RU2288714C2

RU2288714C2 - Agent for treatment of brain ischemic injury

Info

Publication number: RU2288714C2
Application number: RU2004109597/15A
Authority: RU
Inventors: Сергей Борисович Середенин (RU); Сергей Борисович Середенин; н Вилен Паруйрович Акоп (AM); Вилен Паруйрович Акопян; Нина Ивановна Авдюнина (RU); Нина Ивановна Авдюнина; н Марине Гарниковна Баласан (AM); Марине Гарниковна Баласанян; Елена Артуровна Вальдман (RU); Елена Артуровна Вальдман; Тать на Алексеевна Зенина (RU); Татьяна Алексеевна Зенина; н Рубен Симонович Мирзо (RU); Рубен Симонович Мирзоян; тин Борис Михайлович П (RU); Борис Михайлович Пятин; Тамара Сергеевна Середенина (RU); Тамара Сергеевна Середенина; н Акоп Вартанович Топч (AM); Акоп Вартанович Топчян
Priority date: 2004-03-31
Filing date: 2004-03-31
Publication date: 2006-12-10
Also published as: RU2004109597A

Abstract

FIELD: medicine, neurology, pharmacy.

SUBSTANCE: invention relates to an agent used in treatment of ischemic injuries in brain. Invention proposes an anxiolytic agent 5-ethoxy-2-[2-(morpholino)ethylthio]benzimidazole dihydrochloride (AFOBAZOL) that shows the expressed neuroprotective activity and can be recommended as an agent for treatment of ischemic insult and other ischemic brain injuries.

EFFECT: valuable medicinal properties of agent.

3 tbl

Description

Изобретение относится к медицине, в частности к фармакологии, и касается средства, обладающего противоишемической и нейропротекторной активностью, которое может быть рекомендовано к применению в клинической практике для лечения ишемического инсульта и других ишемических состояний мозга. Ишемические поражения мозга в большинстве развитых стран занимают одно из ведущих мест среди основных причин смертности и инвалидизации населения. При ишемическом инсульте центральный инфаркт окружен ишемизированной, но живой зоной «ишемической полутени» или «пенумбры», где еще сохранен в целом энергетический метаболизм и имеют место лишь функциональные, но не структурные изменения. Эта область мозга и подлежит фармакологической коррекции, целью которой является восстановление кровоснабжения, метаболизма и функционального состояния поврежденной зоны. Церебральная ишемия характеризуется значительным высвобождением глутамата и других возбуждающих нейромедиаторных аминокислот, которые играют ключевую роль в развитии некротического поражения нервных клеток. Установлена взаимосвязь между нейротоксичностью глутамата и транспортом ионов кальция в нервной ткани.The invention relates to medicine, in particular to pharmacology, and relates to an agent having anti-ischemic and neuroprotective activity, which can be recommended for use in clinical practice for the treatment of ischemic stroke and other ischemic conditions of the brain. Ischemic brain damage in most developed countries occupy one of the leading places among the main causes of mortality and disability of the population. In ischemic stroke, a central heart attack is surrounded by an ischemic, but lively zone of “ischemic penumbra” or “penumbra,” where energy metabolism is still generally preserved and only functional, but not structural changes take place. This area of the brain is subject to pharmacological correction, the purpose of which is to restore blood supply, metabolism and the functional state of the damaged zone. Cerebral ischemia is characterized by a significant release of glutamate and other exciting neurotransmitter amino acids, which play a key role in the development of necrotic damage to nerve cells. The relationship between the neurotoxicity of glutamate and the transport of calcium ions in the nervous tissue has been established.

Многочисленные исследования последних лет, посвященные изучению нейропротекторной активности блокаторов кальциевых каналов, позволили выявить препарат нимодипин (РЛС, Энциклопедия лекарств, 2004 г., 11), который в настоящее время применяется в неврологической практике при лечении больных с цереброваскулярными расстройствами. Однако литературные данные, посвященные изучению его эффективности при ишемическом поражении головного мозга, не отличаются однородностью, так как нимодипин понижает уровень артериального давления и это негативно влияет на кровоснабжение ишемизированной области мозга. Что касается антагонистов глутаматных рецепторов, то несмотря на положительные результаты экспериментального изучения соединения МК-801 (дизоцилпин) (Kemp et al., Trens Pharmacol. Sci., v.10, p.294-298, 1987), его клинические испытания были прекращены из-за серьезных побочных эффектовNumerous studies of recent years devoted to the study of the neuroprotective activity of calcium channel blockers have revealed the drug nimodipine (Radar, Drug Encyclopedia, 2004, 11), which is currently used in neurological practice in the treatment of patients with cerebrovascular disorders. However, literature data on the study of its effectiveness in ischemic brain damage do not differ in homogeneity, since nimodipine lowers blood pressure and this negatively affects the blood supply to the ischemic area of the brain. As for antagonists of glutamate receptors, despite the positive results of an experimental study of compound MK-801 (disocilpin) (Kemp et al., Trens Pharmacol. Sci., V.10, p. 294-298, 1987), its clinical trials were discontinued due to serious side effects

