RU2270858C2 - Штамм бактерий b. subtilis - продуцент сурфактина - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения биогенного поверхностно-активного вещества сурфактина, обладающего множественной биологической активностью. Штамм Bacillus subtilis 0017 выделен из образца типичного чернозема Республики Башкортостан и поддерживается в коллекции микроорганизмов Института биологии Уфимского научного центра РАН. Регистрационный номер в коллекции - 0017. Штамм превосходит по уровню накопления сурфактина известные природные штаммы. 1 табл., 4 ил.

Description

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения биогенного поверхностно-активного вещества сурфактина, обладающего множественной биологической активностью. Его практическое применение возможно в нефтедобывающей промышленности для увеличения извлечения нефти из нефтеносных пластов [1], при очистке емкостей от остатков нефти, очистки загрязненной углеводородами почвы, для стабилизации и дестабилизации эмульсий [2, 3], а также в качестве биологически активного компонента фармпрепаратов.

Это вещество, согласно описанию Kakinuma et al. [4, 5], представляет собой смесь циклических гексапептидов, замкнутых в кольцо через β-гидрокси жирную кислоту с углеродной цепью из 13-15 атомов:

Сурфактин обладает множественной биологической активностью. Он способен лизировать эритроциты [6] и протопласты бактерий [7]. Кроме того, сурфактин ингибирует реакцию фибриноген-тромбин, замедляя образование фибрина [8]. Это свойство определяет его как возможный компонент при создании противокоагулирующих средств для профилактики тромбозов и для предотвращения болезней типа инфаркта миокарда, легочной эмболии и т.д.

Сурфактин проявляет антихолестеразную активность, снижая уровень холестерина в плазме и печени [9], обладает противоопухолевой [10], фунгицидной и антибиотической активностями [11]. Данный липопетид проявляет бактериостатические свойства даже при концентрациях 5-10 ppm.

Сурфактин является сильным поверхностно-активным соединением, при концентрации 0,05% поверхностное натяжение воды снижается с 72 мН/м до 27 мН/м [8].

Множественность полезных физико-химических, биологических и физиологических свойств этого вещества свидетельствует о том, что оно может широко использоваться в фармацевтике, технических и природоохранных областях.

Arima, К et al. [8] описал метод получения сурфактина, основанный на использовании природных штаммов бактерий B.subtilis ATCC 21331 или АТСС 21332. Однако эти штаммы обеспечивали выход не более 0.05-0.1 г/л сырого продукта и 0.04-0.05 г/л очищенного вещества, что экономически оказалось невыгодно.

Для повышения выхода сурфактина в процессах ферментации были предложены решения, основанные на подборе состава питательных сред, изменении технологических схем или на получении мутантных штаммов уже известного продуцента B.subtilis ATCC 21332.

Путем добавления в базовую питательную среду гидролизата торфа Sheppard J. and Mulligan С. [12] добились выхода 0,16 г/л сурфактина, используя известный продуцент.

Cooper D.G. et al., [13] предложили технологию получения сурфактина с помощью известного штамма B.subtilis ATCC 21332, основанную на непрерывном отборе пены из ферментера. Реализация данного решения позволила достичь выхода сурфактина 0,7-0,8 г/л.

Mulligan et al. [14] путем ультрафиолетового облучения известного продуцента B.subtilis ATCC 21332 получили мутант B.subtilis ATCC 53813, в 3,4 раза превосходящий исходный по продуктивности.

Carrera et al. [15, 16], используя в качестве мутагена N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин, получили из известного B.subtilis ATCC 21332 новый мутант B.subtilis ATCC 55033, обеспечивающий выход от 1,2 до 2,0 г/л сурфактина с чистотой 99%.

Ohno et al. [17] с помощью рекомбинантной плазмиды рС112 получили штамм Bacillus subtilis MI 113, превосходящий по продуктивности дикий штамм в 1,5 раза. Однако накопление сурфактина при глубинном культивировании не превышало 0,4 г/л, но при твердофазной ферментации этого рекомбинантного штамма на среде с коагулятом сои "Okara" в качестве субстрата продуктивность возросла до 2,0 г/кг сырого веса среды [18].

