй ПЦР. Реакцию в ПЦР-растворе для второй стадии (98 мкл), содержавшем в качестве матрицы 1 мкл ПЦР-продукта первой стадии А-В и C-D, 100 пмоль каждого из праймеров, 10 мкл 10-кратного ПЦР-буфера Gold II, 1,5 мМ MgCl2, 0,08 мМ dNTP и 5 единиц ДНК-полимеразы AmpliTaq Gold (все от Perkin Elmer), проводили в тех же самых условиях, которые описаны выше.PCR products AB (429 bp) and CD (395 bp) were docked using the second PCR. The reaction in the PCR solution for the second stage (98 μl) containing 1 μl of the PCR product of the first stage A-B and CD as a matrix, 100 pmol of each of the primers, 10 μl of 10-fold Gold II PCR buffer, 1.5 mM MgCl 2 , 0.08 mM dNTP and 5 units of AmpliTaq Gold DNA polymerase (all from Perkin Elmer) were carried out under the same conditions as described above.
ДНК-фрагмент 795 п.о., полученный во второй ПЦР, очищали с использованием 1,5% геля легкоплавкой агарозы, расщепляли EcoRI и NotI и клонировали в вектор рСНО1 или вектор pCOS1. Экспрессионный вектор pCHO1 представлял собой вектор, сконструированный путем делеции гена антитела из DHFR-ΔE-RVH-PM1-f (см. WO 92/19759) в результате расщепления EcoRI и SmaI и присоединения к EcoRI-NotI-BamHI-адаптору (Takara Shuzo). После определения ДНК-последовательности плазмиды, содержащие ДНК-фрагмент, кодирующий правильную аминокислотную последовательность реконструированного одноцепочечного Fv 12E10, были обозначены как pCHO-db 12E10 и pCOS-db 12E10. Нуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность реконструированного одноцепочечного Fv антитела 12E10, включенного в плазмиды pCHO-db12E10 и pCOS-db12E10, показаны в SEQ ID NO 110.The 795 bp DNA fragment obtained in the second PCR was purified using a 1.5% agarose gel, digested with EcoRI and NotI and cloned into the pCHO1 vector or pCOS1 vector. The pCHO1 expression vector was a vector constructed by deletion of an antibody gene from DHFR-ΔE-RVH-PM1-f (see WO 92/19759) by digestion of EcoRI and SmaI and attachment to an EcoRI-NotI-BamHI adapter (Takara Shuzo) . After determining the DNA sequence of the plasmid containing the DNA fragment encoding the correct amino acid sequence of the reconstructed single chain Fv 12E10, were designated as pCHO-db 12E10 and pCOS-db 12E10. The nucleotide sequence and amino acid sequence of the reconstructed single chain Fv antibody 12E10 included in the plasmids pCHO-db12E10 and pCOS-db12E10 are shown in SEQ ID NO 110.
(2) Получение реконструированного одноцепочечного Fv 12E10 с использованием линкерной последовательности, состоящей из 15 аминокислот(2) Obtaining a reconstructed single chain Fv 12E10 using a linker sequence of 15 amino acids
Ген, кодирующий реконструированный одноцепочечный Fv антитела 12Е10, который содержал линкерную последовательность, состоящую из 15 аминокислот, конструировали путем введения нуклеотидной последовательности для линкера (Gly4Ser)3 с 3'-конца гена, кодирующего V-область Н-цепи 12Е10, и с 5'-конца гена, кодирующего V-область L-цепи 12Е10, амплификации полученного таким образом гена при помощи ПЦР и состыковки амплифицированных генов. Для получения этого реконструированного одноцепочечного Fv 12E10 использовали четыре праймера (A-D). Праймеры А и С имели смысловые последовательности, а праймеры В и D имели антисмысловые последовательности.The gene encoding the reconstructed single-chain Fv of antibody 12E10, which contained a linker sequence of 15 amino acids, was constructed by introducing the nucleotide sequence for the linker (Gly 4 Ser) 3 from the 3'-end of the gene encoding the V region of the 12E10 H chain, and c 5'-end of the gene encoding the V region of the L-chain 12E10, amplification of the thus obtained gene by PCR and docking amplified genes. Four primers (AD) were used to obtain this reconstructed single chain Fv 12E10. Primers A and C had sense sequences, and primers B and D had antisense sequences.
Прямым праймером для V-области Н-цепи был 12E10S (Праймер A, SEQ ID NO 106). Обратный праймер sc4.3 (Праймер В, SEQ ID NO 111) для V-области Н-цепи конструировали так, чтобы он гибридизовался с ДНК, кодирующей С-конец V-области Н-цепи, и содержал нуклеотидную последовательность, кодирующую линкер (Gly4SeR)3, и нуклеотидную последовательность, кодирующую N-конец V-области L-цепи.The direct primer for the V region of the H chain was 12E10S (Primer A, SEQ ID NO 106). The sc4.3 reverse primer (Primer B, SEQ ID NO 111) for the V region of the H chain was designed to hybridize with DNA encoding the C-terminus of the V region of the H chain and contain the nucleotide sequence encoding the linker (Gly 4 SeR) 3 , and a nucleotide sequence encoding the N-terminus of the V region of the L chain.
