RU2263148C1

RU2263148C1 - Method for differentiated determination of microorganism number in mixed cultures

Info

Publication number: RU2263148C1
Application number: RU2004104606/13A
Authority: RU
Inventors: Е.Н. Ефременко (RU); Е.Н. Ефременко; Руфат Эйваз Оглы Азизов (RU); Руфат Эйваз Оглы Азизов; Т.А. Махлис (RU); Т.А. Махлис; С.Д. Варфоломеев (RU); С.Д. Варфоломеев
Original assignee: Ефременко Елена Николаевна; Руфат Эйваз Оглы Азизов; Махлис Татьяна Абрамовна; Варфоломеев Сергей Дмитриевич
Priority date: 2004-02-18
Filing date: 2004-02-18
Publication date: 2005-10-27
Also published as: RU2004104606A

Abstract

FIELD: biotechnology, microbiology.

SUBSTANCE: method involves sowing out samples of mixed cultures in liquid selective media, determination of cells number accumulating in media during microorganisms growth by bioluminescent method and mathematical treatment of kinetic data of the growth of individual bacterial cultures, determination of the parent concentration of microorganisms relating to different taxonomic groups. Invention allows carrying out the simultaneous identification of bacterial cells relating to different taxonomic groups and presenting in mixed cultures simultaneously, and to enhance precision in determination of cells number in the broad concentration range and to reduce the total analysis time significantly. In industry mixed cultures are used widely in different branches of food industry (dairy, meat, brewing and others) and in other biotechnological processes (biological treatment of sewage waters, bioremediation of soils, producing methane from waste in different manufactures and others). Invention can be used for differentiated determination of microorganisms number in mixed cultures that are widely distributed in nature: in air, soil, ponds, as components of natural microflora in higher organisms and among contaminants causing injury of different objects.

EFFECT: improved method for determination.

1 tbl, 3 dwg, 5 ex

Description

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для дифференцированного определения численности бактерий в смешанных культурах на основе комбинированного подхода, сочетающего в себе микробиологические приемы работы с клетками микроорганизмов, предполагающих использование селективных питательных сред роста, биолюминесцентный метод анализа внутриклеточной концентрации аденозинтрифосфата, а также стандартные математические методы обработки кинетических данных.The invention relates to biotechnology and can be used for differentially determining the number of bacteria in mixed cultures based on a combined approach that combines microbiological methods of working with microorganism cells, using selective growth media, a bioluminescent method for analyzing intracellular adenosine triphosphate concentration, as well as standard mathematical methods kinetic data processing.

Естественный кругооборот углерода, азота, кислорода и многих других химических элементов требуют активного участия разных типов микроорганизмов, поэтому столь широко распространение смешанных популяций микроорганизмов в природе - они встречаются в воздухе, почве, водоемах, являются естественной микрофлорой высших организмов. Смешанные культуры находят широкое применение в пищевой промышленности (в молочной - производство кисломолочных продуктов, сыроделие и др.; в мясной - производство колбасных заквасок, а также в виноделии и пивоварении). Смешанные культуры применяются во многих природоохранных и биотехнологичсеких процессах (биологическая очистка сточных вод, биоремедиация почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, получение метана из отходов сельского хозяйства и др.).The natural cycle of carbon, nitrogen, oxygen and many other chemical elements require the active participation of different types of microorganisms, therefore, the widespread distribution of mixed populations of microorganisms in nature - they are found in air, soil, water bodies, are a natural microflora of higher organisms. Mixed cultures are widely used in the food industry (in the dairy industry - the production of dairy products, cheese making, etc.; in the meat industry - the production of sausage starter cultures, as well as in winemaking and brewing). Mixed cultures are used in many environmental and biotechnological processes (biological wastewater treatment, bioremediation of soils contaminated with oil and oil products, methane production from agricultural wastes, etc.).

Дифференцированное определение микроорганизмов в смешанных культурах необходимо для изучения биологической активности данной биосистемы в целом и вклада каждого вида бактерий в общий процесс функционирования смешанных культур. Информация, полученная при дифференцированном анализе проб смешанных культур, может быть использована не только для изучения и повышения эффективности биотехнологических процессов, но и для детекции и предотвращения развития нежелательных процессов с участием смешанных культур, в частности различных заболеваний и процессов порчи готовой продукции (биокоррозии, гниения и др.).A differentiated definition of microorganisms in mixed cultures is necessary to study the biological activity of this biosystem as a whole and the contribution of each bacterial species to the overall process of functioning of mixed cultures. The information obtained during the differential analysis of samples of mixed cultures can be used not only to study and improve the efficiency of biotechnological processes, but also to detect and prevent the development of undesirable processes involving mixed cultures, in particular various diseases and spoilage of finished products (biocorrosion, rotting) and etc.).

Существует ряд методов, основанных на дифференцированной количественной идентификации одного вида клеток, присутствующих в популяции смешанных культур. Большинство этих методов предполагает применение классического микробиологического способа определения численности клеток, согласно которому производят посев анализируемых проб в жидкую или твердую агаризованную питательную среду и инкубируют в течение длительного времени [Под ред. Звягинцева Д.Г. Методы почвенной микробиологии и биохимии. М.: Изд-во. Моск. ун-та, 1991, с.59-63]. Далее в жидкой питательной среде количество выросших клеток микроорганизмов оценивают спектрофотометрически по поглощению клеточной суспензии при длине волны 520-560 нм или нефелометрически по мутности клеточной суспензии, используя калибровочные графики. На твердой питательной среде определяют количество колониеобразующих единиц. При этом для дифференцированного определения целевой культуры используются селективные среды роста.There are a number of methods based on differentiated quantitative identification of one type of cell present in a mixed culture population. Most of these methods involve the use of the classical microbiological method for determining the number of cells, according to which the analyzed samples are inoculated into a liquid or solid agarized nutrient medium and incubated for a long time [Ed. Zvyagintseva D.G. Methods of soil microbiology and biochemistry. M .: Publishing House. Mosk. University, 1991, S. 59-63]. Then, in a liquid nutrient medium, the number of grown microorganism cells is estimated spectrophotometrically by absorbing a cell suspension at a wavelength of 520-560 nm or nephelometrically by turbidity of a cell suspension using calibration graphs. On a solid nutrient medium, the number of colony forming units is determined. At the same time, selective growth media are used to differentially determine the target culture.

Так, известен способ выделения и количественного определения бифидобактерий из смешанных культур [Пат. РФ №2154105 (2000) C 12 N 1/20, C 12 Q 1/04, Способ количественной оценки содержания бифидобактерий в смешанных культурах микроорганизмов]. Способ предусматривает посев исследуемых проб в питательную селективную среду для выделения бифидобактерий. Посевы культивируют в термостате и производят подсчет числа колоний бифидобактерий в исследуемом биоматериале. В качестве селективных компонентов (агентов) питательной среды используют азид натрия и литий пропионовокислый, которые одновременно вносят в среду в количестве, соответственно, 120-150 мг и 20-30 мл на 1 л питательной среды.So, there is a method of isolation and quantification of bifidobacteria from mixed cultures [Pat. RF №2154105 (2000) C 12 N 1/20, C 12 Q 1/04, Method for the quantitative assessment of the content of bifidobacteria in mixed cultures of microorganisms]. The method involves seeding the test samples in a selective nutrient medium for the isolation of bifidobacteria. Crops are cultivated in a thermostat and count the number of colonies of bifidobacteria in the studied biomaterial. As selective components (agents) of the nutrient medium, sodium azide and lithium propionic acid are used, which are simultaneously added to the medium in an amount of, respectively, 120-150 mg and 20-30 ml per 1 liter of nutrient medium.

Также известен способ определения концентрации сульфатредуцирующих бактерий (СРБ) в пробах, взятых из биокоррозионных объектов [V.P.Kholodenko, S.K.Jigletsova, Chemico-Microbiological Diagnosis of Stress Corrosion Cracking of Pipelines. //Appl. Biochem. Microbiol, 2000, V.36, p.685-693]. Для определения концентрации СРБ используют модифицированную среду Постгейта. Стерильные среды разливают в пробирки по 9 мл и засевают по общепринятому методу предельных разведений. Культивирование проводят в течение 7-10 суток при 28°С. О присутствии жизнеспособных СРБ судят по образованию черного осадка сульфида железа. Определяя номер разведения, в котором уже не наблюдается сульфатредукция, дают количественную оценку концентрации СРБ в исходном образце.Also known is a method for determining the concentration of sulfate-reducing bacteria (CRP) in samples taken from biocorrosive objects [V.P. Kholodenko, S.K. Jigletsova, Chemico-Microbiological Diagnosis of Stress Corrosion Cracking of Pipelines. // Appl. Biochem. Microbiol, 2000, V.36, p.685-693]. To determine the concentration of CRP using a modified Postgate medium. Sterile media are poured into test tubes of 9 ml and seeded according to the standard method of limiting dilutions. Cultivation is carried out for 7-10 days at 28 ° C. The presence of viable CRP is judged by the formation of a black precipitate of iron sulfide. Determining the dilution number, in which sulfate reduction is no longer observed, give a quantitative estimate of the concentration of CRP in the initial sample.

Микробиологические способы определения численности клеток методом посева предельных разведении и комбинированные с ними методы достаточно универсальны, могут быть использованы при работе с разнообразными типами клеток, но имеют ряд существенных недостатков:Microbiological methods for determining the number of cells by seeding by the limiting dilution method and the methods combined with them are quite universal, can be used when working with various types of cells, but have a number of significant disadvantages:

а) Методы требуют больших затрат времени, длительность инкубации определяется тем уровнем концентраций клеток, который допустим для данного объекта. Если допустимый порог концентраций составляет, например, 10⁴-10⁵ клеток/мл, то инкубация продолжается 24-72 ч. Если же предстоит анализ образца с очень низким содержанием клеток (около 1-10 клеток на 100 мл), то инкубация может продолжаться до 14-21 суток.a) Methods are time consuming, the incubation time is determined by the level of cell concentrations that is acceptable for a given object. If the permissible concentration threshold is, for example, 10 ⁴ -10 ⁵ cells / ml, then the incubation lasts 24-72 hours. If the sample is to be analyzed with a very low cell content (about 1-10 cells per 100 ml), then the incubation can continue up to 14-21 days.

