RU2286798C2

RU2286798C2 - Method for identifying chromosomal translocations leading to the development of malignant blood diseases (leukoses), due to applying oligonucleotide biological microchip (biochip)

Info

Publication number: RU2286798C2
Application number: RU2004114587/15A
Authority: RU
Inventors: Андрей Дарьевич Мирзабеков (RU); Андрей Дарьевич Мирзабеков; Тать на Васильевна Наседкина (RU); Татьяна Васильевна Наседкина; Владислав Сергеевич Жаринов (RU); Владислав Сергеевич Жаринов; Екатерина Александровна Исаева (RU); Екатерина Александровна Исаева
Original assignee: Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук
Priority date: 2004-07-08
Filing date: 2004-07-08
Publication date: 2006-11-10
Also published as: RU2004114587A

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: the present innovation deals with hybridization of chimeric amplified fluorescently labeled product consisted of gene sequences that participate in certain chromosomal leucosis-associated translocation with oligonucleotide microchip. The method deals with reverse transcription, two-stage "socket" multiplex PCR; labeling chimeric PCR-product in the second round of PCR; hybridization upon a biochip that contains original set of oligonucleotides. The innovation enables to accelerate and simplify the technique applied.

EFFECT: higher accuracy and efficiency of identification.

16 cl, 4 dwg, 8 ex, 3 tbl

Description

Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION

Изобретение относится к молекулярной биологии и онкогематологии и обеспечивает способ диагностики острых и хронических лейкозов непосредственно в клиническом образце с использованием дифференцирующего олигонуклеотидного биологического микрочипа (биочипа).The invention relates to molecular biology and oncohematology and provides a method for diagnosing acute and chronic leukemia directly in a clinical sample using a differentiating oligonucleotide biological microchip (biochip).

Уровень техникиState of the art

Для анализа хромосомных транслокаций (аберраций) применяют следующие методы, использующие мультиплексную полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и/или гибридизацию:For the analysis of chromosomal translocations (aberrations), the following methods are used that use the multiplex polymerase chain reaction (PCR) and / or hybridization:

1. Флуоресцентная гибридизация in situ1. In situ fluorescence hybridization

Kerney L. 1999. The impact of the new FISH technologies on the cytogenetics of haematological malignancies. Br. J. Haematol. 104: 648-658.Kerney L. 1999. The impact of the new FISH technologies on the cytogenetics of haematological malignancies. Br. J. Haematol. 104: 648-658.

Флуоресцентная гибридизация in situ представляет собой гибридизацию флуоресцентно меченных специфичных зондов с ДНК метафазных хромосом или интерфазных ядер, фиксированных на предметном стекле. Метод является высокоспецифичным и достаточно чувствительным, однако трудоемким и требующим дорогостоящего микроскопического оборудования. Число одновременно анализируемых транслокаций ограничено.In situ fluorescence hybridization is a hybridization of fluorescently labeled specific probes with DNA metaphase chromosomes or interphase nuclei fixed on a glass slide. The method is highly specific and quite sensitive, but time-consuming and requiring expensive microscopic equipment. The number of simultaneously analyzed translocations is limited.

2. Обратная транскрипция - полимеразная цепная реакция с индивидуальными праймерами2. Reverse transcription - polymerase chain reaction with individual primers

Dongen van J.I.M., Macintyre E.A., Gabert J.A., Delabesse E., Rossi V., Saglio G., Gottardi E., Rimbaldi A., Dotti G., Griesinger F., Parreira A., Cameiro P., Gonzalez Diaz M., Malec M., Langerak A.W., San Miguel J.F., Biondi A. 1999. Standardized RT-PCR analysis of fusion gene transcripts from chromosome aberrations in acute leukemia for detection of minimal residual disease. Leukemia. 13: 1901-1928.Dongen van JIM, Macintyre EA, Gabert JA, Delabesse E., Rossi V., Saglio G., Gottardi E., Rimbaldi A., Dotti G., Griesinger F., Parreira A., Cameiro P., Gonzalez Diaz M. , Malec M., Langerak AW, San Miguel JF, Biondi A. 1999. Standardized RT-PCR analysis of fusion gene transcripts from chromosome aberrations in acute leukemia for detection of minimal residual disease. Leukemia. 13: 1901-1928.

Обратная транскрипция - полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР) с индивидуальными праймерами является наиболее широко распространенным методом диагностики транслокаций. На первом этапе проводят синтез кДНК на матрице РНК. Далее кДНК используют в полимеразной цепной реакции, где пара праймеров подобрана таким образом, что один праймер соответствует участку одного гена, а другой праймер - участку другого гена, вовлеченных в данную транслокацию. В результате реакции происходит амплификация фрагментов химерных последовательностей. Метод обладает высокой чувствительностью и специфичностью, однако при анализе большого числа транслокаций является трудоемким и требует больших затрат рабочего времени, расходуется много клинического материала.Reverse transcription - polymerase chain reaction (RT-PCR) with individual primers is the most widely used method for the diagnosis of translocations. At the first stage, cDNA synthesis is carried out on an RNA template. Next, cDNA is used in the polymerase chain reaction, where a pair of primers is selected so that one primer corresponds to a region of one gene, and the other primer to a region of another gene involved in this translocation. As a result of the reaction, amplification of fragments of chimeric sequences occurs. The method has high sensitivity and specificity, however, when analyzing a large number of translocations it is time-consuming and requires a lot of working time, a lot of clinical material is spent.

3. Мультиплексная ПЦР с последующими индивидуальными ПЦР реакциями3. Multiplex PCR followed by individual PCR reactions

Pallisgaard N., Hokland P., Riishoj D.C., Pedersen В., Jorgensen P. Multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction for simultaneous screening of 29 translocations and chromosomal aberrations in acute leukemia. Blood 1998; 92: 574-588.Pallisgaard N., Hokland P., Riishoj D.C., Pedersen B., Jorgensen P. Multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction for simultaneous screening of 29 translocations and chromosomal aberrations in acute leukemia. Blood 1998; 92: 574-588.

Strehl S., König M., Mann G., Haas O.A. Multiplex reverse transcriptase-polymerase chain reaction screening in childhood acute myeloblastic leukemia. Blood 2001; 97: 805-808.Strehl S., König M., Mann G., Haas O.A. Multiplex reverse transcriptase-polymerase chain reaction screening in childhood acute myeloblastic leukemia. Blood 2001; 97: 805-808.

Мультиплексная ПЦР отличается тем, что в реакции участвует одновременно несколько пар праймеров на разные транслокации. В результате реакции получают продукты амплификации, для идентификации которых необходимо проводить индивидуальные ПЦР. Метод является чувствительным и достаточно специфичным, однако высока вероятность контаминации и получения ложноположительных результатов. Также возможно получение ложноположительных результатов из-за неспецифического связывания праймеров с кДНК, особенно в мультиплексной реакции.Multiplex PCR is different in that several pairs of primers for different translocations are involved in the reaction simultaneously. As a result of the reaction, amplification products are obtained, the identification of which requires individual PCR. The method is sensitive and quite specific, but there is a high probability of contamination and false-positive results. It is also possible to obtain false positive results due to nonspecific binding of primers to cDNA, especially in a multiplex reaction.

4. Мультиплексная ПЦР с анализом ПЦР-продуктов с помощью высокоразрешающего электрофореза на приборе GeneScan.4. Multiplex PCR with the analysis of PCR products using high-resolution electrophoresis on a GeneScan device.

Viehmann S., Borkhardt A., Lampert F., Harbott J. 1999. Multiplex PCR - a rapid screening method for detection of gene rearrangements in childhood acute lymphoblastic leukemia. Ann. Hematol. 78: 157-162.Viehmann S., Borkhardt A., Lampert F., Harbott J. 1999. Multiplex PCR - a rapid screening method for detection of gene rearrangements in childhood acute lymphoblastic leukemia. Ann. Hematol. 78: 157-162.

Мультиплексная ПЦР с анализом ПЦР-продуктов с помощью высокоразрешающего электрофореза на приборе GeneScan требует наличия дорогостоящего прибора и не отличается высокой чувствительностью и специфичностью.Multiplex PCR with the analysis of PCR products using high-resolution electrophoresis on a GeneScan device requires an expensive device and is not very sensitive and specific.

5. Мультиплексная ПЦР с последующей дот-блот-гибридизацией5. Multiplex PCR followed by dot blot hybridization

Scurto P., Rocha M.H., Kane J.R., Williams W.K., Haney D.M., Conn W.P., Shurtleff S.A., Downing J.R. 1998. A multiplex RT-PCR assay for the detection of chimeric transcripts encoded by the risk-stratifying translocations of pediatric acute lymphoblastic leukemia. Leukemia 12: 1994-2005.Scurto P., Rocha M.H., Kane J.R., Williams W.K., Haney D.M., Conn W.P., Shurtleff S.A., Downing J.R. 1998. A multiplex RT-PCR assay for the detection of chimeric transcripts encoded by the risk-stratifying translocations of pediatric acute lymphoblastic leukemia. Leukemia 12: 1994-2005.

В этом способе после проведения мультиплексной ПЦР с праймерами на несколько транслокаций проводят идентификацию амплифицированных последовательностей методом дот-блот гибридизации. Олигонуклеотидные зонды иммобилизуют на нейлоновом фильтре, для мечения гибридизуемой ДНК-мишени используют радиоактивную метку или биотиновую метку с последующим проявлением стрептавидином, конъюгированным со щелочной фосфатазой. Данный способ представляет собой одноэтапную ПЦР и реакцию гибридизации в макрообъеме с визуальной оценкой результата, что делает его недостаточно чувствительным и технологичным.In this method, after conducting multiplex PCR with primers for several translocations, the amplified sequences are identified by the dot blot hybridization method. Oligonucleotide probes are immobilized on a nylon filter, a radioactive label or biotin label is used to label the target DNA to be hybridized, followed by the development of streptavidin conjugated with alkaline phosphatase. This method is a one-stage PCR and a hybridization reaction in macro volume with a visual assessment of the result, which makes it insufficiently sensitive and technologically advanced.

6. Мультиплексная ПЦР с последующим анализом на олигонуклеотидном микрочипе6. Multiplex PCR followed by analysis on an oligonucleotide microchip

Nasedkina Т., Domer P., Zharinov V., Hoberg J., Lysov Yu., Mirzabekov A. 2002. Identification of chromosomal translocations in leukemias by hybridization with oligonucleotide microarrays. Hematologica 87: 363-372.Nasedkina T., Domer P., Zharinov V., Hoberg J., Lysov Yu., Mirzabekov A. 2002. Identification of chromosomal translocations in leukemias by hybridization with oligonucleotide microarrays. Hematologica 87: 363-372.