Прямой праймер scl.3 (Праймер С, SEQ ID NO 112) для V-области L-цепи конструировали так, чтобы он гибридизовался с ДНК, кодирующей N-конец V-области L-цепи, и содержал нуклеотидную последовательность, кодирующую линкер (Gly4Ser)3, и нуклеотидную последовательность, кодирующую С-конец V-области Н-цепи. Обратный праймер 12E10FA для V-области L-цепи (Праймер D, SEQ ID NO 109) конструировали так, чтобы он гибридизовался с ДНК, кодирующей С-конец V-области L-цепи, и содержал последовательность, кодирующую FLAG, и сайт узнавания рестриктазы NotI.The forward scl.3 primer (Primer C, SEQ ID NO 112) for the L chain V region was designed to hybridize with DNA encoding the N-terminus of the L chain V region and contain a nucleotide sequence encoding a linker (Gly 4 Ser) 3 , and the nucleotide sequence encoding the C-terminus of the V region of the H chain. The 12E10FA reverse primer for the L chain V region (Primer D, SEQ ID NO 109) was designed to hybridize with DNA encoding the C-terminus of the L chain V region and contain a FLAG coding sequence and restriction enzyme recognition site NotI.
На первой стадии ПЦР проводили две реакции А-В и C-D, и два ПЦР-продукта, полученные на первой стадии ПЦР, состыковывали на основе взаимной комплементарности. После добавления праймеров А и D амплифицировали полноразмерную ДНК, кодирующую реконструированный одноцепочечный Fv 12E10, содержащий линкер, состоящий из 15 аминокислот (вторая ПЦР). В ПЦР первой стадии в качестве матрицы использовали плазмиду pCOS-db12E10 (см. пример 8. 3(1)), кодирующую реконструированный одноцепочечный Fv 12E10.In the first stage of PCR, two reactions A-B and C-D were carried out, and two PCR products obtained in the first stage of PCR were docked on the basis of mutual complementarity. After the addition of primers A and D, a full-length DNA encoding the reconstructed single-chain Fv 12E10 containing a linker consisting of 15 amino acids was amplified (second PCR). In the PCR of the first stage, the plasmid pCOS-db12E10 (see Example 8. 3 (1)) encoding the reconstructed single chain Fv 12E10 was used as a template.
50 мкг ПЦР-раствора для первой стадии ПЦР содержали 5 мкл 10-кратного ExTaq-буфера II, 0,4 мМ dNTP, 2,5 единиц ДНК-полимеразы TaKaRa ExTaq (TAKARA), по 100 пмоль каждого праймера и 10 нг каждой ДНК-матрицы. ПЦР-раствор нагревали при начальной температуре 94°С в течение 30 секунд, затем при 94°С в течение 15 секунд и 72°С в течение 2 минут и этот цикл повторяли 5 раз. После повторения 28 раз цикла нагревания при 94°С в течение 15 секунд и при 70°С в течение 2 минут реакционную смесь дополнительно нагревали при 72°С в течение 5 минут.50 μg of the PCR solution for the first PCR stage contained 5 μl of 10-fold ExTaq-buffer II, 0.4 mm dNTP, 2.5 units of TaKaRa ExTaq DNA polymerase (TAKARA), 100 pmol of each primer and 10 ng of each DNA matrices. The PCR solution was heated at an initial temperature of 94 ° C for 30 seconds, then at 94 ° C for 15 seconds and 72 ° C for 2 minutes, and this cycle was repeated 5 times. After repeating 28 times the heating cycle at 94 ° C for 15 seconds and at 70 ° C for 2 minutes, the reaction mixture was further heated at 72 ° C for 5 minutes.
ПЦР-продукты А-В (477 п.о.) и C-D (447 п.о.) состыковывали при помощи второй ПЦР. В ПЦР-смеси для второй стадии (98 мкл), содержавшей в качестве матрицы 1 мкл ПЦР-продуктов первой стадии А-В и C-D, 100 пмоль каждого из праймеров А и D, 5 мкл 10-кратного ExTaq-буфера, 0,4 мМ dNTP, 2,5 единиц ДНК-полимеразы TaKaRa ExTaq (TAKARA), реакцию проводили при тех же самых условиях, которые описаны выше.PCR products AB (477 bp) and C-D (447 bp) were docked using the second PCR. In the PCR mixture for the second stage (98 μl) containing 1 μl of the PCR products of the first stage AB and CD as a template, 100 pmol of each of primers A and D, 5 μl of a 10-fold ExTaq buffer, 0.4 mM dNTP, 2.5 units of TaKaRa ExTaq DNA polymerase (TAKARA), the reaction was carried out under the same conditions as described above.