Основным недостатком известных рекомбинантных штаммов является недостаточная стабильность плазмид, несущих ген, регулирующий биосинтез сурфактина. К другим недостаткам следует отнести законодательные ограничения на применение генетически модифицированных микроорганизмов в природных условиях и фармацевтике, существующие в большинстве развитых стран.

В научных публикациях имеются данные о природных ("диких") штаммах B.subtilis S 499 (продуктивность 110 мг/л) [19] и B.subtilis RB 14 (продуктивность 250 мг/л) [17], однако, их недостатком является сопродукция антибиотика итурина, который крайне сложно отделить от целевого продукта.

Цель настоящего изобретения - получение природного, генетически неизмененного штамма почвенных бактерий, превосходящего по уровню накопления сурфактина известные природные ("дикие") штаммы.

Поставленная цель достигается предлагаемым штаммом Bacillus subtilis ИБ-17, выделенным из образца почвы типичного чернозема, отобранного на территории республики Башкортостан (Российская Федерация). Штамм поддерживается в Коллекции микроорганизмов лаборатории прикладной микробиологии Института биологии Уфимского научного центра РАН. Номер штамма в коллекции 0017 (ИБ-17).

Культурально-морфологические признаки. Спорообразующие, грамотрицательные, палочковидные подвижные клетки размером 0,9-1,7 на 5,6-9,9 мкм. Спорангий не раздувают, расположены субцентрально. На среде с мясопептонным агаром на 1 сутки образует колонии: овальные, диаметром 1,0-1,5 мм, плоские, непрозрачные, блестящие, кремового цвета. На седьмые сутки роста около 80% колоний разрастаются в размерах до 4-8 мм и приобретают неправильную форму за счет вторичного веерообразного разрастания исходной колонии. У колонии края приобретают ярко выраженный лопастной вид с незначительным бортиком по краям, где сохраняется исходный цвет и непрозрачность. Тогда как сама колония становится полупрозрачной, структура ее не однородная, в центре крупнозернистая с включением не прозрачных глыбок.

Физиологические признаки. Отношение к кислороду - строгий аэроб. Светонезависим. Хорошо растет в интервале температур от 30 до 45°С. Минимальная температура 10°С, максимальная 50°С. Растет в интервале рН от 4,5 до 9,0, оптимально - при рН 7,5. Галотолерантность характеризуется ростом при 7% NaCl. При сбраживании сахаров газа не образует. Гидролизует крахмал. Реакция Фогес-Проскауэра (образование ацетилметилкарбинола) положительная. Индол не образует. Дезаминирование фенилаланина не происходит. Разлагает тирозин и использует цитрат. Проявляет гемолитическую активность - β гемолиз, кислород независимый.

По совокупности физиолого-биохимических признаков штамм принадлежит к семейству Bacillaceae и относится к роду Bacillus, виду subtilis [20].

Состав среды для культивирования, мас.%: крахмал - 1; пептон - 0,5; дрожжевой экстракт - 0,3; кукурузный экстракт - 0,3; К₂HPO₄ - 0,2; (NH₄)₂SO₄ - 0,2; вода водопроводная - до 100. Штамм хранится на косяках картофельного агара или в лиофильно высушенном состоянии.

Образование заявляемым штаммом поверхностно-активного вещества - сурфактина характеризуется следующими примерами.