Ранее авторами настоящего изобретения был предложен подход, сочетающий мультиплексную ОТ-ПЦР и гибридизацию на олигонуклеотидном микрочипе для обнаружения химерных транскриптов в клиническом образце. Метод был апробирован на ограниченном числе транслокаций, процедура подготовки пробы включала введение флуоресцентной метки как отдельный этап после прохождения ПЦР, для мультиплексной ПЦР использовали праймеры, разработанные авторами способа (3).Previously, the present inventors have proposed an approach combining multiplex RT-PCR and hybridization on an oligonucleotide microchip to detect chimeric transcripts in a clinical sample. The method was tested on a limited number of translocations, the sample preparation procedure included the introduction of a fluorescent label as a separate stage after PCR, for multiplex PCR, primers developed by the authors of the method were used (3).

7. Мультиплексная ПЦР с универсальными праймерами и последующим анализом на олигонуклеотидном микрочипе7. Multiplex PCR with universal primers and subsequent analysis on an oligonucleotide microchip

Shi R.Z., Morrisey J.M., Rowley J.D. 2003. Screening and quantification of multiple chromosome translocations in human leukemia. Clinical Chemistry 49: 1066-1073.Shi R.Z., Morrisey J.M., Rowley J.D. 2003. Screening and quantification of multiple chromosome translocations in human leukemia. Clinical Chemistry 49: 1066-1073.

Метод включает проведение мультиплексной ПЦР со специфическими и универсальными праймерами, представляющими собой последовательности промотора Т7 и SP6 полимераз. Перед гибридизацией на микрочипе проводят реакцию in vitro транскрипции с включением биотиновой метки и проявление гибридизованного продукта с помощью стрептавидина, конъюгированного с флуорохромом. В данном способе подготовка пробы включает помимо ПЦР отдельную дополнительную реакцию in vitro транскрипции, также непосредственно в реакции гибридизации участвует амплифицированная РНК, которая легко подвергается деградации и из общих соображений является менее предпочтительной мишенью, чем ДНК.The method involves conducting multiplex PCR with specific and universal primers, which are sequences of the T7 and SP6 polymerase promoter. Before hybridization on a microchip, an in vitro transcription reaction is carried out with the inclusion of a biotin tag and the manifestation of a hybridized product using streptavidin conjugated with fluorochrome. In this method, sample preparation includes, in addition to PCR, a separate additional in vitro transcription reaction, amplified RNA is also directly involved in the hybridization reaction, which easily undergoes degradation and, from general considerations, is a less preferred target than DNA.

8. Мультиплексная ПЦР с последующим анализом на микрошариках8. Multiplex PCR followed by microprobe analysis

Wallace J., Zhou Y., Usmani G.N., Reardon M., Newburger P., Woda В., Pihan G. 2003. BARCODE-ALL: accelerated and cost-effective genetic risk stratification in acute leukemia using spectrally addressable liquid bead microarrays. Leukemia 17: 1404-1410.Wallace J., Zhou Y., Usmani G.N., Reardon M., Newburger P., Woda B., Pihan G. 2003. BARCODE-ALL: accelerated and cost-effective genetic risk stratification in acute leukemia using spectrally addressable liquid bead microarrays. Leukemia 17: 1404-1410.

Описанный в этой работе метод включает мультиплексную ПЦР и последующую гибридизацию амплифицированного фрагмента с микрошариками, каждый из которых несет на своей поверхности иммобилизованные олигонуклеотидные зонды, специфичные в отношении химерных последовательностей. Каждый тип шарика, несущего определенный зонд, обладает также уникальными спектральными характеристиками, позволяющими проводить его однозначную идентификацию. Чувствительность метода такова, что позволяет определять химерный транскрипт при 100-кратном разведении исходного образца, что несколько ниже, чем для двухэтапной ПЦР. В данном способе использование одноэтапной мультиплексной ПЦР не позволяет достичь высокой чувствительности метода, кроме того, распознавание и декодирование микрошариков требует использования специального дорогостоящего оборудования типа проточного цитофлуориметра.The method described in this work involves multiplex PCR and subsequent hybridization of the amplified fragment with beads, each of which carries immobilized oligonucleotide probes specific for chimeric sequences on its surface. Each type of ball carrying a specific probe also has unique spectral characteristics that allow its unambiguous identification. The sensitivity of the method is such that it allows to determine the chimeric transcript at 100-fold dilution of the original sample, which is somewhat lower than for two-stage PCR. In this method, the use of single-stage multiplex PCR does not allow to achieve high sensitivity of the method, in addition, the recognition and decoding of beads requires the use of special expensive equipment such as a flow cytofluorimeter.

Ближайшим аналогом настоящего изобретения является способ, описанный в (6) и представляющий собой раннюю версию настоящего изобретения, которая включала мультиплексную ПЦР с использованием ранее описанных праймеров. К существенным недостаткам способа можно отнести то, что мечение амплифицированного продукта проводилось после реакции амплификации как отдельная двухстадийная реакция.The closest analogue of the present invention is the method described in (6) and representing an early version of the present invention, which included multiplex PCR using the previously described primers. Significant disadvantages of the method include the fact that the labeling of the amplified product was carried out after the amplification reaction as a separate two-stage reaction.

Таким образом, все имеющиеся в настоящее время способы страдают теми или иными недостатками, и существует потребность в создании быстрого, простого, недорогого, чувствительного и специфичного метода, который мог бы быть внедрен в стандартную клиническую лабораторию.Thus, all currently available methods suffer from one or another disadvantage, and there is a need to create a quick, simple, inexpensive, sensitive and specific method that could be implemented in a standard clinical laboratory.

Такой способ обеспечивается настоящим изобретением.Such a method is provided by the present invention.

Раскрытие изобретенияDisclosure of invention

Сущность изобретения заключается в обеспечении способа экспресс-анализа типа химерного транскрипта в клиническом образце при острых и хронических лейкозах, который включает верификацию последовательности в точке слияния двух генов, участвующих в транслокации. Способ основан на проведении обратной транскрипции - мультиплексной ПЦР с последующей гибридизацией полученного флуоресцентно меченного фрагмента ДНК на биочипе, содержащем оригинальный набор дифференцирующих олигонуклеотидов, а также процедуры регистрации и интерпретации результатов.The essence of the invention is to provide a method for rapid analysis of the type of chimeric transcript in a clinical sample in acute and chronic leukemia, which includes verification of the sequence at the fusion point of two genes involved in translocation. The method is based on reverse transcription - multiplex PCR followed by hybridization of the obtained fluorescently labeled DNA fragment on a biochip containing an original set of differentiating oligonucleotides, as well as registration and interpretation of the results.

Комбинированное использование двухэтапной мультиплексной ПЦР и метода гибридизации на биочипах выгодно отличается от способов из уровня техники возможностью определения многих транслокаций с наименьшими затратами и наиболее специфичным и чувствительным способом за короткое время. Способ экономичен, не требует дорогостоящего оборудования и может быть введен в повсеместную клиническую практику. Данные, полученные с помощью способа настоящего изобретения, могут быть использованы в клинической диагностике первичных лейкозов, а также при мониторинге минимальной резидуальной болезни, так как чувствительность метода позволяет определить 1 бластную клетку среди 1000-10000 нормальных клеток.The combined use of two-stage multiplex PCR and the hybridization method on biochips compares favorably with the prior art methods for determining many translocations at the lowest cost and in the most specific and sensitive way in a short time. The method is economical, does not require expensive equipment, and can be introduced into widespread clinical practice. The data obtained using the method of the present invention can be used in the clinical diagnosis of primary leukemia, as well as in monitoring the minimum residual disease, since the sensitivity of the method allows to determine 1 blast cell among 1000-10000 normal cells.

Важной особенностью изобретения является то, что флуоресцентное мечение фрагмента химерного гена осуществляют одновременно с амплификацией при проведении второго этапа ПЦР.An important feature of the invention is that fluorescent labeling of a fragment of a chimeric gene is carried out simultaneously with amplification during the second stage of PCR.

Следующей особенностью изобретения является то, что идентификацию амплифицированных последовательностей осуществляют путем гибридизации полученного флуоресцентно меченного продукта амплификации с набором олигонуклеотидных зондов, иммобилизованных на биочипе.Another feature of the invention is that the identification of amplified sequences is carried out by hybridization of the obtained fluorescently labeled amplification product with a set of oligonucleotide probes immobilized on a biochip.

Согласно первому аспекту, настоящее изобретение обеспечивает способ экспресс-анализа типа химерного транскрипта, включающий верификацию последовательности в точке слияния двух генов, участвующих в транслокации, в клиническом образце, полученном от больного лейкозом, предусматривающий следующие стадии:According to the first aspect, the present invention provides a method for rapid analysis of the type of chimeric transcript, comprising verifying the sequence at the fusion point of two genes involved in translocation in a clinical sample obtained from a patient with leukemia, comprising the following steps:

(а) - выделение РНК и реакция обратной транскрипции;(a) RNA isolation and reverse transcription reaction;

(б) - мультиплексная "гнездовая" (nested) двухэтапная полимеразная цепная реакция (ПЦР) с использованием набора праймеров, охарактеризованных в п.1, для амплификации химерных транскриптов и мечение химерного ПЦР-продукта на втором этапе ПЦР;(b) a multiplex “nested” two-stage polymerase chain reaction (PCR) using the set of primers described in claim 1 for amplification of chimeric transcripts and labeling of a chimeric PCR product at the second stage of PCR;

(в) - обеспечение биочипа, охарактеризованного в п.3, содержащего набор иммобилизованных олигонуклеотидов, охарактеризованных в п.2, для проведения гибридизации;(c) - providing a biochip, characterized in claim 3, containing a set of immobilized oligonucleotides, characterized in claim 2, for hybridization;

(г) - гибридизация амплифицированного меченого продукта на биочипе;(d) - hybridization of the amplified labeled product on a biochip;

(д) - регистрация и интерпретация результатов гибридизации.(e) - registration and interpretation of hybridization results.

В одном из воплощений настоящего изобретения в качестве клинического образца используют костный мозг или кровь, полученные от обследуемого индивидуума.In one embodiment of the present invention, bone marrow or blood obtained from the subject being examined is used as a clinical sample.