ДНК-фрагмент 825 п.о., полученный во второй ПЦР, очищали с использованием 1,0% геля легкоплавкой агарозы, расщепляли EcoRI и NotI. Полученный таким образом ДНК-фрагмент клонировали в вектор рСНО1 или вектор pCOS1. После определения ДНК-последовательности плазмиды, содержащие ДНК-фрагмент, кодирующий правильную аминокислотную последовательность реконструированного одноцепочечного Fv 12E10, были обозначены как pCHO-sc12E10 и pCOS-sc12E10. Нуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность этого реконструированного одноцепочечного Fv антитела 12E10, включенного в плазмиды pCHO-sc12E10 и pCOS-sc12E10, показаны в SEQ ID NO 113.The 825 bp DNA fragment obtained in the second PCR was purified using a 1.0% low melting agarose gel, and EcoRI and NotI were digested. The DNA fragment thus obtained was cloned into the pCHO1 vector or the pCOS1 vector. After determining the DNA sequence of the plasmid containing the DNA fragment encoding the correct amino acid sequence of the reconstructed single chain Fv 12E10, were designated as pCHO-sc12E10 and pCOS-sc12E10. The nucleotide sequence and amino acid sequence of this reconstructed single chain Fv antibody 12E10 included in the plasmids pCHO-sc12E10 and pCOS-sc12E10 are shown in SEQ ID NO 113.
8.4 Экспрессия антитела 12E10 (IgG, Fab) и одноцепочечного полипептида Fv клеткой животного8.4 Expression of 12E10 Antibody (IgG, Fab) and Single Chain Fv Polypeptide by Animal Cell
Антитело 12Е10 (IgG, Fab) и одноцепочечный Fv, происхоящий из антитела 12Е10 (линкерная последовательность 5 аминокислот, 15 аминокислот), экспрессировали с использованием клеток COS7 или клеток СНО.Antibody 12E10 (IgG, Fab) and single chain Fv derived from antibody 12E10 (linker sequence of 5 amino acids, 15 amino acids) were expressed using COS7 cells or CHO cells.
Временную экспрессию с использованием клеток COS7 выполняли следующим образом. Трансфекцию проводили способом электропорации с применением устройства Gene Pulser (BioRad). Для экспрессии антитела 12Е10 (IgG) добавляли по 10 мкг вышеупомянутого экспрессионного вектора HEF-12E10H-gγ1 и pCOS-12E10L, для экспрессии Fab-фрагмента 12Е10 добавляли по 10 мкг pFd-12E10H и pCOS-12E10L и для экспрессии одноцепочечного Fv 10 мкг pCOS-sc12E10 или 10 мкг pCOS-db12E10 добавляли к клеткам COS7 (1×107 клеток/мл), суспендированным в 0,8 мл PBS. Смесь, находящуюся в кювете, обрабатывали импульсом 1,5 кВ, при электрической емкости 25 мкФ. После "восстановления" в течение 10 минут при комнатной температуре электропорированные клетки добавляли в культуральную среду DMEM (Gibco BRL), содержащую 10% фетальную телячью сыворотку, и культивировали. После культивирования в течение ночи клетки промывали один раз PBS, добавляли в бессывороточную среду CHO-S-SFM II (Gibco BRL) и культивировали в течение 3 дней. Культуральную среду центрифугировали для удаления клеточного дебриса и фильтровали через фильтр с размером пор 0,22 мкм.Temporary expression using COS7 cells was performed as follows. Transfection was performed by electroporation using a Gene Pulser device (BioRad). For the expression of antibody 12E10 (IgG), 10 μg of the aforementioned expression vector HEF-12E10H-gγ1 and pCOS-12E10L were added, for the expression of the Fab fragment 12E10, 10 μg of pFd-12E10H and pCOS-12E10L were added and for the expression of single-
Для получения клеточной линии СНО, стабильно экспрессирующей одноцепочечный Fv (полипептид), происходящий из антитела 12Е10, экспрессионные вектора pCHO-sc12E10 или pCOS-ds12E10 вводили в клетки СНО, соответственно.To obtain a CHO cell line stably expressing single-chain Fv (polypeptide) derived from 12E10 antibody, pCHO-sc12E10 or pCOS-ds12E10 expression vectors were introduced into CHO cells, respectively.