Пример 1. Поверхностно-активные свойства. Предлагаемый штамм Bacillus subtilis ИБ-17 выращивают в колбах объемом 250 мл со 100 мл питательной среды на качалке УВМТ-12 при 37°С и n=160 мин^-1 в жидкой питательной среде следующего состава, г/л дистиллированной воды:

Картофельный крахмал	10,0
Кукурузный экстракт	1,5
(NH4)2HPO4	2,0
К2HPO4	2,0
(NH4)2SO4	2,0
СаСО3	5,0
начальное рН	8,2

Через 8, 10, 24, 30, 48, 72, 96, 120 часов от начала культивирования отбирают пробы для определения биомассы (г/л), оптической плотности (D₆₃₀), рН. Поверхностное натяжение определяют методом отрыва кольца после отделения биомассы центрифугированием при n=4000 мин^-1. Результаты, свидетельствующие о динамике роста и снижении поверхностного натяжения в процессе культивирования штамма Bacillus subtilis ИБ-17, представлены на рисунке 1. Снижение поверхностного натяжения с 72 мН/м до 27 мН/м характерно для сурфактинов.

Пример 2. Биологическая активность. Предлагаемый штамм Bacillus subtilis ИБ-17 выращивают как в примере 1 в течение 72 ч. Биомассу отделяют центрифугированием при n=4000 мин^-1. Супернатант закисляют 2N HCl до рН 2,0 и оставляют на ночь при +4°С для формирования осадка. Осадок отделяют центрифугированием при n=4000 мин^-1. Осадок трижды экстрагируют 10 мл метанола при комнатной температуре в течение 1,5 ч. Экстракты объединяют, добавляют 1 г активированного угля, встряхивают 15 мин на ротационном шейкере. Осветленный центрифугированием экстракт выпаривают в тигле при 60°С досуха и перерастворяют в 10 мл дистиллированной воды. Полученный раствор вносят в лунки чашек Петри агара с эритроцитами и сусло-агара, предварительно инокулированного пекарскими дрожжами Saccharomyces cervisiae. Чашки с эритроцитами выдерживают в течение 12 ч при температуре 10°С, затем 6 ч при комнатной температуре и определяют зоны гемолиза. Чашки с пекарскими дрожжами инкубируют в термостате при 28°С в течение 48 ч и измеряют зоны ингибирования роста дрожжей вокруг лунок. Результаты представляют в таблице:

Концентрация вещества, мкг/мл	Диаметр зоны гемолиза, мм	Диаметр зоны ингибирования роста дрожжей, мм
200	7,6±0,2	0,0
400	9,0±0,2	0,0
1000	11,2±0,3	0,0

Из литературных источников известно, что гемолиз эритроцитов одно из основных свойств сурфактинов, в то же время сурфактин не ингибирует рост дрожжевых клеток. Отсутствие ингибирования роста Saccharomyces cervisiae в данном случае свидетельствует об отсутствии сопродукции итурина [21].

Пример 3. ИК-спектроскопия. Культуру выращивают и выделяют сурфактин как в примере 2. Раствор сурфактина в дистиллированной воде высушивают лиофильно и полученный порошок диспергируют в вазелиновом масле и подвергают анализу на инфракрасном спектрофотометре Specord (Carl Zeiss Jena, ГДР) М-80. Данные спектра поглощения (фиг.2) свидетельствуют о наличии следующих полос: пептидных связей (1648 см^-1); аминогрупп (1568 см^-1), а также карбоксильных групп (1420 см^-1) и сложноэфирных связей (1248 см^-1, 1080 см^-1), что характерно для молекул липопептидов.

Пример 4. Аминокислотный анализ. Культуру выращивают и выделяют вещество как в примере 2 и высушивают как в примере 3. Навеску сухого вещества (около 10 мг) помещают в стеклянную ампулу, добавляют 10 мл 6N HCl, запаивают и выдерживают в течение 24 часов при 110°С для гидролиза. Гидролизат анализируют с помощью Автоматического анализатора аминокислот ААА 339 М (Mikrotechna, Чехия). Данные аминокислотного анализа (фиг.3) свидетельствуют о наличии четырех доминирующих аминокислот: Аспарагиновой кислоты, Глутаминовой кислоты, Валина и Лейцина в соотношении 1:1:1:4, что свойственно сурфактину.