В еще одном воплощении изобретения на стадии (а) при проведении реакции обратной транскрипции используют специфические праймеры, последовательность которых определена в Перечне последовательностей (SEQ ID NO: 1-8).In yet another embodiment of the invention, in the step (a), the reverse transcription reaction uses specific primers, the sequence of which is defined in the Sequence Listing (SEQ ID NO: 1-8).

В другом воплощении изобретения на втором этапе ПЦР на стадии (б) для флуоресцентного мечения фрагмента химерного гена используют флуоресцентно меченные по 5'-концу праймеры.In another embodiment of the invention, in a second PCR step in step (b), fluorescently labeled 5 ′ end primers are used to fluorescently label a chimeric gene fragment.

В еще одном воплощении изобретения на втором этапе ПЦР на стадии (б) для флуоресцентного мечения фрагмента химерного гена используют модифицированные дезоксинуклеозидтрифосфаты.In another embodiment of the invention, in a second PCR step in step (b), modified deoxynucleoside triphosphates are used to fluorescently label a chimeric gene fragment.

В другом воплощении изобретения для обеспечения биочипа настоящего изобретения, содержащего набор иммобилизованных олигонуклеотидов настоящего изобретения, на стадии (в) используют метод фотоиндуцируемой сополимеризации в акриламидном геле.In another embodiment of the invention, to provide a biochip of the present invention comprising a set of immobilized oligonucleotides of the present invention, a photoinduced acrylamide gel copolymerization method is used in step (c).

В еще одном воплощении настоящего изобретения для обеспечения биочипа настоящего изобретения, содержащего набор иммобилизованных олигонуклеотидов настоящего изобретения, на стадии (в) используют любой другой метод.In yet another embodiment of the present invention, any other method is used in step (c) to provide a biochip of the present invention comprising a set of immobilized oligonucleotides of the present invention.

В одном из воплощений изобретения используют условия гибридизации на стадии (г), обеспечивающие высокую степень дифференциации между совершенными и несовершенными гибридизационными дуплексами.In one embodiment of the invention, hybridization conditions in step (d) are used to provide a high degree of differentiation between perfect and imperfect hybridization duplexes.

В еще одном из воплощений регистрацию результатов гибридизации на стадии (д) проводят с помощью портативного анализатора биочипов, снабженного ПЗС-камерой.In yet another embodiment, the registration of hybridization results in step (e) is carried out using a portable biochip analyzer equipped with a CCD camera.

В другом воплощении изобретения регистрацию результатов гибридизации на стадии (д) проводят с помощью флуоресцентного микроскопа, снабженного ПЗС-камерой.In another embodiment of the invention, the registration of the results of hybridization in stage (e) is carried out using a fluorescence microscope equipped with a CCD camera.

В следующем воплощении регистрацию результатов гибридизации на стадии (д) проводят с помощью любого устройства, способного регистрировать и записывать сигналы флуоресценции.In a further embodiment, the registration of the results of hybridization in step (e) is carried out using any device capable of recording and recording fluorescence signals.

В другом воплощении изобретения интерпретацию результатов на стадии (д) проводят визуально.In another embodiment of the invention, the interpretation of the results in step (e) is carried out visually.

В еще одном воплощении изобретения интерпретацию результатов на стадии (д) проводят с использованием программы автоматического анализа изображения.In yet another embodiment of the invention, the interpretation of the results in step (e) is carried out using an automatic image analysis program.

Наконец, в еще одном воплощении интерпретированные результаты используют для целей медицинской диагностики, определения прогноза и выбора специфической терапии, используя в качестве маркера наличие той или иной транслокации.Finally, in yet another embodiment, the interpreted results are used for the purposes of medical diagnosis, determining the prognosis, and selecting a specific therapy, using the presence of a particular translocation as a marker.

Следующим важным аспектом изобретения является набор праймеров для амплификации фрагментов химерных генов, используемый в способе экспресс-анализа типа химерного транскрипта настоящего изобретения. Последовательность праймеров приведена в Перечне последовательностей (SEQ ID NO: 9-47).Another important aspect of the invention is a set of primers for amplification of fragments of chimeric genes used in the method of rapid analysis of the type of chimeric transcript of the present invention. The sequence of primers is shown in the List of sequences (SEQ ID NO: 9-47).

Еще одним важным аспектом изобретения является набор олигонуклеотидов, иммобилизованных на биочипе, используемый в способе экспресс-анализа типа химерного транскрипта настоящего изобретения и позволяющий идентифицировать гены, вовлеченные в транслокации, и верифицировать последовательности в точке слияния генов. Последовательность олигонуклеотидов приведена в Перечне последовательностей (SEQ ID NO: 48-94).Another important aspect of the invention is a set of oligonucleotides immobilized on a biochip, used in the rapid analysis method of the type of chimeric transcript of the present invention and allowing to identify the genes involved in translocation and to verify sequences at the fusion point of the genes. The sequence of oligonucleotides shown in the List of sequences (SEQ ID NO: 48-94).

Наконец, еще одним важным аспектом изобретения является биочип, содержащий набор иммобилизованных олигонуклеотидов настоящего изобретения и используемый в способе экспресс-анализа типа химерного транскрипта настоящего изобретения.Finally, another important aspect of the invention is a biochip containing a set of immobilized oligonucleotides of the present invention and used in the rapid analysis method of the type of chimeric transcript of the present invention.

Перечень фигур:List of figures:

Фигура 1. Схема биологического микрочипа.Figure 1. Scheme of a biological microchip.

Фигура 2. Гибридизационная картина образца, не несущего транслокаций.Figure 2. Hybridization picture of a sample that does not carry translocations.

Фигура 3. Гибридизационная картина образца, несущего транслокацию t(12; 21).Figure 3. Hybridization pattern of a sample bearing translocation t (12; 21).

Фигура 4. Гибридизационная картина образца, несущего транслокацию t(15; 17).Figure 4. Hybridization pattern of a sample bearing translocation t (15; 17).

Осуществление изобретенияThe implementation of the invention

Задача настоящего изобретения состоит в обеспечении способа экспресс-анализа типа химерного транскрипта, включающего верификацию последовательности в точке слияния генов, вовлеченных в транслокации, в клинических образцах, полученных от больных острыми и хроническими лейкозами, с использованием олигонуклеотидного биочипа.The objective of the present invention is to provide a method for rapid analysis of the type of chimeric transcript, including verification of the sequence at the fusion point of the genes involved in translocation in clinical samples obtained from patients with acute and chronic leukemia using an oligonucleotide biochip.

Из клинического образца выделяют лейкоциты, из лейкоцитов выделяют РНК и проводят реакцию обратной транскрипции. Полученный образец кДНК используют как матрицу в мультиплексной "гнездовой" двухэтапной ПЦР. На втором этапе ПЦР получают флуоресцентно меченный амплифицированный фрагмент. Меченый ПЦР-продукт используют для дальнейшей гибридизации на биочипе, содержащем иммобилизованные олигонуклеотиды, представляющие собой участки последовательностей генов, вовлеченных в транслокации как из смысловой, так и из антисмысловой цепей. Анализируемый фрагмент ДНК образует совершенные гибридизационные дуплексы только с соответствующими полностью комплементарными ему олигонуклеотидами. Со всеми остальными олигонуклеотидами анализируемый фрагмент ДНК будет образовывать несовершенные дуплексы, стабильность которых существенно ниже стабильности совершенных дуплексов. Дискриминацию совершенных и несовершенных дуплексов проводят после отмывки биочипа, сравнивая интенсивности флуоресценции соответствующих ячеек биочипа. Интенсивность сигнала в случае образования совершенного дуплекса выше, чем в случае несовершенного. Используя схему расположения олигонуклеотидов на биочипе, определяют, какие гены участвуют в транслокации, а также определяют последовательность в точке слияния этих генов.Leukocytes are isolated from a clinical sample, RNA is isolated from leukocytes and a reverse transcription reaction is performed. The resulting cDNA sample is used as a template in a multiplex "nested" two-stage PCR. In a second step, PCR produces a fluorescently labeled amplified fragment. Labeled PCR product is used for further hybridization on a biochip containing immobilized oligonucleotides, which are parts of gene sequences involved in translocation from both sense and antisense chains. The analyzed DNA fragment forms perfect hybridization duplexes only with the corresponding oligonucleotides fully complementary to it. With all other oligonucleotides, the analyzed DNA fragment will form imperfect duplexes, the stability of which is significantly lower than the stability of perfect duplexes. Discrimination of perfect and imperfect duplexes is carried out after washing the biochip, comparing the fluorescence intensities of the corresponding cells of the biochip. The signal intensity in the case of the formation of a perfect duplex is higher than in the case of an imperfect one. Using the arrangement of oligonucleotides on the biochip, determine which genes are involved in translocation, and also determine the sequence at the fusion point of these genes.

В аспекте удобства клинического применения способа настоящего изобретения наличие транслокаций предпочтительно определяют, используя лейкоциты, выделенные непосредственно из клинического образца, полученного от пациента. Однако должно быть понятно, что для этого могут быть использованы также и культивированные клетки. В качестве клинического образца предпочтительно используют такие образцы, которые обычно получают от пациентов, страдающих лейкозами, или индивидуумов, относящихся к соответствующей группе риска, при проведении стандартных для такой ситуации медицинских обследований, т.е. образцы костного мозга или периферической крови.In an aspect of the convenience of clinical application of the method of the present invention, the presence of translocations is preferably determined using leukocytes isolated directly from a clinical sample obtained from a patient. However, it should be understood that cultured cells can also be used for this. As a clinical sample, it is preferable to use such samples, which are usually obtained from patients suffering from leukemia, or individuals belonging to the corresponding risk group, when conducting standard medical examinations for such a situation, i.e. bone marrow or peripheral blood samples.

Для получения лейкоцитов из образца костного мозга или крови может быть использован любой способ фракционирования клеток крови, известный специалисту в данной области (например, центрифугирование в градиенте плотности, получение лейкоцитарных пленок и т.д.), или гемолиз эритроцитов в гипотонических растворах.To obtain leukocytes from a bone marrow or blood sample, any blood cell fractionation method known to a person skilled in the art can be used (for example, density gradient centrifugation, production of leukocyte films, etc.) or erythrocyte hemolysis in hypotonic solutions.