Каждый экспрессионный вектор вводили в клетки СНО электропорацией с использованием прибора Gene Pulser (BioRad). Линеаризованную ДНК (100 мкг), полученную расщеплением рестриктазой Pvul, и клетки СНО (1×107 клеток/мл), суспендированные в 0,8 мл PBS, смешивали в кювете, оставляли без перемешивания на льду на 10 минут и обрабатывали импульсом 1,5 кВ, при электрической емкости 25 мкФ. После "восстановления" в течение 10 минут при комнатной температуре электропорированные клетки добавляли в среду CHO-S-SFM II (Gibco BRL), содержащую 10% диализованную фетальную телячью сыворотку и нуклеиновые кислоты, и культивировали. После культивирования в течение 2 дней культивирование продолжали в свободной от нуклеиновых кислот среде CHO-S-SFM II (Gibco BRL), содержащей 10% диализованную фетальную телячью сыворотку. Из полученных таким образом клонов отбирали клон с высоким уровнем экспрессии в качестве клеточной линии-продуцента одноцепочечного Fv 12E10. После культивирования в бессывороточной среде CHO-S-SFM II (Gibco BRL), культуральный супернатант центрифугировали для отделения клеточного дебриса (остатков клеток) и фильтровали через фильтр с размером пор 0,22 мкм.Each expression vector was introduced into CHO cells by electroporation using a Gene Pulser (BioRad) instrument. Linearized DNA (100 μg) obtained by digestion with Pvul restrictase and CHO cells (1 × 10 7 cells / ml) suspended in 0.8 ml of PBS were mixed in a cuvette, left without stirring on ice for 10 minutes and treated with
8.5 Очистка одноцепочечного Fv, происходящего из 12E10, продуцируемого клетками СНО8.5 Purification of single chain Fv originating from 12E10 produced by CHO cells
Культуральные супернатанты, продуцируемые клеточными линиями СНО, экспрессирующими одноцепочечный Fv 12E10 (sc 12E10, db 12E10), полученные в примере 8.4, очищали с использованием колонки с анти-FLAG-антителом и гель-фильтрационной колонки, соответственно, для получения очищенных одноцепочечных Fv.The culture supernatants produced by CHO cell lines expressing single chain Fv 12E10 (sc 12E10, db 12E10) obtained in Example 8.4 were purified using an anti-FLAG antibody column and a gel filtration column, respectively, to obtain purified single chain Fv.
(1) Очистка с использованием колонки с анти-FLAG-антителом(1) Purification using an anti-FLAG antibody column
Каждый культуральный супернатант (sc 12E10, db 12E10) наносили на колонку с анти-FLAG М2-аффинным гелем (Sigma), уравновешенным 50 мМ Трис-HCl-буфером (рН 7,4), содержащим 150 мМ NaCl. После промывания этой колонки тем же самым буфером белки, адсорбированные на колонке, элюировали 100 мМ глицин-HCl-буфером (рН 3,5). Элюированные фракции незамедлительно нейтрализовали добавлением 1 М Трис-HCl-буфера (рН 8,0) и анализировали электрофорезом в ДСН-ПААГ. Фракции, которые, как было подтверждено, содержали одноцепочечный Fv, объединяли и концентрировали приблизительно в 20 раз с использованием Centricon-10 (Millipore).Each culture supernatant (sc 12E10, db 12E10) was applied to a column with anti-FLAG M2 affinity gel (Sigma) equilibrated with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 150 mM NaCl. After washing this column with the same buffer, the proteins adsorbed on the column were eluted with 100 mM glycine-HCl buffer (pH 3.5). The eluted fractions were immediately neutralized by adding 1 M Tris-HCl buffer (pH 8.0) and analyzed by SDS-PAGE. Fractions that were confirmed to contain single chain Fv were pooled and concentrated approximately 20 times using Centricon-10 (Millipore).
(2) Гель-фильтрация(2) Gel Filtration
Концентрированный раствор, полученный в (1), добавляли на колонку Superdex 200 HR (10×300 мм, Amersham Pharmacia), уравновешенную PBS, содержащим 0,01% Твин 20. Хроматограммы представлены на фиг.53 и 54. Продукт sc12E10 элюировался в виде двух пиков (А, В) (см. фиг.53). Продукт db12E10 элюировался в виде двух пиков (С, D) (см. фиг.54). Фракцию каждого пика собирали, обрабатывали в присутствии и в отсутствие восстанавливающего агента, подвергали электрофорезу согласно способу Лэммли и окрашивали Кумасси бриллиантовым синим после электрофореза. Как показано на фиг.55, все фракции А, В, С и D, независимо от присутствия или отсутствия восстанавливающего агента, давали единственную полосу, имеющую кажущуюся молекулярную массу около 31 кДа. При анализе этих фракций гель-фильтрацией с использованием Superdex 200 HR фракция А давала продукт, элюируемый с кажущейся молекулярной массой около 42 кДа, фракция В - 20 кДа, фракция С - 69 кДа и фракция D - 41 кДа (см. фиг.57). Эти результаты предполагают, что происходящая из sc12E10 фракция А является нековалентно связанным димером одноцепочечного Fv sc12E10 и фракция В является мономером одноцепочечного Fv, а происходящая из db12E10 фракция С является нековалентно связанным тримером одноцепочечного Fv и D является нековалентно связанным димером одноцепочечного Fv.The concentrated solution obtained in (1) was added to a
8.6 Измерение ТРО-подобной агонистической активности различных одноцепочечных Fv8.6 Measurement of TPO-like agonistic activity of various single chain Fv
ТРО-подобную активность одноцепочечного анти-MPL-антитела оценивали измерением пролиферативной активности в отношении клеток Ba/F3 (BaF/mpl), экспрессирующих ТРО-рецептор человека (MPL).TPO-like activity of a single chain anti-MPL antibody was evaluated by measuring proliferative activity against Ba / F3 cells (BaF / mpl) expressing human TPO receptor (MPL).