б) Успех проведения анализа во многом определяется квалификацией персонала, занятого подготовкой образцов и интерпретацией результатов анализа. Результаты анализа, полученные разными людьми, часто существенно отличаются друг от друга. Статистическая ошибка самого метода определения составляет 10%.b) The success of the analysis is largely determined by the qualifications of the personnel involved in preparing the samples and interpreting the results of the analysis. The results of the analysis obtained by different people often differ significantly from each other. The statistical error of the determination method itself is 10%.

в) Прямой подсчет количества клеток микроорганизмов мало применим для непрозрачных образцов, содержащих малорастворимые химические соединения, что тоже ограничивает практическое применение метода и требует проведения предварительной пробоподготовки аналогичных образцов.c) Direct counting of the number of cells of microorganisms is of little use for opaque samples containing poorly soluble chemical compounds, which also limits the practical application of the method and requires preliminary sample preparation of similar samples.

г) Микробиологические методы отличаются достаточно большой погрешностью и требуют постановки ряда параллельных экспериментов, которые делают метод еще более трудоемким и повышают стоимость анализа.d) Microbiological methods have a rather large error and require a number of parallel experiments, which make the method even more time-consuming and increase the cost of analysis.

д) Так как определение концентрации клеток в образце основывается на прямом подсчете колониеобразующих единиц, выросших на агаризованных средах, то оно может быть ошибочным ввиду того, что не все жизнеспособные микробные клетки в принципе могут образовывать колонии на твердой питательной среде, а также отсутствие роста может быть результатом их определенного физиологического и метаболического состояния [Заварзин Г.А., Колотилова Н.Н. Введение в природоведческую микробиологию. Москва, 2001, с.71-74].e) Since the determination of the concentration of cells in a sample is based on a direct calculation of colony forming units grown on agarized media, it may be erroneous in view of the fact that not all viable microbial cells can form colonies on a solid nutrient medium, and the lack of growth can be the result of their specific physiological and metabolic state [Zavarzin G.A., Kolotilova N.N. Introduction to natural microbiology. Moscow, 2001, p. 71-74].

Другая группа дифференцированных методов определения численности клеток предполагает идентификацию специфической ферментативной активности, характерной для определенного типа бактерий.Another group of differentiated methods for determining cell numbers involves the identification of specific enzymatic activity characteristic of a particular type of bacteria.

Способ количественного определения и дифференциации колиформных бактерий и клеток E.coli [US Pat. 5393662 (1995), C 12 Q 1/10, C 12 Q 1/04, Test media for identifying and differentiating general coliforms and Escherichia coli bacteria] позволяет количественно определять все колиформные клетки, имеющие бета-галактозидазную активность, но не имеющие бета-глюкуронидазную активности, а затем проводить определение клеток E.coli, дополнительно имеющих бета-глюкуронидазную активность. Для этого используются хромогенные субстраты, которые образуют нерастворимый осадок одного цвета, взаимодействуя с бета-галактозидазой, и осадок другого цвета, контрастирующий с первым, взаимодействуя с бета-глюкуронидазой.A method for the quantitative determination and differentiation of coliform bacteria and E. coli cells [US Pat. 5393662 (1995), C 12 Q 1/10, C 12 Q 1/04, Test media for identifying and differentiating general coliforms and Escherichia coli bacteria] allows you to quantify all coliform cells with beta-galactosidase activity, but not having beta- glucuronidase activity, and then determine the E. coli cells, additionally having beta-glucuronidase activity. For this, chromogenic substrates are used, which form an insoluble precipitate of one color, interacting with beta-galactosidase, and a precipitate of a different color, contrasting with the first, interacting with beta-glucuronidase.

Основным недостатком этого метода является то, что он не является полностью количественным, так как клетки с бета-галактозидазной активностью определяют косвенным путем, вычитая из общего числа всех колиформ те, что имеют бета-глюкуронидазную активность, а также применим только для одного типа бактерий. К тому же концентрация фермента, как и его активность в клетках, может варьироваться в зависимости от разных факторов, что также может сильно влиять на адекватное определение численности клеток по ферментативной активности.The main disadvantage of this method is that it is not completely quantitative, since cells with beta-galactosidase activity are determined indirectly by subtracting from the total number of all coliforms those that have beta-glucuronidase activity, and is also applicable only to one type of bacteria. In addition, the concentration of the enzyme, as well as its activity in the cells, can vary depending on various factors, which can also greatly affect the adequate determination of the number of cells by enzymatic activity.

Существует также дифференцированный метод определения численности клеток бактерий, основанный на особенностях строения бактериальной клеточной стенки. Этот метод позволяет осуществить дифференциацию грамположительных и грамотрицательных клеток.There is also a differentiated method for determining the number of bacterial cells based on the structural features of the bacterial cell wall. This method allows the differentiation of gram-positive and gram-negative cells.

Так, известен способ дифференцированного определения грамположительных и грамотрицательных бактерий в жидких средах, содержащих смешанные культуры, с помощью устойчивого окрашивания клеток специфическим составом [US Pat. 5081017 (1992), C 12 Q 1/24, С 12 М 1/34, Method and apparatus for detection and quantitation of bacteria]. Способ предполагает нанесение образца, содержащего клетки, на отрицательно заряженный фильтр. Далее клетки обрабатывают реактивом с кислым значением рН, изменяющим электростатический заряд клеток и обеспечивающий, таким образом, их адсорбцию на целлюлозном фильтре, затем клетки окрашивают специальным составом при рН 8-12 (карбонатно-боратный буфер) и смывают несвязавшийся краситель. Интенсивность окраски поверхности фильтра в центре коррелирует с численностью клеток. Для определения точного количества бактериальных клеток используются пять окрашенных фильтров с известной концентрацией бактерий в качестве стандартных цветовых индикаторов, предполагающих следующие цвета: белый (нулевой контроль), светло-розовый (5×10⁴ клеток/мл), розовый (10⁵клеток/мл), красный (10⁶ клеток/мл) и темно-красный (10⁷ клеток/мл).Thus, a known method for the differential determination of gram-positive and gram-negative bacteria in liquid media containing mixed cultures, using stable staining of cells with a specific composition [US Pat. 5081017 (1992), C 12 Q 1/24, C 12 M 1/34, Method and apparatus for detection and quantitation of bacteria]. The method involves applying a sample containing cells to a negatively charged filter. Next, the cells are treated with a reagent with an acidic pH that changes the electrostatic charge of the cells and thus ensures their adsorption on the cellulose filter, then the cells are stained with a special composition at pH 8-12 (carbonate-borate buffer) and the unbound dye is washed off. The color intensity of the filter surface in the center correlates with the number of cells. To determine the exact number of bacterial cells, five stained filters with a known concentration of bacteria are used as standard color indicators, assuming the following colors: white (zero control), light pink (5 × 10 ⁴ cells / ml), pink (10 ⁵ cells / ml ), red (10 ⁶ cells / ml) and dark red (10 ⁷ cells / ml).

Несмотря на эффективность и экспрессность, этот метод, очевидно, имеет ряд недостатков, главным из которых является его большая неточность (возможная минимальная концентрация клеток для определения - 5·10⁴клеток/мл), основанная на визуальной оценке полученных результатов, и возможность определения всего пяти концентраций бактериальных клеток.Despite the effectiveness and expressivity, this method obviously has a number of drawbacks, the main of which is its large inaccuracy (the possible minimum cell concentration for determination is 5 · 10 ⁴ cells / ml), based on a visual assessment of the results, and the ability to determine the total five concentrations of bacterial cells.

Методы, основанные на особенностях строения клеточной стенки, позволяют дифференцировать бактерии, принадлежащие двум большим группам, но не определять их более подробную таксономическую принадлежность.Methods based on structural features of the cell wall allow us to differentiate bacteria belonging to two large groups, but not to determine their more detailed taxonomic affiliation.

Известен высокочувствительный универсальный способ дифференцированного определения микроорганизмов в смешанных культурах, основанный на проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР). Способ предусматривает экстракцию ДНК из клеток с последующим проведением ПЦР с использованием соответствующих праймеров. Процедура ПЦР состоит в следующем [Б.Глик, Дж.Пастернак. Молекулярная биотехнология - принципы и применения. М.: Мир, 2002, с.94-103]. Денатурируют экстрагированную ДНК, отжигают одноцепочечные молекулы с праймерами, добавленными в избытке, и осуществляют синтез ДНК in vitro. Затем опять проводят денатурацию, отжиг с праймерами и синтез и т.д. до, примерно, 30-го раунда. К этому времени в реакционной смеси преобладают фрагменты, на одном конце которых находится одна праймерная последовательность, а на другом - последовательность комплементарная второму праймеру. Все реакции проводят в пробирках, помещенных в термостат. Смена температурного режима и его поддержание осуществляются автоматически. Каждый цикл обычно длится 3-5 мин.Known highly sensitive universal method for the differential determination of microorganisms in mixed cultures, based on the polymerase chain reaction (PCR). The method involves the extraction of DNA from cells followed by PCR using appropriate primers. The PCR procedure is as follows [B. Glick, J. Pasternak. Molecular biotechnology - principles and applications. M .: Mir, 2002, pp. 94-103]. The extracted DNA is denatured, single-stranded molecules with primers added in excess are annealed, and DNA synthesis is carried out in vitro. Then, denaturation, annealing with primers and synthesis, etc. are carried out again. until about the 30th round. By this time, fragments prevailed in the reaction mixture, at one end of which there was one primer sequence, and at the other - a sequence complementary to the second primer. All reactions are carried out in test tubes placed in a thermostat. Changing the temperature and maintaining it are carried out automatically. Each cycle usually lasts 3-5 minutes.

