RU2291675C2 - Method for treating cardiovascular surgical transplants - Google Patents
Method for treating cardiovascular surgical transplants Download PDFInfo
- Publication number
- RU2291675C2 RU2291675C2 RU2004121050/15A RU2004121050A RU2291675C2 RU 2291675 C2 RU2291675 C2 RU 2291675C2 RU 2004121050/15 A RU2004121050/15 A RU 2004121050/15A RU 2004121050 A RU2004121050 A RU 2004121050A RU 2291675 C2 RU2291675 C2 RU 2291675C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- calcium
- concentration
- cells
- fragments
- calcification
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Epoxy Compounds (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области медицины, в частности к способам обработки трансплантатов клапанов сердца и сосудов, выполняемым для повышения их биосовместимости и профилактики кальциноза.The invention relates to medicine, in particular to methods for processing transplants of heart valves and blood vessels, performed to increase their biocompatibility and prevention of calcification.
Из литературы известно, что одной из основных причин реопераций у взрослых больных и высокой смертности у пациентов в раннем детском возрасте является кальцификация аллотрансплантатов клапанов сердца. Считается, что кальциноз аллотрансплантатов клапанов сердца связан с гибелью клеток донора, в результате которой образуются центры минерализации ткани. Причем иммунный ответ против клеток донора может способствовать усилению кальциноза. Поэтому для того, чтобы уменьшить иммунный ответ на трансплантат, уменьшить кальциноз трансплантата, способствовать репопуляции ткани клетками реципиента и, соответственно, ее регенерации, в последние годы предлагается разрушать клетки донора в трансплантатах клапанов сердца (включая аллотрансплантаты и ксенотрансплантаты), а также в трансплантатах сосудов (см. J.Vase. Sugr. 1994, v.19, p.446-456; Ann. Thorac. Surg. 2001, v.71 (5 Suppl) p.S428-432).From the literature it is known that one of the main causes of reoperations in adult patients and high mortality in patients in early childhood is the calcification of heart valve allografts. It is believed that calcification of heart valve allografts is associated with the death of donor cells, resulting in the formation of tissue mineralization centers. Moreover, the immune response against donor cells can contribute to increased calcification. Therefore, in order to reduce the immune response to the transplant, to reduce the graft calcification, to promote tissue repopulation by the recipient cells and, accordingly, its regeneration, in recent years it has been proposed to destroy donor cells in heart valve transplants (including allografts and xenografts), as well as in vascular grafts (see J.Vase. Sugr. 1994, v.19, p. 466-456; Ann. Thorac. Surg. 2001, v. 71 (5 Suppl) p. S 428-432).
Известен способ обработки трансплантатов для сердечно-сосудистой хирургии, в котором для снижения иммуногенности ткани и повышения ее биосовместимости обеспечивают гибель клеток донора путем инкубации в гипотонической среде и разрушение нуклеиновых кислот в растворах, содержащих ферменты нуклеазы (см. Sem. Thorac. Cardiovasc. Surg. 1999, vol.4 (Suppl 1), p.194-200).A known method of processing transplants for cardiovascular surgery, in which to reduce the immunogenicity of the tissue and increase its biocompatibility provide the death of donor cells by incubation in a hypotonic medium and the destruction of nucleic acids in solutions containing nuclease enzymes (see Sem. Thorac. Cardiovasc. Surg. 1999, vol. 4 (Suppl 1), p. 194-200).
Недостатком способа является то, что согласно результатам экспериментов на лабораторных животных такая обработка снижает иммуногенность, но не предотвращает кальциноз стенок кровеносных сосудов, например аорты, фрагмент которой является частью трансплантатов аортальных клапанов сердца. Кальциноз трансплантатов клапанов сердца, обработанных этим способом, был причиной нарушения работы имплантированных клапанов при клинических испытаниях.The disadvantage of this method is that according to the results of experiments on laboratory animals, this treatment reduces immunogenicity, but does not prevent calcification of the walls of blood vessels, such as the aorta, a fragment of which is part of the transplantation of the aortic valves of the heart. The calcification of heart valve transplants treated with this method caused disruption of the implanted valves in clinical trials.
