RU2278379C1

RU2278379C1 - Method of preparation of high-efficient columns with polymer sorbents for liquid chromatography

Info

Publication number: RU2278379C1
Application number: RU2005102875/15A
Authority: RU
Inventors: Виктор Борисович Хабаров (RU); Виктор Борисович Хабаров; Александр Яковлевич Пронин (RU); Александр Яковлевич Пронин; Вадим Викторович Ермаков (RU); Вадим Викторович Ермаков; к Алексей Константинович Бур (RU); Алексей Константинович Буряк; Михаил Викторович Хабаров (RU); Михаил Викторович Хабаров
Original assignee: Виктор Борисович Хабаров; Александр Яковлевич Пронин
Priority date: 2005-02-07
Filing date: 2005-02-07
Publication date: 2006-06-20

Abstract

FIELD: liquid chromatography.

SUBSTANCE: to prepare high-efficient columns with polymer absorbents the suspension of absorbent is prepared in water solution of alkali having pH=11-14 with exposure time of 0,5-60 hours. Absorbent is packed in sealed in column in alkali water solution as well.

EFFECT: improved efficiency of exploitation.

3 cl, 5 dwg, 11 ex

Description

Изобретение относится к жидкостной хроматографии и может быть использовано для получения эффективных колонок для разделения биополимеров, для экспресс-контроля молекулярно-массового распределения (ММР) олигомеров этоксисилоксанов в гидролизованных и негидролизованных этилсиликатах, а также для других случаев хроматографических процессов.The invention relates to liquid chromatography and can be used to obtain effective columns for the separation of biopolymers, for express control of the molecular weight distribution (MMP) of ethoxysiloxane oligomers in hydrolyzed and non-hydrolyzed ethyl silicates, as well as for other cases of chromatographic processes.

Для приготовления современных высокоэффективных колонок широко используют полимерные сорбенты на основе полистирола (ПС) и полистирол-дивинилбензола (ПС-ДВБ) с высокой степенью сшивки, причем существующие технологии позволяют получать мелкие фракции моносферических зерен диаметром 3-10 мкм [1, 2].For the preparation of modern high-performance columns, polymeric sorbents based on polystyrene (PS) and polystyrene-divinylbenzene (PS-DVB) with a high degree of crosslinking are widely used, and existing technologies make it possible to obtain fine fractions of monospherical grains with a diameter of 3-10 μm [1, 2].

Полимерные сорбенты, используемые в высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), должны обладать определенными свойствами по параметрам величин: механической прочности, изменению объема в органических и водно-органических средах, диаметру пор, распределению пор по размеру, удельной поверхности и гидрофобности.Polymeric sorbents used in high performance liquid chromatography (HPLC) should have certain properties in terms of parameters: mechanical strength, volume change in organic and aqueous-organic media, pore diameter, pore size distribution, specific surface area and hydrophobicity.

В большинстве случаев, из вышеперечисленных характеристик, определяющих применимость полимерного сорбента в ВЭЖХ, основными являются его механическая прочность и степень набухания в органических и водно-органических средах.In most cases, of the above characteristics that determine the applicability of the polymer sorbent in HPLC, the main ones are its mechanical strength and the degree of swelling in organic and aqueous-organic media.

Синтезированные по патенту [2] моносферические гранулы полимерного сорбента на основе ПС-ДВБ, упакованные в хроматографическую колонку, изменяют объем при набухании в дихлорметане (хороший растворитель) на 9-20%, а в 50% растворе метанола в воде (плохой растворитель) на 0,03-0,15%.The monospheric granules of a PS-DVB-based polymer sorbent synthesized according to the patent [2], packed in a chromatographic column, change the volume during swelling in dichloromethane (a good solvent) by 9-20%, and in a 50% solution of methanol in water (a bad solvent) 0.03-0.15%.

Хроматографические колонки, упакованные моносферическими гранулами диаметром 3 мкм полимерного сорбента на основе ПС-ДВБ, имеют эффективность более 50000 теоретических тарелок/метр (т.т./м) [2]. Но в патенте [2] не указаны тип используемого растворителя для приготовления суспензии сорбента и условия методики приготовления колонок.Chromatographic columns packed with monospherical granules with a diameter of 3 μm of a polymer sorbent based on PS-DVB have an efficiency of more than 50,000 theoretical plates / meter (tp / m) [2]. But the patent [2] does not indicate the type of solvent used to prepare the sorbent suspension and the conditions of the column preparation procedure.

Следует отметить ряд свойств, которые принципиально отличают сорбенты на основе сверхсшитого полистирола (ССПС) от всех известных полимерных сорбентов. Сухой ССПС набухает в любых растворителях, независимо от их параметра растворимости [3, 4]. Начиная с 20% степени сшивки, полимеры этого типа проявляют способность набухать в метаноле, этаноле и гексане.It should be noted a number of properties that fundamentally distinguish sorbents based on hypercrosslinked polystyrene (SCPS) from all known polymer sorbents. Dry JCSS swells in any solvent, regardless of their solubility parameter [3, 4]. Starting at a 20% degree of crosslinking, polymers of this type exhibit the ability to swell in methanol, ethanol and hexane.

В настоящее время фирма Purolite, Великобритания, выпускает ряд ССПС сорбентов как гидрофобных, так и содержащих катионо- и анионообменные группы, под общим названием Macronet (MN). Их характеристики представлены в [5]. Эти сорбенты предназначены для извлечения органических соединений из вод в промышленных масштабах. Из зерен немодифицированного гидрофобного сорбента MN-200 можно получать мелкие частицы, пригодные для ВЭЖХ, имеющие диаметр макропор 850-950 Å и микропор 15 Å, работающие при рН 0-14.Currently, Purolite, Great Britain, produces a number of JCSS sorbents, both hydrophobic and containing cation and anion exchange groups, under the general name Macronet (MN). Their characteristics are presented in [5]. These sorbents are designed to extract organic compounds from water on an industrial scale. From the grains of the unmodified hydrophobic sorbent MN-200 it is possible to obtain small particles suitable for HPLC, having a macropore diameter of 850-950 Å and micropores of 15 Å, operating at a pH of 0-14.

Среди ССПС для ВЭЖХ, наиболее изучена химическая структура MN-200 [6], которая исследована в работе [7]. ССПС MN-200 по сравнению с сорбентом на основе ПС-ДВБ имеет меньшее набухание в тетрагидрофуране в 3,9 раза и ацетонитриле в 8,7-12 раз [6, стр.6].Among JCSS for HPLC, the chemical structure of MN-200 [6], which was studied in [7], is the most studied. Compared to PS-DVB based sorbent, MN-200 MPS 200 has a 3.9-fold lower swelling in tetrahydrofuran and 8.7-12-fold in acetonitrile [6, p. 6].

Одним из уникальных свойств немодифицированного ССПС является то, что, несмотря на высокую гидрофобность этого сорбента, его поверхность смачивается водой. Проведенные исследования показали, что поверхность ССПС MN-200 имеет заряд, причем и величина, и знак заряда определяются рН раствора, в котором находится сорбент [7]. В соответствии с зависимостью дзета-потенциала (ξ) от рН, при рН<4,3 немодифицированный ССПС MN-200 имеет положительный заряд, достигающий максимального значения при рН 2,5-2,7, а при рН>4,3 имеет отрицательный заряд, достигающий максимального значения при рН 8-9.One of the unique properties of unmodified JCSS is that, despite the high hydrophobicity of this sorbent, its surface is wetted by water. Studies have shown that the surface of the MNS-200 SSPS has a charge, both the magnitude and sign of the charge being determined by the pH of the solution in which the sorbent is located [7]. In accordance with the dependence of the zeta potential (ξ) on pH, at pH <4.3, the unmodified JCSS MN-200 has a positive charge, reaching a maximum value at pH 2.5-2.7, and at pH> 4.3 charge reaching a maximum value at pH 8-9.