Все это свидетельствует о необходимости поиска новых путей фармакологической коррекции ишемических поражений головного мозга. В соответствии с вышеизложенным, перспективным направлением исследований является изыскание средств, способных противодействовать постишемической активации возбуждающей нейротрансмиссии путем повышения активности тормозной ГАМК-ергической системы. Подобный подход к защите ишемизированного мозга основан еще и на том, что в избирательно уязвимых к ишемии регионах, наряду с высокой плотностью кальциевых каналов, контролируемых NMDA-рецепторами, обнаружено множество ГАМК-ергических нервных окончаний. Действительно, если в норме механизмы возбуждения и торможения находятся в состоянии устойчивого равновесия, то в условиях ишемии развивается дисбаланс между возбуждающими и тормозными нейромедиаторными системами. Указанный дисбаланс характерен не только для ишемического поражения мозга, но и для состояния патологической тревожности (Lydiard, J., Clin Psychiatry; v.64 (3), pp.21-27, 2003).All this indicates the need to find new ways of pharmacological correction of ischemic brain lesions. In accordance with the foregoing, a promising area of research is finding funds that can counteract the postischemic activation of exciting neurotransmission by increasing the activity of the inhibitory GABA-ergic system. A similar approach to the protection of the ischemic brain is based on the fact that in the regions selectively vulnerable to ischemia, along with a high density of calcium channels controlled by NMDA receptors, many GABA-ergic nerve endings were found. Indeed, while normal mechanisms of excitation and inhibition are in a state of stable equilibrium, then in conditions of ischemia an imbalance develops between excitatory and inhibitory neurotransmitter systems. The indicated imbalance is characteristic not only for ischemic brain damage, but also for the state of pathological anxiety (Lydiard, J., Clin Psychiatry; v.64 (3), pp.21-27, 2003).

Необходимо также отметить, что инсульт довольно часто сопровождается повышенным чувством тревожности (Schultz S.K. et al., Am. J. Geriat. Psych.; 5, 229-237, 1997). Установлено, что у 25-50% больных с острыми цереброваскулярными нарушениями развиваются генерализованные тревожные расстройства, которые регистрируются даже через три года после перенесенного ишемического инсульта (Carota A. et al., Neurology, v.15, pp.57-69, 2002). Психоневрологические последствия цереброваскулярных нарушений охватывают довольно широкий спектр эмоциональных и когнитивных расстройств, проявление которых имеет исключительно важное значение для клинической оценки результатов лечения инсульта (Truelsen Т., Bonita R., Adv. Neurol, v.92, pp.1-12, 2003).It should also be noted that stroke is often accompanied by an increased sense of anxiety (Schultz S.K. et al., Am. J. Geriat. Psych .; 5, 229-237, 1997). It has been established that 25-50% of patients with acute cerebrovascular disorders develop generalized anxiety disorders that are recorded even three years after an ischemic stroke (Carota A. et al., Neurology, v.15, pp. 57-69, 2002) . The neuropsychiatric consequences of cerebrovascular disorders cover a fairly wide range of emotional and cognitive disorders, the manifestation of which is extremely important for the clinical evaluation of stroke outcomes (Truelsen T., Bonita R., Adv. Neurol, v.92, pp.1-12, 2003) .

Сущность изобретения заключается в разработке лекарственного средства, которое обладает нейропротекторной активностью и может явиться средством для уменьшения ишемических повреждений мозга. С этой целью было изучено нейропротекторное действие афобазола - оригинального селективного анксиолитика, разработанного в НИИ фармакологии РАМН (Середенин С.Б. и соавт., Производные меркаптобензимидазола, обладающие селективной анксиолитической активностью. Патент Российской Федерации №2061686, Бюллетень изобретений, №16, 1996). Выбор афобазола был продиктован особенностями механизма его действия. Так, в экспериментальных исследованиях было показано, что препарат препятствует развитию мембранозависимых изменений в ГАМК-бензодиазепиновом рецепторном комплексе, приводящих к снижению доступности рецепторного участка для лиганда, т.е. афобазол повышает аффинность эндогенного лиганда к рецептору, способствуя тем самым усилению ГАМК-ергической передачи (Середенин С.Б. и соавт., Вестник РАМП, №11, с.3-9, 1998). Данные клинического изучения афобазола подтвердили наличие у препарата анксиолитического действия с активирующим компонентом при отсутствии седативного, миорелаксантного эффектов (Незнамов Г.Г. и соавт., Экспериментальная и клиническая фармакология, т.64, №2, с.15-19, 2001).The essence of the invention lies in the development of a drug that has neuroprotective activity and may be a means to reduce ischemic brain damage. To this end, the neuroprotective effect of afobazole, an original selective anxiolytic developed at the Scientific Research Institute of Pharmacology of the Russian Academy of Medical Sciences (Seredenin SB et al., Derivatives of mercaptobenzimidazole with selective anxiolytic activity, was studied. Patent of the Russian Federation No. 2061686, Bulletin of inventions, No. 16, 1996) . The choice of afobazole was dictated by the features of its mechanism of action. Thus, in experimental studies it was shown that the drug prevents the development of membrane-dependent changes in the GABA-benzodiazepine receptor complex, leading to a decrease in the availability of the receptor site for the ligand, i.e. afobazole increases the affinity of the endogenous ligand for the receptor, thereby enhancing the GABAergic transmission (Seredenin SB et al., Vestnik RAMP, No. 11, pp. 3-9, 1998). The data from a clinical study of afobazole confirmed the presence of an anxiolytic effect with an activating component in the drug in the absence of sedative, muscle relaxant effects (G. Neznamov et al., Experimental and Clinical Pharmacology, vol. 64, No. 2, pp. 15-19, 2001).