Известен способ обработки тканей, содержащих коллаген, в котором для снижения иммуногенности и улучшения регенерации трансплантатов их обрабатывают до имплантации так, что удаляют все неколлагеновые компоненты, включая клетки, остатки погибших клеток, и другие компоненты тканевого матрикса, такие как протеогликаны, гликозаминогликаны, используя для этого щелочи, хелатирующие агенты, кислоты и соли (см.: патент США N 5993844, 30-11-1999). Согласно этому изобретению коллагеновый матрикс после удаления неколлагеновых компонентов сохраняет структурную организацию, целостность и способность к ремоделированию, т.е. не препятствует миграции в него клеток реципиента, ответственных за поддержание нативности ткани. Способ исключает применение детергентов и ферментов, которые отрицательно влияют на биоремоделирование коллагенового матрикса, предназначенного для имплантации.A known method of processing tissues containing collagen, in which to reduce immunogenicity and improve the regeneration of transplants, they are processed before implantation so that all non-collagen components, including cells, dead cell residues, and other components of the tissue matrix, such as proteoglycans, glycosaminoglycans, are removed using this alkali, chelating agents, acids and salts (see: US patent N 5993844, 30-11-1999). According to this invention, the collagen matrix after removal of non-collagen components preserves the structural organization, integrity and remodeling ability, i.e. does not interfere with the migration of recipient cells responsible for maintaining tissue nativeness into it. The method excludes the use of detergents and enzymes that adversely affect the bioremodeling of the collagen matrix intended for implantation.
Недостатком способа является то, что предложенная обработка направлена на удаление из тканевого матрикса не только клеток и их остатков, но также гликозаминогликанов, которые участвуют в защите ткани от кальциноза. Кроме того, коллаген является значительной составляющей поверхности миофибробластов и гладкомышечных клеток, и поэтому невозможно удалить клетки и ее составляющие, не удаляя коллаген. Следовательно, предложенная обработка не может не влиять на структуру коллагенового матрикса, подобно ферментативной обработке, а это, как известно, сохраняет кальциноз и поэтому препятствует регенерации тканевой структуры, ограничивает срок функционирования трансплантатов.The disadvantage of this method is that the proposed treatment is aimed at removing from the tissue matrix not only cells and their residues, but also glycosaminoglycans, which are involved in protecting the tissue from calcification. In addition, collagen is a significant component of the surface of myofibroblasts and smooth muscle cells, and therefore it is impossible to remove cells and its components without removing collagen. Therefore, the proposed treatment cannot but affect the structure of the collagen matrix, like an enzymatic treatment, and this, as you know, preserves calcification and therefore interferes with the regeneration of the tissue structure, and limits the life of the grafts.
Наиболее близким, принятым за прототип, является способ обработки тканей аллотрансплантатов клапанов сердца, согласно которому для уменьшения иммуногенности и ускорения их регенерации за счет обеспечения условий, вызывающих гибель клеток донора перед посевом аутологичных клеток до имплантации, ткани инкубируют в фосфатно-солевом растворе, содержащем трипсин (0.25%) и этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) (0,02%), при рН 7,4 и температуре 37°С в течение 2 суток, затем отмывают от трипсина и ЭДТА и помещают в фосфатно-солевой раствор до посева на них клеток реципиента (см.: Circulation, 2002, sept.4; 106 [suppl.I]; I-63-I-68).The closest adopted for the prototype is a method of processing tissue of allograft heart valves, according to which to reduce immunogenicity and accelerate their regeneration by providing conditions that cause the death of donor cells before seeding of autologous cells before implantation, the tissues are incubated in phosphate-saline solution containing trypsin (0.25%) and ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) (0.02%), at a pH of 7.4 and a temperature of 37 ° C for 2 days, then washed from trypsin and EDTA and placed in phosphate-saline solution before sowing and these recipient cells (see .: Circulation, 2002, sept.4; 106 [suppl.I]; I-63-I-68).
Недостатком способа является то, что, обеспечивая снижение иммуногенности и способствуя заселениию тканей трансплантата аутологичными клетками, он не приводит в достаточной мере к снижению кальциноза трансплантата, что ограничивает его биосовместимость. Клеточная гибель инициируется в таких условиях, которые не препятствуют зарождению центров кальциноза. Образовавшиеся в ходе гибели клеток центры кальциноза обеспечивают минерализацию бесклеточных трансплантатов даже после посева аутологичных клеток реципиента.The disadvantage of this method is that, providing a decrease in immunogenicity and contributing to the population of transplant tissues with autologous cells, it does not sufficiently reduce the graft calcification, which limits its biocompatibility. Cell death is initiated under conditions that do not interfere with the nucleation of calcification centers. The centers of calcification formed during cell death provide the mineralization of cell-free grafts even after seeding of autologous recipient cells.