Пример 5. Хромато-масс-спектрометрия. Культуру Bacillus subtilis ИБ-17 выращивают как в примере 1. Биомассу отделяют центрифугированием при n=4000 мин^-1. Супернатант закисляют 2N HCl до рН 2,0 и оставляют на ночь при +4°С для формирования осадка. Осадок отделяют центрифугированием при n=4000 мин^-1. Осадок трижды экстрагируют 10 мл метанола при комнатной температуре в течение 1,5 ч. Экстракты объединяют, добавляют 1 г активированного угля, встряхивают 15 мин на ротационном шейкере. Осветленный центрифугированием экстракт выпаривают в тигле при 60°С досуха. Навеску полученного вещества перерастворяют в метаноле до концентрации 3,0 мг/мл и анализируют на масс-спектрометре, используя масс-детектор "Waters Micromass ZQ 2000" с электроспрей ионизацией (ESI). Условия детектирования положительно заряженных ионов следующие:

напряжение на капилляре - 3,0 кВ;

напряжение на конусе - 60 В,

напряжение на экстракторе - 5 В;

температура испарения - 150°С;

температура источника - 70°С;

расход азота при испарении - 150 л/ч;

расход азота на конусе - 50 л/ч.

В результате анализа вещества получают спектр заряженных частиц, характеризующийся кластером интенсивных пиков в интервале 1032-1150 m/z, характерным для изоформ сурфактина (фиг.4).

Пример 6. Продуктивность штамма. Предлагаемый штамм Bacillus subtilis ИБ-17 выращивают как в примере 1 в течение 72 ч и отделяют биомассу центрифугированием. Супернатант закисляют 2N HCl до рН 2,0 и оставляют на ночь при +4°С для формирования осадка. Осадок отделяют центрифугированием при n=4000 мин^-1. Осадок трижды экстрагируют 10 мл метанола при комнатной температуре в течение 1,5 ч. Экстракты объединяют, добавляют 1 г активированного угля, встряхивают 15 мин на ротационном шейкере, фильтруют через капроновый мембранный фильтр с диаметром пор 0,2 мкм. Фильтрат анализируют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на приборе ГПЦ (Чехия) с ультрафиолетовым детектором при 205 нм. Условия разделения: подвижная фаза - ацетонитрил: 1%-ный раствор уксусной кислоты - 4:1; скорость потока 1,5 мл/мин; колонка Zorbax ODS (4,6 мм×25 см).

Содержание сурфактина в культуральной жидкости рассчитывают исходя из калибровочной кривой, построенной на основе растворов коммерческого препарата сурфактина (Sigma-Aldrich Co) чистотой 98,0%.

Выход сурфактина при данных условиях культивирования Bacillus subtilis ИБ-17 составляет 1798±87 мг/л.

Источники, принятые во внимание

1. Schaller К. D., Bala G. A. Characterization of Surfactin from Bacillus subtilis for Application as an Agent for Enhanced Oil Recovery // 25-th Symposium on Biotechnology for Fuels and Chemicals. Breckenridge, Colorado, May 4-7 2003. PP.5-17. http://www.nrel.gov/biotech_symposium/docs/abst5-17.doc.

2. Gitnik D., Pinas W. Perspectives of microbiol surfactants. // Biochem. Soc. Transakt. - 1987. - V.15, №6. - P.19S-35S.

3. Елисеев С.А, Вильданова-Марцишина Р.И., Шульга А.П., Шабо З.В., Туровский А.А. Нефтеотмывающий биоэмульгатор, образуемый Bacillus species. // Микробиологический журнал. - 1991. - Т.53, №6. - С.61-66.

4. Kakinuma A., Hori M., Isono M., Tamura G., Arima К. Determination of amino acid sequence in surfactin, a crystalline peptidolipid surfactant produced by Bacillus subtilis. // Agric. Biol. Chem., - 1969. - V.33, - P.971-972.

5. Kakinuma A., Sugino H., Isono M., Tamura G., Arima K. Determination of fatty acid in surfactin and elucidation of the total structure of surfactin. // Agric. Biol. Chem., - 1969. - V.33, - P.973-976.