По данным элементного анализа, наряду с углеродом и водородом MN-200 содержит небольшое количество хлора и около 6% кислорода. Таким образом, наличие положительного заряда на поверхности немодифицированного ССПС можно объяснить только присутствием атомов кислорода в структуре полимерной матрицы. Природа функциональных групп на поверхности MN-200 была исследована методами твердофазного ЯМР ¹³С, рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии и ИК-спектроскопии с Фурье-преобразованием [7, 8]. Установлено, что на поверхности ССПС находятся кетонные, эфирные (R-O-R) и функциональные спиртовые группы, точную концентрацию каждой из которых определить не удается.According to elemental analysis, along with carbon and hydrogen, the MN-200 contains a small amount of chlorine and about 6% oxygen. Thus, the presence of a positive charge on the surface of an unmodified SCSS can be explained only by the presence of oxygen atoms in the structure of the polymer matrix. The nature of the functional groups on the MN-200 surface was studied by ¹³ C solid-state NMR, X-ray photoelectron spectroscopy, and Fourier transform IR spectroscopy [7, 8]. It was found that ketone, ether (ROR) and functional alcohol groups are located on the surface of the HSSS, the exact concentration of each of which cannot be determined.

Потенциометрическое титрование MN-200 показало, что на его поверхности помимо карбонильных, присутствуют катионообменные группы трех типов: слабо и сильно кислые, а также фенольные [6, стр.87].Potentiometric titration of MN-200 showed that on its surface, in addition to carbonyl, there are three types of cation-exchange groups: weakly and strongly acidic, as well as phenolic ones [6, p. 87].

В работе [6, с.53] заполнение колонок ССПС MN-200 осуществляли в виде суспензии в ацетоне, но других условий методики заполнения колонок не приведено.In [6, p.53], the MNS-200 SSPS columns were filled in the form of a suspension in acetone, but other conditions for the column filling technique were not given.

В работе [9, с.89] заполнение колонок нейтральным ССПС марки Chromalite 5 HGN осуществляли в виде суспензии, но какие использовали растворители и условия методики заполнения колонок не приведено.In [9, p. 89], columns were filled with neutral JCSS of the Chromalite 5 HGN brand in the form of a suspension, but which solvents were used and the conditions for filling the columns were not given.

У сорбентов типа μ-стирогеля (сополимер стирола и дивинилбензола) с малым размером пор (100 Å и 500 Å) наблюдается усадка слоя сорбента в колонке как в полярных, так и в неполярных растворителях. Удобным, хотя и весьма дорогим выходом из положения является использование отдельных наборов колонок для каждого применяемого растворителя. Некоторые фирмы с этой целью выпускают колонки с одним и тем же размером пор, заполненные разными растворителями - тетрагидрофураном, толуолом, хлороформом и диметилформамидом [10].For sorbents of the μ-styrogel type (styrene-divinylbenzene copolymer) with a small pore size (100 Å and 500 Å), the sorbent layer shrinks in the column both in polar and non-polar solvents. A convenient, albeit very expensive way out is to use separate sets of columns for each solvent used. Some firms for this purpose produce columns with the same pore size, filled with different solvents - tetrahydrofuran, toluene, chloroform and dimethylformamide [10].

Колонки для ВЭЖХ с полимерными сорбентами на основе сополимера стирола и дивинилбензола с диаметром гранул 10 мкм и диаметром пор 500 Å, 1000 Å имеют следующую эффективность (тыс. т.т./м): μ-стирогель, заполнены в толуоле - 10; μ-сферогель, заполнены в толуоле - 18; ультрастирогель, заполнены в толуоле - 46; ультрастирогель, заполнены в тетрагидрофуране - 40; TSK - гель, заполнены в тетрагидрофуране - 20 [10].HPLC columns with polymer sorbents based on a styrene-divinylbenzene copolymer with a granule diameter of 10 μm and a pore diameter of 500 Å, 1000 Å have the following efficiencies (thousand tons / m): μ styrene gel, filled in toluene - 10; μ-spherogel, filled in toluene - 18; ultrastyrogel filled in toluene - 46; ultrastyrogel, filled in tetrahydrofuran - 40; TSK gel, filled in tetrahydrofuran - 20 [10].

Как видно, колонки для ВЭЖХ с полимерными сорбентами на основе сополимера стирола и дивинилбензола имеют различную эффективность, которая в большой степени зависит от методики заполнения колонок.As can be seen, HPLC columns with polymer sorbents based on a styrene-divinylbenzene copolymer have different efficiencies, which to a large extent depend on the column filling technique.

Учитывая, что сверхсшитые полимерные сорбенты на основе полистирола, полидивинилбензола и полистирола-дивинилбензола не набухают в воде, казалось бы, что вода - идеальный элюент для набивки колонок. Однако в водном элюенте эти сорбенты не образуют суспензии и в нем не разрушаются агломераты зерен сорбентов, что препятствует плотной упаковке сорбентов в колонках для ВЭЖХ.Considering that supercrosslinked polymer sorbents based on polystyrene, polydivinylbenzene and polystyrene-divinylbenzene do not swell in water, it would seem that water is an ideal eluent for packing columns. However, in the aqueous eluent, these sorbents do not form a suspension and agglomerates of sorbent grains are not destroyed in it, which prevents dense packing of the sorbents in HPLC columns.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому способу, выбранному в качестве ближайшего аналога, является способ приготовления колонок для ВЭЖХ суспензионным методом, включающий: взвешивание требуемого для колонки данного размера количества сорбента, заливку его растворителем и приготовление суспензии. Суспензию помещают в резервуар, соединенный с колонкой, на конце которой установлен фитинг с фильтром, и под давлением 20-60 МПа продавливают суспензию через колонку, подавая в резервуар насосом растворитель. Суспензию отфильтровывают на фильтре колонки, формируя упорядоченный слой сорбента, обеспечивающий эффективное разделение при ВЭЖХ. Останавливают поток растворителя, дают давлению упасть до нуля и снимают колонку. Удаляют избыток сорбента с конца колонки и присоединяют второй фитинг с фильтром. Полученную таким образом колонку устанавливают на хроматограф, прокачивают через нее до установления равновесия рабочий растворитель, после чего она готова к работе [10, стр.151].The closest in technical essence and the achieved result to the proposed method, selected as the closest analogue, is a suspension method for preparing HPLC columns, including: weighing the amount of sorbent required for a column of a given size, pouring it with a solvent and preparing a suspension. The suspension is placed in a tank connected to the column, at the end of which a fitting with a filter is installed, and under a pressure of 20-60 MPa, the suspension is forced through the column, feeding the solvent into the tank with a pump. The suspension is filtered on a column filter, forming an ordered sorbent layer, which ensures efficient separation by HPLC. Stop the flow of solvent, let the pressure drop to zero and remove the column. Remove excess sorbent from the end of the column and attach a second fitting with a filter. The column thus obtained is mounted on a chromatograph, the working solvent is pumped through it until equilibrium is established, after which it is ready for operation [10, p. 151].

Растворитель для приготовления суспензии сорбента часто является определяющим фактором для качества упаковки колонки, так как суспензия должна сохранять стабильность, начиная от переноса ее в резервуар и в течение всей упаковки, или необходимо замедлить седиментацию или исключить ее. Растворители с сорбентами могут давать истинные суспензии, осаждающиеся в соответствии с законом Стокса (в них частицы распределены в виде индивидуальных частиц), и "склеенные" суспензии, осаждающиеся много быстрее и содержащие комочки из нескольких частиц сорбента [10, стр.152-153].The solvent for the preparation of the sorbent suspension is often a determining factor for the quality of the column packaging, since the suspension must remain stable from transferring it to the tank and throughout the packaging, or sedimentation must be slowed down or eliminated. Solvents with sorbents can produce true suspensions that precipitate in accordance with the Stokes law (particles are distributed in the form of individual particles) and glued suspensions that precipitate much faster and contain lumps of several particles of sorbent [10, pp. 152-153] .

Истинные суспензии осаждаются в виде плотного, труднодиспергируемого осадка. "Склеенные" суспензии осаждаются в виде рыхлого и легкодиспергируемого осадка. Предпочтение следует отдавать растворителям, дающим с данным сорбентом истинную суспензию.True suspensions precipitate in the form of a dense, hard-to-disperse precipitate. “Glued” suspensions precipitate in the form of a loose and easily dispersible precipitate. Preference should be given to solvents that give a true suspension with this sorbent.

Мнения о концентрации суспензии, оптимальной для упаковки колонок расходятся: некоторые авторы получают наилучшие результаты с очень разбавленными суспензиями (1-5%), другие - с концентрацией (10-30%). Очевидно, для каждой системы растворитель-сорбент существует диапазон концентраций суспензии, дающий наилучшую упаковку слоя сорбента [10, стр.153].Opinions about the concentration of the suspension optimal for packing the columns differ: some authors get the best results with very diluted suspensions (1-5%), others with a concentration (10-30%). Obviously, for each solvent-sorbent system, there is a range of suspension concentrations giving the best packing of the sorbent layer [10, p. 153].