Задачей настоящего изобретения является создание способа обработки трансплантатов для сердечно-сосудистой хирургии, который, вызывая гибель клеток донора, предотвращает их кальциноз в организме реципиента и повышает тем самым биосовместимость трансплантатов.An object of the present invention is to provide a method for treating transplants for cardiovascular surgery, which, by causing the death of donor cells, prevents their calcification in the recipient organism and thereby increases the biocompatibility of the grafts.
Поставленная задача достигается тем, что в известном способе, включающем инкубацию тканей до имплантации в физиологическом солевом растворе с агентами, вызывающими гибель клеток донора, согласно предлагаемому изобретению трансплантаты инкубируют в солевом растворе без ионов кальция и фосфатов, содержащем хелаторы кальция в концентрации, достаточной для инициации гибели клеток донора и ингибирования центров кальциноза, и дигитонин. При этом в качестве хелаторов ионов кальция используют ЭДТА в концентрации от 0,2% до 2% либо цитрат натрия в концентрации от 1 до 2,5%, а для повышения эффективности гибели клеток донора добавляют дигитонин в концентрации до 0,1% и инкубируют трансплантаты при значении рН раствора в диапазоне от 5,0 до 7,4 и при температуре в диапазоне от 10 до 37°С в течение 2-4 суток.The problem is achieved in that in the known method, including incubation of tissues before implantation in physiological saline with agents that cause the death of donor cells, according to the invention, the grafts are incubated in saline without calcium ions and phosphates containing calcium chelators in a concentration sufficient to initiate death of donor cells and inhibition of centers of calcification, and digitonin. Moreover, EDTA at a concentration of 0.2% to 2% or sodium citrate at a concentration of 1 to 2.5% are used as calcium ion chelators, and digitonin at a concentration of up to 0.1% is added to increase the efficiency of death of donor cells and incubated grafts at a pH of the solution in the range from 5.0 to 7.4 and at a temperature in the range from 10 to 37 ° C for 2-4 days.
В предпочтительном для полного предотвращения кальциноза варианте способа трансплантаты инкубируют в солевом растворе, содержащем 0,4% ЭДТА, 0,02% дигитонина при рН 6,0 при комнатной температуре (20-25°С) в течение 2 суток.In a preferred embodiment of the method to completely prevent calcification, the transplants are incubated in saline containing 0.4% EDTA, 0.02% digitonin at pH 6.0 at room temperature (20-25 ° C) for 2 days.
Применение для инкубации солевого раствора без ионов кальция и фосфатов, который содержит также хелаторы ионов кальция в высоких концентрациях и дигитонин, обеспечивает не только гибель клеток, но и эффективное связывание ионов кальция в процессе клеточной гибели, что предотвращает накопление фосфатов кальция в митохондриях и тем самым препятствует зарождению центров кальциноза ткани. Хелаторы ионов кальция при высоких концентрациях инициируют апоптотическую клеточную гибель и, кроме того, связывая ионы кальция в околоклеточном микроокружении, препятствуют локальному накоплению фосфатов кальция в митохондриях и зарождению центров кальциноза. Отсутствие ионов фосфатов и кальция в инкубационном растворе также препятствует образованию центров кальциноза во время гибели клеток. Дигитонин повышает эффективность клеточной гибели, связываясь с холестерином плазматической мембраны, в результате чего нарушается ее целостность и обеспечивается быстрая некротическая гибель клеток. Указанные в заявляемом способе значения рН солевого раствора необходимы для эффективного снижения кальциноза, поскольку минерализация фосфатов кальция и, соответственно, кальциноз ткани усиливается при щелочных рН, а при низких значениях рН (ниже 5,0) повышается вероятность конформационных перестроек белков тканевого матрикса, которые также будут способствовать минерализации кальция. Заявляемый способ может работать в широком диапазоне температур.The use for the incubation of a saline solution without calcium ions and phosphates, which also contains high concentration chelators of ions of calcium and digitonin, provides not only cell death, but also effective binding of calcium ions during cell death, which prevents the accumulation of calcium phosphates in mitochondria, and thereby interferes with the nucleation of tissue calcification centers. Chelators of calcium ions at high concentrations initiate apoptotic cell death and, in addition, by binding calcium ions in the pericellular microenvironment, they prevent the local accumulation of calcium phosphates in mitochondria and the origin of calcification centers. The absence of phosphate and calcium ions in the incubation solution also prevents the formation of calcification centers during cell death. Digitonin increases the efficiency of cell death by binding to plasma membrane cholesterol, as a result of which its integrity is violated and rapid necrotic cell death is ensured. The pH values of the salt solution indicated in the claimed method are necessary to effectively reduce calcification, since the mineralization of calcium phosphates and, accordingly, tissue calcification increases at alkaline pH, and at low pH values (below 5.0), the probability of conformational rearrangements of tissue matrix proteins increases, which also will contribute to the mineralization of calcium. The inventive method can operate in a wide range of temperatures.