Для выделения РНК может быть использован любой известный специалисту в данной области способ, такой как метод экстракции РНК кислым фенолом (Chomczynski P., Sacchi N. 1987, Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenolchloroform extraction. Anal. Biochem. 162, 156-159) или любые коммерчески доступные наборы реагентов, предназначенные для выделения РНК ("RNAqueous" (Ambion, USA); "RNeasy" (Qiagen, USA); "Trizol" (Invitrogene), USA и т.д. без ограничения). Для уменьшения деградации РНК под действием повсеместно присутствующих РНКаз в среду для выделения РНК могут добавляться известные специалисту в данной области ингибиторы рибонуклеаз, например (без ограничения) Rnase inhibitor (Ambion, USA), RNasin Ribonuclease Inhibitor (Promega, USA) и т.д., который может быть как рекомбинантным, так и природным, например из плаценты человека.Any method known to the person skilled in the art can be used to isolate RNA, such as acid phenol extraction method of RNA (Chomczynski P., Sacchi N. 1987, Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenolchloroform extraction. Anal. Biochem. 162, 156-159) or any commercially available reagent kits designed for RNA isolation ("RNA aqueous" (Ambion, USA); "RNeasy" (Qiagen, USA); "Trizol" (Invitrogene), USA, etc. without restrictions). To reduce RNA degradation under the influence of ubiquitous RNases, ribonuclease inhibitors known to a person skilled in the art can be added to the RNA isolation medium, for example, (without limitation) Rnase inhibitor (Ambion, USA), RNasin Ribonuclease Inhibitor (Promega, USA), etc. , which can be both recombinant and natural, for example, from human placenta.

Перед проведением обратной транскрипции выделенная РНК может быть обработана ДНКазой I. Этот этап необязателен, если выделенная РНК высокого качества и содержит крайне незначительные примеси ДНК.Prior to reverse transcription, the isolated RNA can be treated with DNase I. This step is optional if the isolated RNA is of high quality and contains extremely minor DNA impurities.

В качестве праймеров в реакции обратной транскрипции могут быть использованы как специфичные для указанных транслокаций кДНК-праймеры, например, типа тех, что были использованы в работе Pallisgaard N., Hokland P., Riishoj D.C., Pedersen B., Jorgensen P. Multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction for simultaneous screening of 29 translocations and chromosomal aberrations in acute leukemia. Blood 1998; 92: 574-588, так и неспецифичные праймеры типа набора случайных гексамеров, или олиго(дТ)_(12-18). В предпочтительном воплощении изобретения для проведения реакции обратной транскрипции используют разработанные авторами настоящего изобретения праймеры SEQ ID NO: 1-8, представленные в Перечне последовательностей, а также в таблице 1.As primers in the reverse transcription reaction, cDNA primers specific for these translocations can be used, for example, those used in the work of Pallisgaard N., Hokland P., Riishoj DC, Pedersen B., Jorgensen P. Multiplex reverse transcription -polymerase chain reaction for simultaneous screening of 29 translocations and chromosomal aberrations in acute leukemia. Blood 1998; 92: 574-588, as well as non-specific primers such as a set of random hexamers, or oligo (dT) _(12-18) . In a preferred embodiment of the invention, the primers SEQ ID NO: 1-8 presented in the Sequence Listing as well as in Table 1 are used to carry out the reverse transcription reaction.

Для проведения реакции обратной транскрипции может быть использован любой фермент, способный создавать ДНК-копию с РНК-матрицы, в том числе обратная транскриптаза MMLV (Moloney Murine Leukemia Virus), обратная транскриптаза AMV (Avian Myeloblastosis Virus), термостабильная полимераза Tth и т.п. Такие ферменты являются коммерчески доступными от большого числа производителей.For the reverse transcription reaction, any enzyme capable of creating a DNA copy from the RNA matrix can be used, including reverse transcriptase MMLV (Moloney Murine Leukemia Virus), reverse transcriptase AMV (Avian Myeloblastosis Virus), thermostable Tth polymerase, etc. . Such enzymes are commercially available from a large number of manufacturers.

Полимеразная цепная реакция может быть проведена с использованием любого вида термостабильной полимеразы (Taq-полимераза, фрагмент Стоффеля, Tth-полимераза, Tfl-полимераза, Pfu-полимераза, Vent-полимераза, DeepVent-полимераза и т.п. без ограничения, которые коммерчески доступны от большого числа производителей), работающей в соответствующем буфере. Для построения новой цепи в буфер добавляется смесь дНТФ (дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ) в принятых концентрациях, но вместо дТТФ может быть использован дУТФ. Для проведения ПЦР могут быть использованы готовые коммерчески доступные наборы, содержащие все необходимые компоненты, за исключением праймеров.The polymerase chain reaction can be carried out using any type of thermostable polymerase (Taq polymerase, Stoffel fragment, Tth polymerase, Tfl polymerase, Pfu polymerase, Vent polymerase, DeepVent polymerase and the like, without limitation, which are commercially available from a large number of manufacturers) working in the corresponding buffer. To build a new chain, a mixture of dNTPs (dATP, dGTF, dTCP, dTTP) at the accepted concentrations is added to the buffer, but dUTP can be used instead of dTTP. For PCR, ready-made commercially available kits containing all the necessary components, with the exception of primers, can be used.

В качестве праймеров для проведения мультиплексной "гнездовой" двухстадийной полимеразной цепной реакции используют праймеры SEQ ID NO: 9-47, приведенные в Перечне последовательностей, а также в таблице 2. Существуют разнообразные химические подходы к синтезу олигонуклеотидных праймеров, например фосфодиэфирный метод, гидрофосфорильный метод и т.д. но наибольшее распространение в настоящее время имеет фосфорамидитный метод. Синтез праймеров осуществляют, используя автоматические ДНК/РНК синтезаторы, например, производства фирмы Applied Biosystems (США).As primers for conducting the multiplex "nested" two-stage polymerase chain reaction, primers SEQ ID NO: 9-47 are used, which are listed in the Sequence Listing, as well as in Table 2. There are various chemical approaches to the synthesis of oligonucleotide primers, for example, the phosphodiester method, the hydrophosphoryl method, and etc. but the most common is currently the phosphoramidite method. Primer synthesis is carried out using automatic DNA / RNA synthesizers, for example, manufactured by Applied Biosystems (USA).

В одном из воплощений мечение ПЦР-продукта на втором этапе ПЦР проводят с помощью праймеров, несущих флуоресцентную метку на 5'-конце. В другом воплощении метку вводят с использованием флуоресцентно меченного дезоксинуклеозидтрифосфата. Специалисту в данной области понятно, что в последнем случае за счет включения в конечный продукт большого числа остатков флуорофора интенсивность флуоресценции будет существенно выше и соответственно будет достигаться более высокая чувствительность. Кроме того, возможно мечение каким-либо другим способом или мечение ПЦР-продукта уже после завершения ПЦР. В качестве примера можно привести включение по 3'-концу ПЦР-продукта флуоресцентно меченного дезоксинуклеозидтрифосфата с помощью фермента терминальной нуклеотидилтрансферазы. Может быть проведена также дополнительная фрагментация ПЦР-продукта, например, при помощи фермента ДНКазы I, химического гидролиза (например, в присутствии ионов магния) или обработки ультразвуком.In one embodiment, the labeling of the PCR product in the second step of the PCR is carried out using primers carrying a fluorescent label at the 5'-end. In another embodiment, the label is administered using fluorescently labeled deoxynucleoside triphosphate. One skilled in the art will understand that in the latter case, by incorporating a large number of fluorophore residues into the final product, the fluorescence intensity will be significantly higher and, accordingly, higher sensitivity will be achieved. In addition, it is possible to label in some other way or to label the PCR product after the completion of the PCR. As an example, the inclusion at the 3'-end of the PCR product of fluorescently labeled deoxynucleoside triphosphate using the enzyme terminal nucleotidyl transferase. Additional fragmentation of the PCR product can also be carried out, for example, using the enzyme DNase I, chemical hydrolysis (for example, in the presence of magnesium ions) or sonication.

В качестве флуоресцентной метки может быть использован любой флуорохром (например, без ограничения, FITC, Texas red, Су-3, Су-5 и т.д.), а также биотин.Any fluorochrome can be used as a fluorescent label (for example, without limitation, FITC, Texas red, Su-3, Su-5, etc.), as well as biotin.

На второй стадии мультиплексной "гнездовой" двухэтапной ПЦР праймеры, входящие в состав одной пары, могут использоваться в эквимолярных количествах. Специалисту понятно, что образующийся при этом продукт амплификации будет, по существу, двухцепочечным, и для его эффективной гибридизации с олигонуклеотидами, иммобилизованными на биочипе, проводят предварительную денатурацию. Обычно денатурацию проводят непосредственно перед проведением гибридизации путем прогрева готовой гибридизационной смеси при 95°С в течение 5 мин с последующим быстрым охлаждением во льду. В предпочтительном воплощении изобретения вторую стадию мультиплексной "гнездовой" двухэтапной ПЦР проводят в асимметричном формате, т.е. флуоресцентно меченный праймер используют в молярном избытке по отношению к немеченому праймеру, например при молярном соотношении около 10:1 соответственно. Специалисту понятно, что образующийся при этом продукт амплификации будет представлен преимущественно одноцепочечной флуоресцентно меченной ДНК. С учетом возможности образования вторичных структур для эффективной гибридизации такого продукта с олигонуклеотидами, иммобилизованными на биочипе, при необходимости также проводится его предварительная денатурация.In the second stage of the multiplex "nested" two-stage PCR primers that are part of one pair can be used in equimolar amounts. One skilled in the art will understand that the amplification product resulting from this will be essentially double-stranded, and to pre-hybridize it with oligonucleotides immobilized on a biochip, preliminary denaturation is carried out. Typically, denaturation is carried out immediately prior to hybridization by heating the finished hybridization mixture at 95 ° C for 5 minutes, followed by rapid cooling in ice. In a preferred embodiment of the invention, the second step of the multiplex “nested” two-step PCR is carried out in an asymmetric format, i.e. fluorescently labeled primer is used in molar excess relative to unlabeled primer, for example, at a molar ratio of about 10: 1, respectively. One skilled in the art will appreciate that the amplification product resulting from this will be predominantly single stranded fluorescently labeled DNA. Given the possibility of the formation of secondary structures for effective hybridization of such a product with oligonucleotides immobilized on a biochip, preliminary denaturation is also carried out if necessary.