Фармакологическая активность афобазола оценивалась по тестам, принятым для оценки нейропротекторной активности («Руководство по экспериментальному изучению новых фармакологических веществ», Москва, 2000). При этом исследовалось морфологическое состояние, активность сукцинатдегидрогеназы в ткани мозга и поведение животных, в условиях локального ишемического поражения мозга. В качестве модели локальной ишемии была избрана модель перевязки средней мозговой артерии Tamura et al. в модификации Топчяна А.В. и соавт.(Экспериментальная и клиническая фармакология, т.59, №5, с.62-64, 1996). Окклюзия средней мозговой артерии вызывает ишемические нарушения, типичные для большинства клинических проявлений цереброваскулярных расстройств ишемической природы.The pharmacological activity of afobazole was evaluated according to tests taken to assess neuroprotective activity ("Guide to the experimental study of new pharmacological substances", Moscow, 2000). At the same time, the morphological state, the activity of succinate dehydrogenase in the brain tissue and the behavior of animals under conditions of local ischemic brain damage were investigated. As a model of local ischemia, the model of ligation of the middle cerebral artery Tamura et al. in the modification Topchyan A.V. et al. (Experimental and Clinical Pharmacology, vol. 59, No. 5, pp. 62-64, 1996). Occlusion of the middle cerebral artery causes ischemic disorders typical of most clinical manifestations of cerebrovascular disorders of an ischemic nature.

Оценка состояния микроциркуляции в условиях перевязки средней мозговой артерии проводилась регистрацией локального кровотока в теменной области коры головного мозга крыс с помощью лазерного допплеровского флоуметра ALF - 21 фирмы «Transonic systems. Inc.» США. Для этой цели игольчатый датчик флоуметра диаметром 0,8 мм устанавливали с помощью микроманипулятора и коромысла в теменной области коры головного мозга на расстоянии 6-7 мм дистальнее основания средней мозговой артерии по направлению к ее центральной ветви. Одновременно проводили регистрацию уровня артериального давления электроманометром BPR-01 «Экспериметрия» (Венгрия). Напряжение углекислоты регистрировали с помощью накожного датчика ТСМ-20 «Radiometer» (Дания), который был установлен на мышцах грудной клетки животного.Assessment of the state of microcirculation under conditions of ligation of the middle cerebral artery was carried out by recording local blood flow in the parietal region of the cerebral cortex of rats using an ALF-21 laser Doppler flowmeter from Transonic systems. Inc. »USA. For this purpose, a 0.8 mm diameter flowmeter needle sensor was installed using a micromanipulator and a rocker in the parietal region of the cerebral cortex at a distance of 6-7 mm distal to the base of the middle cerebral artery towards its central branch. At the same time, the blood pressure level was recorded with the BPR-01 Experimetry electrometer (Hungary). The carbon dioxide voltage was recorded using a TCM-20 “Radiometer” skin sensor (Denmark), which was installed on the muscles of the chest of the animal.

Опыты показали, что сразу же после перевязки средней мозговой артерии в теменной области коры головного мозга локальный мозговой кровоток понижается на 85,0±9,0% и продолжает оставаться на низком уровне в течение всего эксперимента (60-120 минут). При этом, не наблюдалось существенных изменений уровня артериального давления и напряжения углекислоты в мышечной ткани.The experiments showed that immediately after ligation of the middle cerebral artery in the parietal region of the cerebral cortex, the local cerebral blood flow decreases by 85.0 ± 9.0% and continues to remain at a low level throughout the experiment (60-120 minutes). At the same time, there were no significant changes in blood pressure and carbon dioxide tension in muscle tissue.

Результаты гистологического исследования позволили заключить, что использованная модель ишемического инсульта, вызванная нарушением кровоснабжения в бассейне средней мозговой артерии, к 6 суткам после перевязки средней мозговой артерии (ОСМА) характеризуется формированием ишемического очага. В связи с этим все эффекты афобазола в условиях локальной ишемии были исследованы через 6 суток после окклюзии средней мозговой артерии, а также в отдаленные сроки ишемии - через 12 дней. Афобазол вводили внутрибрюшинно в дозе 5 мг/кг сразу же после перевязки средней мозговой артерии, а затем дважды в день в той же дозе в течение 6 сутокThe results of a histological examination allowed us to conclude that the used model of ischemic stroke caused by a violation of blood supply in the middle cerebral artery basin, by 6 days after ligation of the middle cerebral artery (OSMA) is characterized by the formation of an ischemic focus. In this regard, all the effects of afobazole in conditions of local ischemia were studied 6 days after occlusion of the middle cerebral artery, as well as in long-term periods of ischemia, after 12 days. Afobazole was administered intraperitoneally at a dose of 5 mg / kg immediately after ligation of the middle cerebral artery, and then twice a day in the same dose for 6 days