Однако данный способ приготовления высокоэффективных колонок со сверхсшитыми полимерными сорбентами на основе полистирола, полистирола-дивинилбензола и полидивинилбензола в виде суспензии в полярных кислородсодержащих органических растворителях (например, в ацетоне или спиртах) имеет следующие недостатки:However, this method of preparing highly efficient columns with hypercrosslinked polymer sorbents based on polystyrene, polystyrene-divinylbenzene and polydivinylbenzene in the form of a suspension in polar oxygen-containing organic solvents (for example, in acetone or alcohols) has the following disadvantages:

1. Не удается получить равномерную и плотную структуру слоя сорбента в колонке из-за наличия на поверхности ССПС положительного или отрицательного электрических зарядов. Наличие отрицательного заряда на поверхности ССПС связано с присутствием карбоксильных сильнокислотных, слабокислотных и функциональных фенольных групп, а наличие положительного - присутствием катионов металлов в структуре этого полимера, таких как хлориды железа, олова, титана, алюминия, которые используются в качестве катализаторов реакции Фриделя-Крафтса - реакции сшивания цепей линейного полистирола метиленовыми группами, и гидролизуются в водных растворах.1. It is not possible to obtain a uniform and dense structure of the sorbent layer in the column due to the presence of positive or negative electric charges on the surface of the SSPS. The presence of a negative charge on the surface of the SCSS is associated with the presence of carboxylic strongly acidic, weakly acidic, and functional phenolic groups, and the presence of a positive charge is due to the presence of metal cations in the structure of this polymer, such as iron, tin, titanium, and aluminum chlorides, which are used as catalysts for the Friedel-Crafts reaction - crosslinking reactions of linear polystyrene chains with methylene groups, and are hydrolyzed in aqueous solutions.

2. Не удается получить равномерную и плотную структуру слоя сорбента в колонке из-за наличия на поверхности ПС-ДВБ и полидивинилбензольных сорбентов положительного заряда. Наличие положительного заряда связано с присутствием катионов металлов в структуре этих полимеров, таких как хлориды железа, олова, титана, алюминия, цинка и т.п., которые используются в качестве катализаторов реакции Фриделя-Крафтса и гидролизуются в водных растворах.2. It is not possible to obtain a uniform and dense structure of the sorbent layer in the column due to the presence of a positive charge on the surface of PS-DVB and polydivinylbenzene sorbents. The presence of a positive charge is associated with the presence of metal cations in the structure of these polymers, such as chloride of iron, tin, titanium, aluminum, zinc, etc., which are used as catalysts for the Friedel-Crafts reaction and are hydrolyzed in aqueous solutions.

3. Наличие карбонильных, карбоксильных и др. групп на поверхности сверхсшитых полимерных сорбентов, а также содержание в структуре полимера катионов железа, олова, титана, алюминия, цинка приводит к сорбции органических веществ биомолекул плазмы крови, мономерной кремниевой кислоты и ее олигомеров при хроматографическом разделении.3. The presence of carbonyl, carboxyl, and other groups on the surface of hypercrosslinked polymer sorbents, as well as the content of iron, tin, titanium, aluminum, and zinc cations in the polymer structure, leads to the sorption of organic substances of blood plasma biomolecules, monomeric silicic acid, and its oligomers during chromatographic separation .

4. Наличие карбонильных и карбоксильных групп на поверхности сверхсшитого полимерного сорбента на основе полидивинилбензола приводит к набуханию сорбента в колонке в течение 30-35 суток в подвижной фазе - абсолютированном этаноле, что приводит к резкому повышению давления на входе в колонку.4. The presence of carbonyl and carboxyl groups on the surface of the cross-linked polymer sorbent based on polydivinylbenzene leads to swelling of the sorbent in the column for 30-35 days in the mobile phase - absolute ethanol, which leads to a sharp increase in pressure at the inlet to the column.

5. Из-за различной степени набухания сверхсшитых полимерных сорбентов в органических и водно-органических средах, в процессе разделения на колонках при использовании элюентов, содержащих 50-95% воды, образуются микропустоты в колонке, что приводит к снижению эффективности разделения.5. Due to the varying degree of swelling of hypercrosslinked polymeric sorbents in organic and aqueous-organic media, micro-hollows are formed in the column during column separation using eluents containing 50-95% water, which reduces the separation efficiency.

6. Изменение положительного заряда на поверхности сверхсшитых полимерных сорбентов в водной среде при рН выше 2,5 связано с постепенным гидролизом катионов железа, олова, титана, алюминия, цинка, в результате чего образуются микропустоты в колонке, что приводит к проседанию сорбента в колонке и, соотвественно, снижению эффективности разделения.6. The change in the positive charge on the surface of hypercrosslinked polymer sorbents in an aqueous medium at pH above 2.5 is associated with the gradual hydrolysis of cations of iron, tin, titanium, aluminum, zinc, resulting in microvoids in the column, which leads to sagging of the sorbent in the column and , respectively, reducing the separation efficiency.

Задача решаемая данным изобретением - устранение набухания сорбентов в процессе приготовления колонок, предотвращение потери эффективности колонок в процессе эксплуатации путем устранения катионов металлов, карбонильных и карбоксильных групп с поверхности сверхсшитых полимерных сорбентов на основе полистирола, полистирола-дивинилбензола и полидивинилбензола и разрушение агломератов моносферических зерен сорбента.The problem solved by this invention is to eliminate sorbent swelling during column preparation, to prevent loss of column efficiency during operation by removing metal cations, carbonyl and carboxyl groups from the surface of hypercrosslinked polymer sorbents based on polystyrene, polystyrene-divinylbenzene and polydivinylbenzene and the destruction of agglomerates of monospherical grains.

Решение поставленной задачи обеспечивается тем, что предлагаемый способ приготовления высокоэффективных колонок с полимерными сорбентами для жидкостной хроматографии включает приготовление суспензии моносферических зерен сверхсшитого полимерного сорбента на основе полистирола, полистирола-дивинилбензола и полидивинилбензола диаметром 5 и 10 мкм в водном растворе щелочи с рН 11-14, выдерживание ее при комнатной температуре в течение 0,5-60 часов для удаления с поверхности сорбента катионов металлов, карбонильных и карбоксильных групп; введение этой суспензии в колонку, упаковку сорбента в колонке и его уплотнение при максимальном давлении (250-300 атм.) последовательным пропусканием водного раствора щелочи с рН 11-14, в котором не происходит набухание сорбента при комнатной температуре.The solution to this problem is ensured by the fact that the proposed method for the preparation of high-performance columns with polymer sorbents for liquid chromatography involves the preparation of a suspension of monospherical grains of supercrosslinked polymer sorbent based on polystyrene, polystyrene-divinylbenzene and polydivinylbenzene with a diameter of 5 and 10 μm in an aqueous alkali solution with a pH of 11-14, keeping it at room temperature for 0.5-60 hours to remove metal cations, carbonyl and carboxyl groups from the surface of the sorbent; introducing this suspension into the column, packing the sorbent in the column and compacting it at maximum pressure (250-300 atm) by sequentially passing an aqueous alkali solution with a pH of 11-14, in which the sorbent does not swell at room temperature.

Приготовленные хроматографические колонки (150 мм × 3 мм), заполненные моносферическими зернами сверхсшитого полимерного сорбента на основе полистирола, полистирола-дивинилбензола и полидивинилбензола диаметром 5 и 10 мкм имеют эффективность 30000-40000 т.т./м по гексану (при скорости элюента - 96%-го этанола - 0,1 мл/мин).The prepared chromatographic columns (150 mm × 3 mm) filled with monospherical grains of a supercrosslinked polymer sorbent based on polystyrene, polystyrene-divinylbenzene and polydivinylbenzene with a diameter of 5 and 10 μm have an efficiency of 30000-40000 t./m hexane (at an eluent speed of 96 % ethanol - 0.1 ml / min).