В предлагаемом варианте спрособа, обеспечивающем полное предотвращение кальциноза, дигитонин вызывает быструю некротическую гибель клеток, а отсутствие ионов фосфатов, кальция и наличие хелатора кальция ЭДТА в инкубационном солевом растворе при рН 6,0 и комнатной температуре (20-25°С) препятствуют зарождению центров кальциноза в погибающих клетках. Ниже представлены примеры реализации предложенного способа подготовки трансплантатов.In the proposed variant of demand, which completely prevents calcification, digitonin causes rapid necrotic cell death, and the absence of phosphate ions, calcium and the presence of EDTA calcium chelator in incubation saline at pH 6.0 and room temperature (20-25 ° C) prevent the nucleation of centers calcification in dying cells. Below are examples of the implementation of the proposed method of preparation of transplants.
Пример 1.Example 1
Фрагменты стенки аорты свиньи, которые согласно люминесцентному анализу содержали до обработки живые гладкомышечные и эндотелиальные клетки, инкубировали при 20°С в течение 2 суток в солевом растворе без ионов кальция и фосфатов, содержащем 0,8% хлористого натрия, 0,4% ЭДТА, 0,25% органического буфера HEPES, рН 7,4, антибиотики гентамицин (400 мг/л) и флуканазол (20 мг/л) для обеспечения стерильности. ЭДТА в указанной концентрации применяли для того, чтобы инициировать гибель клеток, а также для того, чтобы хелатировать кальций и препятствовать образованию центров минерализации кальция во время гибели клеток. После инкубации фрагменты в течение 1 суток отмывали в забуференном солевом растворе (рН 7,4) без ионов кальция и фосфатов при 20°С, три раза меняя раствор на свежий для удаления ЭДТА. Согласно люминесцентному микроскопическому анализу после такой обработки клетки во фрагментах не менее 5 суток оставались живыми. Однако, если после обработки фрагменты помещали в питательную среду Игла с кальцием при 37°С, клетки в ткани начинали погибать в первые два часа и через 8 часов все клетки погибали. Аналогичная ситуация была после имплантации этих фрагментов крысам под кожу. Следовательно, инкубация, выполненная в соответствии с заявляемым способом, запускала гибель клеток, и реализация этой гибели осуществлялась при наличии субстратов.Fragments of the pig’s aortic wall, which, according to the luminescent analysis, contained live smooth muscle and endothelial cells before treatment, were incubated at 20 ° C for 2 days in a saline solution without calcium ions and phosphates containing 0.8% sodium chloride, 0.4% EDTA, 0.25% HEPES organic buffer, pH 7.4, antibiotics gentamicin (400 mg / l) and flucanazole (20 mg / l) to ensure sterility. EDTA at the indicated concentration was used to initiate cell death, as well as to chelate calcium and prevent the formation of calcium mineralization centers during cell death. After incubation, the fragments were washed for 1 day in buffered saline (pH 7.4) without calcium ions and phosphates at 20 ° C, changing the solution to fresh three times to remove EDTA. According to luminescent microscopic analysis, after such treatment, the cells in the fragments remained alive for at least 5 days. However, if, after treatment, the fragments were placed in the Eagle's nutrient medium with calcium at 37 ° C, the cells in the tissue began to die in the first two hours and after 8 hours all the cells died. A similar situation was after implantation of these fragments to rats under the skin. Therefore, incubation performed in accordance with the claimed method, triggered cell death, and the implementation of this death was carried out in the presence of substrates.