При подборе условий гибридизации создают условия, обеспечивающие наибольшую интенсивность флуоресценции совершенных дуплексов, специфичность взаимодействия и максимальную разницу в стабильности между совершенными и несовершенными дуплексами. Гибридизация может быть проведена в любом известном специалисту в данной области гибридизационном буфере, при необходимости содержащем реагенты, понижающие температуру плавления образуемых дуплексов и обеспечивающие специфичность взаимодействия между олигонуклеотидным зондом и ДНК-мишенью в диапазоне температур от 20 до 37°С. Это обеспечивает дополнительное удобство в использовании способа настоящего изобретения в случае клинической лаборатории, в комплект стандартного оборудования которой обычно входит термостат, установленный на температуру, например, 37°С. К таким реагентам относятся формамид, гуанидин гидрохлорид, гуанидин изотиоцианат и др. Гибридизация может проводиться и в отсутствии таких реагентов, но при более высоких температурах, соответствующих температурам плавления олигонуклеотидных зондов в используемом буфере. При подборе условий гибридизации и отмывки основное внимание должно быть обращено на специфичность прохождения гибридизации. Отмывка может быть проведена в любом известном в данной области техники буфере с добавлением соли (SSC, SSPE и т.п.) или в деионизованной воде, но за более короткое время (J.F.Sambrook and D.W.Russell, 2001, "Molecular cloning: a laboratory manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press).When selecting hybridization conditions, conditions are created that ensure the highest fluorescence intensity of perfect duplexes, the specificity of the interaction, and the maximum difference in stability between perfect and imperfect duplexes. Hybridization can be carried out in any hybridization buffer known to a person skilled in the art, optionally containing reagents that lower the melting point of the formed duplexes and ensure the specificity of the interaction between the oligonucleotide probe and the target DNA in the temperature range from 20 to 37 ° C. This provides additional convenience in using the method of the present invention in the case of a clinical laboratory, the standard equipment of which usually includes a thermostat set to a temperature, for example, 37 ° C. Such reagents include formamide, guanidine hydrochloride, guanidine isothiocyanate, etc. Hybridization can be carried out in the absence of such reagents, but at higher temperatures corresponding to the melting points of the oligonucleotide probes in the buffer used. When selecting the conditions of hybridization and washing, the main attention should be paid to the specificity of the passage of hybridization. Washing can be carried out in any buffer known in the art with the addition of salt (SSC, SSPE, etc.) or in deionized water, but in a shorter time (JFSambrook and DWRussell, 2001, "Molecular cloning: a laboratory manual "Cold Spring Harbor Laboratory Press).

Регистрация гибридизационной картины может быть произведена с помощью любой детектирующей системы, распознающей флуоресцентный сигнал (флуоресцентный микроскоп с ПЗС-камерой, лазерный сканер или портативный анализатор биочипов, доступные коммерчески от большого числа производителей, например портативный анализатор биочипов, производимый серийно ООО "Биочип-ИМБ", и снабженной регистрирующим устройством (ПЗС-камерой, видеокамерой, фотокамерой)). Анализ изображения может быть произведен как визуально, так и в автоматическом режиме с использованием специальной программы.The hybridization pattern can be recorded using any detection system that recognizes a fluorescent signal (a fluorescence microscope with a CCD camera, a laser scanner, or a portable biochip analyzer, available commercially from a large number of manufacturers, for example, a portable biochip analyzer, produced commercially by Biochip-IMB LLC , and equipped with a recording device (CCD camera, video camera, camera)). Image analysis can be done both visually and automatically using a special program.

При изготовлении микрочипа могут быть использованы олигонуклеотиды, несущие по 5'- или 3'-концу активную группу, обеспечивающую иммобилизацию. Существуют разнообразные химические подходы к синтезу олигонуклеотидов, например фосфодиэфирный метод, гидрофосфорильный метод и т.д., но наибольшее распространение в настоящее время имеет фосфорамидитный метод. Синтез олигонуклеотидов осуществляют, используя автоматические ДНК/РНК синтезаторы, например, производства фирмы Applied Biosystems (США). Возможно использование широкого спектра групп для модификации иммобилизуемых олигонуклеотидов, таких как аминогруппа, тиол, гидразид, акриламидная группа, бензальдегид, тиофосфат и т.п. (Seliger H., Hinz М., Нарр Е. "Arrays of immobilized oligonucleotides - contributions to nucleic acids technology" Current Pharmaceutical Biotechnology, 2003, 4, 379-395). Модификация олигонуклеотида, имеющая целью введение активной группы, пригодной для последующей иммобилизации олигонуклеотида на биочипе, может быть осуществлена как в автоматическом режиме при синтезе с использованием широкого спектра модификаторов, которые коммерчески доступны, например от Glen Research (USA), так и постсинтетически в ручном режиме.In the manufacture of the microchip, oligonucleotides that carry an active group providing immobilization at the 5'- or 3'-end can be used. There are various chemical approaches to the synthesis of oligonucleotides, for example, the phosphodiester method, the hydrophosphoryl method, etc., but the phosphoramidite method is currently the most widely used. The synthesis of oligonucleotides is carried out using automatic DNA / RNA synthesizers, for example, manufactured by Applied Biosystems (USA). A wide range of groups can be used to modify immobilized oligonucleotides, such as an amino group, thiol, hydrazide, acrylamide group, benzaldehyde, thiophosphate, and the like. (Seliger H., Hinz M., Narr E. "Arrays of immobilized oligonucleotides - contributions to nucleic acids technology" Current Pharmaceutical Biotechnology, 2003, 4, 379-395). Modification of the oligonucleotide, with the aim of introducing an active group suitable for subsequent immobilization of the oligonucleotide on a biochip, can be carried out both automatically in the synthesis using a wide range of modifiers that are commercially available, for example from Glen Research (USA), and postsynthetically in manual mode .

Биочипы могут быть изготовлены путем создания на поверхности стеклянной подложки матрицы из ячеек полиакриламидного геля, активации ячеек и ковалентной иммобилизации в ячейках модифицированных олигонуклеотидов, несущих активные группы (Mirzabekov А. & Kolchinsky A. MAGIChip: Properties and applications in genomic studies. (2002) In Genomic Technologies: Present and Future. Eds. Galas D.J., S.J.McCormack. Caister Academic Press, pp.163-196). Также биочипы могут быть изготовлены методом химически индуцируемой или фотоиндуцируемой сополимеризации олигонуклеотида в акриламидном геле, как описано ранее (Vasiliskov, V., Timofeev E., Surzhikov S., Drobyshev, A., Shick, V. & Mirzabekov, A. 1999. Fabrication ofmicroarray of gel-immobilized compounds on a chip by copolymerization. BioTechnique, 27, 592-606; Мирзабеков А.Д., Рубина А.Ю., Паньков С.В., Чернов Б.К Патент на изобретение N2175972 "Способ иммобилизации олигонуклеотидов, содержащих непредельные группы, в полимерных гидрогелях при формировании микрочипа". Приоритет от 28.12.1999). Также биочипы могут быть изготовлены любыми другими известными специалисту в данной области способами (Seliger H., Hinz M., Happ E. "Arrays of immobilized oligonucleotides - contributions to nucleic acids technology" Current Pharmaceutical Biotechnology, 2003, 4, 379-395), а в качестве подложки, помимо стекла, может быть использован другой материал (пластик, металл, гибкие мембраны и т.д.). Также для изготовления микрочипов могут быть использованы активированные подложки, коммерчески доступные от различных производителей (см., например, Ramakrishnan R., Dorris D., Lublinsky A., Nguyen A., Domanus M., Prokhorova A., Gieser L., Touma E., Lockner R., Tata M., Zhu X., Patterson M., Shippy R., Sendera T.J., Mazumder A. 2002. An assessment of Motorola CodeLink microarray performance for gene expression profiling applications. Nucleic Acids Res. 30: e30).Biochips can be made by creating on the glass substrate surface a matrix of polyacrylamide gel cells, activating the cells and covalently immobilizing the modified oligonucleotides in the cells carrying active groups (Mirzabekov A. & Kolchinsky A. MAGIChip: Properties and applications in genomic studies. (2002) In Genomic Technologies: Present and Future. Eds. Galas DJ, SJMcCormack. Caister Academic Press, pp. 163-196). Biochips can also be made by chemically-induced or photo-induced copolymerization of an oligonucleotide in an acrylamide gel, as previously described (Vasiliskov, V., Timofeev E., Surzhikov S., Drobyshev, A., Shick, V. & Mirzabekov, A. 1999. Fabrication ofmicroarray of gel-immobilized compounds on a chip by copolymerization. BioTechnique, 27, 592-606; Mirzabekov A.D., Rubina A.Yu., Pankov S.V., Chernov B.K. Patent for invention N2175972 "Method for immobilization of oligonucleotides containing unsaturated groups in polymer hydrogels during microchip formation. "Priority dated 12/28/1999). Biochips can also be made by any other methods known to a person skilled in the art (Seliger H., Hinz M., Happ E. "Arrays of immobilized oligonucleotides - contributions to nucleic acids technology" Current Pharmaceutical Biotechnology, 2003, 4, 379-395), and as a substrate, in addition to glass, another material can be used (plastic, metal, flexible membranes, etc.). Activated substrates commercially available from various manufacturers can also be used for the manufacture of microchips (see, for example, Ramakrishnan R., Dorris D., Lublinsky A., Nguyen A., Domanus M., Prokhorova A., Gieser L., Touma E., Lockner R., Tata M., Zhu X., Patterson M., Shippy R., Sendera TJ, Mazumder A. 2002. An assessment of Motorola CodeLink microarray performance for gene expression profiling applications. Nucleic Acids Res. 30: e30).

Для изготовления биочипа настоящего изобретения используют набор олигонуклеотидов SEQ ID NO: 48-93, приведенных в Перечне последовательностей, а также таблице 3. В качестве контроля прохождения гибридизации в настоящем изобретении используют фрагмент последовательности гена rpoB Mycobacterium tuberculosis (SEQ ID NO: 93, 94). Однако специалисту понятно, что в качестве контроля прохождения гибридизации можно использовать любую последовательность, не содержащуюся в человеческом геноме. Расположение конкретных олигонуклеотидных зондов на биочипе может варьировать и определяется только удобством для интерпретации результатов гибридизации. Модификацией данного биочипа может быть вариант, когда иммобилизованы олигонуклеотидные зонды только одного знака, либо из смысловой цепи либо из антисмысловой цепи, причем для каждого варианта химерного транскрипта (каждой транслокации) это определяется тем, какой из праймеров второго этапа несет флуоресцентную метку. Если меченым является верхний праймер, в набор детектирующих олигонуклеотидов для данного химерного транскрипта входят последовательности из антисмысловой цепи и наоборот.For the manufacture of the biochip of the present invention, the set of oligonucleotides SEQ ID NO: 48-93 shown in the Sequence Listing and Table 3 are used. As a control of hybridization, a fragment of the rpoB gene sequence of Mycobacterium tuberculosis (SEQ ID NO: 93, 94) is used in the present invention. . However, one skilled in the art will appreciate that any sequence not contained in the human genome can be used as a control for hybridization. The location of specific oligonucleotide probes on the biochip can vary and is determined only by the convenience for interpreting the results of hybridization. A modification of this biochip can be an option when oligonucleotide probes of only one sign are immobilized, either from the sense strand or from the antisense strand, and for each variant of the chimeric transcript (each translocation) this is determined by which of the primers of the second stage carries a fluorescent label. If the top primer is labeled, the set of detecting oligonucleotides for a given chimeric transcript includes sequences from the antisense strand and vice versa.