Высокоэффективные эксклюзионно-хроматографические колонки характеризуются следующими параметрами: моносферические зерна сорбента имеют диаметр 10 мкм и менее [11, с.1, 113]; длина колонки при размере частиц сорбента 5-6 мкм составляет 10-15 см [11, с.200]; диаметр колонки 0,26-0,70 см [11, с.183]; противодавление колонки до 7000 psi (490 ат) [11, с.128, 141]; скорость потока элюента до 3 мл/мин [11, с.128]; объем проточной кюветы рефрактометра 5-10 мкл [11, с.151]; колонка с частицами сорбента 10 мкм дает эффективность 7000-10000 т.т. на 25 см длины.Highly performance exclusion chromatographic columns are characterized by the following parameters: monospherical grains of the sorbent have a diameter of 10 μm or less [11, p.1, 113]; the length of the column with a particle size of the sorbent 5-6 microns is 10-15 cm [11, p.200]; column diameter 0.26-0.70 cm [11, p.183]; column back pressure up to 7000 psi (490 at) [11, p.128, 141]; eluent flow rate up to 3 ml / min [11, p.128]; the volume of the flow cell of the refractometer is 5-10 μl [11, p.151]; a column with 10 μm sorbent particles gives an efficiency of 7000–10,000 t. 25 cm long.

Пример 1. 1,5 см³ моносферических зерен диаметром 10 мкм сверхсшитого полистирольного сорбента (ССПС) марки Chromalite 10HMN2 с диаметром пор 1000 Å, помещают в 10 см³ 96%-го этанола при комнатной температуре. Через 1 час суспензию ССПС переносят на стеклянный фильтр с диаметром пор менее 10 мкм и отфильтровывают этанол под вакуумом. ССПС переносят на сито с размером ячейки 20 мкм и протирают его через сито с дробным добавлением (по 0,5-1,0 см³) 15 см³ 96%-го этанола для разрушения агломератов моносферических зерен сорбента. Суспензию ССПС помещают в металлическое устройство для заполнения колонок объемом 15 см³, герметизируют его с помощью головки, к которой присоединяют в металлическом корпусе с помощью штуцера и фторопластовой прокладки стеклянную колонку длиной 150 мм, внутренним диаметром 3 мм (150 мм × 3 мм), на противоположном конце которой установлен металлический фильтр, фторопластовая прокладка и фитинг. Устройство для заполнения колонок с присоединенной колонкой переворачивают, и заполнение колонки ССПС осуществляют в положении снизу-вверх. При плавном повышении давления до 30 МПа продавливают суспензию ССПС через колонку, подавая в устройство для заполнения колонок насосом растворитель. Суспензию ССПС отфильтровывают на фильтре колонки, формируя упорядочный слой сорбента. При прокачивании через колонку 15 см³ этанола, останавливают поток растворителя, давление снижают до нуля и отсоединяют колонку. Удаляют избыток сорбента с конца колонки с помощью скальпеля, устанавливают металлический фильтр, фторопластовую прокладку и присоединяют второй фитинг. Заполненную ССПС колонку устанавливают на жидкостной хроматограф, прокачивают через нее до установления равновесия рабочий растворитель, после чего она готова к работе. Приготовленная такими действиями по известному способу [10] колонка имеет эффективность по гексану 4000 т.т./м (при скорости элюента - 96%-го этанола - 0,1 мл/мин). В дальнейшей работе при использовании элюента - воды с рН 1-13 происходит проседание слоя ССПС в колонке и, соответственно, снижение эффективности колонки. Это связано с тем, что агломераты моносферических зерен ССПС полностью не разрушаются при протирании его через сито и при использовании элюента - воды с рН 1-13 происходит изменение заряда моносферических зерен ССПС и гидролиз хлоридов металлов (железа, олова, титана, алюминия, цинка и др.).Example 1. 1.5 cm ³ monospherical grains with a diameter of 10 μm supercrosslinked polystyrene sorbent (HSS) brand Chromalite 10HMN2 with a pore diameter of 1000 Å, placed in 10 cm ^{3 of} 96% ethanol at room temperature. After 1 hour, the HSSS suspension was transferred to a glass filter with a pore diameter of less than 10 μm and ethanol was filtered off under vacuum. The JCSS is transferred to a sieve with a mesh size of 20 μm and rubbed through a sieve with fractional addition (0.5-1.0 cm ³ ) of 15 cm ^{3 of} 96% ethanol to destroy agglomerates of monospherical sorbent grains. The SSPS suspension is placed in a metal device for filling columns with a volume of 15 cm ³ , it is sealed with a head, to which a glass column with a length of 150 mm, an inner diameter of 3 mm (150 mm × 3 mm) is connected in a metal case with a fitting and a fluoroplastic gasket, at the opposite end of which there is a metal filter, fluoroplastic gasket and fitting. The device for filling the columns with the attached column is turned over, and the filling of the JCSS column is carried out in a bottom-up position. With a smooth increase in pressure to 30 MPa, the JCSS suspension is forced through the column, feeding the solvent to the device for filling the columns with a pump. The JCSS suspension is filtered off on a column filter, forming an orderly layer of sorbent. When pumping 15 cm ^{3 of} ethanol through the column, the solvent flow is stopped, the pressure is reduced to zero and the column is disconnected. Remove the excess sorbent from the end of the column with a scalpel, install a metal filter, a fluoroplastic gasket and attach a second fitting. A filled JCSS column is mounted on a liquid chromatograph, the working solvent is pumped through it until equilibrium is established, after which it is ready for operation. The column prepared by such actions according to the known method [10] has a hexane efficiency of 4000 tp / m (at an eluent speed of 96% ethanol - 0.1 ml / min). In further work, when using the eluent — water with a pH of 1–13, the JCSS layer sags in the column and, accordingly, the column efficiency decreases. This is due to the fact that agglomerates of monospherical SSPS grains do not completely collapse when rubbed through a sieve and when using an eluent — water with a pH of 1–13, the charge of monospherical SSPS grains and the hydrolysis of metal chlorides (iron, tin, titanium, aluminum, zinc and other).

При хроматографическом разделении на колонке с ССПС олигомеров этоксисилоксанов и кремниевой кислоты, имеющихся в гидролизате тетраэтоксисилана, (элюент - абсолютный этанол - 0,1 мл/мин), отмечается сорбция кремниевой кислоты на сорбенте.Chromatographic separation on an SCSS column of ethoxysiloxane and silicic acid oligomers present in the tetraethoxysilane hydrolyzate (eluent — absolute ethanol — 0.1 ml / min) showed sorption of silicic acid on a sorbent.

Использование органического растворителя - этанола для приготовления суспензии моносферических зерен сорбента ССПС при заполнении колонки при высоком давлении (30 МПа) по известному способу [10] не обеспечивает получение колонки с высокой эффективностью для ВЭЖХ.The use of an organic solvent, ethanol, for preparing a suspension of monospherical grains of the SCPS sorbent when filling the column at high pressure (30 MPa) using the known method [10] does not provide a column with high efficiency for HPLC.

Пример 2. Стеклянную колонку (150 мм × 3 мм) с моносферическими зернами ССПС диаметром 10 мкм марки Chromalite 10HMN2 с диаметром пор 1000 Å приготавливают аналогично примеру 1, с той разницей, что для приготовления суспензии моносферических зерен ССПС используют толуол, как в известном способе [10]. Приготовленная колонка имеет эффективность по гексану 1500 т.т./м (при скорости элюента - 96%-го этанола - 0,1 мл/мин). В дальнейшей работе при использовании элюента - воды с рН 1-13 происходит проседание слоя ССПС в колонке.Example 2. A glass column (150 mm × 3 mm) with monospherical grains of the SSPS with a diameter of 10 μm of Chromalite 10HMN2 brand with a pore diameter of 1000 Å is prepared analogously to Example 1, with the difference that toluene is used to prepare a suspension of monospherical grains of the SSPS, as in the known method [10]. The prepared column has a hexane efficiency of 1500 tp / m (at an eluent speed of 96% ethanol - 0.1 ml / min). In further work, when using the eluent — water with a pH of 1–13, the JCSS layer sags in the column.

Использование органического растворителя как в известном способе [10] - толуола для приготовления суспензии моносферических зерен сорбента ССПС при заполнени колонки при высоком давлении (30 МПа) по известному способу [10] не обеспечивает получение колонки с высокой эффективностью для ВЭЖХ.The use of an organic solvent as in the known method [10] - toluene for preparing a suspension of monospherical grains of the SPSS sorbent when filling the column at high pressure (30 MPa) by the known method [10] does not provide a column with high efficiency for HPLC.