Второй набор фрагментов стенок аорты свиньи инкубировали в дистиллированной воде и в физиологическом растворе, содержащем рибонуклеазу (20 мкг/мл) и дезоксирибонуклеазу (0,2 мг/мл) согласно известному способу (см.: Sem Thorac Cardiovasc Surg 1999, vol.4 (Suppl 1), p.194-200). Третий и четвертый наборы фрагментов обрабатывали с применением протеолитического фермента трипсина (0,25%) и ЭДТА (0,02%), с последующей обработкой рибонуклеазой (20 мкг/мл) и дезоксирибонуклеазой (0,2 мг/мл) в соответствии с другим известным способом (см.: Eur. J Vasc. Endovasc. Surg., 2000, vol.19, p.381-386) либо без обработки нуклеазами, как в способе, принятом за прототип. Второй и третий наборы не содержали после обработок ни живых, ни погибших клеток. В четвертом наборе все клетки после обработки были погибшими.The second set of fragments of porcine aortic wall was incubated in distilled water and in physiological saline containing ribonuclease (20 μg / ml) and deoxyribonuclease (0.2 mg / ml) according to the known method (see: Sem Thorac Cardiovasc Surg 1999, vol. 4 ( Suppl 1), p. 194-200). The third and fourth sets of fragments were processed using the proteolytic enzyme trypsin (0.25%) and EDTA (0.02%), followed by treatment with ribonuclease (20 μg / ml) and deoxyribonuclease (0.2 mg / ml) in accordance with another in a known manner (see: Eur. J Vasc. Endovasc. Surg., 2000, vol.19, p.381-386) or without treatment with nucleases, as in the method adopted for the prototype. The second and third sets did not contain either live or dead cells after treatment. In the fourth set, all cells after treatment were dead.
Пятый набор фрагментов сохраняли 3 суток при 4°С в питательной среде RPMI 1640 (рН 7,4) и использовали в качестве контрольных трансплантатов с живыми клетками донора. После этой инкубации эндотелиальные и гладкомышечные клетки во фрагментах оставались живыми.The fifth set of fragments was stored for 3 days at 4 ° C in RPMI 1640 nutrient medium (pH 7.4) and was used as control transplants with living donor cells. After this incubation, the endothelial and smooth muscle cells in the fragments remained alive.
Фрагменты стенок аорты после обработок помещали в пористые камеры из нержавеющей стали с размером пор 40 мкм и имплантировали крысам линии Wistar под кожу в область спины. После 2 месяцев фрагменты эксплантировали из крыс и определяли в них содержание минерализованного кальция методом атомной абсорбционной спектроскопии. На фиг.1 приведены данные о содержании кальция в трансплантатах, обработанных известными способами, вызывающими разрушение или только гибель клеток донора, и заявляемым способом, вызывающим гибель клеток и препятствующим зарождению центров минерализации. Кроме того, представлены данные о минерализации фрагментов, содержащих живые клетки донора. Видно, что при обработке известными способами кальциноз имплантированных крысам фрагментов аорты свиньи не уменьшался. После обработки трансплантатов заявляемым способом в физиологическом растворе без кальция и фосфатов, содержащем ЭДТА в высокой концентрации (0,4%), при 37°С и рН 7,4, содержание минерализованного кальция в трансплантатах уменьшалось с 70 мг/г сухого веса ткани (необработанные трансплантаты) до 6,1 мг/г сухого веса ткани. Таким образом, применение предложенного способа путем обеспечения гибели клеток донора при высокой концентрации хелатора кальция ЭДТА, эффективно препятствующей зарождению центров минерализации, позволило значительно предотвратить кальциноз трансплантатов стенок аорты свиньи в крысах.Fragments of the aortic walls after treatments were placed in porous stainless steel chambers with a pore size of 40 μm and were implanted into Wistar rats under the skin in the back. After 2 months, the fragments were explanted from rats and the content of mineralized calcium was determined in them by atomic absorption spectroscopy. Figure 1 shows data on the calcium content in transplants treated by known methods that cause destruction or only death of donor cells, and the claimed method, causing cell death and preventing the nucleation of mineralization centers. In addition, data are presented on the mineralization of fragments containing living donor cells. It is seen that when processing by known methods, calcification of pig aortic fragments implanted in rats did not decrease. After treating the grafts with the claimed method in physiological saline without calcium and phosphates containing high concentration of EDTA (0.4%) at 37 ° C and pH 7.4, the content of mineralized calcium in the grafts decreased from 70 mg / g dry tissue weight ( untreated grafts) up to 6.1 mg / g dry tissue weight. Thus, the application of the proposed method by ensuring the death of donor cells at a high concentration of calcium chelator EDTA, which effectively prevents the emergence of mineralization centers, significantly prevented calcification of transplantation of pig aortic wall in rats.