Выявление и идентификация химерных транскриптов, образующихся в результате хромосомных транслокаций, являются важным моментом в точной диагностике злокачественных заболеваний крови. В настоящее время известно более 50 различных транслокаций, которые, как было обнаружено, специфичны для определенных типов лейкозов и лимфом. Из них можно выделить несколько наиболее важных с прогностической точки зрения транслокаций, которые являются генетическими маркерами заболевания и используются для стратификации пациентов по группам риска. К таким транслокациям, в первую очередь, относятся t(9;22) BCR/ABL р190 и р210, t(4;11) MLL/AF4, t(12;21) TEL/AML1, t(1;19) E2A/PBX, t(15;17) PML/RARA, t(8;21) AML1/ETO, inv16 CBFB/MYH11. Одна из известнейших транслокаций - Филадельфийская (Ph) хромосома t(9;22) (q34;q11), химерный транскрипт BCR/ABL. Единственным шансом для таких больных до недавнего времени оставалась трансплантация костного мозга. Вместе с тем, в настоящее время разработана дифференцированная терапия с использованием ингибитора химерного белка BCR/ABL-тирозинкиназы, экспрессирующегося при этой транслокации, которая существенно улучшает показатели выживаемости у больных этой формой лейкоза. Транслокация t(15; 17) (q22; q21), химерный транскрипт PML/RARA встречается исключительно при остром промиелоцитарном лейкозе (М3 вариант ОНЛЛ) и является его генетическим маркером. Данная хромосомная перестройка затрагивает ген рецептора ретиноевой кислоты (RARA), что определяет хороший ответ на лечение производными транс ретиноевой кислоты (all-trans retinoic acid ATRA). Излечение при этой форме лейкоза возможно у 95% больных. Также в случае обнаружения определенного типа химерного транскрипта он может быть использован как маркер заболевания при отслеживании минимальной резидуальной болезни. Это дает возможность оценивать эффективность проводимой терапии и прогнозировать возникновение рецидива.The identification and identification of chimeric transcripts resulting from chromosomal translocations are an important point in the accurate diagnosis of malignant blood diseases. Currently, more than 50 different translocations are known that have been found to be specific for certain types of leukemia and lymphomas. Of these, several of the most prognostically important translocations can be distinguished, which are genetic markers of the disease and are used to stratify patients by risk groups. Such translocations primarily include t (9; 22) BCR / ABL p190 and p210, t (4; 11) MLL / AF4, t (12; 21) TEL / AML1, t (1; 19) E2A / PBX, t (15; 17) PML / RARA, t (8; 21) AML1 / ETO, inv16 CBFB / MYH11. One of the most famous translocations is the Philadelphia (Ph) chromosome t (9; 22) (q34; q11), the chimeric transcript BCR / ABL. Until recently, bone marrow transplantation remained the only chance for such patients. At the same time, differentiated therapy has been developed with the use of an inhibitor of the chimeric protein BCR / ABL tyrosine kinase expressed during this translocation, which significantly improves survival rates in patients with this form of leukemia. Translocation t (15; 17) (q22; q21), the chimeric transcript PML / RARA occurs exclusively in acute promyelocytic leukemia (M3 version of ONLL) and is its genetic marker. This chromosomal rearrangement affects the retinoic acid receptor gene (RARA), which determines a good response to treatment with trans retinoic acid derivatives (all-trans retinoic acid ATRA). Cure with this form of leukemia is possible in 95% of patients. Also, if a certain type of chimeric transcript is detected, it can be used as a marker of the disease while tracking minimal residual disease. This makes it possible to evaluate the effectiveness of the therapy and to predict the occurrence of relapse.

Далее изобретение иллюстрируется примерами, которые показывают применение способа ДНК-дезоксиолигонуклеотид гибридизации для идентификации хромосомных транслокаций и верификации последовательности в точке слияния генов, участвующих в транслокации. Следует, однако, понимать, что приводимые примеры служат исключительно для иллюстрации и не предназначены для ограничения объема притязаний, выраженных в формуле изобретения. На основании настоящего описания специалист в данной области сможет легко предложить свои варианты и модификации осуществления изобретения, не отходя от общей концепции настоящего изобретения и без привлечения собственной изобретательской деятельности, так что должно быть понятно, что такие варианты и модификации также будут входить в объем притязаний настоящего изобретения.The invention is further illustrated by examples that show the application of the DNA deoxy oligonucleotide hybridization method for identifying chromosomal translocations and verifying the sequence at the fusion point of genes involved in translocation. However, it should be understood that the examples provided are for illustration only and are not intended to limit the scope of the claims expressed in the claims. Based on the present description, a person skilled in the art will be able to easily suggest their options and modifications of the invention without departing from the general concept of the present invention and without involving their own inventive activity, so it should be clear that such options and modifications will also be included in the scope of the claims of this inventions.

Пример 1. Подготовка образца для исследования и выделение РНКExample 1. Sample preparation for research and RNA isolation

1. В качестве материала для проведения исследования используют образцы костного мозга или крови больных лейкозом. Клинический образец (костный мозг или кровь), предварительно смешанный с антикоагулянтом (ЭДТА или цитратом натрия), подвергают гемолизу в растворе 0,8% NH₄Cl и последующему центрифугированию в течение 20 мин при 3000 об/мин для выделения фракции лейкоцитов.1. As the material for the study using samples of bone marrow or blood of patients with leukemia. A clinical sample (bone marrow or blood), pre-mixed with an anticoagulant (EDTA or sodium citrate), is subjected to hemolysis in a solution of 0.8% NH ₄ Cl and subsequent centrifugation for 20 min at 3000 rpm to isolate the leukocyte fraction.

2. В качестве эталонных образцов используют клеточные линии, несущие специфические хромосомные транслокации: К-562, MV-4-11, NB4, REH, или не несущие каких-либо транслокаций, например HL-60. При использовании клеточных линий клетки выращивают на среде RPMI с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки. За 18 часов перед выделением РНК клетки рассевают в концентрации 500000 клеток/мл. Клетки собирают центрифугированием, промывают фосфатно-солевым буфером и проводят выделение РНК.2. As reference samples, cell lines using specific chromosomal translocations are used: K-562, MV-4-11, NB4, REH, or not carrying any translocations, for example, HL-60. Using cell lines, cells are grown in RPMI medium supplemented with 10% fetal calf serum. 18 hours before RNA isolation, the cells are seeded at a concentration of 500,000 cells / ml. Cells are harvested by centrifugation, washed with phosphate-buffered saline, and RNA is isolated.

3. Для выделения РНК используют метод экстракции кислым фенолом (Chomczynski Р., Sacchi N. 1987, Anal. Biochem. 162, 156-159).3. For extraction of RNA using the method of extraction with acidic phenol (Chomczynski P., Sacchi N. 1987, Anal. Biochem. 162, 156-159).

Пример 2. Получение кДНК и амплификация химерных транскриптов методом двухэтапной "гнездовой" мультиплексной ПЦР с целью наработки флуоресцентно меченного фрагмента гибридного гена, специфичного для каждой транслокацииExample 2. Obtaining cDNA and amplification of chimeric transcripts by the method of two-stage "nested" multiplex PCR in order to produce a fluorescently labeled fragment of a hybrid gene specific for each translocation

4. Перед проведением обратной транскрипции препарат РНК, полученный в п.3 Примера 1, обрабатывают ДНКазой I (Gibco, BRL) по стандартной методике для удаления примеси ДНК. РНК (2-4 мкг) инкубируют при 70°С в течение 5 мин со смесью специфических кДНК праймеров (SEQ ID NO: 1-8). Реакцию обратной транскрипции проводят с ферментом обратная транскриптаза MMLV в количестве 200 ед. на 25 мкл реакционной смеси, содержащей 20 ед. ингибитора РНКазы (Rnase inhibitor, Ambion, USA), по 1 mM каждого из дНТФ, 10 мМ дитиотрейтол, 50 мМ Трис-HCl, рН 8.3, 75 mM KCl и 3 мМ MgCl₂ при 37°C-42°C в течение 1,5 ч с последующей инактивацией фермента при 70°С в течение 10 мин.4. Before reverse transcription, the RNA preparation obtained in clause 3 of Example 1 is treated with DNase I (Gibco, BRL) according to a standard procedure to remove DNA impurities. RNA (2-4 μg) was incubated at 70 ° C for 5 min with a mixture of specific cDNA primers (SEQ ID NO: 1-8). The reverse transcription reaction is carried out with the enzyme reverse transcriptase MMLV in an amount of 200 units. 25 μl of the reaction mixture containing 20 units RNase inhibitor (Rnase inhibitor, Ambion, USA), 1 mM each of dNTP, 10 mM dithiothreitol, 50 mM Tris-HCl, pH 8.3, 75 mM KCl and 3 mM MgCl ₂ at 37 ° C-42 ° C for 1 , 5 hours, followed by inactivation of the enzyme at 70 ° C for 10 minutes

5. В 25 мкл ПЦР-смеси первого этапа вносят 1 мкл образца, полученного в п.4. Состав ПЦР-смеси: 67 мМ Трис-HCl, рН 8.6, 166 мМ (NH₄)₂SO₄, 0.01% Тритон X-100, 1.5 мМ MgCl₂, 0,2 мМ каждого из дНТФ (Promega, USA), смесь праймеров первого раунда по 5 пмоль каждого (SEQ ID NO: 9, 10, 14, 15, 18-20, 26, 26, 29, 30, 33-35, 39-41, 45, 46) и 1,5 единицы фермента Taq-полимераза фирмы "Силекс" (Россия). Всю смесь нагревают при 94°С в течение 5 мин, затем проводят 25 циклов амплификации по следующей схеме: 94°С - 30 сек, 58°С - 30 сек, 72°С - 1 мин.5. In 25 μl of the PCR mixture of the first stage make 1 μl of the sample obtained in paragraph 4. Composition of the PCR mixture: 67 mM Tris-HCl, pH 8.6, 166 mM (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , 0.01% Triton X-100, 1.5 mM MgCl ₂ , 0.2 mM each of dNTPs (Promega, USA), mixture primers of the first round of 5 pmol each (SEQ ID NO: 9, 10, 14, 15, 18-20, 26, 26, 29, 30, 33-35, 39-41, 45, 46) and 1.5 units of the enzyme Taq polymerase company "Sileks" (Russia). The whole mixture is heated at 94 ° C for 5 min, then 25 cycles of amplification are carried out according to the following scheme: 94 ° C - 30 sec, 58 ° C - 30 sec, 72 ° C - 1 min.