Пример 3. Стеклянную колонку (150 мм × 3 мм) приготавливают аналогично примеру 1 по известному способу [10], с той разницей, что для приготовления колонки используют моносферические зерна диаметром 10 мкм высокосшитого полидивинилбензольного сорбента с диаметром пор 500 Å, которые выдерживают давление до 30 МПа. Заполнение колонки суспензией сорбента осуществляют при давлении 25 МПа.Example 3. A glass column (150 mm × 3 mm) is prepared analogously to example 1 by a known method [10], with the difference that monospherical grains with a diameter of 10 μm of a highly crosslinked polydivinylbenzene sorbent with a pore diameter of 500 Å, which withstand pressures up to 30 MPa. The column is filled with a sorbent suspension at a pressure of 25 MPa.

Приготовленная колонка имеет эффективность по гексану 3500 т.т./м (при скорости элюента - 96%-го этанола - 0,1 мл/мин). В дальнейшей работе при использовании элюента - воды с рН 1-13 происходит проседание слоя сорбента в колонке. Это связано с тем, что агломераты моносферических зерен полидивинилбензольного сорбента полностью не разрушаются при протирании сорбента через сито и при использовании элюента - воды с рН 1-13 происходит изменение заряда моносферических зерен сорбента.The prepared column has a hexane efficiency of 3500 tp / m (at an eluent speed of 96% ethanol - 0.1 ml / min). In further work, when using the eluent - water with a pH of 1-13, the sorbent layer sags in the column. This is due to the fact that the agglomerates of monospherical grains of a polydivinylbenzene sorbent do not completely collapse when rubbing the sorbent through a sieve and when using eluent - water with a pH of 1-13, the charge of monospherical grains of the sorbent changes.

Использование органического растворителя, как в известном способе [10] - этанола для приготовления суспензии моносферических зерен высокосшитого полидивинилбензольного сорбента при заполнении колонки при высоком давлении (25 МПа) не обеспечивает получение колонки с высокой эффективностью для ВЭЖХ.The use of an organic solvent, as in the known method [10], of ethanol for preparing a suspension of monospherical grains of a highly cross-linked polydivinylbenzene sorbent when filling the column at high pressure (25 MPa) does not provide a column with high efficiency for HPLC.

Пример 4. Стеклянную колонку (150 мм × 3 мм) с моносферическими зернами полимерного сорбента на основе полистирола-дивинилбензола (ПС-ДВБ) диаметром 10 мкм и диаметром пор 500 Å приготавливают аналогично примеру 1, с той разницей, что для приготовления суспензии моносферических зерен ПС-ДВБ сорбента используют тетрагидрофуран, как в известном способе [10]. Приготовленная колонка имеет эффективность по гексану 4500 т.т./м (при скорости элюента - 96%-го этанола - 0,1 мл/мин). В дальнейшей работе при использовании элюента - воды с рН 1-13 происходит проседание слоя ПС-ДВБ сорбента в колонке.Example 4. A glass column (150 mm × 3 mm) with monospherical grains of a polymer sorbent based on polystyrene-divinylbenzene (PS-DVB) with a diameter of 10 μm and a pore diameter of 500 Å is prepared analogously to example 1, with the difference that for the preparation of a suspension of monospherical grains PS-DVB sorbent use tetrahydrofuran, as in the known method [10]. The prepared column has a hexane efficiency of 4500 tp / m (at an eluent speed of 96% ethanol - 0.1 ml / min). In further work, when using the eluent — water with a pH of 1–13, the PS-DVB sorbent layer sags in the column.

Использование органического растворителя - тетрагидрофурана для приготовления суспензии моносферических зерен ПС-ДВБ сорбента при заполнени колонки при высоком давлении (30 МПа) по известному способу [10] не обеспечивает получение колонки с высокой эффективностью для ВЭЖХ.The use of an organic solvent, tetrahydrofuran, for preparing a suspension of PS-DVB sorbent monospherical grains when filling the column at high pressure (30 MPa) by the known method [10] does not provide a column with high efficiency for HPLC.

Пример 5. Готовят суспензию - 1,5 см³ моносферических зерен ССПС диаметром 10 мкм марки Chromalite 10HMN2 с диаметром пор 1000 Å, в соответствии с предложенным изобретением, помещают в 10 см³ водного раствора щелочи (NaOH) с рН 13, и оставляют при комнатной температуре на 12 часов. Затем суспензию ССПС помещают в металлическое устройство для заполнения колонок объемом 15 см³, герметизируют его с помощью головки. К головке присоединяют в металлическом корпусе с помощью штуцера и фторопластовой прокладки стеклянную колонку (150 мм × 3 мм), на конце которой установлен металлический фильтр, фторопластовая прокладка и фитинг. Устройство для заполнения колонок с присоединенной колонкой переворачивают, и заполнение колонки суспензией ССПС осуществляют в положении снизу-вверх. При плавном повышении давления до 30 МПа продавливают суспензию ССПС через колонку, подавая в устройство для заполнения колонок насосом водный раствор щелочи с рН 13. Суспензию ССПС отфильтровывают на фильтре колонки, формируя упорядочный слой сорбента. После прокачивания через колонку 15 см³ водного раствора щелочи, останавливают поток растворителя, давление снижают до нуля и отсоединяют колонку. Удаляют избыток сорбента с конца колонки с помощью скальпеля, устанавливают металлический фильтр, фторопластовую прокладку и присоединяют второй фитинг. Заполненную ССПС колонку устанавливают на жидкостной хроматограф, прокачивают через нее дистилированную воду для удаления щелочи, а затем 96%-ный этанол до установления равновесия, после чего она готова к работе. Приготовленная колонка имеет эффективность по гексану 30000 т.т./м (при скорости элюента - 96%-го этанола - 0,1 мл/мин).Example 5. Prepare a suspension of 1.5 cm ³ monospherical SSPS grains with a diameter of 10 μm brand Chromalite 10HMN2 with a pore diameter of 1000 Å, in accordance with the invention, is placed in 10 cm ^{3 of an} aqueous solution of alkali (NaOH) with a pH of 13, and left at room temperature for 12 hours. Then the JCSS suspension is placed in a metal device to fill the columns with a volume of 15 cm ³ , seal it with a head. A glass column (150 mm × 3 mm) is attached to the head in a metal casing with a fitting and a fluoroplastic gasket, at the end of which a metal filter, a fluoroplastic gasket and fitting are installed. The device for filling columns with an attached column is turned upside down, and the column is filled with a JCSS suspension in a bottom-up position. With a gradual increase in pressure to 30 MPa, the JCSS suspension is forced through the column, and an aqueous alkali solution with a pH of 13 is pumped into the column filling device with a pump. After pumping 15 cm ^{3 of} an alkaline aqueous solution through the column, the solvent flow is stopped, the pressure is reduced to zero and the column is disconnected. Remove the excess sorbent from the end of the column with a scalpel, install a metal filter, a fluoroplastic gasket and attach a second fitting. A filled JCSS column is mounted on a liquid chromatograph, distilled water is pumped through it to remove alkali, and then 96% ethanol until equilibrium is established, after which it is ready for operation. The prepared column has a hexane efficiency of 30,000 tp / m (at an eluent speed of 96% ethanol - 0.1 ml / min).

При использовании элюента - воды с рН 1-13 не происходит проседание слоя ССПС марки Chromalite 10HMN2 в колонке. Это связано с тем, что агломераты моносферических зерен ССПС при заполнении колонки разрушаются в водном растворе щелочи, так как удаляются карбонильные и карбоксильные группы с поверхности сорбента и хлориды металлов.When using the eluent - water with a pH of 1-13, subsidence of the Chromalite 10HMN2 grade SSPS layer does not occur in the column. This is due to the fact that the agglomerates of the monospherical SSPS grains during column filling are destroyed in an aqueous alkali solution, since carbonyl and carboxyl groups are removed from the surface of the sorbent and metal chlorides.