6. Bernheimer A.W., Avigad L.S. Nature and properties of a cytolytic agent produced by Bacillus subtilis // J.Gen. Microbiol. - 1970. V 61, - P.361-369.

7. Hosono K, Suzuki H. Acylpeptides, the inhibitors of cyclic adenosine 3',5'-monophosphate phosphodiesterase. III. Inhibition of cyclic AMP phosphodiesterase. //J Antibiot (Tokyo). - 1983. V.36, - P.679-683.

8. Arima K., Kakinuma A., Tamura G. Surfactin, a crystalline peptidolipid surfactant produced by Bacillus subtilis: isolation, characterization and its inhibition of fibrin clot formation. // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1968. V.31, - p.488-494.

9. Imai Y., Sugino H., Takeshi, Takinuma A. Hypocholesterolemic effect of surfactin, a novel bacterial peptide lipid. //Takeda Kenkyusho Ho - 1971. - V.30, - P.728-734.

10. Kameda Y., Matsui К., Hisato К., Yamada Т., Sagai H. Antitumor activity of Bacillus natto. III. Isolation and characterization of a cytilytic substance on Ehrlich ascites carcinoma cells in the culture medium of Bacillus natto KMD 1126. //Chem. Pharm. Bull. - 1972. - V.20, - P.1551-1553.

11. Tsukagoshi N., Tamura G., Arima K. A novel protoplast-bursting factor (surfactin) obtaned from Bacilus subtilis IAM 1213. I. The effects of surfactin on Bacillus megaterium KM. // Biochim. Biophys. Acta. - 1970. - V.196, - P.204-210.

12. Sheppard J.D., Mulligan C.C.N., The production of surfactin by Bacillus subtilis grown on peat hydrolysate // Appl. Microbiol. Biotechnol., - 1987. - V.27 - Р.110-116.

13. Cooper D.G., MacDonald C.R., Duff S.F.B., Kosaric N. Enhanced production of surfactin from Bacillus subtilis by continuous product removal and metal cation additions. // Appl. Environ. Microbiol. - 1981. V.42 - P.408-412.

14. Pat. 5037758 USA, C12N 001/20 Enhanced production of biosurfactant through the use of a mutated В subtilis strain. /Mulligan C.N., Chow T.Y./ Publ. August 6, 1991.

15. Pat. 5227294 USA, C12P 021/02; C12P 001/125 Method of producing surfactin with the use of mutant of Bacillus subtilis. / Carrera P., Cosmina P., Grandi G./ Publ. July 13, 1993.

16. Pat. 5264363 USA, C12R 001/125; C12P 021/04 Mutant of Bacillus subtilis. / Carrera P., Cosmina P., Grandi G./ Publ. November 23, 1993.

17. Ohno A., Takashi A., Shoda M. Production of a lipopeptide antibiotic surfactin with recombinant Bacillus subtilis. // Biotechnol. Lett. - 1992. V.14, - P.1165-1168.

18. Ohno A., Ano Т., Shoda M. Production of a lipopeptide antibiotic surfactin with recombinant Bacillus subtilis in solid state fermentation. // Biotechnol. Bioeng. - 1995. V.47, - P.209-214.

19. Sandrin С, Peypoux F, Michel G. Coproduction of surfactin and iturin A, lipopeptides with surfactant and antifungal properties, by Bacillus subtilis.// Biotechnol Appl Biochem. - 1990. V.12, No4, - P.370-375.

20. Bergey's manual of systematic bacteriology/ - Baltimore: Willliams & Wilkins Co., 1986, - V.2, - P.1104-1141.

21. Feignier С., Besson F., Geoges M. Studies on lipopeptide biosynthesis by Bacillus subtilis: Isolation and characterization of iturin^-, surfactin⁺ mutants //FEMS Microbiol. Letters, 1995, V.127, - P.11-15.

Claims (1)

1. Штамм бактерий Bacillus subtilis №0017 (Коллекция микроорганизмов Института биологии УНЦ РАН) - продуцент сурфактина.

Images