После промывания клеток BaF/mpI два раза культуральной средой RPMI1640 (Gibco), содержащей 1% фетальную телячью сыворотку (Gibco), эти клетки суспендировали в среде при плотности клеток 5×105 клеток/мл. Одноцепочечное анти-MPL-антитело и ТРО человека (R & D Systems) разбавляли этой культуральной средой, соответственно. 50 мкл клеточной суспензии и 50 мкл разведенного антитела или ТРО человека добавляли в 96-луночный микропланшет (плоскодонный) (Corning) и культивировали в СО2-инкубаторе (концентрация СО2: 5%) в течение 24 часов. После инкубирования добавляли 10 мкл реагента WST-8 (реагента для измерения числа живых клеток SF: Nacalai Tesque) и поглощение немедленно измеряли при длине волны измерения 450 нм и при опорной длине волны 655 нм с использованием флуоресцентно-абсорбционного фотометра Benchmark Plus (BioRad). После инкубирования в CO2-инкубаторе (концентрация СО2: 5%) в течение 2 часов вновь измеряли оптическую плотность при длине волны измерения 450 нм и опорной длине волны 655 нм при помощи Benchmark Plus. Поскольку реагент WST-8 развивал окраску при длине волны 450 нм в зависимости от числа живых клеток, пролиферативную активность BaF/rnpl оценивали по изменению оптической плотности за 2 часа.After washing the BaF / mpI cells twice with RPMI1640 culture medium (Gibco) containing 1% fetal calf serum (Gibco), these cells were suspended in the medium at a cell density of 5 × 10 5 cells / ml. Single chain anti-MPL antibody and human TPO (R & D Systems) were diluted with this culture medium, respectively. 50 μl of cell suspension and 50 μl of diluted human antibody or TPO were added to a 96-well microplate (flat-bottom) (Corning) and cultured in a CO 2 incubator (CO 2 concentration: 5%) for 24 hours. After incubation, 10 μl of WST-8 reagent (SF: Nacalai Tesque live cell reagent) was added and the absorbance was immediately measured at a measurement wavelength of 450 nm and at a reference wavelength of 655 nm using a Benchmark Plus fluorescence absorption photometer (BioRad). After incubation in a CO 2 incubator (CO 2 concentration: 5%) for 2 hours, the optical density was again measured at a measurement wavelength of 450 nm and a reference wavelength of 655 nm using Benchmark Plus. Since the reagent WST-8 developed color at a wavelength of 450 nm depending on the number of living cells, the proliferative activity of BaF / rnpl was evaluated by the change in optical density over 2 hours.
Агонистическая активность в отношении MPL, измеренная с использованием культуральных супернатантов клеток COS-7, экспрессирующих различные варианты молекул антитела 12Е10, показана на фиг, 58. Одноцепочечные Fv, имеющие линкер из 5 аминокислот (ds12E10) и линкер из 15 аминокислот (sc12E10), увеличивали оптическую плотность зависимым от концентрации образом, показывая ТРО-подобную агонистическую активность (ED50; 9 пМ и 51 пМ, соответственно), тогда как 12E10IgG и 12E10Fab не имели активности.MPL agonist activity measured using COS-7 cell culture supernatants expressing different variants of 12E10 antibody molecules is shown in FIG. 58. Single chain Fvs having a 5 amino acid linker (ds12E10) and a 15 amino acid linker (sc12E10) were increased optical density in a concentration-dependent manner, showing TPO-like agonistic activity (ED50; 9 pM and 51 pM, respectively), while 12E10IgG and 12E10Fab had no activity.
Было известно, что Н-цепь и L-цепь одноцепочечного Fv ассоциируют не только внутри молекулы, но также между молекулами с образованием мультимеров, таких как димеры. Культуральные супернатанты клеток СНО, экспрессирующих одноцепочечные Fv антитела 12Е10, подвергали гель-фильтрации и испытывали на агонистическую активность в отношении MPL. Эти результаты показаны на фиг.59. Димер, который содержался в sc12E10 в небольшом количестве, показал приблизительно в 5000 раз более сильную ТРО-подобную агонистическую активность (димер sc12E10, ED50; 1,9 пМ) в сравнении с мономером (мономер sc12E10, ED50; >10 нМ). Активность была более высокой, чем активность ТРО (ED50; 27 пМ). Димер db12E10 (ED50; 2,0 пМ) показал сильную активность, сравнимую с активностью димера sc12E10. Тример db12E10 (ED50; 7,4 пМ), который, как предполагалось, был тримером исходя из его молекулярной массы, полученной при гель-фильтьрации, показал высокую активность, которая является более низкой, чем активность димера db12E10. Эти результаты предполагают, что для активности агонистического антитела 12Е10 важным является то, что антигенсвязывающий сайт является бивалентным (димер). С учетом того факта, что 12E10-IgG не имел активности, предполагается, что важными являются и другие факторы, кроме бивалентности, такие как местоположение антигенсвязывающего сайта, расстояние или угол.It has been known that the H chain and the L chain of single chain Fv associate not only within the molecule, but also between the molecules to form multimers such as dimers. The culture supernatants of CHO cells expressing 12E10 single chain Fv antibodies were gel filtered and tested for MPL agonist activity. These results are shown in FIG. A small amount of dimer contained in sc12E10 showed approximately 5000 times stronger TPO-like agonistic activity (dimer sc12E10, ED50; 1.9 pM) compared to monomer (monomer sc12E10, ED50;> 10 nM). Activity was higher than TPO activity (ED50; 27 pM). The db12E10 dimer (ED50; 2.0 pM) showed strong activity comparable to that of the sc12E10 dimer. The db12E10 trimer (ED50; 7.4 pM), which was supposed to be a trimer based on its molecular weight obtained by gel filtration, showed high activity, which is lower than the activity of the db12E10 dimer. These results suggest that it is important for the activity of the 12E10 agonist antibody that the antigen-binding site is bivalent (dimer). Given the fact that 12E10-IgG was not active, it is assumed that other factors other than bivalence are important, such as the location of the antigen binding site, distance or angle.
ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬINDUSTRIAL APPLICABILITY
Модифицированные антитела данного изобретения обладают агонистическим действием, способным трансдуцировать сигнал в клетки посредством образования поперечных связей между молекулой (молекулами) клеточной поверхности, и обладают преимуществами, благодаря тому, что их проницаемость в ткани и опухоли является высокой вследствие меньшего молекулярного размера в сравнении с исходной молекулой антитела (цельным IgG). Данное изобретение обеспечивает модифицированные антитела, которые имеют необыкновенно высокую агонистическую активность в сравнении с природными лигандами, такими как ТРО, и исходное антитело (цельный IgG). Даже в том случае, если исходное антитело не имеет агонистической активности, может быть получено модифицированное антитело с более высокой агонистической активностью в сравнении с природными лигандами. Это связано с тем, что модифицированные антитела имеют форму, более близкую к лиганду в сравнении с исходными антителами. Таким образом, модифицированные антитела могут быть использованы в качестве трансдуцирующих сигнал агонистов для достижения индукции апоптоза, индукции пролиферации клеток, индукции дифференцировки, индукции клеточного деления или регуляторного действия на клеточный цикл. Модификация молекулы антитела с образованием модифицированного антитела в соответствии с данным изобретением приводит к уменьшению побочных эффектов, вызываемых образованием межклеточных сшивок, и обеспечивает новые лекарственные средства, вызывающие только требуемый эффект путем сшивания молекулы (молекул) клеточной поверхности. Медицинские препараты, содержащие в качестве активного ингредиента модифицированное антитело данного изобретения, применимы в качестве профилактических средств и/или лечебных средств при раках, воспалениях, гормональных нарушениях, аутоиммунных заболеваниях и заболеваниях крови, например, лейкозе, злокачественной лимфоме, апластической анемии, синдроме миелоплазии и красной, или истинной, полицитемии.The modified antibodies of the present invention have an agonistic effect, capable of transducing the signal into cells through the formation of cross-links between the cell surface molecule (s), and have advantages due to their high permeability in tissue and tumor due to their smaller molecular size compared to the original molecule antibodies (whole IgG). This invention provides modified antibodies that have unusually high agonistic activity compared to natural ligands, such as TPO, and the original antibody (whole IgG). Even if the original antibody does not have agonistic activity, a modified antibody with higher agonistic activity compared to natural ligands can be obtained. This is due to the fact that the modified antibodies have a form closer to the ligand in comparison with the original antibodies. Thus, modified antibodies can be used as signal transducing agonists to achieve induction of apoptosis, induction of cell proliferation, induction of differentiation, induction of cell division or regulatory action on the cell cycle. Modification of an antibody molecule with the formation of a modified antibody in accordance with this invention reduces the side effects caused by the formation of intercellular crosslinks and provides new drugs that cause only the desired effect by crosslinking the molecule (s) of the cell surface. Medications containing the modified antibody of the invention as an active ingredient are useful as prophylactic and / or therapeutic agents for cancers, inflammations, hormonal disorders, autoimmune diseases and blood diseases, for example, leukemia, malignant lymphoma, aplastic anemia, myeloplasia syndrome and red, or true, polycythemia.