На фиг.1 представлена хроматограмма олигомеров этоксисилоксанов в гидролизате тетраэтоксисилана, полученная на колонке (300 мм × 3 мм) (соединенные две стеклянные колонки 150 мм × 3 мм) с ССПС марки Chromalite 10HMN2. Олигомеры этоксисилоксанов: 1 - олигоэтоксисилоксан (Si₁₃), 2-4 - олигоэтоксисилоксаны (Si₂-Si₆) и мономеры: 5 - тетраэтоксисилан, 6 - кремниевая кислота. Детектор - дифференциальный рефрактометр RIDK-102 юстирован по циклогексану, чувствительность 16×10^-7 ед. рефракции; скорость сухого элюента - 0,2 мл/мин толуола, содержащего 1% изопропанола; температура термостата колонки, инжектора и детектора - 25°С; объем дозирующей петли - 10 мкл; проба 10 мкл 0,1% гидролизата тетраэтоксисилана в сухом толуоле, содержащего 1% изопропанола.Figure 1 shows the chromatogram of ethoxysiloxane oligomers in a tetraethoxysilane hydrolyzate obtained on a column (300 mm × 3 mm) (two glass columns connected together 150 mm × 3 mm) with a Chromalite 10HMN2 JCSS. Oligomers of ethoxysiloxanes: 1 - oligoethoxysiloxane (Si ₁₃ ), 2-4 - oligoethoxysiloxanes (Si ₂ -Si ₆ ) and monomers: 5 - tetraethoxysilane, 6 - silicic acid. Detector - RIDK-102 differential refractometer adjusted according to cyclohexane, sensitivity 16 × 10 ^-7 units. refraction the speed of the dry eluent is 0.2 ml / min of toluene containing 1% isopropanol; temperature of the column thermostat, injector and detector - 25 ° С; the volume of the dosing loop is 10 μl; a sample of 10 μl of 0.1% tetraethoxysilane hydrolyzate in dry toluene containing 1% isopropanol.

При хроматографическом разделении на колонке с ССПС марки Chromalite 10HMN2 не отмечается сорбции кремниевой кислоты, содержащейся в гидролизате тетраэтоксисилана.Chromatographic separation on a column with a Chromalite 10HMN2 JCSS column did not show sorption of silicic acid contained in the tetraethoxysilane hydrolyzate.

Пример 6. Стеклянную колонку (150 мм × 3 мм) с моносферическими зернами ССПС диаметром 10 мкм марки Chromalite 10HMN2 с диаметром пор 1000 Å приготавливают по предлагаемому изобретению аналогично примеру 5, с той разницей, что для приготовления суспензии моносферических зерен сорбента используют водный раствор щелочи (NaOH) с рН 14, а время обработки сорбента в щелочи составляет 30 минут. Приготовленная колонка имеет эффективность по гексану 30000 т.т./м (при скорости элюента - 96%-го этанола - 0,1 мл/мин).Example 6. A glass column (150 mm × 3 mm) with monospherical SCPS grains with a diameter of 10 μm of Chromalite 10HMN2 brand with a pore diameter of 1000 Å is prepared according to the invention in analogy to Example 5, with the difference that an aqueous alkali solution is used to prepare a suspension of monospherical sorbent grains (NaOH) with a pH of 14, and the processing time of the sorbent in alkali is 30 minutes. The prepared column has a hexane efficiency of 30,000 tp / m (at an eluent speed of 96% ethanol - 0.1 ml / min).

При использовании элюента - воды с рН 1-14 не происходит проседание слоя ССПС марки Chromalite 10HMN2 в колонке. Это связано с тем, что агломераты моносферических зерен ССПС при заполнении колонки разрушаются в водном растворе щелочи, так как удаляются карбонильные и карбоксильные группы с поверхности сорбента, и хлориды металлов в результате гидролиза.When using the eluent - water with a pH of 1-14, subsidence of the Chromalite 10HMN2 SSPS layer does not occur in the column. This is due to the fact that the agglomerates of the monospherical SSPS grains during column filling are destroyed in an aqueous alkali solution, since carbonyl and carboxyl groups are removed from the surface of the sorbent and metal chlorides as a result of hydrolysis.

Пример 7. Стеклянную колонку (150 мм × 3 мм) с моносферическими зернами ССПС диаметром 10 мкм марки Chromalite 10HMN2 с диаметром пор 1000 Å приготавливают аналогично примеру 5, с той разницей, что для приготовления суспензии моносферических зерен сорбента используют водный раствор щелочи (NaOH) с рН 11, а время обработки сорбента в щелочи составляет 60 часов. Приготовленная колонка имеет эффективность по гексану 30000 т.т./м (при скорости элюента - 96%-го этанола - 0,1 мл/мин).Example 7. A glass column (150 mm × 3 mm) with monospherical JCSS grains with a diameter of 10 μm of Chromalite 10HMN2 brand with a pore diameter of 1000 Å is prepared analogously to example 5, with the difference that an aqueous alkali solution (NaOH) is used to prepare a suspension of monospherical sorbent grains. with a pH of 11, and the processing time of the sorbent in alkali is 60 hours. The prepared column has a hexane efficiency of 30,000 tp / m (at an eluent speed of 96% ethanol - 0.1 ml / min).

При использовании элюента - воды с рН 1-13 не происходит проседание слоя ССПС марки Chromalite 10HMN2 в колонке. Это связано с тем, что агломераты моносферических зерен ССПС при заполнении колонки разрушаются в водном растворе щелочи, так как удаляются карбонильные и карбоксильные группы с поверхности сорбента, и хлориды металлов в результате гидролиза.When using the eluent - water with a pH of 1-13, subsidence of the Chromalite 10HMN2 grade SSPS layer does not occur in the column. This is due to the fact that the agglomerates of the monospherical SSPS grains, when filling the columns, are destroyed in an aqueous alkali solution, since carbonyl and carboxyl groups are removed from the surface of the sorbent and metal chlorides as a result of hydrolysis.

Пример 8. Стеклянную колонку (150 мм × 3 мм) приготавливают по предлагаемому изобретению аналогично примеру 5, с той разницей, что для приготовления колонки используют моносферические зерна диаметром 10 мкм высокосшитого полидивинилбензольного сорбента с диаметром пор 500 Å и заполнение колонки суспензией сорбента осуществляют при давлении 25 МПа. Приготовленная колонка имеет эффективность по гексану 30000 т.т./м (при скорости элюента - 96%-го этанола - 0,1 мл/мин).Example 8. A glass column (150 mm × 3 mm) is prepared according to the invention as in Example 5, with the difference that monospherical grains with a diameter of 10 μm of a highly crosslinked polydivinylbenzene sorbent with a pore diameter of 500 Å are used to prepare the column and the column is filled with a suspension of the sorbent at a pressure 25 MPa. The prepared column has a hexane efficiency of 30,000 tp / m (at an eluent speed of 96% ethanol - 0.1 ml / min).

При использовании элюента - воды с рН 1-13 не происходит проседание слоя полидивинилбензольного сорбента в колонке. Это связано с тем, что агломераты моносферических зерен сорбента при заполнении колонки разрушаются в водном растворе щелочи, так как удаляются карбонильные и карбоксильные группы с поверхности сорбента.When using the eluent - water with a pH of 1-13, there is no subsidence of the polydivinylbenzene sorbent layer in the column. This is due to the fact that the agglomerates of monospherical grains of the sorbent are destroyed in the aqueous alkali solution when the columns are filled, since carbonyl and carboxyl groups are removed from the surface of the sorbent.

На фиг.2-3 представлены хроматограммы, полученные на колонке с полидивинилбензольным сорбентом диаметром 10 мкм. Сигналы детектора через интерфейс записывают в компьютер с помощью программы "Экохром".Figure 2-3 presents chromatograms obtained on a column with a polydivinylbenzene sorbent with a diameter of 10 μm. The detector signals through the interface are recorded in a computer using the Ecochrome program.

На фиг.2 представлена хроматограмма определения флуоресцирующих комплексов глутатиона и металлотионеина с N-(9-акридин)-малеимидом (NAM) в ацетонитрильном экстракте плазмы крови (10 мкл) крупного рогатого скота (коровы) из Тырнауза. 1, 2, 3, 6, 7, 8 - металлотионеины с NAM с временами удерживания 2,14, 2,31, 2,56, 5,22, 6,06, 8,02 мин; 4, 5 - металлотионеины + глутатион с NAM временами удерживания 3,32, 4,14 мин.Figure 2 presents a chromatogram for the determination of fluorescent complexes of glutathione and metallothionein with N- (9-acridine) maleimide (NAM) in an acetonitrile plasma extract (10 μl) of cattle (cow) from Tyrnauz. 1, 2, 3, 6, 7, 8 — metallothioneins with NAM with retention times of 2.14, 2.31, 2.56, 5.22, 6.06, 8.02 min; 4, 5 - metallothioneins + glutathione with NAM retention times of 3.32, 4.14 minutes.