При исследовании влияния афобазола на динамику морфологических изменений головного мозга крысы в условиях локальной ишемии мозга было установлено, что афобазол значительно уменьшает зону ишемии, которая ограничена небольшим участком (зона пирамидальной коры). Мягкая мозговая оболочка несколько отечная, сосуды ее полнокровные (в зоне повреждения). На этом же участке отмечается умеренная инфильтрация мозговой оболочки лимфоцитами со скудной примесью нейрофилов. Со стороны мягкой мозговой оболочки по направлению к зоне повреждения наблюдается наползание макрофагов в виде компактного тяжа. В самой зоне ишемии наблюдается выраженный глиоз. Здесь же наблюдаются пикноморфные нейроциты, у которых зачастую имеется хорошо сохранившееся ядро. В зоне формирующегося рубца обнаруживаются предсуществующие и новообразованные капилляры. Область CPu в обоих полушариях хорошо сохранена, без заметных патологических изменений (в отличие от нелеченных крыс, у которых зачастую развивался некроз CPu на стороне перевязки). Правое (противоположное) полушарие по всем полям не отличается от такового у интактных крыс. В левом полушарии (сторона перевязки) по всем слоям коры выявляются гиперхромные и пикнотичные нейроциты. В полях Par1 и Раr2 в V слое коры (слева) выявляются единичные пикнотичные нейроциты. Сосудистые сплетения боковых и III желудочка без патологических изменений.When studying the influence of afobazole on the dynamics of morphological changes in the rat brain under conditions of local brain ischemia, it was found that afobazole significantly reduces the area of ischemia, which is limited to a small area (the area of the pyramidal cortex). The pia mater is somewhat edematous, its vessels are full-blooded (in the area of damage). In the same area, moderate infiltration of the cerebral membrane by lymphocytes with a scant admixture of neurophiles is noted. From the side of the pia mater in the direction of the damage zone, macrophages creep in the form of a compact strand. In the zone of ischemia, pronounced gliosis is observed. Pycnomorphic neurocytes are also observed here, which often have a well-preserved nucleus. In the area of the forming scar, pre-existing and newly formed capillaries are found. The CPu region in both hemispheres is well preserved, without noticeable pathological changes (unlike untreated rats, which often developed CPu necrosis on the ligation side). The right (opposite) hemisphere in all fields does not differ from that in intact rats. In the left hemisphere (ligation side), hyperchromic and pycnotic neurocytes are detected in all layers of the cortex. In the fields Par1 and Par2 in the V layer of the cortex (left), single pycnotic neurocytes are detected. Vascular plexus of the lateral and III ventricle without pathological changes.

При лечении животных афобазолом в течение 12 суток было установлено, что зона ишемии по сравнению с 6 сутками применения препарата еще более уменьшена в размерах в результате сформировавшегося глиального рубца. В обеих сериях опытов на фоне лечения афобазолом со стороны сосудов вещества мозга как ипси-, так и контралатерального полушарий явления вазодилатации, вазоконстрикции или дистонии не были обнаружены, в отличие от таковых у нелеченных крыс.When treating animals with afobazole for 12 days, it was found that the area of ischemia compared with 6 days of drug administration is even more reduced in size as a result of the formed glial scar. In both series of experiments, against the background of the treatment with afobazole from the vessels of the brain substance of the ipsi and contralateral hemispheres, the phenomena of vasodilation, vasoconstriction or dystonia were not detected, in contrast to those in untreated rats.

Результаты морфологического исследования по изучению влияния афобазола на структурные изменения, вызванные окклюзией средней мозговой артерии, свидетельствуют о выраженном защитном эффекте препарата. В первую очередь следует отметить хорошую сохранность CPu, т.е. стриопаллидарной системы, которая более всего страдала у ишемизипрованных крыс. После применения афобазола зона ишемического некроза коры оказывается четко ограниченной (пенумбра практически отсутствует) и характеризуется ранней реперфузией. При применении препарата отмечается и хорошая сохранность нейроцитов: афобазол оказывает выраженное протективное воздействие в отношении нейроцитов базальных и гипоталамических ядер.The results of a morphological study to study the effect of afobazole on structural changes caused by occlusion of the middle cerebral artery indicate a pronounced protective effect of the drug. First of all, CPu is well preserved, i.e. striopallidar system, which is most affected in ischemic rats. After the use of afobazole, the area of ischemic necrosis of the cortex is clearly limited (penumbra is practically absent) and is characterized by early reperfusion. When using the drug, good preservation of neurocytes is also noted: afobazole has a pronounced protective effect on neurocytes of the basal and hypothalamic nuclei.