Существуют различные модифицированные варианты данного метода для разных бактерий, в частности бактерий, окисляющих ароматические полициклические углеводороды нефти [Р.Padmanabhan, R.Shanker and P.Khanna, A method for extraction of DNA and PCR-based detection of polycyclic hydrocarbon-degrading bacteria in soil contaminated with oil and grease. //World J.Microbiol. & Biotech., 1998, V.14, 925-926], бактерий Lactobacillus brevis [T.Guameri, L.Rosetti and G.Giraffa, Rapid identification of Lactobacillus brevis using the polymerase chain reaction. //Lett. Appl. Microbiol., 2001, V.33, p.377-381], сульфатредуцирующих бактерий [Y.Tanaka, M.Sogabe, K.Okumura and R.Kurane, A highly selective direct method of detecting sulphate-reducing bacteria in crude oil. //Lett. Appl. Microbiol., 2002, V.35, p.242-246] и стрептококков [Т.Igarashi, Y.Yano, A.Yamamoto, R. Sasa, Identification of Streptococcus salivaris by PCR and DNA probe. //Lett. Appl. Microbiol., 2001, V.32, p.394-397]. Варианты метода, предназначенные для различных бактерий, отличаются, соответственно, объектом экстракции ДНК, применяемыми регентами для экстракции ДНК и используемыми праймерами в ПЦР.There are various modified versions of this method for different bacteria, in particular bacteria that oxidize aromatic polycyclic petroleum hydrocarbons [R. Padmanabhan, R. Shanker and P. Khanna, A method for extraction of DNA and PCR-based detection of polycyclic hydrocarbon-degrading bacteria in soil contaminated with oil and grease. // World J. Microbiol. & Biotech., 1998, V.14, 925-926], bacteria Lactobacillus brevis [T. Guameri, L. Rosetti and G. Giraffa, Rapid identification of Lactobacillus brevis using the polymerase chain reaction. // Lett. Appl. Microbiol., 2001, V.33, p.377-381], sulfate-reducing bacteria [Y. Tanaka, M. Sogabe, K. Okumura and R. Kurane, A highly selective direct method of detecting sulphate-reducing bacteria in crude oil. // Lett. Appl. Microbiol., 2002, V.35, p.242-246] and streptococci [T. Igarashi, Y. Yano, A. Yamamoto, R. Sasa, Identification of Streptococcus salivaris by PCR and DNA probe. // Lett. Appl. Microbiol., 2001, V.32, p. 394-397]. Variants of the method intended for various bacteria differ, respectively, in the object of DNA extraction, the reagents used for DNA extraction and the primers used in PCR.

Способ определения бактерий экстракцией ДНК, с последующим проведением ПЦР реакции, высокочувствительный, дифференцированный и универсальный, но имеет ряд недостатков:The method for determining bacteria by DNA extraction, followed by PCR reaction, highly sensitive, differentiated and universal, but has several disadvantages:

а) Способ слишком трудоемкий, требует несколько стадий для экстракции и очистки ДНК.a) The method is too time-consuming, requires several stages for the extraction and purification of DNA.

б) Способ длительный и требует высокой подготовки персонала. В зависимости от объекта исследования бактерий процесс пробоподготовки для ПЦР может длиться до 6 ч, а общее время эксперимента составляет 9-11 ч.b) The method is lengthy and requires highly trained personnel. Depending on the object of study of bacteria, the sample preparation process for PCR can last up to 6 hours, and the total experiment time is 9-11 hours.

в) Способ используется для дифференцированного определения бактерий, но не является количественным.c) The method is used for the differential determination of bacteria, but is not quantitative.

г) Реагенты, используемые в экстракции ДНК, и компоненты, составляющие объект экстракции, могут сильно ингибировать ПЦР амплификации, что требует проведение ряда повторных ПЦР амплификаций.d) The reagents used in DNA extraction and the components that make up the extraction object can strongly inhibit PCR amplification, which requires a series of repeated PCR amplifications.

д) Использование различных реагентов, высокоэффективных приборов и праймеров для ПЦР, повышает стоимость анализа.d) The use of various reagents, high-performance devices and primers for PCR, increases the cost of analysis.

е) ПЦР является высокочувствительным методом, поэтому при наличии ДНК, случайно попавшей из одной реакционной смеси в другую, могут быть получены ложноположительные результаты. Это заставляет тщательно контролировать все используемые для ПЦР растворы и посуду.f) PCR is a highly sensitive method, therefore, in the presence of DNA that accidentally gets from one reaction mixture to another, false-positive results can be obtained. This forces careful monitoring of all solutions and utensils used for PCR.

Существуют способы дифференцированного определения бактерий с помощью иммунологических методов, в частности применения антител, высокоспецифичных по отношению к бактериям определенного типа. Так, известен способ селективного определения общего количества анаэробных бактериальных клеток B.vulgatus и B.distasonis, присутствующих в фекальной системе человека [G.Corthier, M.C.Muller, R.L'Haridon, Selective enumeration of Bacteroides vulgatus and B.distasonis organisms in the predominant human fecal flora by using monoclonal antibodies.// Appl. Environ. Microbiol, 1996, V.62, p.735-738]. Способ основан на использовании моноклональных антител к этим клеткам, которые не реагируют с другими клетками рода Bacteroides. Согласно способу, пробы фекальной системы инкубируют в питательной среде (мясопептонный агар) в течение 3 суток при 37°С, далее клетки приводят в контакт с моноклональными антителами. Клетки, реагирующие с антителами, окрашиваются в голубой цвет, что позволяет селективно вести их подсчет на отпечатках, снятых с поверхности чашек Петри с помощью специальных фильтров. Метод позволяет определять клетки, присутствующие в образце в концентрации 10³-10⁹ кл/г фекалий. Общая длительность анализа составляет 4-5 суток.There are methods for the differential determination of bacteria using immunological methods, in particular the use of antibodies highly specific in relation to bacteria of a certain type. Thus, a method is known for selectively determining the total number of anaerobic bacterial cells of B. vulgatus and B. distasonis present in the human fecal system [G. Corthier, MC Muller, R. L'Haridon, Selective enumeration of Bacteroides vulgatus and B. distasonis organisms in the predominant human fecal flora by using monoclonal antibodies.// Appl. Environ. Microbiol, 1996, V.62, p.735-738]. The method is based on the use of monoclonal antibodies to these cells that do not react with other cells of the genus Bacteroides. According to the method, samples of the fecal system are incubated in a nutrient medium (meat peptone agar) for 3 days at 37 ° C, then the cells are brought into contact with monoclonal antibodies. Cells that react with antibodies are stained blue, which makes it possible to selectively count them on prints taken from the surface of Petri dishes using special filters. The method allows you to determine the cells present in the sample at a concentration of 10 ³ -10 ⁹ cells / g feces. The total duration of the analysis is 4-5 days.

Способы дифференцированного определения численности клеток с помощью иммунологических методов, в том числе и рассмотренный, имеют несколько существенных недостатков, главным из которых является неуниверсальность этих способов и необходимость предварительного получения высоко специфичных моноклональных антител для каждого определяемого типа бактерий, что делает сами методы очень дорогими, а область их возможного применения очень узкой.The methods for differentially determining the number of cells using immunological methods, including the one considered, have several significant drawbacks, the main of which is the non-universality of these methods and the need to first obtain highly specific monoclonal antibodies for each determined type of bacteria, which makes the methods themselves very expensive, and the scope of their possible application is very narrow.

Известен метод дифференцированного определения численности микробных клеток в септической крови в присутствии соматических клеток, основанный на определении АТФ биолюминесцентным методом [В.Г.Фрунджян, Л.Ю.Бровко, М.А.Карабасова, Н.Н.Угарова, Биолюминесцентный метод определения антибиотикочувствительности микробных клеток в септической крови. // Прикл. Биохим. Микробиол., 1997, Т.33, №4, с.455-460]. Согласно методу, дифференцируют бактериальный и немикробный (свободный и соматический) АТФ путем обработки образцов 0,1 М раствором перийодата натрия в 5% Тритоне Х-100, в результате которой свободный и находящийся в соматичеких клетках АТФ разрушается. АТФ из бактериальных клеток экстрагируют диметилсульфоксидом (ДМСО). Обе операции проводят последовательно со строгим соблюдением временного регламента.The known method of differentially determining the number of microbial cells in septic blood in the presence of somatic cells, based on the determination of ATP by the bioluminescent method [V.G. Frunjyan, L.Yu. Brovko, M.A. Karabasova, N.N. Ugarova, Bioluminescent method for determining antibiotic sensitivity microbial cells in septic blood. // adj. Biochem. Microbiol., 1997, T.33, No. 4, p. 454-460]. According to the method, bacterial and non-microbial (free and somatic) ATP are differentiated by treating samples with a 0.1 M sodium periodate solution in 5% Triton X-100, as a result of which free and ATP located in somatic cells is destroyed. ATP from bacterial cells is extracted with dimethyl sulfoxide (DMSO). Both operations are carried out sequentially with strict observance of the time limit.

Согласно методу, первоначально из образца крови, содержащего клетки бактерий E.coli, удаляют немикробный АТФ. С этой целью проводят гемолиз, а именно кровь разбавляют в 25 раз водой и инкубируют 30 мин при комнатной температуре, затем восстанавливают осмомолярность, добавляя в равный объем среды удвоенную концентрацию компонентов LB-среды (Serva, Германия). Далее проводят культивирование пробы на качалке при 37°С в течение 5 часов, отбирают аликвоту (0,1 мл), добавляют к ней 0,01 мл 10 мМ раствора NaIO₄ в 0,5%-ном Тритоне Х-100, встряхивают в течение 1 мин, затем вносят 0,9 мл ДМСО. В полученном экстракте биолюминесцентным методом определяют концентрацию АТФ. По калибровочным зависимостям определяют концентрацию клеток в среде de facto. Общее время эксперимента составляет 6-7 часов.According to the method, initially non-microbial ATP is removed from a blood sample containing E. coli bacteria cells. To this end, hemolysis is performed, namely, the blood is diluted 25 times with water and incubated for 30 minutes at room temperature, then osmolarity is restored, adding to the equal volume of the medium a double concentration of LB-medium components (Serva, Germany). Next, the sample is cultured on a rocking chair at 37 ° C for 5 hours, an aliquot (0.1 ml) is taken, 0.01 ml of a 10 mM NaIO ₄ solution in 0.5% Triton X-100 is added to it, shaken in for 1 min, then add 0.9 ml of DMSO. In the obtained extract, the ATP concentration is determined by the bioluminescent method. The calibration dependences determine the concentration of cells in the medium de facto. The total experiment time is 6-7 hours.

Данное техническое решение, как наиболее близкое к заявляемому по типу используемого подхода к дифференцированному количественному определению численности клеток в образце, содержащем бактериальные клетки, принято в качестве прототипа.This technical solution, as the closest to the claimed type of approach used to differentiated quantitative determination of the number of cells in a sample containing bacterial cells, was adopted as a prototype.