При определении металлотионеина в плазме крови животных использовали методику [12] со следующими внесенными изменениями:When determining metallothionein in the blood plasma of animals, the methodology [12] was used with the following changes:

- из плазмы крови металлотионеин экстрагировали ацетонитрилом, при этом высокомолекулярные белки высаждались;- metallothionein was extracted from blood plasma with acetonitrile, while high molecular weight proteins were precipitated;

- после центрифугирования ацетонитрильный экстракт из плазмы крови подвергали дереватизации и проведению реакции с NAM по методике [12];- after centrifugation, the acetonitrile extract from the blood plasma was subjected to stadization and reaction with NAM according to the procedure [12];

Детектор - флуоресцентный RF-530 (Шимадзу), возбуждение при 360 нм, флуоресценция при 435 нм; скорость элюента - 0,4 мл/мин 0,05 М фосфатного буфера с рН 6,5, содержащего 35% этанола; проба 10 мкл дериватизата из ацетонитрильного экстракта плазмы крови в 0,05 М фосфатном буфере с рН 6,5.Detector - fluorescent RF-530 (Shimadzu), excitation at 360 nm, fluorescence at 435 nm; the speed of the eluent is 0.4 ml / min of 0.05 M phosphate buffer with a pH of 6.5, containing 35% ethanol; a sample of 10 μl of derivatizate from acetonitrile blood plasma extract in 0.05 M phosphate buffer with a pH of 6.5.

Хроматографирование ацетонитрильных экстрактов металлотионеина из плазмы крови животных позволяет заметно повысить чувствительность анализа за счет увеличения объема исследуемой плазмы и сократить время анализа до 25 мин за счет уменьшения коэкстрактивных веществ, реагируемых с NAM.Chromatography of acetonitrile extracts of metallothionein from animal blood plasma can significantly increase the sensitivity of the analysis by increasing the volume of the studied plasma and reduce the analysis time to 25 min by reducing coextracting substances that react with NAM.

На фиг.3 представлена хроматограмма определения стандарта металлотионеина (100 нг) в виде флуоресцирующих комплексов с NAM по методике [12]. 1-9 - металлотионеины с NAM с временами удерживания 2,12, 2,31, 3,40, 4,33, 6,08, 6,47, 11,45, 14,45 и 15,58 мин.Figure 3 presents the chromatogram for determining the standard metallothionein (100 ng) in the form of fluorescent complexes with NAM according to the method [12]. 1-9 - metallothioneins with NAM with retention times of 2.12, 2.31, 3.40, 4.33, 6.08, 6.47, 11.45, 14.45 and 15.58 min.

Детектор - флуоресцентный RF-530 (Шимадзу), возбуждение при 360 нм, флуоресценция при 435 нм; скорость элюента - 0,4 мл/мин 0,05 М фосфатного буфера с рН 6,5, содержащего 35% этанола.Detector - fluorescent RF-530 (Shimadzu), excitation at 360 nm, fluorescence at 435 nm; the speed of the eluent is 0.4 ml / min of 0.05 M phosphate buffer with a pH of 6.5, containing 35% ethanol.

Пример 9. Стеклянную колонку (150 мм × 3 мм) приготавливают по предлагаемому изобретению аналогично примеру 5, с той разницей, что для приготовления колонки используют моносферические зерна диаметром 5 мкм высокосшитого полидивинилбензола с диаметром пор 500 Å и заполнение колонки суспензией сорбента осуществляют при давлении 25 МПа. Приготовленная колонка имеет эффективность по гексану 40000 т.т./м (при скорости элюента - 96%-го этанола - 0,1 мл/мин).Example 9. A glass column (150 mm × 3 mm) is prepared according to the invention as in Example 5, with the difference that monospherical grains with a diameter of 5 μm highly crosslinked polydivinylbenzene with a pore diameter of 500 Å are used to prepare the column and the column is filled with a sorbent suspension at a pressure of 25 MPa The prepared column has a hexane efficiency of 40,000 tons / m (at an eluent speed of 96% ethanol, 0.1 ml / min).

При использовании элюента - воды с рН 1-13 не происходит проседание слоя полидивинилбензольного сорбента в колонке в связи с тем, что агломераты моносферических зерен сорбента при заполнении колонки разрушаются в водном растворе щелочи, так как удаляются карбонильные и карбоксильные группы с поверхности сорбента.When using the eluent - water with a pH of 1-13, the polydivinylbenzene sorbent layer does not sag in the column due to the fact that the agglomerates of monospherical grains of the sorbent are destroyed in the aqueous alkali solution when the column is filled, since carbonyl and carboxyl groups are removed from the surface of the sorbent.

На фиг.4 представлена хроматограмма, полученная на колонке с полидивинилбензольным сорбентом диаметром 5 мкм, олигомеров этоксисилоксанов в гидролизате тетраэтоксисилана. Олигомеры этоксисилоксанов: 1 - олигоэтоксисилоксан (Si₁₃), 2-4 - олигоэтоксисилоксаны (Si₂-Si₆) и мономеры: 5 - тетраэтоксисилан и 6 - кремниевая кислота (Si(OH)₄). Детектор - дифференциальный рефрактометр RIDK-102 юстирован по абсолютному этанолу, чувствительность 8×10^-7ед. рефракции; скорость элюента - абсолютного этанола - 0,18 мл/мин; температура термостата колонки, инжектора и детектора - 25°С; объем дозирующей петли - 10 мкл; проба 10 мкл 0,4% гидролизата тетраэтоксисилана в абсолютном этаноле.Figure 4 presents the chromatogram obtained on a column with a polydivinylbenzene sorbent with a diameter of 5 μm, ethoxysiloxane oligomers in the tetraethoxysilane hydrolyzate. Oligomers of ethoxysiloxanes: 1 - oligoethoxysiloxane (Si ₁₃ ), 2-4 - oligoethoxysiloxanes (Si ₂ -Si ₆ ) and monomers: 5 - tetraethoxysilane and 6 - silicic acid (Si (OH) ₄ ). Detector - RIDK-102 differential refractometer aligned with absolute ethanol, sensitivity 8 × 10 ^-7 units. refraction the rate of eluent - absolute ethanol - 0.18 ml / min; temperature of the column thermostat, injector and detector - 25 ° С; the volume of the dosing loop is 10 μl; a sample of 10 μl of 0.4% tetraethoxysilane hydrolyzate in absolute ethanol.

При хроматографическом разделении на колонке с полидивинилбензольным сорбентом не отмечается сорбции кремниевой кислоты на сорбенте, содержащейся в гидролизате тетраэтоксисилана.During chromatographic separation on a column with a polydivinylbenzene sorbent, sorption of silicic acid on the sorbent contained in the tetraethoxysilane hydrolyzate is not observed.

На фиг.5 представлена хроматограмма, полученная на колонке с полидивинилбензольным сорбентом диаметром 5 мкм, гидратированных форм сульфата натрия - 1-8 с временами удерживания 3,16, 3,32, 4,08, 4,26, 5,09, 6,33, 7,43, 8,46 мин. Детектор - УФ - 230 нм (спектрофотометр фирмы Хитачи 320 с кюветой объемом 7 мкл); скорость элюента - 0,2 мл/мин 80% ацетонитрила в воде; проба 10 мкл насыщенного водного раствора сульфата натрия.Figure 5 presents the chromatogram obtained on a column with a polydivinylbenzene sorbent with a diameter of 5 μm, hydrated forms of sodium sulfate - 1-8 with retention times of 3.16, 3.32, 4.08, 4.26, 5.09, 6, 33, 7.43, 8.46 min. Detector - UV - 230 nm (Hitachi 320 spectrophotometer with a 7 μl cuvette); the speed of the eluent is 0.2 ml / min 80% acetonitrile in water; sample 10 μl of a saturated aqueous solution of sodium sulfate.