6. На втором этапе проводят асимметричную ПЦР с праймерами второго этапа (SEQ ID NO: 11-13, 16, 17, 21-24, 27, 28, 31, 32, 36-38, 42-44, 45, 47). В 25 мкл ПЦР-смеси второго этапа вносят 2 мкл продукта первого этапа ПЦР. Для каждого химерного транскрипта в реакции участвуют праймеры, меченные флуоресцентным красителем Су-3, по 50 пмоль каждого (SEQ ID NO: 11, 12, 16, 21-23, 27, 31, 36, 37, 42, 47) и немеченые праймеры по 5 пмоль каждого (SEQ ID NO: 13, 17, 24, 28, 32, 38, 43, 44, 45), подобранные так, чтобы в каждой паре "верхний и нижний праймеры" один был меченым, а другой немеченым. Последовательности праймеров первого и второго этапа приведены также в таблице 1. Условия реакции используют те же, что и в п.5, но после 25 циклов амплификации следует этап элонгации при 72°С в течение 10 мин. В результате реакции для каждого химерного транскрипта нарабатывают преимущественно цепь одного знака (смысловая или антисмысловая), содержащую на 5'-конце флуоресцентную метку. ПЦР-анализ на наличие химерного транскрипта проводят как несколько параллельных мультиплексных реакций.6. At the second stage, an asymmetric PCR is performed with the primers of the second stage (SEQ ID NO: 11-13, 16, 17, 21-24, 27, 28, 31, 32, 36-38, 42-44, 45, 47). In 25 μl of the PCR mixture of the second stage make 2 μl of the product of the first stage of PCR. For each chimeric transcript, the reaction involves primers labeled with a Su-3 fluorescent dye, 50 pmol each (SEQ ID NO: 11, 12, 16, 21-23, 27, 31, 36, 37, 42, 47) and unlabeled primers 5 pmol each (SEQ ID NO: 13, 17, 24, 28, 32, 38, 43, 44, 45), selected so that in each pair of “upper and lower primers” one was labeled and the other unlabeled. The sequences of the primers of the first and second stages are also shown in table 1. The reaction conditions are the same as in step 5, but after 25 amplification cycles, an elongation step follows at 72 ° C for 10 minutes. As a result of the reaction, for each chimeric transcript, a chain of the same sign (semantic or antisense) containing a fluorescent label at the 5'-end is predominantly generated. PCR analysis for the presence of a chimeric transcript is carried out as several parallel multiplex reactions.

Пример 3. Олигонуклеотидный биочип для идентификации хромосомных транслокаций при злокачественных заболеваниях кровиExample 3. Oligonucleotide biochip for identification of chromosomal translocations in malignant blood diseases

7. Олигонуклеотиды для иммобилизации на микрочипе синтезируют на автоматическом синтезаторе 394 DNA/RNA Synthesizer (Applied Biosystems, США) с использованием стандартной фосфоамидитной процедуры. 5' или 3'-конец олигонуклеотидов содержит спейсер со свободной аминогруппой, который вводят в состав олигонуклеотида при синтезе путем использования 3'-Amino-Modifier C7 CPG 500 (Glen Research, USA). Присоединение флуоресцентной метки к олигонуклеотидам по свободной аминогруппе осуществляют в соответствии с рекомендациями производителя. Олигонуклеотиды, меченные цианиновым красителем Су-3, очищают ВЭЖХ от олигонуклеотидов, не включивших флуоресцентный краситель, на колонке "Hypersil ODS 5 мкм, 4,6×250 мм" ("Sypeico Int", США).7. Oligonucleotides for immobilization on a microchip are synthesized on a 394 DNA / RNA Synthesizer (Applied Biosystems, USA) using a standard phosphoamidite procedure. The 5 ′ or 3 ′ end of the oligonucleotides contains a free amino group spacer, which is introduced into the oligonucleotide by synthesis using the 3′-Amino-Modifier C7 CPG 500 (Glen Research, USA). The addition of a fluorescent label to the free amino group oligonucleotides is carried out in accordance with the manufacturer's recommendations. Oligonucleotides labeled with cyanine dye Su-3 purified HPLC from oligonucleotides that did not include a fluorescent dye on a Hypersil ODS 5 μm, 4.6 × 250 mm column (Sypeico Int, USA).

8. Биочип изготовляют методом сополимеризации олигонуклеотида в акриламидном геле, как описано ранее (Патент на изобретение N 2175972 "Способ иммобилизации олигонуклеотидов, содержащих непредельные группы, в полимерных гидрогелях при формировании микрочипа" Мирзабеков А.Д., Рубина А.Ю., Паньков С.В., Чернов Б.К. Приоритет от 28.12.1999). Биочип содержит 45 типов иммобилизованных олигонуклеотидов (SEQ ID NO: 48-93), список которых представлен также в таблице 3. На фиг.1. представлена структура биочипа для идентификации хромосомных транслокаций при злокачественных заболеваниях крови. В трех крайних ячейках биочипа расположены контрольные олигонуклеотиды (spike), которые используют в качестве положительного контроля прохождения гибридизации. В настоящем примере в качестве контрольного олигонуклеотида использован фрагмент последовательности гена rpoB Mycobacterium tuberculosis (SEQ ID NO: 93). Олигонуклеотиды к гену ABL, который служит положительным контролем для определения качества препарата РНК, эффективности процедуры обратной транскрипции, мечения, расположены в нижних углах чипа. В вертикальных рядах ячеек (столбцах) располагаются олигонуклеотиды (каждая проба и соответственно каждый столбец были продублированы), представляющие собой участки последовательностей генов, вовлеченных в транслокации. Набор олигонуклеотидов в вертикальном ряду для каждой транслокации включает олигонуклеотид из участка гена, входящего во все варианты химерных транскриптов для данной транслокации. Далее расположены олигонуклеотиды, представляющие собой последовательности в точке слияния, причем часть нуклеотидов в данном олигонуклеотиде принадлежала одному гену, часть - другому гену, участвующим в транслокации.8. The biochip is made by copolymerization of an oligonucleotide in an acrylamide gel, as described previously (Patent for invention N 2175972 "Method for immobilizing oligonucleotides containing unsaturated groups in polymer hydrogels during microchip formation" Mirzabekov AD, Rubina A.Yu., Pankov S .V., Chernov B.K. Priority dated 12/28/1999). The biochip contains 45 types of immobilized oligonucleotides (SEQ ID NO: 48-93), a list of which is also presented in table 3. In figure 1. The biochip structure for identification of chromosomal translocations in malignant blood diseases is presented. In the three extreme cells of the biochip, control oligonucleotides (spike) are located, which are used as a positive control for hybridization. In the present example, a fragment of the rpoB gene sequence of Mycobacterium tuberculosis (SEQ ID NO: 93) was used as a control oligonucleotide. Oligonucleotides for the ABL gene, which serves as a positive control for determining the quality of the RNA preparation, the effectiveness of the reverse transcription procedure, labeling, are located in the lower corners of the chip. The vertical rows of cells (columns) contain oligonucleotides (each sample and, accordingly, each column were duplicated), which are parts of the sequences of genes involved in translocation. The set of oligonucleotides in the vertical row for each translocation includes an oligonucleotide from a portion of a gene that is included in all variants of chimeric transcripts for a given translocation. Next are the oligonucleotides, which are sequences at the fusion point, with some of the nucleotides in this oligonucleotide belong to one gene, part to another gene involved in the translocation.

Пример 4. Гибридизация меченого продукта на биочипеExample 4. Hybridization of a labeled product on a biochip

9. Содержимое из каждой пробирки, полученной на стадии 6 Примера 2, отбирают, смешивают и добавляют контрольный олигонуклеотид (spike-hyb) (SEQ ID NO: 94), который комплементарен иммобилизованному на биочипе контрольному олигонуклеотиду (spike_imm) (SEQ ID NO: 93), в конечной концентрации 10^-3-10^-4пмоль/мл. Эту смесь используют для гибридизации на биочипе в буфере следующего состава: 20% формамид (Gibco BRL), 6×SSPE. Готовую гибридизационную смесь перед гибридизацией денатурируют при 95°С в течение 5 мин, охлаждают во льду и наносят на биочип под гибридизационную камеру объемом 30 мкл (Sigma, USA). Гибридизацию проводят в течение ночи (16-18 ч) при температуре 37°С. Отмывку проводят в буфере 1×SSPE при комнатной температуре в течение 10 мин.9. The contents of each tube obtained in step 6 of Example 2 are selected, mixed and a control oligonucleotide (spike-hyb) (SEQ ID NO: 94), which is complementary to a biochip immobilized control oligonucleotide (spike_imm) (SEQ ID NO: 93), is added ), in a final concentration of 10 ^-3 -10 ^-4 pmol / ml. This mixture is used for hybridization on a biochip in a buffer of the following composition: 20% formamide (Gibco BRL), 6 × SSPE. Before hybridization, the prepared hybridization mixture was denatured at 95 ° C for 5 min, cooled in ice, and applied onto a biochip under a hybridization chamber with a volume of 30 μl (Sigma, USA). Hybridization is carried out overnight (16-18 hours) at a temperature of 37 ° C. Washing is carried out in 1 × SSPE buffer at room temperature for 10 minutes.