Claims (31)
Applications Claiming Priority (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000-321822 | 2000-10-20 | ||
| JP2000321822 | 2000-10-20 | ||
| JP2000321821 | 2000-10-20 | ||
| JP2000-321821 | 2000-10-20 | ||
| JPPCT/JP01/01912 | 2001-03-12 | ||
| JPPCT/JP01/03288 | 2001-04-17 | ||
| JP2001-277314 | 2001-09-12 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2006127049/10A Division RU2430927C2 (en) | 2000-10-20 | 2001-10-22 | Atomic compound capable of specifically identifying and cross linkinking cell surface molecule or intracellular molecule |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2003114746A RU2003114746A (en) | 2004-12-20 |
| RU2295537C2 true RU2295537C2 (en) | 2007-03-20 |
Family
ID=37994203
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2003114746/13A RU2295537C2 (en) | 2000-10-20 | 2001-10-22 | Modified antagonistic antibody |
| RU2006127049/10A RU2430927C2 (en) | 2000-10-20 | 2001-10-22 | Atomic compound capable of specifically identifying and cross linkinking cell surface molecule or intracellular molecule |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2006127049/10A RU2430927C2 (en) | 2000-10-20 | 2001-10-22 | Atomic compound capable of specifically identifying and cross linkinking cell surface molecule or intracellular molecule |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (2) | RU2295537C2 (en) |
Cited By (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2533809C2 (en) * | 2010-02-24 | 2014-11-20 | Ринат Ньюросайенс Корп. | Antagonist anti-il-7 receptor antibodies and methods |
| RU2542382C2 (en) * | 2008-10-08 | 2015-02-20 | Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг | Bispecific anti-vegf/anti-ang-2 antibodies |
| RU2573914C2 (en) * | 2009-06-16 | 2016-01-27 | Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг | Bispecific antigen-binding proteins |
| RU2580049C2 (en) * | 2007-10-15 | 2016-04-10 | Санофи-Авентис | Il-4 and/or il-13 binding antibodies and using them |
| RU2587616C2 (en) * | 2007-12-21 | 2016-06-20 | Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг | Bivalent bispecific antibodies |
| RU2604189C2 (en) * | 2009-06-18 | 2016-12-10 | Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг | Bispecific, tetravalent antigen binding proteins |
| RU2607038C2 (en) * | 2011-02-28 | 2017-01-10 | Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг | Antigen-binding proteins |
| RU2617970C2 (en) * | 2011-08-23 | 2017-04-28 | Рош Гликарт Аг | ANTIBODIES WITHOUT Fc-FRAGMENT INCLUDING TWO FAB-FRAGMENT AND METHODS OF APPLICATION |
| US9879095B2 (en) | 2010-08-24 | 2018-01-30 | Hoffman-La Roche Inc. | Bispecific antibodies comprising a disulfide stabilized-Fv fragment |
| US9890204B2 (en) | 2009-04-07 | 2018-02-13 | Hoffmann-La Roche Inc. | Trivalent, bispecific antibodies |
| US9994646B2 (en) | 2009-09-16 | 2018-06-12 | Genentech, Inc. | Coiled coil and/or tether containing protein complexes and uses thereof |
| US10106600B2 (en) | 2010-03-26 | 2018-10-23 | Roche Glycart Ag | Bispecific antibodies |
| US10323099B2 (en) | 2013-10-11 | 2019-06-18 | Hoffmann-La Roche Inc. | Multispecific domain exchanged common variable light chain antibodies |
| US10611825B2 (en) | 2011-02-28 | 2020-04-07 | Hoffmann La-Roche Inc. | Monovalent antigen binding proteins |
| US10633457B2 (en) | 2014-12-03 | 2020-04-28 | Hoffmann-La Roche Inc. | Multispecific antibodies |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20080077261A (en) * | 2005-12-06 | 2008-08-21 | 도만티스 리미티드 | Ligands that have binding specificity for egfr and/or vegf and methods of use therefor |
| TWI419904B (en) * | 2006-12-18 | 2013-12-21 | Genentech Inc | Antagonist anti-notch3 antibodies and their use in the prevention and treatment of notch3-related diseases |
-
2001
- 2001-10-22 RU RU2003114746/13A patent/RU2295537C2/en not_active IP Right Cessation
- 2001-10-22 RU RU2006127049/10A patent/RU2430927C2/en not_active IP Right Cessation
Cited By (29)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9732162B2 (en) | 2007-10-15 | 2017-08-15 | Sanofi | Antibodies that bind IL-4 and/or IL-13 and their uses |
| US10759871B2 (en) | 2007-10-15 | 2020-09-01 | Sanofi | Antibodies that bind IL-4 and/or IL-13 and their uses |
| US11453727B2 (en) | 2007-10-15 | 2022-09-27 | Sanofi | Antibodies that bind IL-4 and/or IL-13 and their uses |
| US9738728B2 (en) | 2007-10-15 | 2017-08-22 | Sanofi | Antibodies that bind IL-4 and/or IL-13 and their uses |
| RU2580049C2 (en) * | 2007-10-15 | 2016-04-10 | Санофи-Авентис | Il-4 and/or il-13 binding antibodies and using them |