Пример 10. Стеклянную колонку (150 мм × 3 мм) с моносферическими зернами высокосшитого полидивинилбензольного сорбента диаметром 5 мкм с диаметром пор 500 Å приготавливают по предлагаемому изобретению аналогично примеру 9, с той разницей, что для приготовления суспензии сорбента используют водный раствор щелочи (NaOH) с рН 11, а время обработки сорбента в щелочи составляет 60 часов. Приготовленная колонка имеет эффективность по гексану 40000 т.т./м (при скорости элюента - 96%-го этанола - 0,1 мл/мин).Example 10. A glass column (150 mm × 3 mm) with monospherical grains of a highly crosslinked polydivinylbenzene sorbent with a diameter of 5 μm and a pore diameter of 500 Å is prepared according to the invention in analogy to Example 9, with the difference that an aqueous alkali solution (NaOH) is used to prepare the suspension of the sorbent. with a pH of 11, and the processing time of the sorbent in alkali is 60 hours. The prepared column has a hexane efficiency of 40,000 tons / m (at an eluent speed of 96% ethanol, 0.1 ml / min).

Пример 11. По предлагаемому изобретению стеклянную колонку (150 мм × 3 мм) с моносферическими зернами полимерного сорбента на основе полистирола-дивинилбензола диаметром 10 мкм с диаметром пор 500 Å приготавливают аналогично примеру 5. Приготовленная колонка имеет эффективность по гексану 35000 т.т./м (при скорости элюента - 96%-го этанола - 0,1 мл/мин).Example 11. According to the invention, a glass column (150 mm × 3 mm) with monospherical grains of a polymer sorbent based on polystyrene-divinylbenzene with a diameter of 10 μm and a pore diameter of 500 Å is prepared analogously to Example 5. The prepared column has a hexane efficiency of 35,000 tp / m (at an eluent speed of 96% ethanol - 0.1 ml / min).

При использовании элюента - воды с рН 1-14 не происходит проседание слоя ПС-ДВБ сорбента в колонке. Это связано с тем, что агломераты моносферических зерен ПС-ДВБ сорбента при заполнении колонки разрушаются в водном растворе щелочи, так как удаляются карбонильные и карбоксильные группы с поверхности сорбента и хлориды металлов в результате гидролиза.When using the eluent, water with a pH of 1-14, the PS-DVB sorbent layer does not sag in the column. This is due to the fact that the agglomerates of PS-DVB monospherical grains of the sorbent are destroyed when the columns are filled in an aqueous alkali solution, since carbonyl and carboxyl groups are removed from the surface of the sorbent and metal chlorides as a result of hydrolysis.

Источники информацииInformation sources

1. А.С. СССР №948110, МКИ С 08 F 212/08; С 08 F 8/00. Способ получения макросетчатых изопористых полимеров стирола / М.П.Цюрупа, В.А.Даванков, Е.И.Люстгартен, А.Б.Пашков, Л.А.Бельчич. Опубл. 23.04.1983, Бюл. №15.1. A.S. USSR No. 948110, MKI C 08 F 212/08; C 08 F 8/00. The method of producing macromagnet isoporous styrene polymers / M.P. Tsyurupa, V.A. Davankov, E.I. Lustgarten, A.B. Pashkov, L.A. Belchich. Publ. 04/23/1983, Bull. No. 15.

2. Патент России №2163911, МКИ С 08 F 257/02; G 01 N 30/48. Способ получения сорбентов для хроматографии // К.О.Сочилина, В.А.Сочилин. Опубл. 10.03.2001, Бюл. №7.2. Patent of Russia No. 2163911, MKI C 08 F 257/02; G 01 N 30/48. A method of producing sorbents for chromatography // K.O. Sochilina, V. A. Sochilin. Publ. 03/10/2001, Bull. Number 7.

3. Даванков В.А., Волынская А.В., Цурюпа М.П. Сорбционные свойства макросетчатых изопористых полимеров стирола // Высокомол. соед.(Серия В). 1980. Т.22. С.746-748.3. Davankov V.A., Volynskaya A.V., Tsuryupa M.P. Sorption properties of macroreticular isoporous styrene polymers // Vysokomol. Comp. (Series B). 1980.V.22. S.746-748.

4. Даванков В.А., Рогожин С.В., Цурюпа М.П., Панкратов Е.А. Физико-химические свойства макросетчатых изопористых полистирольных гелей // Ж. физ. химии. 1974. Т. 48. С.2964-2967.4. Davankov V.A., Rogozhin S.V., Tsuryupa M.P., Pankratov E.A. Physicochemical Properties of Macrocellular Isoporous Polystyrene Gels // J. Phys. chemistry. 1974.V. 48. S.2964-2967.

5. Hypersol-Macronet Sorbent Resins // Purolite Technical Bulletin. 1995. V.1. P.3-7.5. Hypersol-Macronet Sorbent Resins // Purolite Technical Bulletin. 1995. V.1. P.3-7.

6. Пеннер Н.А. Сверхсшитые полистирольные сорбенты для высокоэффективной жидкостной хроматографии. Дис. канд. хим. наук. М., 2000, 178 с.6. Penner N.A. Super crosslinked polystyrene sorbents for high performance liquid chromatography. Dis. Cand. Chem. sciences. M., 2000, 178 p.

7. Streat М., Sweetland L. A. Removal of pesticides from water using hypercrosslinked polymer phases: Part 1 - Physical and chemical characterization of adsorbents // Trans.I.Chem.Eng. 1998. V.76. P.115-126.7. Streat M., Sweetland L. A. Removal of pesticides from water using hypercrosslinked polymer phases: Part 1 - Physical and chemical characterization of adsorbents // Trans.I.Chem.Eng. 1998. V.76. P.115-126.

8. Steckle W.P.J., Duke J.R.J. Solid state NMR studies of hypercrosslinked resins. // Polym.Prepr. 1997. V.38. P.834-835.8. Steckle W.P.J., Duke J.R.J. Solid state NMR studies of hypercrosslinked resins. // Polym.Prepr. 1997. V.38. P.834-835.

9. Сычев К.С. Применение сверхсшитого полистирола в высокоэффективной жидкостной хроматографии и твердофазной экстракции. Дис. канд. хим. наук. М., 2004, 147 с.9. Sychev K.S. The use of hypercrosslinked polystyrene in high performance liquid chromatography and solid phase extraction. Dis. Cand. Chem. sciences. M., 2004, 147 p.

10. Стыскин Е.Л., Ициксон Л.Б., Брауде Е.Б. Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография. - М.: Химия, 1986, 271 с.10. Styskin E.L., Itsikson LB, Braude E.B. Practical high performance liquid chromatography. - M.: Chemistry, 1986, 271 p.

11. W.W.Yau, J.J.Kirkland, D.D.Bly. Modern Size-Exclusion liquid chromatograhy. Practice of Gel permleation and Gel Filtration Chromatograhy. New York-Chichester-Brisban-Toronto, 1979. P.393.11. W.W. Yau, J.J. Kirkland, D.D. Bly. Modern Size-Exclusion liquid chromatograhy. Practice of Gel permleation and Gel Filtration Chromatograhy. New York-Chichester-Brisban-Toronto, 1979. P.393.

12. Kamata К. Sensitive Fluorometuy of metallothionein as a functionl metal carrier in body // Japan-Russia International Symposium on Enviromental Studies. Tohoku Fukushi University: Sendai, 2003, p.9-10.12. Kamata K. Sensitive Fluorometuy of metallothionein as a functionl metal carrier in body // Japan-Russia International Symposium on Enviromental Studies. Tohoku Fukushi University: Sendai, 2003, p. 9-10.

Claims

1. A method of preparing high-performance columns with polymer sorbents for liquid chromatography, including the preparation of a suspension of monospherical grains of a supercrosslinked polymer sorbent based on polystyrene, polystyrene-divinylbenzene and polydivinylbenzene in solution, introducing the suspension into the column, forcing the suspension through the column with increasing pressure at the supply of the solution compaction and formation of an orderly layer of the sorbent, pumping the solution through the column and reducing the pressure, characterized in that the solution used is an aqueous alkali solution with a pH of 11-14, moreover, before the suspension is introduced into the column, the sorbent is kept in the solution for 0.5-60 hours.

2. The method according to claim 1, characterized in that the sorbent grains with a diameter of 5 and 10 microns are used to prepare the suspension.

3. The method according to claim 1, characterized in that the sorbent is densified at a maximum pressure of 25-30 MPa.