Пример 5. Регистрация и интерпретация результатов гибридизацииExample 5. Registration and interpretation of hybridization results

10. Регистрацию гибридизационной картины производят с помощью портативного анализатора биочипов, снабженного ПЗС-камерой, производимого ООО "Биочип-ИМБ". При визуальном анализе изображения интерпретацию результатов проводят следующим образом. Гибридизационный сигнал в трех угловых ячейках, где иммобилизованы контрольные олигонуклеотиды (spike_imm), должен присутствовать на всех гибридизационных картинах. Наличие сигнала с ячеек свидетельствует о расположении чипа. Гибридизационный сигнал в ячейках, где иммобилизованы олигонуклеотиды, относящиеся к гену ABL, должен присутствовать на всех гибридизационных картинах. Он свидетельствует о том, что такие этапы подготовки пробы как выделение РНК, обратная транскрипция, мечение и сама гибридизация прошли нормально. Отсутствие гибридизационного сигнала с ячеек, расположенных в вертикальных рядах (столбцах), свидетельствует об отсутствии в клиническом образце химерных транскриптов, принадлежащих вышеперечисленным транслокациям. Наличие сигнала с ячеек, расположенных в столбцах, свидетельствует о присутствии в образце химерного транскрипта, обусловленного наличием одной из перечисленных транслокаций. По расположению набора ячеек на чипе можно определить тип транслокации, а также определить вариант химерного транскрипта и таким образом верифицировать последовательность в точке слияния двух генов, участвующих в данной транслокации. Описание алгоритма автоматического анализа изображения с помощью программы ImageWare™ выходит за рамки настоящего изобретения.10. Registration of the hybridization pattern is carried out using a portable biochip analyzer equipped with a CCD camera manufactured by Biochip-IMB LLC. In the visual analysis of the image, the interpretation of the results is as follows. A hybridization signal in three corner cells where control oligonucleotides (spike_imm) are immobilized should be present in all hybridization patterns. The presence of a signal from the cells indicates the location of the chip. A hybridization signal in cells where oligonucleotides related to the ABL gene are immobilized should be present in all hybridization patterns. It indicates that such stages of sample preparation as RNA isolation, reverse transcription, labeling, and hybridization itself were normal. The absence of a hybridization signal from cells located in vertical rows (columns) indicates the absence in the clinical sample of chimeric transcripts belonging to the above translocations. The presence of a signal from cells located in columns indicates the presence of a chimeric transcript in the sample due to the presence of one of the listed translocations. By the location of the set of cells on the chip, one can determine the type of translocation, as well as determine the variant of the chimeric transcript and thus verify the sequence at the fusion point of the two genes involved in this translocation. A description of an automatic image analysis algorithm using ImageWare ™ is beyond the scope of the present invention.

Пример 6. Определение в образце отсутствия вышеперечисленных транслокацийExample 6. Determination in the sample of the absence of the above translocations

РНК из культуры клеток HL-60 выделяют и получают флуоресцентно меченный амплифицированный продукт, как описано в пп.2-6 Примеров 1 и 2; полученный меченый ПЦР-продукт гибридизуют, как описано в п.9 Примера 4, на биочипе, изготовленном по п.8 Примера 3; анализ изображения проводят, как описано в п.10 Примера 5. На фиг.2 представлена картина гибридизации. Присутствуют гибридизационные сигналы только в контрольных ячейках биочипа. Это означает, что процедуры выделения РНК, обратной транскрипции и гибридизации, прошли нормально. Сигналы с ячеек, расположенных выше в вертикальных столбцах, отсутствуют. Делается заключение, что в образце отсутствуют клетки, содержащие вышеперечисленные транслокации.RNA from the HL-60 cell culture is isolated and a fluorescently labeled amplified product is obtained, as described in claims 2-6 of Examples 1 and 2; the resulting labeled PCR product is hybridized, as described in claim 9 of Example 4, on a biochip made according to claim 8 of Example 3; image analysis is carried out as described in clause 10 of Example 5. Figure 2 presents a picture of hybridization. Hybridization signals are present only in control cells of the biochip. This means that the RNA isolation, reverse transcription and hybridization procedures went well. There are no signals from cells located higher in the vertical columns. It is concluded that the sample contains no cells containing the above translocations.

Пример 7. Определение в клинических образцах костного мозга транслокации t(12; 21).Example 7. Determination of translocation t in clinical samples of bone marrow (12; 21).

Клинический образец (костный мозг больного острым лимфобластным лейкозом) получают, как описано в п.1 Примера 1, дальнейшую обработку проводят, как описано в пп.3-6 Примеров 1 и 2. Полученный меченый ПЦР-продукт гибридизуют, как описано в п.9 Примера 4, на биочипе, изготовленном по п.8 Примера 3; анализ изображения проводят, как описано в п.10 Примера 5. На фиг.3. представлена картина гибридизации. Наличие гибридизационных сигналов в крайних ячейках свидетельствует о том, что все этапы приготовления образца прошли нормально. Появление сигналов с ячеек, расположенных в парных столбцах, свидетельствует о наличии транслокации. Ориентируясь по схеме микрочипа, определяют, что это транслокация (12; 21). В гибридизации участвуют иммобилизованные олигонуклеотиды из антисмысловой цепи.A clinical sample (bone marrow of a patient with acute lymphoblastic leukemia) is obtained as described in paragraph 1 of Example 1, further processing is carried out as described in paragraphs 3-6 of Examples 1 and 2. The resulting labeled PCR product is hybridized as described in paragraph. 9 of Example 4, on a biochip made according to claim 8 of Example 3; image analysis is carried out as described in paragraph 10 of Example 5. In Fig.3. presents a picture of hybridization. The presence of hybridization signals in the extreme cells indicates that all stages of sample preparation were normal. The appearance of signals from cells located in paired columns indicates the presence of translocation. Based on the microchip scheme, they determine that this is translocation (12; 21). Hybridization involves immobilized antisense oligonucleotides.

Пример 8. Определение в клиническом образце костного мозга транслокации t(15; 17).Example 8. Determination of translocation t in a clinical bone marrow sample (15; 17).

Клинический образец (костный мозг больного острым промиелоцитарным лейкозом) получают, как описано в п.1 Примера 1, дальнейшую обработку проводят, как описано в пп.3-6 Примеров 1 и 2. Полученный меченый ПЦР-продукт гибридизуют, как описано в п.9 Примера 4, на биочипе, изготовленном по п.8 Примера 3; анализ изображения проводят, как описано в п.10 Примера 5. На Фиг.4. представлены картины гибридизации амплифицированного продукта, полученного из клинического образца костного мозга. Наличие гибридизационных сигналов в крайних ячейках свидетельствует о том, что все этапы приготовления образца прошли нормально. Появление сигналов с ячеек, расположенных в парных столбцах, свидетельствует о наличии транслокации. Ориентируясь по схеме микрочипа, определяют, что это транслокация (15; 17). Появление сигналов с определенных ячеек вдоль столбца позволяет определить, что данная транслокация в этом образце представлена bcr 1 вариантом слияния между участвующими в транслокации генами PML и RARα. Следует отметить, что и в данном случае в гибридизации участвуют иммобилизованные олигонуклеотиды из антисмысловой цепи.A clinical sample (bone marrow of a patient with acute promyelocytic leukemia) is obtained as described in paragraph 1 of Example 1, further processing is carried out as described in paragraphs 3-6 of Examples 1 and 2. The resulting labeled PCR product is hybridized as described in paragraph. 9 of Example 4, on a biochip made according to claim 8 of Example 3; image analysis is carried out as described in paragraph 10 of Example 5. In Fig.4. hybridization patterns of an amplified product obtained from a clinical bone marrow sample are presented. The presence of hybridization signals in the extreme cells indicates that all stages of sample preparation were normal. The appearance of signals from cells located in paired columns indicates the presence of translocation. Based on the microchip scheme, they determine that this is translocation (15; 17). The appearance of signals from certain cells along the column allows us to determine that this translocation in this sample is represented by the bcr 1 variant of fusion between the PML and RARα genes involved in the translocation. It should be noted that in this case as well, immobilized oligonucleotides from the antisense chain are involved in hybridization.

Claims

1. A set of primers for rapid analysis of the type of chimeric transcript, the sequence of which is defined in the List of sequences (SEQ ID NO: 9-33, 35, 37-47).

2. A set of oligonucleotides for rapid analysis of the type of chimeric transcript, the sequence of which is defined in the List of sequences (SEQ ID NO: 48-94).

3. A biochip for rapid analysis of the type of chimeric transcript, which is a substrate with a set of immobilized oligonucleotides on it, described in paragraph 2.

4. The method of rapid analysis of the type of chimeric transcript, comprising verifying the sequence at the fusion point of two genes involved in translocation, in a clinical sample obtained from a patient with leukemia, comprising the following stages:

(a) RNA isolation and reverse transcription reaction;

(b) a multiplex "nested" two-stage polymerase chain reaction (PCR) using the set of primers described in claim 1 for the amplification of chimeric transcripts, while the first stage uses primers of the first stage (SEQ ID NO: 9, 10, 14, 15, 18-20, 26, 26, 29, 30, 33, 35, 39-41, 45, 46), and the second primers of the second stage (SEQ ID NO: 11-13, 16, 17, 21-24 , 27, 28, 31, 32, 37, 38, 42-44, 45, 47) with simultaneous labeling of the chimeric PCR product in the second stage of PCR;

(c) providing a biochip, characterized in claim 3, containing a set of immobilized oligonucleotides, characterized in claim 2, for hybridization;

(d) hybridization of the amplified labeled product on a biochip with the formation of perfect and imperfect duplexes;

(e) recording and interpretation of hybridization results.

5. The method according to claim 4, in which bone marrow or blood is used as a clinical sample.

6. The method according to claim 4, in which at the stage (a) in the reverse transcription reaction, specific primers are used, the sequence of which is defined in the Sequence Listing (SEQ ID NO: 1-8).

7. The method according to claim 4, in which, in step (b), in the second PCR step, fluorescently labeled 5 ′ end-labeled primers are used for fluorescent labeling of a chimeric gene fragment.

8. The method according to claim 4, in which at the stage (b) in the second PCR stage, modified deoxynucleoside triphosphates are used for fluorescent labeling of the chimeric gene fragment.

9. The method according to claim 4, in which, in step (c), a photoinduced acrylamide gel copolymerization method is used to provide the biochip described in claim 3 containing the set of immobilized oligonucleotides described in claim 2.

10. The method according to claim 4, in which at the stage (d) use the conditions of hybridization, providing a high degree of differentiation between perfect and imperfect hybridization duplexes.

11. The method according to claim 4, in which the registration of the results of hybridization in stage (e) is carried out using a portable biochip analyzer equipped with a CCD camera.

12. The method according to claim 4, in which the registration of the results of hybridization in stage (e) is carried out using a fluorescence microscope equipped with a CCD camera.

13. The method according to claim 4, in which the registration of the results of hybridization at stage (e) is carried out using any device capable of recording and recording fluorescence signals.

14. The method according to claim 4, in which the interpretation of the results in stage (e) is carried out visually.

15. The method according to claim 4, in which the interpretation of the results in stage (e) is carried out using an automatic image analysis program.

16. The method according to claim 4, in which the interpreted results are used for the purpose of medical diagnosis, determining the prognosis and choosing a specific therapy, using as a marker the presence of a particular translocation.