Несмотря на высокую точность метода, прототип не позволяет дифференцировать разные виды бактерий, присутствующие в смеси, а только определять общую численность бактерий в присутствии соматических клеток. При этом численность бактерий, определяемая, согласно прототипу, в среде для подращивания клеток, отражает количество клеток, фактически выросших в среде, и позволяет весьма условно судить об исходной концентрации клеток в образце, а не количественно определять ее.Despite the high accuracy of the method, the prototype does not allow differentiating different types of bacteria present in the mixture, but only determining the total number of bacteria in the presence of somatic cells. Moreover, the number of bacteria, determined, according to the prototype, in the medium for growing cells, reflects the number of cells actually grown in the medium, and allows you to very arbitrarily judge the initial concentration of cells in the sample, and not quantify it.

Задачей предлагаемого изобретения является создание способа дифференцированного определения численности бактерий разных таксономических групп в смешанных культурах.The task of the invention is to provide a method for differentially determining the number of bacteria of different taxonomic groups in mixed cultures.

Поставленная задача решается тем, что применяется определенная последовательность действий, предусматривающая высев образцов смешанных культур в жидкие селективные питательные среды, определение численности клеток биолюминесцентным методом, накапливающихся в средах в ходе роста бактерий, с последующей математической обработкой кинетических данных роста индивидуальных бактериальных культур.The problem is solved by the fact that a certain sequence of actions is applied, providing for the seeding of samples of mixed cultures in liquid selective nutrient media, the determination of the number of cells by the bioluminescent method, which accumulate in the media during the growth of bacteria, followed by mathematical processing of the kinetic data of the growth of individual bacterial cultures.

Предлагаемый способ сочетает в себе микробиологические приемы работы с клетками при использовании селективных сред роста, биолюминесцентный метод анализа АТФ, позволяющий достоверно оценить численность клеток в образцах, а также стандартные математические методы обработки кинетических данных.The proposed method combines microbiological techniques for working with cells using selective growth media, a bioluminescent method of ATP analysis, which allows to reliably estimate the number of cells in the samples, as well as standard mathematical methods for processing kinetic data.

Применение селективных сред, предназначенных для роста клеток одной определенной таксономической группы, позволяет осуществлять культивирование и дифференциацию целевых видов бактерий.The use of selective media intended for the growth of cells of one particular taxonomic group allows cultivation and differentiation of target bacterial species.

Применение биолюминесцентного метода определения концентрации внутриклеточного АТФ для определения численности клеток обеспечивает экспрессность и высокую точность определения, что существенно сокращает время дифференцированного количественного анализа.The use of the bioluminescent method for determining the concentration of intracellular ATP for determining the number of cells provides expressivity and high accuracy of determination, which significantly reduces the time of differentiated quantitative analysis.

Экспериментальные данные биолюминесцентного исследования линеаризуются математическими методами с целью определения начальной концентрации отдельных видов клеток в смешанной культуре.The experimental data of a bioluminescent study are linearized by mathematical methods to determine the initial concentration of individual types of cells in a mixed culture.

Способ дифференцированного определения численности бактерий в смешанных культурах включает следующие стадии.The method of differentially determining the number of bacteria in mixed cultures includes the following stages.

- Высев образцов смешанных культур в жидкие селективные питательные среды.- Sowing samples of mixed cultures in liquid selective culture media.

Это проводится известными приемами, а именно готовят стерильные селективные питательные среды роста определенного состава, необходимого для роста бактерий, численность которых необходимо определить в смешанных культурах. Далее в каждую емкость со средой инокулируют аликвоту жидкого образца исследуемой смешанной культуры.This is carried out by well-known methods, namely, sterile selective growth media of a certain composition are required that are necessary for the growth of bacteria, the number of which must be determined in mixed cultures. Then, an aliquot of a liquid sample of the investigated mixed culture is inoculated into each container with medium.

- Определение численности клеток биолюминесцентным методом.- Determination of cell numbers by bioluminescent method.

Это осуществляется путем проведения культивирования клеток в условиях (например, температура, аэрация среды, наличие анаэробных условий и др.), которые зависят от специфических характеристик роста клеток, принадлежащих к определяемой группе бактерий, и являются оптимальными. В процессе роста клеток производят отбор проб культуральной жидкости, начиная с момента инокуляции анализируемых проб. Культивирование клеток осуществляют до достижения ими конца логарифмической фазы роста. Для экстракции внутриклеточного АТФ из клеток, присутствующих в пробах, используется экстрагирующий агент. Определение концентрации АТФ проводят с применением препарата иммобилизованной люциферазы светляков.This is accomplished by culturing cells under conditions (for example, temperature, aeration of the medium, the presence of anaerobic conditions, etc.), which depend on the specific characteristics of the growth of cells belonging to a defined group of bacteria and are optimal. In the process of cell growth, culture fluid samples are taken, starting from the moment of inoculation of the analyzed samples. The cells are cultured until they reach the end of the logarithmic growth phase. An extracting agent is used to extract intracellular ATP from cells present in the samples. Determination of ATP concentration is carried out using the preparation of immobilized firefly luciferase.

- Математическая обработка кинетических данных роста индивидуальных бактериальных культур.- Mathematical processing of kinetic data on the growth of individual bacterial cultures.

По данным биолюминесцентного анализа строят кинетические кривые роста клеток бактерий, дифференцированных при их культивировании в разных селективных средах. Для определения начальной концентрации каждого вида в смешанной культуре проводят линеаризацию кинетических кривых роста математическими методами анализа [Варфоломеев С.Д., Калюжный С.В. Биотехнология - кинетические основы микробиологических процессов. - М.: Изд-во "Выс. школа", 1990, стр.52-78]. Полученные линеаризованные кинетические кривые роста экстраполируют до начального момента клеточного роста и далее рассчитывают концентрацию бактерий каждой таксономической группы в исследуемой смешанной культуре.According to bioluminescent analysis, kinetic growth curves of bacterial cells are constructed that are differentiated during their cultivation in different selective media. To determine the initial concentration of each species in a mixed culture, linearize the kinetic growth curves using mathematical methods of analysis [Varfolomeev SD, Kalyuzhny SV Biotechnology - the kinetic basis of microbiological processes. - M .: Publishing house "High School", 1990, p. 52-78]. The obtained linearized kinetic growth curves are extrapolated to the initial moment of cell growth and then the concentration of bacteria of each taxonomic group in the mixed culture is calculated.

Существенным отличием заявляемого изобретения является новое сочетание последовательно выполняемых действий и применяемых методов анализа (а именно микробиологического, биолюминесцентного и математического, т.е. культивирование аликвот смешанной культуры в селективных средах, количественный биолюминесцентный анализ концентраций внутриклеточного АТФ, построение кинетических кривых роста и последующая математическая обработка данных) для дифференцированного количественного определения бактерий разных таксономических групп, присутствующих исходно в одном образце в смеси, которое ранее не было известно.A significant difference of the claimed invention is a new combination of sequentially performed actions and applied analysis methods (namely, microbiological, bioluminescent and mathematical, i.e. culturing aliquots of mixed culture in selective media, quantitative bioluminescent analysis of intracellular ATP concentrations, construction of kinetic growth curves and subsequent mathematical processing data) for differentiated quantitative determination of bacteria of different taxonomic groups, with absent initially in one sample in a mixture that was not previously known.

Ниже приводятся конкретные примеры, иллюстрирующие заявляемый способ.The following are specific examples illustrating the claimed method.

Пример 1. Дифференцированное определение численности бактерий в модельной смешанной культуре.Example 1. Differentiated determination of the number of bacteria in a model mixed culture.

А. Микробиологическое определение численности клеток в образце (контроль).A. Microbiological determination of the number of cells in the sample (control).

В составе сточных вод нефтедобывающей промышленности присутствуют бактерии - представители разных таксономических групп, в частности гетеротрофные кислотообразующие, сульфатредуцирующие и железоокисляющие бактерии [V.P. Kholodenko, S.K. Jigletsova, Chemico-Microbiological Diagnosis of Stress Corrosion Cracking of Pipelines.// Appl. Biochem.Microbiol, 2000, V.36, p.685-693].The wastewater of the oil industry contains bacteria - representatives of different taxonomic groups, in particular heterotrophic acid-forming, sulfate-reducing and iron-oxidizing bacteria [V.P. Kholodenko, S.K. Jigletsova, Chemico-Microbiological Diagnosis of Stress Corrosion Cracking of Pipelines.// Appl. Biochem. Microbiol, 2000, V.36, p. 685-693].

Образец смешанных культур бактериальных клеток готовят путем суспендирования в физиологическом растворе клеток Pseudomonas putida, Desulfovibrio vulgaris и Acidithiobacillus ferrooxidans, являющихся представителями указанных выше групп бактерий, так, чтобы их конечные концентрации в смеси были (1,6±0,6)×10⁶, 10⁶ и 10⁴ кл/мл, соответственно. Эти концентрации клеток в полученной смеси определяют микробиологическим методом, а именно берут аликвоту (1 мл) смеси клеток, готовят 7-8 последовательных 10-кратных разведений этой пробы в физиологическом растворе и высевают каждое разведение по 0,1 мл на чашки Петри со Средой №1 и по 1 мл в пробирки со Средами №2 и 3 (по 9 мл) следующего состава:A sample of mixed cultures of bacterial cells is prepared by suspending Pseudomonas putida, Desulfovibrio vulgaris and Acidithiobacillus ferrooxidans, which are representatives of the above bacterial groups, in physiological saline, so that their final concentration in the mixture is (1.6 ± 0.6) × 10 ⁶ , 10 ⁶ and 10 ⁴ cells / ml, respectively. These cell concentrations in the resulting mixture are determined by the microbiological method, namely, an aliquot (1 ml) of the cell mixture is taken, 7-8 consecutive 10-fold dilutions of this sample are prepared in physiological saline, and each dilution of 0.1 ml is plated on Petri dishes with Medium No. 1 and 1 ml in test tubes with Wednesdays No. 2 and 3 (9 ml) of the following composition:

Среда №1 (г/л): пептон - 10,0; глюкоза - 5,0; дрожжевой экстракт - 11,0; Nacl - 5,0; агар - 15,0; рН 6,8-7,0.Wednesday No. 1 (g / l): peptone - 10.0; glucose - 5.0; yeast extract - 11.0; Nacl - 5.0; agar - 15.0; pH 6.8-7.0.