Пример 2.Example 2
Первую часть фрагментов стенок аорты свиньи инкубировали 2 суток при 20°С в забуференном органическим буфером HEPES (0,25%, рН 6,0) солевом растворе хлористого натрия (0,8%) без ионов кальция и фосфатов, содержащем 0,4% ЭДТА, 0,02% дигитонина, гентамицин (400 мг/л) и флуканазол (20 мг/л). Затем фрагменты отмывали 1 сутки в аналогичном физиологическом растворе, но без ЭДТА и дигитонина, меняя три раза раствор на свежий с целью удаления ЭДТА и дигитонина из фрагментов. После обработки все клетки во фрагментах были погибшими, но ядра клеток оставались в ткани. Следовательно, применяемая обработка не удаляла остатки погибших клеток из ткани. Второй набор фрагментов инкубировали 2 суток при 37°С в питательной среде Игла с кальцием с добавлением дигитонина (0,02%), гентамицина (400 мг/л) и флуконазола (20 мг/л) при рН 7,4. Затем дигитонин удаляли из фрагментов отмывкой солевым раствором, как и в первом наборе фрагментов. Во втором наборе фрагментов все клетки после обработки были погибшими и оставались во фрагментах ткани. Для этого набора фрагментов не предпринималось попыток ингибировать образование зародышей минерализации во время гибели клеток. Третий набор фрагментов сохраняли 2 суток при 4°С в питательной среде Игла (рН 7,4) с кальцием и использовали в качестве контрольных трансплантатов с живыми клетками донора, как в первом примере. После такой инкубации все клетки во фрагментах оставались живыми.The first part of the fragments of the aortic wall of the pig was incubated for 2 days at 20 ° C in HEPES buffered organic buffer (0.25%, pH 6.0) sodium chloride solution (0.8%) without calcium ions and phosphates containing 0.4% EDTA, 0.02% digitonin, gentamicin (400 mg / l) and flucanazole (20 mg / l). Then the fragments were washed for 1 day in the same physiological saline, but without EDTA and digitonin, changing the solution three times to fresh in order to remove EDTA and digitonin from the fragments. After treatment, all cells in the fragments were dead, but the nuclei of the cells remained in the tissue. Therefore, the treatment used did not remove the remains of dead cells from the tissue. The second set of fragments was incubated for 2 days at 37 ° C in a nutrient medium Eagle with calcium supplemented with digitonin (0.02%), gentamicin (400 mg / l) and fluconazole (20 mg / l) at pH 7.4. Then, digitonin was removed from the fragments by washing with saline, as in the first set of fragments. In the second set of fragments, all cells after treatment were dead and remained in tissue fragments. No attempt was made to inhibit the formation of mineralization nuclei during cell death for this set of fragments. The third set of fragments was stored for 2 days at 4 ° C in Eagle's nutrient medium (pH 7.4) with calcium and was used as control transplants with living donor cells, as in the first example. After this incubation, all cells in the fragments remained alive.
Кальциноз трансплантатов изучали так же, как и в первом примере, методом подкожной имплантации крысам. После 2 месяцев фрагменты эксплантировали из крыс и измеряли в них содержание минерализованного кальция методом атомной абсорбционной спектроскопии. На фиг.2 представлены данные о содержании кальция в трансплантатах с живыми клетками донора (контроль), в трансплантатах, обработанных только дигитонином, когда вызывали гибель клеток, но не ингибировали образование центров минерализации, и в трансплантатах, подготовленных заявляемым способом. Видно, что после обработки трансплантатов, вызывающей гибель клеток, но не препятствующей образованию центров минерализации, кальциноз был такой же активный, как в трансплантатах с живыми клетками донора. После обработки трансплантатов, выполненной в соответствии с заявляемым способом, кальциноз трансплантатов подавлялся полностью. Таким образом, заявляемый способ обработки трансплантатов, в котором сочетается обеспечение гибели клеток и ингибирование возникновения центров минерализации, вызывал полное подавление кальциноза трансплантатов.Graft calcification was studied in the same way as in the first example by subcutaneous implantation in rats. After 2 months, the fragments were explanted from rats and the content of mineralized calcium was measured in them by atomic absorption spectroscopy. Figure 2 presents data on the calcium content in transplants with living donor cells (control), in transplants treated only with digitonin, when they caused cell death, but did not inhibit the formation of mineralization centers, and in transplants prepared by the claimed method. It can be seen that after the treatment of transplants, which causes cell death, but does not prevent the formation of mineralization centers, calcification was as active as in transplants with living donor cells. After processing the grafts, performed in accordance with the claimed method, calcification of the grafts was completely suppressed. Thus, the claimed method of processing grafts, which combines the provision of cell death and the inhibition of the emergence of centers of mineralization, caused a complete suppression of calcification of the grafts.