Афобазол способствует также и хорошей сохранности нейроцитов коры контралатерального полушария. В симметричных полях коры ипсилатерального полушария в значительной степени уменьшается выраженность гипоксических повреждений нейроцитов.Afobazole also contributes to the good preservation of neurocytes of the cortex of the contralateral hemisphere. In the symmetrical fields of the cortex of the ipsilateral hemisphere, the severity of hypoxic damage to neurocytes is significantly reduced.

Обращает на себя внимание тот факт, что афобазол способствует нормализации мозгового кровообращения в обоих полушариях, что указывает на то, что препарат, по всей вероятности, воздействует на нейромедиаторную систему, предотвращая расстройства мозгового кровообращения в виде дистонии, полнокровия и тромбоза мозговых сосудов.It is noteworthy that afobazole contributes to the normalization of cerebral circulation in both hemispheres, which indicates that the drug most likely acts on the neurotransmitter system, preventing cerebrovascular disorders in the form of dystonia, plethora and thrombosis of cerebral vessels.

Итак, в условиях локального ишемического повреждения проявляется выраженный защитный эффект препарата на все структурные компоненты головного мозга крыс.So, in conditions of local ischemic damage, a pronounced protective effect of the drug on all structural components of the brain of rats is manifested.

Полученные данные послужили основанием для исследования влияния афобазола на активность одного из ферментов цикла трикарбоновых кислот - сукцинатдегидрогеназы (СДГ). В литературе имеются убедительные доказательства непосредственной связи между энергетическим состоянием нейронов и глутаматной нейротоксичностью (Zeevalk G.D. and Nicklas W.J., J. Neurochem., v.59, pp.1211-1220, 1992). Получены также данные об изменениях энергетического метаболизма организма при развитии тревожности.The data obtained served as the basis for studying the effect of afobazole on the activity of one of the enzymes of the tricarboxylic acid cycle, succinate dehydrogenase (LDH). There is compelling evidence in the literature of a direct link between the energy state of neurons and glutamate neurotoxicity (Zeevalk G. D. and Nicklas W.J., J. Neurochem., V. 59, pp. 1211-1220, 1992). Data were also obtained on changes in the energy metabolism of the body during the development of anxiety.

В связи с вышеизложенным целью данной серии экспериментов явилось исследование эффектов афобазола на активность СДГ в условиях локальной ишемии, вызванной перевязкой средней мозговой артерии у крыс.In connection with the foregoing goal of this series of experiments was the study of the effects of afobazole on the activity of LDH under conditions of local ischemia caused by ligation of the middle cerebral artery in rats.

Эксперименты по изучению активности СДГ в обоих полушариях мозга в условиях локальной ишемии показали, что перевязка средней мозговой артерии сопровождается понижением активности фермента различной выраженности. При этом, наибольшее угнетение активности сукцинатдегидрогеназы отмечается через 24 часа после перевязки средней мозговой артерии, составляя 31% по сравнению с контрольной величиной. К 6 суткам окклюзии отмечается тенденция к восстановлению активности фермента, которая в дальнейшем продолжает снижаться и к 12 суткам ишемии оказывается ниже контрольного уровня более чем в 2 раза. Аналогичные изменения в активности СДГ, но меньшей выраженности, регистрируются и в контралатеральном полушарии мозга (табл.1).Experiments to study the activity of LDH in both hemispheres of the brain under local ischemia showed that ligation of the middle cerebral artery is accompanied by a decrease in the activity of the enzyme of varying severity. Moreover, the greatest inhibition of succinate dehydrogenase activity is observed 24 hours after ligation of the middle cerebral artery, making up 31% compared to the control value. By 6 days of occlusion, there is a tendency to restoration of enzyme activity, which further continues to decrease and by 12 days of ischemia is more than 2 times lower than the control level. Similar changes in the activity of LDH, but of lesser severity, are recorded in the contralateral hemisphere of the brain (Table 1).

Исследование эффектов афобазола на активность СДГ в условиях локального ишемического поражения мозга показало, что на фоне внутрибрюшинного введения афобазола (в дозе 1 мг/кг сразу же после перевязки, затем дважды в день) активность фермента в течение 24 часов не только сохраняется на контрольном уровне, но и несколько превосходит исходное значение. В дальнейшем отмечается падение активности СДГ, однако намного слабее, чем у нелеченных крыс после ОСМА. Важно отметить, что на противоположной стороне максимальный эффект препарата регистрируется не через 24 часа, а через 6 суток после введения афобазола.A study of the effects of afobazole on the activity of LDH under conditions of local ischemic brain damage showed that against the background of intraperitoneal administration of afobazole (at a dose of 1 mg / kg immediately after ligation, then twice a day), the enzyme activity for 24 hours not only remains at the control level, but also slightly exceeds the original value. Subsequently, a decrease in the activity of LDH is noted, however, much weaker than in untreated rats after OSMA. It is important to note that on the opposite side, the maximum effect of the drug is recorded not after 24 hours, but 6 days after the administration of afobazole.