Среда №2 (г/л): лактат - 4,0; дрожжевой экстракт - 1,0; аскорбиновая кислота - 0,1; MgSO₄×7H₂О - 0,2; К₂НРО₄ - 0,01; Fe(SO₄)₂(NH₄)₂×6H₂О - 0,2; NaCl - 10,0; рН 6,8-7,0.Wednesday No. 2 (g / l): lactate - 4.0; yeast extract - 1.0; ascorbic acid - 0.1; MgSO ₄ × 7H ₂ O 0.2; To ₂ NRA ₄ - 0.01; Fe (SO ₄ ) ₂ (NH ₄ ) ₂ × 6H ₂ O — 0.2; NaCl - 10.0; pH 6.8-7.0.

Среда №3 (г/л): KCl - 0,1; К₂HPO₄ - 0,5; MgSO₄×7H₂O - 0,5; Са(NO₃)₂ - 0,01; Fe(SO₄)₂(NH₄)₂×6H₂O - 63,0; H₂SO₄ (10 M) - 1 мл, рН 2,7-3,5.Wednesday No. 3 (g / l): KCl - 0.1; K ₂ HPO ₄ - 0.5; MgSO ₄ × 7H ₂ O - 0.5; Ca (NO ₃ ) ₂ - 0.01; Fe (SO ₄ ) ₂ (NH ₄ ) ₂ × 6H ₂ O - 63.0; H ₂ SO ₄ (10 M) - 1 ml, pH 2.7-3.5.

Для роста клеток Ps.putida и Ac. ferrooxidans инокулированные Среды №1 и №3, соответственно, инкубируют при 28°С в аэробных условиях, а для роста клеток D. vulgaris Среду №2 - в анаэробных условиях при той же температуре.For cell growth, Ps.putida and Ac. ferrooxidans inoculated Mediums No. 1 and No. 3, respectively, are incubated at 28 ° C under aerobic conditions, and for growth of D. vulgaris cells, Medium No. 2 under anaerobic conditions at the same temperature.

Через 11 дней отмечают последнее разведение, инокулированное в питательные Среды №2 и 3 и давшее рост, проявляющийся в появлении характерной мутности, а на Среде №1 подсчитывают число выросших колониеобразующих единиц. Исходные концентрации отдельных клеток получают, учитывая все предыдущие разбавления исходной пробы смешанных клеток. Общее время анализа составляет 12 суток.After 11 days, the last dilution was noted, which was inoculated in nutrient media No. 2 and 3 and gave rise, which is manifested in the appearance of a characteristic turbidity, and on Wednesday No. 1, the number of colony forming units grown is calculated. Initial concentrations of individual cells are obtained, taking into account all previous dilutions of the original sample of mixed cells. The total analysis time is 12 days.

Б. Определение численности клеток в образце по заявляемому способу.B. Determination of the number of cells in the sample by the present method.

- Высев и культивирование образцов смешанных культур в жидких селективных питательных средах.- Sowing and cultivation of samples of mixed cultures in liquid selective nutrient media.

Берут аликвоты (по 0,5 мл) и высевают в жидкие питательные Среды №2, 3 и 4 (по 4, 5 мл). Среда №4 имеет тот же состав, что и Среда №1, но без агара. Культивирование образцов на Средах №3 и 4 проводят при 28°С в аэробных условиях, а на Среде №2 - в анаэробных условиях при той же температуре. Время культивирования составляет 86 ч. Селективные среды обеспечивают подавляющий рост клеток одного типа бактерий, для которого среды являются специфическими.Aliquots are taken (0.5 ml each) and plated in liquid nutrient media No. 2, 3 and 4 (4.5 ml each). Wednesday No. 4 has the same composition as Wednesday No. 1, but without agar. Cultivation of samples on Wednesdays No. 3 and 4 is carried out at 28 ° C under aerobic conditions, and on Wednesday No. 2 under anaerobic conditions at the same temperature. The cultivation time is 86 hours. Selective media provide the inhibitory growth of cells of one type of bacteria for which the media are specific.

В процессе культивирования образцов на разных селективных средах периодически отбирают пробы культуральной жидкости (по 0,1 мл) для определения в них общей концентрации АТФ. Для этого к взятой пробе добавляют 0,9 мл ДМСО, затем в полученный раствор (50 мкл) добавляют люциферин-люциферазный реагент (50 мкл), содержащий иммобилизованную люциферазу светляков, D-люциферин, соли магния, стабилизаторы и компоненты буферного раствора, и измеряют интенсивность биолюминесценции с помощью биолюминометра. Время анализа составляет 1 мин. Определение концентрации АТФ в пробе проводят по калибровочной зависимости интенсивности свечения от концентрации АТФ, полученной при использовании стандартных растворов АТФ со строго известной концентрацией вещества. Расчет численности клеток в каждой пробе, взятой в процессе роста клеток, производят при использовании известной средней величины удельной концентрации АТФ в одной клетке. Данный параметр является постоянным на протяжении всего жизненного цикла клетки и имеет строго определенную величину, характерную для каждого типа клеток. Например, для клеток Ps. putida, D. vulgaris и Ac.ferrooxidans величина удельной концентрации АТФ составляет, соответственно, (1,0±0,1)×10^-16, (5,2±0,3)×10^-18 и (2,7±0,4)×10^-16 моль/кл.During the cultivation of samples on different selective media, culture fluid samples (0.1 ml each) are periodically taken to determine the total ATP concentration in them. To this end, 0.9 ml of DMSO is added to the sample taken, then luciferin-luciferase reagent (50 μl) containing immobilized firefly luciferase, D-luciferin, magnesium salts, stabilizers and buffer solution components are added to the resulting solution (50 μl), and measured the intensity of bioluminescence using a bioluminometer. Analysis time is 1 min. Determination of the concentration of ATP in the sample is carried out according to the calibration dependence of the luminous intensity on the concentration of ATP obtained using standard ATP solutions with a strictly known concentration of the substance. The calculation of the number of cells in each sample taken in the process of cell growth is carried out using a known average value of the specific concentration of ATP in one cell. This parameter is constant throughout the entire life cycle of the cell and has a strictly defined value characteristic of each type of cell. For example, for Ps cells. putida, D. vulgaris and Ac.ferrooxidans, the specific ATP concentration is, respectively, (1.0 ± 0.1) × 10 ^-16 , (5.2 ± 0.3) × 10 ^-18 and (2.7 ± 0.4) × 10 ^-16 mol / cell

По данным, полученным в результате измерения общей концентрации АТФ в образцах и пересчитанным на концентрацию клеток, соответствующую определенному времени культивирования, строят кинетическую кривую роста клеток. Далее проводят линеаризацию экспоненциальных фаз кривых роста смешанных клеток на селективных средах, рассчитывая натуральный логарифм полученных концентраций клеток. Точка пересечения прямой, проведенной через полученные точки на графике в полулогарифмических координатах, определяет исходную концентрацию клеток строго определенного типа бактерий, исходно присутствовавших в смеси. Далее учитывают все разведения исходной пробы и получают исходную концентрацию каждой индивидуальной культуры в смеси. Фиг.1 (а, б, с) иллюстрирует типичные результаты линеаризации экспоненциальных фаз роста клеток на селективных средах. В Табл. 1 приведены исходные концентрации клеток, определенные согласно заявляемому методу. Время проведения всего анализа составляет 4 суток.According to the data obtained by measuring the total concentration of ATP in the samples and recalculated for the cell concentration corresponding to a specific cultivation time, a kinetic curve of cell growth is constructed. Next, linearize the exponential phases of the growth curves of mixed cells on selective media, calculating the natural logarithm of the obtained cell concentrations. The point of intersection of the straight line drawn through the points on the graph in semi-logarithmic coordinates determines the initial concentration of cells of a strictly defined type of bacteria that were originally present in the mixture. Then, all dilutions of the initial sample are taken into account and the initial concentration of each individual culture in the mixture is obtained. Figure 1 (a, b, c) illustrates typical results of the linearization of exponential phases of cell growth on selective media. In Tab. 1 shows the initial cell concentration determined according to the claimed method. The entire analysis takes 4 days.

Пример 2. Дифференцированное определение, численности бактерий в модельной смешанной культуре.Example 2. Differentiated determination of the number of bacteria in a model mixed culture.

Образец смешанных культур бактериальных клеток готовят с использованием тех же клеток (Pseudomonas putida, Desulfovibrio vulgaris и Acidithiobacillus ferrooxidans), что и в Примере 1. Их конечные концентрации в смеси составляют (4,3±0,6)×10⁶, 10⁵ и 10³ кл/мл, соответственно. Эти концентрации клеток в смесях определяют микробиологическим методом так же, как в Примере 1. Общее время анализа составляет 12 суток.A sample of mixed cultures of bacterial cells is prepared using the same cells (Pseudomonas putida, Desulfovibrio vulgaris and Acidithiobacillus ferrooxidans) as in Example 1. Their final concentration in the mixture is (4.3 ± 0.6) × 10 ⁶ , 10 ⁵ and 10 ³ cells / ml, respectively. These cell concentrations in the mixtures are determined by the microbiological method in the same way as in Example 1. The total analysis time is 12 days.

Б. Определение численности клеток в образце по заявляемому способу проводят так же, как и в Примере 1.B. The determination of the number of cells in the sample by the present method is carried out in the same way as in Example 1.

Полученные данные представлены в Табл. 1. Время проведения всего анализа составляет 4 суток.The data obtained are presented in Table. 1. The time for the entire analysis is 4 days.

Пример 3. Дифференцированное определение численности бактерий в модельной смешанной культуре.Example 3. Differentiated determination of the number of bacteria in a model mixed culture.

Образец смешанных культур бактериальных клеток готовят с использованием тех же клеток что и в Примере 1, а именно Pseudomonas putida, Desulfovibrio vulgaris, но вместо Acidithiobacillus ferrooxidans вводят клетки Rhodococcus erythropolis, широко распрастраненные в почве и способные осуществлять высокоэффективную биодеградацию углеводородов нефти [Т.В.Коронелли, Е.Д.Нестерова, Экологическая стратегия бактерий, использующих гидрофобный субстрат.// Микробиол., 1990, Т.59, с.993-997]. Их конечные концентрации в смеси составляют (1,3±0,6)×10², 10⁴ и 10³ кл/мл, соответственно. Эти концентрации клеток в полученной смеси определяют микробиологическим методом, а именно берут аликвоту (1 мл) смеси клеток, готовят 7-8 последовательных 10-кратных разведений этой пробы в физиологическом растворе и высевают каждое разведение по 0,1 мл на чашки Петри со Средами №1 и 5 и по 1 мл в пробирки со Средой №2 (по 9 мл).A sample of mixed cultures of bacterial cells was prepared using the same cells as in Example 1, namely, Pseudomonas putida, Desulfovibrio vulgaris, but instead of Acidithiobacillus ferrooxidans, Rhodococcus erythropolis cells widely distributed in the soil and capable of highly efficient biodegradation of petroleum B. are introduced [T. Coronelli, ED Nesterova, Ecological strategy of bacteria using a hydrophobic substrate. // Mikrobiol., 1990, V. 59, p. 993-997]. Their final concentration in the mixture is (1.3 ± 0.6) × 10 ² , 10 ⁴ and 10 ³ cells / ml, respectively. These cell concentrations in the resulting mixture are determined by the microbiological method, namely, an aliquot (1 ml) of the cell mixture is taken, 7-8 consecutive 10-fold dilutions of this sample are prepared in physiological saline, and each dilution of 0.1 ml is plated on Petri dishes with Medium No. 1 and 5 and 1 ml in test tubes with Wednesday No. 2 (9 ml each).