Пример 3.Example 3
Часть фрагментов стенок аорты свиньи инкубировали 2 суток при 20°С в забуференном (рН 6,0) физиологическом растворе без ионов кальция и фосфатов, содержащем 1,3% цитрата натрия, гентамицин (400 мг/л) и флуканазол (20 мг/л). Затем фрагменты отмывали в течение суток в аналогичном растворе, но без цитрата натрия, меняя три раза раствор на свежий с целью удаления цитрата из фрагментов. Цитрат применяли для того, чтобы инициировать гибель клеток, а также для того, чтобы хелатировать кальций и тем самым препятствовать образованию центров минерализации кальция во время гибели клеток. Люминесцентный анализ показал, что клетки в обработанных фрагментах, помещенных в отмывочном растворе, оставались живыми длительное время, не менее 5 суток. Однако если после обработки фрагменты помещали в питательную среду Игла с кальцием при 37°С, клетки в ткани начинали погибать в первые два часа и через 8 часов все клетки были погибшими. Аналогичная ситуация была после имплантации этих фрагментов крысам под кожу. Второй набор фрагментов инкубировали 3 дня в питательной среде Игла с кальцием при 37°С (контроль). Клетки после такой инкубации оставались живыми как до инкубации. Кальциноз трансплантатов изучали так же, как и в первых двух примерах, используя широко известную модель подкожной имплантации крысам. Фрагменты стенок аорты свиньи эксплантировали из крыс после 2 месяцев имплантации и измеряли в них содержание минерализованного кальция методом атомной абсорбционной спектроскопии. На фиг.3 представлены данные о содержании кальция в трансплантатах с живыми клетками донора (контроль), а также в трансплантатах, подготовленных согласно предлагаемому способу. Согласно полученным результатам обработка цитратом вызывала эффективное уменьшение содержания минерализованного кальция в трансплантатах до 1,7 мг/г сухого веса ткани, в то время как трансплантат с живыми клетками без обработки кальцифицировался значительно (65 мг/г сухого веса ткани).Some pig wall fragments were incubated for 2 days at 20 ° C in buffered saline (pH 6.0) without calcium ions and phosphates containing 1.3% sodium citrate, gentamicin (400 mg / l) and flucanazole (20 mg / l ) Then the fragments were washed overnight in a similar solution, but without sodium citrate, changing the solution three times to fresh in order to remove citrate from the fragments. Citrate was used to initiate cell death, as well as to chelate calcium and thereby prevent the formation of calcium mineralization centers during cell death. Luminescent analysis showed that the cells in the treated fragments placed in the washing solution remained alive for a long time, at least 5 days. However, if, after treatment, the fragments were placed in a Needle medium with calcium at 37 ° C, the cells in the tissue began to die in the first two hours and after 8 hours all the cells were dead. A similar situation was after implantation of these fragments to rats under the skin. The second set of fragments was incubated for 3 days in a nutrient medium Needle with calcium at 37 ° C (control). The cells after this incubation remained alive as before the incubation. Graft calcification was studied in the same way as in the first two examples using the well-known rat subcutaneous implantation model. Fragments of the walls of the aortic pig were explanted from rats after 2 months of implantation and the content of mineralized calcium was measured in them by atomic absorption spectroscopy. Figure 3 presents data on the calcium content in transplants with living donor cells (control), as well as in transplants prepared according to the proposed method. According to the results obtained, treatment with citrate caused an effective decrease in the content of mineralized calcium in the transplants to 1.7 mg / g dry tissue weight, while a transplant with living cells without treatment was calcified significantly (65 mg / g dry tissue weight).