Таблица 1.Table 1. Влияние афобазола на изменение активности СДГ в условиях локальной ишемии, вызванной ОСМА.The effect of afobazole on changes in the activity of LDH under local ischemia caused by OSMA. Активность СДГ (нмоль сукцината/мин на 1 мг белка)The activity of LDH (nmol succinate / min per 1 mg of protein) Сторона перевязкиDressing side Контралатеральная сторонаContralateral side КонтрольThe control 4,5±0,344,5 ± 0,34 ОСМАOSMA 24 часа (n=9)24 hours (n = 9) 3,08±0,3*3.08 ± 0.3 * 3,51±0,22*3.51 ± 0.22 * 6 суток (n=8)6 days (n = 8) 3,46±0,18*3.46 ± 0.18 * 3,78±0,63.78 ± 0.6 12 суток (n=8)12 days (n = 8) 1,64±0,14*1.64 ± 0.14 * 1,86±0,22*1.86 ± 0.22 * ОСМА + афобазол (1 мг/кг, внутрибрюшинно)OSMA + Afobazole (1 mg / kg, ip) 24 часа (n=11)24 hours (n = 11) 4,74±0,78**4.74 ± 0.78 ** 3,72±0,123.72 ± 0.12 6 суток (n=12)6 days (n = 12) 3,78±0,243.78 ± 0.24 4,36±0,22**4.36 ± 0.22 ** 12 суток n=812 days n = 8 2,56±0,22**2.56 ± 0.22 ** 2,72±0,26**2.72 ± 0.26 ** Примечание: * - Р<0,01 по сравнению с контролем.Note: * - P <0.01 compared with the control. ** - Р<0,01 по сравнению с ишемией.** - P <0.01 compared with ischemia.

К 12 суткам после перевязки средней мозговой артерии и на фоне действия афобазола активность фермента выше показателей, которые наблюдаются при ОСМА без применения препарата.By 12 days after ligation of the middle cerebral artery and against the background of the action of afobazole, the enzyme activity is higher than that observed with OSMA without the use of the drug.

Таким образом, полученные данные дают основание предположить, что в проявлении защитного эффекта афобазола, возможно, участвует и активация препаратом энергетического обмена мозговой ткани путем повышения активности сукцинатдегидрогеназы, угнетенной ишемическим поражением.Thus, the obtained data suggest that the activation of the brain tissue’s energy metabolism by increasing the activity of succinate dehydrogenase, inhibited by ischemic damage, may also be involved in the manifestation of the protective effect of afobazole.

Для исследования влияния афобазола на тревожность, развиваемую ишемическим нарушением, сразу же после перевязки средней мозговой артерии животным внутрибрюшинно вводили афобазол в дозе 1 мг/кг, в которой препарат проявляет максимальный анксиолитический эффект. Далее введение препарата продолжали в той же дозе дважды в сутки. В первой серии экспериментов афобазол вводился в течение 6 дней после перевязки средней мозговой артерии, во второй серии - введение препарата продолжалось в течение 12 суток после ишемии.To study the effect of afobazole on anxiety developed by ischemic disorder, immediately after ligation of the middle cerebral artery, animals were injected intraperitoneally with afobazole at a dose of 1 mg / kg, in which the drug exhibits the maximum anxiolytic effect. Further, the introduction of the drug was continued at the same dose twice a day. In the first series of experiments, afobazole was administered within 6 days after ligation of the middle cerebral artery, in the second series, the administration of the drug continued for 12 days after ischemia.

Статистический анализ данных, представленных в таблицах 2 и 3, свидетельствует о выраженном анксиолитическом эффекте препарата в условиях ишемии. Препарат довольно эффективно предотвращает развитие тревожности, вызванное перевязкой средней мозговой артерии. При этом, было показано, что действие афобазола возрастает при его применении в течение 12 суток после перевязки средней мозговой артерии.Statistical analysis of the data presented in tables 2 and 3, indicates a pronounced anxiolytic effect of the drug in conditions of ischemia. The drug quite effectively prevents the development of anxiety caused by ligation of the middle cerebral artery. At the same time, it was shown that the effect of afobazole increases with its use within 12 days after ligation of the middle cerebral artery.

Таким образом, селективный анксиолитик афобазол оказывает выраженное нейропротекторное действие при моделировании in vivo ишемического инсульта. В условиях локального ишемического поражения, вызванного перевязкой средней мозговой артерии, препарат защищает головной мозг от морфологических нарушений и изменений активности сукцинатдегидрогеназы, а также препятствует развитию тревожности у крыс.Thus, the selective anxiolytic afobazole has a pronounced neuroprotective effect when modeling in vivo ischemic stroke. In conditions of local ischemic damage caused by ligation of the middle cerebral artery, the drug protects the brain from morphological disorders and changes in the activity of succinate dehydrogenase, and also prevents the development of anxiety in rats.