Состав Сред №1 и 2 такой же, как в Примере 1.The composition of Environments No. 1 and 2 is the same as in Example 1.

Среда №5 имеет следующий состав (г/л): нефть - 5,0; агар - 15,0; NaCl - 5,0; KH₂PO₄ - 3,0; Na₂CO₃ - 0,1; К₂НРО₄ - 6,0; NH₄Cl - 2,0; MgSO₄×7H₂O - 0,2; CaCl₂×6Н₂О - 0,01; MnSO₄×5H₂O - 0,02; FeSO₄×7Н₂O - 0,01; рН 6,7-7,2.Wednesday No. 5 has the following composition (g / l): oil - 5.0; agar - 15.0; NaCl - 5.0; KH ₂ PO ₄ - 3.0; Na ₂ CO ₃ - 0.1; K ₂ NRA ₄ - 6.0; NH ₄ Cl - 2.0; MgSO ₄ × 7H ₂ O 0.2; CaCl ₂ × 6H ₂ O — 0.01; MnSO ₄ × 5H ₂ O - 0.02; FeSO ₄ × 7H ₂ O — 0.01; pH 6.7-7.2.

Для роста клеток Ps.putida и Rh.erythropolis инокулированные Среды №1 и №5, соответственно, инкубируют при 28°С в аэробных условиях, а для роста клеток D. vulgaris Среду №2 - в анаэробных условиях при той же температуре.For growth of Ps.putida and Rh.erythropolis cells, inoculated Mediums No. 1 and No. 5, respectively, are incubated at 28 ° C under aerobic conditions, and for cell growth of D. vulgaris Medium No. 2, under anaerobic conditions at the same temperature.

Через 14 дней отмечают последнее разведение, инокулированное в питательную Среду №2 и давшее рост, проявляющийся в появлении характерной мутности, а на Среде №1 и 5 подсчитывают число выросших колониеобразующих единиц. Исходные концентрации отдельных клеток получают, учитывая все предыдущие разбавления исходной пробы смешанных клеток. Общее время анализа составляет 15 суток.After 14 days, the last dilution was noted, which was inoculated into Nutrient Medium No. 2 and gave rise, which manifests itself in the appearance of a characteristic turbidity, and on Medium No. 1 and 5, the number of colony forming units grown is counted. Initial concentrations of individual cells are obtained, taking into account all previous dilutions of the original sample of mixed cells. The total analysis time is 15 days.

Берут аликвоты (по 0,5 мл) и высевают сразу же в жидкие питательные среды №2, 4 и 6 (по 4, 5 мл).Aliquots are taken (0.5 ml each) and seeded immediately in liquid nutrient media No. 2, 4 and 6 (4.5 ml each).

Среда №6 имеет тот же состав, что и Среда №5, но без агара. Культивирование образцов на средах №4 и 6 проводили при 28°С в аэробных условиях, а на среде №2 - в анаэробных условиях при той же температуре. Время культивирования составляет 120 ч. Селективные среды обеспечивают подавляющий рост одного типа клеток, для которого среды являются специфическими.Wednesday No. 6 has the same composition as Wednesday No. 5, but without agar. Cultivation of samples on media No. 4 and 6 was carried out at 28 ° C under aerobic conditions, and on medium No. 2 under anaerobic conditions at the same temperature. The cultivation time is 120 hours. Selective media provide the inhibitory growth of one type of cell for which the media are specific.

- Определение численности клеток Pseudomonas putida и Desulfovibrio vulgaris биолюминесцентным методом проводят так же, как в Примере 1.- Determination of the number of cells of Pseudomonas putida and Desulfovibrio vulgaris bioluminescent method is carried out as in Example 1.

Для определения численности клеток Rh. erythropolis в процессе культивирования на Среде №6 периодически отбирают пробы культуральной жидкости (по 0,1 мл) для проведения биолюминесцентного анализа содержащейся в них общей концентрации АТФ. К взятой пробе добавляют 0,5 мл хлороформа, далее интенсивно перемешивают в течение 3 мин, добавляют 0,5 мл 0,1 М трис-ацетатного буфера, смесь вновь интенсивно встряхивают и после расслоения фаз 50 мкл водной фазы вносят в кювету люминометра, содержащую 50 мкл люциферазного реагента. Время анализа составляет 1 мин. Далее определение концентрации АТФ в пробе проводят по калибровочной зависимости интенсивности свечения от концентрации АТФ, полученной при использовании стандартных растворов АТФ со строго известной концентрацией вещества. Расчет численности клеток в каждой пробе, взятой в процессе роста клеток, производят с учетом известной средней величины удельной концентрации АТФ в одной клетке, которая для клеток Rh. erythropolis составляет (2,2±0,1)×10^-17 моль/кл.To determine the number of cells Rh. erythropolis during cultivation on Wednesday No. 6 periodically take samples of the culture fluid (0.1 ml each) for bioluminescent analysis of the total concentration of ATP contained in them. 0.5 ml of chloroform is added to the sample taken, then intensively stirred for 3 minutes, 0.5 ml of 0.1 M Tris-acetate buffer is added, the mixture is again vigorously shaken, and after phase separation, 50 μl of the aqueous phase is added to the luminometer cuvette containing 50 μl of luciferase reagent. Analysis time is 1 min. Further, the determination of the concentration of ATP in the sample is carried out according to the calibration dependence of the luminous intensity on the concentration of ATP obtained using standard ATP solutions with a strictly known concentration of the substance. The calculation of the number of cells in each sample taken in the process of cell growth is made taking into account the known average value of the specific concentration of ATP in one cell, which for Rh cells. erythropolis is (2.2 ± 0.1) × 10 ^-17 mol / cell.

Математическую обработку кинетических данных роста индивидуальных бактериальных культур проводят, как в Примере 1. Полученные данные представлены в Табл. 1. Время проведения всего анализа составляет 5 суток.Mathematical processing of the kinetic data of the growth of individual bacterial cultures is carried out as in Example 1. The data obtained are presented in Table. 1. The time for the entire analysis is 5 days.

Пример 4. Дифференцированное определение численности бактерий в смешанной культуре, содержащейся в реальных сточных водах нефтяного месторождения.Example 4. Differentiated determination of the number of bacteria in a mixed culture contained in real wastewater of an oil field.

Берут аликвоту (1 мл) образца сточной воды на нефтяном месторождении, готовят 7-8 последовательных 10-кратных разведений этой пробы в физиологическом растворе и высевают каждое разведение по 0,1 мл на чашки Петри со Средами №1 и 5 и по 1 мл в пробирки со Средами №2 и 3 (по 9 мл), составы которых указаны в Примерах 1 и 3, необходимых для обнаружения бактериальных клеток родов Pseudomonas, Desulfovibrio, Acidithiobacillus и Rhodococcus.An aliquot (1 ml) of a sample of wastewater from an oil field is taken, 7-8 consecutive 10-fold dilutions of this sample are prepared in physiological saline, and each dilution of 0.1 ml is plated on Petri dishes with Media No. 1 and 5 and 1 ml each. tubes with Media No. 2 and 3 (9 ml each), the compositions of which are indicated in Examples 1 and 3, necessary for the detection of bacterial cells of the genera Pseudomonas, Desulfovibrio, Acidithiobacillus and Rhodococcus.

Культивирование клеток в селективных Средах №1, 3 и 5 проводят при 28°С в аэробных условиях, а культивирование клеток в Среде №2 - в анаэробных условиях при той же температуре.Cell cultivation in selective media No. 1, 3 and 5 is carried out at 28 ° C under aerobic conditions, and cell cultivation in medium No. 2 is carried out under anaerobic conditions at the same temperature.

Через 15 дней отмечают последнее разведение, инокулированное в питательные Среды №2 и 3 и давшее рост, проявляющийся в появлении характерной мутности, а на Средах №1 и 5 подсчитывают число выросших колониеобразующих единиц. Исходные концентрации отдельных клеток получают, учитывая все предыдущие разбавления исходной пробы смешанных клеток, а также считая, что для клеток родов Pseudomonas, Desulfovibrio, Acidithiobacillus и Rhodococcus являются селективными, соответственно, Среды №1, 2, 3 и 5. Полученные данные приведены в Табл. 1. Общее время анализа составляет 16 суток.After 15 days, the last dilution was noted, inoculated into nutrient media No. 2 and 3 and giving rise, which is manifested in the appearance of a characteristic turbidity, and on Wednesdays No. 1 and 5, the number of colony forming units grown is calculated. Initial concentrations of individual cells are obtained, taking into account all previous dilutions of the original sample of mixed cells, and also assuming that for cells of the genera Pseudomonas, Desulfovibrio, Acidithiobacillus and Rhodococcus are selective, respectively, Environments No. 1, 2, 3 and 5. The data obtained are shown in Table . 1. The total analysis time is 16 days.

Берут аликвоты (по 0,5 мл) и высевают сразу же в жидкие питательные Среды №2, 3, 4 и 6 (по 4, 5 мл). Составы селективных Сред те же, что в Примерах 1 и 3. Культивирование образцов на Средах №3, 4 и 6 проводят при 28 С в аэробных условиях, а на Среде №2 - в анаэробных условиях при той же температуре. Время культивирования составляет 120 ч. Селективные среды обеспечивают подавляющий рост одного типа клеток, для которого среды являются специфическими.Aliquots are taken (0.5 ml each) and seeded immediately in liquid nutrient media No. 2, 3, 4 and 6 (4, 5 ml each). The compositions of the selective media are the same as in Examples 1 and 3. Cultivation of the samples on Wednesdays No. 3, 4 and 6 is carried out at 28 ° C under aerobic conditions, and on Medium No. 2 under anaerobic conditions at the same temperature. The cultivation time is 120 hours. Selective media provide the inhibitory growth of one type of cell for which the media are specific.