| RU2587616C2 (en) * | 2007-12-21 | 2016-06-20 | Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг | Bivalent bispecific antibodies |
| US10927163B2 (en) | 2007-12-21 | 2021-02-23 | Hoffmann-La Roche, Inc. | Bivalent, bispecific antibodies |
| US10138293B2 (en) | 2007-12-21 | 2018-11-27 | Hoffmann-La Roche, Inc. | Bivalent, bispecific antibodies |
| RU2640253C2 (en) * | 2008-10-08 | 2017-12-27 | Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг | Bispecific anti-vegf/anti-ang-2 antibodies |
| RU2542382C2 (en) * | 2008-10-08 | 2015-02-20 | Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг | Bispecific anti-vegf/anti-ang-2 antibodies |
| US9890204B2 (en) | 2009-04-07 | 2018-02-13 | Hoffmann-La Roche Inc. | Trivalent, bispecific antibodies |
| US10640555B2 (en) | 2009-06-16 | 2020-05-05 | Hoffmann-La Roche Inc. | Bispecific antigen binding proteins |
| RU2573914C2 (en) * | 2009-06-16 | 2016-01-27 | Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг | Bispecific antigen-binding proteins |
| US9676845B2 (en) | 2009-06-16 | 2017-06-13 | Hoffmann-La Roche, Inc. | Bispecific antigen binding proteins |
| US11673945B2 (en) | 2009-06-16 | 2023-06-13 | Hoffmann-La Roche Inc. | Bispecific antigen binding proteins |
| RU2604189C2 (en) * | 2009-06-18 | 2016-12-10 | Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг | Bispecific, tetravalent antigen binding proteins |
| US9994646B2 (en) | 2009-09-16 | 2018-06-12 | Genentech, Inc. | Coiled coil and/or tether containing protein complexes and uses thereof |
| RU2653430C2 (en) * | 2010-02-24 | 2018-05-08 | Ринат Ньюросайенс Корп. | Antagonistic antibodies against the il-7 receptor and methods |
| RU2533809C9 (en) * | 2010-02-24 | 2015-05-20 | Ринат Ньюросайенс Корп. | Antagonist anti-il-7 receptor antibodies and methods |
| RU2533809C2 (en) * | 2010-02-24 | 2014-11-20 | Ринат Ньюросайенс Корп. | Antagonist anti-il-7 receptor antibodies and methods |
| US10106600B2 (en) | 2010-03-26 | 2018-10-23 | Roche Glycart Ag | Bispecific antibodies |
| US9879095B2 (en) | 2010-08-24 | 2018-01-30 | Hoffman-La Roche Inc. | Bispecific antibodies comprising a disulfide stabilized-Fv fragment |
| RU2607038C2 (en) * | 2011-02-28 | 2017-01-10 | Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг | Antigen-binding proteins |
| US10611825B2 (en) | 2011-02-28 | 2020-04-07 | Hoffmann La-Roche Inc. | Monovalent antigen binding proteins |
| US10793621B2 (en) | 2011-02-28 | 2020-10-06 | Hoffmann-La Roche Inc. | Nucleic acid encoding dual Fc antigen binding proteins |
| US9982036B2 (en) | 2011-02-28 | 2018-05-29 | Hoffmann-La Roche Inc. | Dual FC antigen binding proteins |
| RU2617970C2 (en) * | 2011-08-23 | 2017-04-28 | Рош Гликарт Аг | ANTIBODIES WITHOUT Fc-FRAGMENT INCLUDING TWO FAB-FRAGMENT AND METHODS OF APPLICATION |
| US10323099B2 (en) | 2013-10-11 | 2019-06-18 | Hoffmann-La Roche Inc. | Multispecific domain exchanged common variable light chain antibodies |
| US10633457B2 (en) | 2014-12-03 | 2020-04-28 | Hoffmann-La Roche Inc. | Multispecific antibodies |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2430927C2 (en) | 2011-10-10 |
| RU2006127049A (en) | 2008-01-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2287534C2 (en) | Degraded antibody as tpo agonist | |
| US20130295096A1 (en) | Degraded agonist antibody | |
| AU2002210918B2 (en) | Degraded agonist antibody | |
| RU2295537C2 (en) | Modified antagonistic antibody | |
| AU2002210917B2 (en) | Degraded TPO agonist antibody | |
| US20040258684A1 (en) | Agonist antibodies | |
| US7696325B2 (en) | Polypeptide inducing apoptosis | |
| JP5577243B2 (en) | Immunoglobulin fusion protein | |
| KR102652247B1 (en) | Heterodimeric Fc-fused cytokine and pharmaceutical composition comprising the same | |
| JP3865802B2 (en) | Immunoconjugate II | |
| JP2021511069A (en) | Fusion protein dimer using antibody Fc region as main chain and its use | |
| AU2001241100C1 (en) | Polypeptide inducing apoptosis | |
| KR20170094341A (en) | Interleukin 15 protein complex and use thereof | |
| WO2001079494A1 (en) | Agonist antibodies | |
| JP2021514625A (en) | Fusion protein construct containing anti-MUC1 antibody and IL-15 | |
| KR100479790B1 (en) | G-CSF receptor agonist antibodies and screening method therefor | |
| WO2020048454A1 (en) | Fusion protein and its application in preparing medicine for treating tumor and/or viral infection | |
| US20240043487A1 (en) | Interleukin-21 mutant and use thereof | |
| JP2023543440A (en) | Bispecific recombinant proteins and their uses | |
| CN116102655A (en) | PD-L1/PD-1 targeting antibody and application thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20181023 |