Таблица 2.Table 2. Поведение крыс в тесте приподнятого крестообразного лабиринта (ПКЛ) через 6 дней после ОСМА и применения афобазола (M±SD).The behavior of rats in the elevated cross-maze labyrinth (PCL) test 6 days after OSMA and the use of afobazole (M ± SD). Параметры ПКЛPCL parameters Контроль (n=23)Control (n = 23) ОСМА 6 дней (n=8)OSMA 6 days (n = 8) Афобазол (1 мг/кг, в/б, n=10)Afobazole (1 mg / kg, ip, n = 10) Число заходов в открытые рукаваNumber of entries in open sleeves 2,57±0,952.57 ± 0.95 0,95±0,53**0.95 ± 0.53 ** 3,30±0,82** (P₁)3.30 ± 0.82 ** (P ₁ ) Время в открытых рукавах (сек)Open Sleeve Time (sec) 33,52±3,8633.52 ± 3.86 17,25±11,1*17.25 ± 11.1 * 34,80±4,64** (P₁)34.80 ± 4.64 ** (P ₁ ) % заходов в открытые рукава% of entries in open sleeves 27,25±9,6927.25 ± 9.69 19,38±14,219.38 ± 14.2 55,1±10,42** (P₁)55.1 ± 10.42 ** (P ₁ ) % времени в открытых рукавах% of time in open sleeves 11,17±1,2911.17 ± 1.29 5,78±1,48**5.78 ± 1.48 ** 11,5±1,55** (Р₁)11.5 ± 1.55 ** (P ₁ ) Число заходов в закрытые рукаваThe number of entries in closed sleeves 6,91±1,386.91 ± 1.38 3,93±0,92**3.93 ± 0.92 ** 2,70±0,82 (P₁)2.70 ± 0.82 (P ₁ ) Время в закрытых рукавах (сек)Closed Sleeve Time (sec) 186,78±10,32186.78 ± 10.32 229,5±11,7**229.5 ± 11.7 ** 199,40±13,71 (P₁)199.40 ± 13.71 (P ₁ ) Время в центре лабиринта (сек)Time in the center of the maze (sec) 79,70±9,8679.70 ± 9.86 52,88±11,15**52.88 ± 11.15 ** 66,6±13,4 (P₁)66.6 ± 13.4 (P ₁ ) Общее число заходов в рукаваTotal number of entries in the sleeves 9,48±1,129.48 ± 1.12 4,88±1,16**4.88 ± 1.16 ** 6,00±1,05* (P₁)6.00 ± 1.05 * (P ₁ ) Обозначения: Р - по сравнению с контролем; P₁ - по сравнению с перевязкой; * - Р, P₁<005; ** - Р, Р₁<001.Designations: P - in comparison with the control; P ₁ - compared with dressing; * - P, P ₁ <005; ** - P, P ₁ <001.

Таблица 3.Table 3. Поведение крыс в тесте приподнятого крестообразного лабиринта через 12 дней после ОСМА и применения афобазола (М±m)The behavior of rats in the test of the elevated cruciform labyrinth 12 days after OSMA and the use of afobazole (M ± m) Параметры ПКЛPCL parameters Контроль (n=23)Control (n = 23) ОСМА 12 дней (n=8)OSMA 12 days (n = 8) Афобазол (1 мг/кг, в/б, n=8)Afobazole (1 mg / kg, ip, n = 8) Число заходов в открытые рукаваNumber of entries in open sleeves 2,57±0,952.57 ± 0.95 1,13±0,831.13 ± 0.83 4,63±0,74** (P₁)4.63 ± 0.74 ** (P ₁ ) Время в открытых рукавах (сек)Open Sleeve Time (sec) 33,52±3,8633.52 ± 3.86 20,25±12,89* (Р)20.25 ± 12.89 * (P) 40,50±8,54** (P₁)40.50 ± 8.54 ** (P ₁ ) % заходов в открытые рукава% of entries in open sleeves 27,25±9,6927.25 ± 9.69 25,42±16,87 (Р)25.42 ± 16.87 (P) 46,25±5,97** (P₁)46.25 ± 5.97 ** (P ₁ ) % времени в открытых рукавах% of time in open sleeves 17±1,2917 ± 1.29 6,75±4,30** (Р)6.75 ± 4.30 ** (P) 13,5±2,85** (Р₁)13.5 ± 2.85 ** (P ₁ ) Число заходов в закрытые рукаваThe number of entries in closed sleeves 6,91±1,386.91 ± 1.38 2,88±0,642.88 ± 0.64 5,38±0,74 (P₁)5.38 ± 0.74 (P ₁ ) Время в закрытых рукавах (сек)Closed Sleeve Time (sec) 186,78±10,32186.78 ± 10.32 225,0±19,71 (Р)225.0 ± 19.71 (P) 197,13±12,23 (P₁)197.13 ± 12.23 (P ₁ ) Время в центре лабиринта (сек)Time in the center of the maze (sec) 79,70±9,8679.70 ± 9.86 54,75±7,70** (Р)54.75 ± 7.70 ** (P) 62,75±17,89* (P₁)62.75 ± 17.89 * (P ₁ ) Общее число заходов в рукаваTotal number of entries in the sleeves 9,48±1,129.48 ± 1.12 4,00±1,07** (Р)4.00 ± 1.07 ** (P) 10,00±0,93** (P₁)10.00 ± 0.93 ** (P ₁ ) Обозначения: Р - по сравнению с контролем; P₁ - по сравнению с перевязкой; * - Р, Р₁<005; ** - Р, Р₁<001.Designations: P - in comparison with the control; P ₁ - compared with dressing; * - P, P ₁ <005; ** - P, P ₁ <001.