- Определение численности клеток биолюминесцентным методом и математическую обработку кинетических данных роста индивидуальных бактериальных культур проводят так же, как описано в Примере 1 и 3 с учетом тех величин удельной концентрации АТФ для клеток родов Pseudomonas, Desulfovibrio, Acidithiobacillus и Rhodococcus, которые приведены в Примерах 1 и 3. Полученные данные представлены в Табл. 1. Время проведения всего анализа составляет 5 суток.- The determination of the number of cells by the bioluminescent method and mathematical processing of the kinetic data of the growth of individual bacterial cultures is carried out as described in Example 1 and 3, taking into account the values of the specific concentration of ATP for cells of the genera Pseudomonas, Desulfovibrio, Acidithiobacillus and Rhodococcus, which are shown in Examples 1 and 3. The data obtained are presented in Table. 1. The time for the entire analysis is 5 days.

Пример 5. Дифференцированное определение численности бактерий в смешанной культуре, присутствующей в составе коррозионных биопленок.Example 5. Differentiated determination of the number of bacteria in a mixed culture present in the composition of corrosive biofilms.

Биопленки, образующиеся на поверхности металлических конструкций, вызывают развитие биокоррозии на местах их формирования. Биопленки представляют собой адгезированные на твердой поверхности смешанные культуры, в состав которых входят гетеротрофные кислотообразующие, сульфатредуцирующие и железоокисляющие бактерии [С.М.Santegoeds, T.G.Ferdelman, G.Muyzer, Structural and functional dynamics of sulfate-reducing populations in bacterial biofilms.// Appl. Environ. Microbiol., 1998, V.64, p.3731-3739].Biofilms formed on the surface of metal structures cause the development of biocorrosion at the places of their formation. Biofilms are mixed cultures adhered on a solid surface, which include heterotrophic acid-forming, sulfate-reducing and iron-oxidizing bacteria [S.M. Santegoeds, TGFerdelman, G. Muyzer, Structural and functional dynamics of sulfate-reducing populations in bacterial biofilms.// Appl. Environ. Microbiol., 1998, V.64, p. 3731-3739].

Берут соскоб биопленки с внутренней поверхности металлической трубы, служащей для отвода сточной воды из резервуара для хранения нефти на нефтяном месторождении, общей площадью 1,5 см². Образец помещают в 10 мл физиологического раствора, проводят ресуспендирование биопленки в растворе с помощью ультразвуковой обработки. Далее берут аликвоту полученной суспензии (1 мл), готовят 7-8 последовательных 10-кратных разведений этой пробы в физиологическом растворе и высевают каждое разведение по 0,1 мл на чашки Петри со Средами №1 и 5 и по 1 мл в пробирки со Средами №2 и 3 (по 9 мл), составы которых указаны в Примерах 1 и 3, необходимых для обнаружения бактериальных клеток родов Pseudomonas, Desulfovibrio, Acidithiobacillus и Rhodococcus.Take a scraping of the biofilm from the inner surface of the metal pipe, which serves to drain the wastewater from the oil storage tank in the oil field, with a total area of 1.5 cm ² . The sample is placed in 10 ml of physiological saline, biofilms are resuspended in solution using ultrasonic treatment. Then, an aliquot of the obtained suspension is taken (1 ml), 7-8 consecutive 10-fold dilutions of this sample are prepared in physiological saline, and each dilution of 0.1 ml is plated on Petri dishes with Media No. 1 and 5 and 1 ml in test tubes with Media No. 2 and 3 (9 ml each), the compositions of which are indicated in Examples 1 and 3, necessary for the detection of bacterial cells of the genera Pseudomonas, Desulfovibrio, Acidithiobacillus and Rhodococcus.

Через 14 дней отмечают последнее разведение, инокулированное в питательные Среды №2 и 3 и давшее рост, проявляющийся в появлении характерной мутности, а на Средах №1 и 5 подсчитывают число выросших колониеобразующих единиц. Исходные концентрации клеток отдельных видов бактерий получают, учитывая все предыдущие разбавления исходной пробы смешанных клеток, а также считая, что для бактерий родов Pseudomonas, Desulfovibrio, Acidithiobacillus и Rhodococcus являются селективными, соответственно, Среды №1, 2, 3 и 5. Полученные данные приведены в Табл. 1. Общее время анализа составляет 15 суток.After 14 days, the last dilution was noted, inoculated into nutrient media No. 2 and 3 and giving rise, which is manifested in the appearance of a characteristic turbidity, and on Wednesdays No. 1 and 5, the number of colony forming units grown is calculated. Initial cell concentrations of individual bacterial species are obtained, taking into account all previous dilutions of the initial sample of mixed cells, and also assuming that for bacteria of the genera Pseudomonas, Desulfovibrio, Acidithiobacillus and Rhodococcus, environments No. 1, 2, 3, and 5, respectively, are obtained. The data are presented in Tab. 1. The total analysis time is 15 days.

Берут соскоб биопленки с внутренней поверхности металлической трубы, служащей для отвода сточной воды из резервуара для хранения нефти на нефтяном месторождении, общей площадью 1,5 см². Образец помещают в 10 мл физиологического раствора, проводят ресуспендирование биопленки в растворе с помощью ультразвуковой обработки. Далее берут аликвоты суспензии (по 0,5 мл) и высевают сразу же в жидкие питательные Среды №2, 3, 4 и 6 (по 4, 5 мл). Составы селективных Сред те же, что в Примерах 1 и 3. Культивирование образцов на Средах №3, 4 и 6 проводят при 28°С в аэробных условиях, а на Среде №2 - в анаэробных условиях при той же температуре. Время культивирования составляет 120 ч. Селективные среды обеспечивают подавляющий рост одного типа клеток, для которого среды являются специфическими.Take a scraping of the biofilm from the inner surface of the metal pipe, which serves to drain the wastewater from the oil storage tank in the oil field, with a total area of 1.5 cm ² . The sample is placed in 10 ml of physiological saline, biofilms are resuspended in solution using ultrasonic treatment. Then, aliquots of the suspension are taken (0.5 ml each) and plated immediately in liquid nutrient media No. 2, 3, 4 and 6 (4, 5 ml each). The compositions of the selective media are the same as in Examples 1 and 3. Cultivation of the samples on Wednesdays No. 3, 4 and 6 is carried out at 28 ° C under aerobic conditions, and on Wednesday No. 2 under anaerobic conditions at the same temperature. The cultivation time is 120 hours. Selective media provide the inhibitory growth of one type of cell for which the media are specific.

- Определение численности клеток биолюминесцентным методом и математическую обработку кинетических данных роста индивидуальных бактериальных культур проводят так же, как описано в Примере 1 и 3, с учетом тех величин удельной концентрации АТФ для клеток родов Pseudomonas, Desulfovibrio, Acidithiobacillus и Rhodococcus, которые приведены в Примерах 1 и 3. Полученные данные представлены в Табл. 1. Время проведения всего анализа составляет 5 суток.- Determination of cell numbers by bioluminescent method and mathematical processing of kinetic data on the growth of individual bacterial cultures is carried out as described in Example 1 and 3, taking into account the values of the specific concentration of ATP for cells of the genera Pseudomonas, Desulfovibrio, Acidithiobacillus and Rhodococcus, which are shown in Examples 1 and 3. The data obtained are presented in Table. 1. The time for the entire analysis is 5 days.

Пример 6. Дифференцированное определение численности бактерий в смешанной культуре, используемой для разложения фосфорорганических пестицидов.Example 6. Differentiated determination of the number of bacteria in a mixed culture used for the decomposition of organophosphorus pesticides.

Бактериальные консорциумы, разрабатываемые для биологической очистки воды и состоящие из разных микроорганизмов, участвующих в последовательных стадиях разложения фосфорорганических пестицидов (ФП) типа малатион, паратион, кумафос и др., обнаруживаемых в сельскохозяйственных и промышленных сточных водах, в водах рек, как правило, состоят из бактерий Escherihia coli, являющихся генно-инженерным продуцентом ферментов, гидролизующих триэфиры ортофосфорной кислоты, и бактерий рода Pseudomonas, способных метаболизировать продукты ферментативного гидролиза ФП [E.S.Gilbert, A.W.Walker, J.D.Keasling, A constructed microbial consortium for biodegradation of the organophosphorus insecticide parathion.//Appl. Microbiol. Biotechnol., 2003, V.61, p.77-81].Bacterial consortia developed for the biological treatment of water and consisting of various microorganisms involved in the sequential stages of the decomposition of organophosphorus pesticides (AF) such as malathion, parathion, coumaphos, etc., found in agricultural and industrial wastewaters, in river waters, as a rule, consist from bacteria Escherihia coli, which are a genetically engineered producer of enzymes that hydrolyze orthophosphoric triesters, and bacteria of the genus Pseudomonas that are able to metabolize enzymatic products AF photolysis [E. S. Gilbert, A.W. Walker, J. D. Keasling, A constructed microbial consortium for biodegradation of the organophosphorus insecticide parathion.//Appl. Microbiol. Biotechnol., 2003, V.61, p.77-81].

Образец смешанных культур бактериальных клеток готовят путем ресуспендирования в физиологическом растворе клеток E.coli, Pseudomonas putida и Pseudomonas fluorescens так, чтобы их конечные концентрации в смеси составили (3,3±0,7)×10³ и (4,4±0,8)×10⁶ кл/мл, соответственно, для клеток E.coli и суммарно для клеток рода Pseudomonas. Эти концентрации клеток в полученной смеси определяют микробиологическим методом, а именно берут аликвоту (1 мл) смеси клеток, готовят 7-8 последовательных 10-кратных разведений этой пробы в физиологическом растворе и высевают каждое разведение по 0,1 мл на чашки Петри со Средой №1 и 7.A sample of mixed cultures of bacterial cells is prepared by resuspending E. coli, Pseudomonas putida and Pseudomonas fluorescens cells in physiological saline so that their final concentration in the mixture is (3.3 ± 0.7) × 10 ³ and (4.4 ± 0, 8) × 10 ⁶ cells / ml, respectively, for E. coli cells and total for cells of the genus Pseudomonas. These cell concentrations in the resulting mixture are determined by the microbiological method, namely, an aliquot (1 ml) of the cell mixture is taken, 7-8 consecutive 10-fold dilutions of this sample are prepared in physiological saline, and each dilution of 0.1 ml is plated on Petri dishes with Medium No. 1 and 7.