Таким образом, приведенные примеры показывают, что заявляемый способ обработки трансплантатов, в котором обеспечивают гибель клеток донора до или после имплантации и ингибируют возникновение центров минерализации, предотвращает кальциноз трансплантатов.Thus, the above examples show that the inventive method of processing grafts, in which they ensure the death of donor cells before or after implantation and inhibit the occurrence of centers of mineralization, prevents transplant calcification.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2004121050/15A RU2291675C2 (en) | 2004-07-09 | 2004-07-09 | Method for treating cardiovascular surgical transplants |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2004121050/15A RU2291675C2 (en) | 2004-07-09 | 2004-07-09 | Method for treating cardiovascular surgical transplants |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2004121050A RU2004121050A (en) | 2006-01-10 |
| RU2291675C2 true RU2291675C2 (en) | 2007-01-20 |
Family
ID=35872141
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2004121050/15A RU2291675C2 (en) | 2004-07-09 | 2004-07-09 | Method for treating cardiovascular surgical transplants |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2291675C2 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2445940C1 (en) * | 2010-11-03 | 2012-03-27 | Федеральное государственное учреждение "Всероссийский центр глазной и пластической хирургии Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" | Method for producing allogenic transplants of cardiac vessels with valves |
| RU2457867C1 (en) * | 2011-05-05 | 2012-08-10 | Учреждение Российской академии медицинских наук Научный центр сердечно-сосудистой хирургии имени А.Н. Бакулева РАМН | Method for sterilisation and pre-implantation storage of biological prostheses of xenogenic and allogenic tissue for cardiovascular surgery |
| RU2796364C1 (en) * | 2022-03-02 | 2023-05-22 | Общество с ограниченной ответственностью "МНТ" (ООО "МНТ") | Method of processing grafts for cardiovascular surgery using sub- and supercritical carbon dioxide |
-
2004
- 2004-07-09 RU RU2004121050/15A patent/RU2291675C2/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| CEBOTARI S. et al. Construction of autologous human heart valves based on an acellular allograft matrix, Circulation. 2002, Sept 24; (suppi 1) p 63-68. * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2445940C1 (en) * | 2010-11-03 | 2012-03-27 | Федеральное государственное учреждение "Всероссийский центр глазной и пластической хирургии Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" | Method for producing allogenic transplants of cardiac vessels with valves |
| RU2457867C1 (en) * | 2011-05-05 | 2012-08-10 | Учреждение Российской академии медицинских наук Научный центр сердечно-сосудистой хирургии имени А.Н. Бакулева РАМН | Method for sterilisation and pre-implantation storage of biological prostheses of xenogenic and allogenic tissue for cardiovascular surgery |
| RU2796364C1 (en) * | 2022-03-02 | 2023-05-22 | Общество с ограниченной ответственностью "МНТ" (ООО "МНТ") | Method of processing grafts for cardiovascular surgery using sub- and supercritical carbon dioxide |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2004121050A (en) | 2006-01-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2447847C (en) | Decellularisation of matrices | |
| US5855620A (en) | Matrix substrate for a viable body tissue-derived prosthesis and method for making the same | |
| ES2255048T3 (en) | METHOD FOR PROCESSING AND PRESERVING COLAGEN-BASED FABRICS FOR TRANSPLANTATION. | |
| CA2345799C (en) | Process for reducing mineralization of tissue used in transplantation | |
| US20070123700A1 (en) | Processes for removing cells and cell debris from tissue and tissue constructs used in transplantation and tissue reconstruction | |
| US20100112543A1 (en) | Processing soft tissue, methods and compositions related thereto | |
| US20100291532A1 (en) | Process for sterilizing acellular soft tissue with irradiation | |
| AU2002310589A1 (en) | Decellularisation of matrices | |
| US20050238688A1 (en) | Method of preparing an immunologically inert graft material from body tissue and material made with the method | |
| WO2009117858A1 (en) | A method for preparing the decellularized matrix | |
| WO2008048663A2 (en) | Novel process for devitalized/acellular tissue for transplantation | |
| EP3488878A1 (en) | Enzyme-activated collagen and tissue matrices | |
| US20100296969A1 (en) | Process for sterilizing acellular soft tissue under vacuum | |
| WO2006057674A2 (en) | COMPOSITIONS AND METHODS FOR EX VIVO PRESERVATION OF BLOOD VESSELS FOR VASCULAR GRAFTS USING ANALOGUES OF cAMP AND cGMP | |
| RU2291675C2 (en) | Method for treating cardiovascular surgical transplants | |
| CA2509519A1 (en) | Method of treating biological tissue by microwave-irradiation | |
| KR100803384B1 (en) | Long-term preservation method for skin tissue | |
| Krasovskaya et al. | Biochemical and physico-chemical aspects of biomaterials calcification | |
| CN110743039A (en) | Preparation method of autologous skull used for replanting material | |
| US20230079141A1 (en) | A method for producing a decellularized tissue scaffold | |
| RU2353092C2 (en) | Sterile process for implantable or transplantable biological material | |
| RU2499611C1 (en) | Method for improving biocompatibility of valve and vascular grafts | |
| RU2678966C1 (en) | Method for improving biocompatability of pericardial biomaterials for reconstructive surgery | |
| RU2231997C2 (en) | Method for treating transplants' tissues for cardiovascular surgery | |
| US20050169894A1 (en) | Compositions and methods for ex vivo preservation of blood vessels for vascular grafts using inhibitors of Type III and/or Type IV phosphodiesterases |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20080710 |