В отдельной серии опытов для изучения противоишемических нейропротекторных свойств афобазола была использована модель ишемии in vitro на культуре нейронов гиппокампа мыши линии НТ-22. Модель in vitro позволяет оценить изменения, происходящие на клеточном и молекулярном уровнях, выявить мишени действия нейропротекторов. К преимуществам клеточных моделей ишемии относится также возможность прямого наблюдения и контроля процессов, происходящих в клетке. В качестве ишемического стимула использовали культивирование клеток в среде с повышенным содержанием нейротоксичных аминокислот, в частности глутаминовой кислоты, поскольку повреждение нейронов по механизму глутаматной токсичности вносит основной вклад в гибель нейронов при ишемии. Культуру клеток инкубировали в присутствии высокой концентрации глутаминовой кислоты (10 мМ) в течение 8 часов, затем помещали клетки в нормальные условия (культуральная среда, содержащая факторы роста, 5% СО₂, 37°С) и через 24 часа определяли количество погибших клеток с помощью МТТ-теста. МТТ(3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолий бромид) - водорастворимая соль тетразолия желтого цвета, легко проникающая в клетки. В живых клетках МТТ превращается в нерастворимые в воде кристаллы формазана фиолетового цвета. По окончании реакции их растворяли в диметилсульфооксиде и измеряли светопоглощение на спектрофотометре при длине волны 600 нм. Афобазол растворяли в воде и вводили в культуральную среду в конечной концентрации 10^-8 моль за 24 часа до моделирования глутаматной токсичности с целью выяснения профилактического нейропротекторного действия. Для того чтобы исследовать терапевтический эффект афобазола, его вводили через 1 час, через 16 часов, через 20 часов после обработки клеток глутаминовой кислотой. Было показано, что афобазол обладает статистически достоверным защитным эффектом при введении его за 24 часа до моделирования глутаматной нейротоксичности и через 16 и 20 часов после повреждения клеток.In a separate series of experiments to study the anti-ischemic neuroprotective properties of afobazole, an in vitro model of ischemia was used in a culture of mouse hippocampal neurons of the NT-22 line. The in vitro model makes it possible to assess changes occurring at the cellular and molecular levels, and to identify targets for the action of neuroprotectors. The advantages of cellular models of ischemia also include the possibility of direct observation and control of processes occurring in the cell. Cell cultivation in an environment with a high content of neurotoxic amino acids, in particular glutamic acid, was used as an ischemic stimulus, since damage to neurons by the glutamate toxicity mechanism makes the main contribution to the death of neurons during ischemia. The cell culture was incubated in the presence of a high concentration of glutamic acid (10 mM) for 8 hours, then the cells were placed under normal conditions (culture medium containing growth factors, 5% CO ₂ , 37 ° C) and after 24 hours the number of dead cells was determined with using the MTT test. MTT (3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyltetrazolium bromide) is a water-soluble yellow tetrazolium salt that easily penetrates the cells. In living cells, MTT is transformed into water-insoluble violet formazan crystals. At the end of the reaction, they were dissolved in dimethyl sulfoxide and the light absorption was measured on a spectrophotometer at a wavelength of 600 nm. Afobazole was dissolved in water and introduced into the culture medium at a final concentration of 10 ^-8 mol 24 hours before modeling glutamate toxicity in order to determine the prophylactic neuroprotective effect. In order to investigate the therapeutic effect of afobazole, it was administered 1 hour, 16 hours, 20 hours after treatment of the cells with glutamic acid. Afobazole has been shown to have a statistically significant protective effect when administered 24 hours before modeling glutamate neurotoxicity and 16 and 20 hours after cell damage.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что афобазол обладает защитным нейропротекторным действием и на культуре гиппокампальных нейронов при моделировании глутаматной нейротоксичности. Наибольшим защитным действием препарат обладает в том случае, если его вводили после повреждения нейронов. Защитное действие афобазола до повреждения клеток может быть обусловлено синтезом цитопротекторных белков под воздействием препарата. Нейропротекторный эффект афобазола после повреждающего действия глутамата может быть связан с влиянием его на развитие процесса апоптоза.The results obtained indicate that afobazole also has a protective neuroprotective effect on the culture of hippocampal neurons in modeling glutamate neurotoxicity. The drug has the greatest protective effect if it was administered after damage to neurons. The protective effect of afobazole before cell damage may be due to the synthesis of cytoprotective proteins under the influence of the drug. The neuroprotective effect of afobazole after the damaging effect of glutamate may be associated with its influence on the development of apoptosis.

Claims

The use of Afobazole (5-ethoxy-2- [2- (morpholino) ethylthio] benzylimidazole dihydrochrodide) as a treatment for ischemic brain damage.