Среда №7 имеет следующий состав (г/л): пептон - 10,0; дрожжевой экстракт - 5,0; NaCl - 5,0; агар - 15,0; ФП (паратион) - 0,002 г; ампициллин - 50 мкг; рН 6,8-7,0.Wednesday No. 7 has the following composition (g / l): peptone - 10.0; yeast extract - 5.0; NaCl - 5.0; agar - 15.0; AF (parathion) - 0.002 g; ampicillin - 50 mcg; pH 6.8-7.0.

Инокулированные Среды №1 и 7 инкубируют при 28°С в аэробных условиях. Через 5 дней отмечают последнее разведение, давшее рост колониеобразующих единиц, число которых подсчитывают и используют для окончательного расчета исходных концентраций клеток E.coli и суммарной концентрации клеток рода Pseudomonas. При этом учитывают все предыдущие разбавления исходной пробы смешанных клеток. Общее время анализа составляет 6 суток.Inoculated Media No. 1 and 7 are incubated at 28 ° C. under aerobic conditions. After 5 days, the last dilution is noted, giving rise to colony forming units, the number of which is calculated and used for the final calculation of the initial concentrations of E. coli cells and the total concentration of cells of the genus Pseudomonas. In this case, all previous dilutions of the initial sample of mixed cells are taken into account. The total analysis time is 6 days.

Берут аликвоты смешанной культуры (по 0,5 мл) и высевают сразу же в жидкие питательные Среды №4 и 8 (по 4, 5 мл).Aliquots of a mixed culture are taken (0.5 ml each) and seeded immediately in liquid nutrient media No. 4 and 8 (4.5 ml each).

Среда №8 имеет тот же состав, что и Среда №7, но без агара. Культивирование образцов на Средах №4 и 8 проводят при 28°С в аэробных условиях. Время культивирования составляет 20 ч. Селективные среды обеспечивают подавляющий рост клеток бактерий одного таксономического типа, для которого среды являются специфическими.Wednesday No. 8 has the same composition as Wednesday No. 7, but without agar. Cultivation of samples on Wednesdays No. 4 and 8 is carried out at 28 ° C under aerobic conditions. The cultivation time is 20 hours. Selective media provide inhibitory growth of bacterial cells of the same taxonomic type, for which the media are specific.

- Определение численности клеток биолюминесцентным методом и математическая обработка кинетических данных роста индивидуальных бактериальных культур проводится, как описано в Примере 1, с учетом известной средней величины удельной концентрации АТФ в одной клетке, которая для клеток E.coli составляет (5,0±0,7)×10^-17 моль/кл. В Табл. 1 приведены исходные концентрации клеток, определенные согласно заявляемому методу. Время проведения всего анализа составляет 2 суток.- The determination of cell numbers by the bioluminescent method and mathematical processing of the kinetic data of the growth of individual bacterial cultures is carried out as described in Example 1, taking into account the known average specific concentration of ATP in one cell, which is (5.0 ± 0.7 for E. coli cells) ) × 10 ^-17 mol / cell. In Tab. 1 shows the initial cell concentration determined according to the claimed method. The entire analysis takes 2 days.

Пример 7. Дифференцированное определение численности бактерий в смешанной культуре, используемой для получения молочно-кислых продуктов.Example 7. Differentiated determination of the number of bacteria in a mixed culture used to obtain lactic acid products.

Для получения различных молочно-кислых продуктов пробиотического назначения широко используются разные смешанные культуры, основу которых составляют бактерии Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium sp. и Streptococcus lactis [M.E.Sanders, J.H.Veld, Bringing a probiotic-containing functional food to the market: microbiological, product, regulatory and labeling issues.//Antome van Leeeuwenhoek, 1999, V.76, p.293-315].To obtain various lactic acid products of probiotic use, various mixed cultures are widely used, the basis of which are bacteria Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium sp. and Streptococcus lactis [M.E. Sanders, J.H. Veld, Bringing a probiotic-containing functional food to the market: microbiological, product, regulatory and labeling issues.//Antome van Leeeuwenhoek, 1999, V.76, p. 293-315].

Образец кисло-молочного продукта (1 мл), содержащий, согласно рецептуре приготовления, смешанную культуру бактерий Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium sp. и Streptococcus thermophilus, суспендируют в физиологическом растворе, готовят 7-8 последовательных 10-кратных разведений этой пробы в физиологическом растворе и высевают каждое разведение по 0,1 мл на чашки Петри со Средами №9, 10. В случае использования Среды №11 пробу (0,1 мл) предварительно вносят в чашку Петри и сверху заливают средой.A sample of the fermented milk product (1 ml) containing, according to the recipe, a mixed culture of bacteria Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium sp. and Streptococcus thermophilus, are suspended in physiological saline, 7-8 consecutive 10-fold dilutions of this sample are prepared in physiological saline, and each dilution is sown in 0.1 ml Petri dishes with Media No. 9, 10. In the case of medium No. 11, the sample ( 0.1 ml) is preliminarily added to the Petri dish and the medium is poured on top.

Используемые среды имеют следующий состав.The media used have the following composition.

Среда №9 (селективная среда для клеток Lactobacillus acidophilus, г/л): пептон - 10,0; дрожжевой экстракт - 5,0; мясной экстракт - 10,0; глюкоза - 20,0; цитрат аммония - 2,0; ацетат натрия - 5,0; MnSO₄ - 0,5; MgSO₄×7Н₂O - 0,2; К₂НРО₄ - 2,0; фенол - 0,005; агар - 15,0; рН 7,0-7,2.Wednesday No. 9 (selective medium for Lactobacillus acidophilus cells, g / l): peptone - 10.0; yeast extract - 5.0; meat extract - 10.0; glucose - 20.0; ammonium citrate - 2.0; sodium acetate - 5.0; MnSO ₄ - 0.5; MgSO ₄ × 7H ₂ O - 0.2; K ₂ NRA ₄ - 2.0; phenol - 0.005; agar - 15.0; pH 7.0-7.2.

Среда №10 (селективная среда для клеток Bifidobacterium sp, г/л): пептон - 10,0; дрожжевой экстракт - 5,0; мясной экстракт - 10,0; глюкоза - 20,0; цитрат аммония - 2,0; сульфат неомицина - 3,0; MnSO₄ - 0,5; MgSO₄×7Н₂О - 0,2; К₂HPO₄ - 2,0; хлорид лития - 0,01; агар - 15,0; рН 7,0-7,2.Wednesday No. 10 (selective medium for cells of Bifidobacterium sp, g / l): peptone - 10.0; yeast extract - 5.0; meat extract - 10.0; glucose - 20.0; ammonium citrate - 2.0; neomycin sulfate - 3.0; MnSO ₄ - 0.5; MgSO ₄ × 7H ₂ O — 0.2; K ₂ HPO ₄ - 2.0; lithium chloride - 0.01; agar - 15.0; pH 7.0-7.2.

Среда №11 (селективная среда для клеток Streptococcus thermophilus, г/л): гидролизованное обезжиренное молоко - 10,0; сахароза - 20,0; агар - 20,0; рН 4,3-4,8.Environment No. 11 (selective medium for Streptococcus thermophilus cells, g / l): hydrolyzed skim milk - 10.0; sucrose - 20.0; agar - 20.0; pH 4.3-4.8.

Культивирование клеток бактерий на селективных Средах №9, 10 и 11 проводят, соответственно, при 37°С, 40°С и 45°С в аэробных условиях. Через 7 дней подсчитывают число выросших колониеобразующих единиц на Средах №9, 10 и 11. Исходные концентрации клеток бактерий определенного вида получают, учитывая все предыдущие разбавления исходной пробы смешанных клеток и считая, что для Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium sp. и Streptococcus thermophilus являются селективными, соответственно, Среды №9, 10 и 11. Полученные данные приведены в Табл. 1. Общее время анализа составляет 8 суток.The cultivation of bacterial cells on selective media No. 9, 10 and 11 is carried out, respectively, at 37 ° C, 40 ° C and 45 ° C under aerobic conditions. After 7 days, the number of grown colony forming units on Media No. 9, 10 and 11 was calculated. The initial concentrations of bacterial cells of a certain type were obtained, taking into account all previous dilutions of the initial sample of mixed cells and considering that for Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium sp. and Streptococcus thermophilus are selective, respectively, Environment No. 9, 10 and 11. The data obtained are given in Table. 1. The total analysis time is 8 days.

Аликвоты кисло-молочного продукта (по 0,5 мл), содержащего, согласно рецептуре приготовления, смешанную культуру бактерий Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium sp. и Streptococcus thermophilus вносят в жидкие питательные Среды №12, 13 и 14 (по 4, 5 мл).Aliquots of fermented milk product (0.5 ml each) containing, according to the recipe, a mixed culture of bacteria Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium sp. and Streptococcus thermophilus are introduced into liquid nutrient media No. 12, 13 and 14 (4.5 ml each).

Среды №12, 13 и 14 имеют тот же состав, что и Среды №9, 10 и 11, но без агара. Культивирование клеток на селективных Средах №12, 13 и 14 проводят, соответственно, при 37°С, 40°С и 45°С в аэробных условиях. Время культивирования составляет 24 ч. Селективные среды обеспечивают подавляющий рост одного типа клеток, для которого среды являются специфическими.Wednesday No. 12, 13 and 14 have the same composition as Wednesday No. 9, 10 and 11, but without agar. Cell cultivation on selective Media No. 12, 13 and 14 is carried out, respectively, at 37 ° C, 40 ° C and 45 ° C under aerobic conditions. The cultivation time is 24 hours. Selective media provide the inhibitory growth of one type of cell for which the media are specific.

- Определение численности клеток биолюминесцентным методом и математическую обработку кинетических данных роста индивидуальных бактериальных культур проводят так же, как описано в Примере 1, учитывая известные средние величины удельной концентрации АТФ, характерные для клеток Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium sp. u Streptococcus thermophilus, которые составляют, соответственно, (1,5±0,1)×10^-17, (4,2±0,6)×10^-17 и (2,7±0,8)×10^-17 моль/кл. В Табл. 1 приведены концентрации клеток, определенные, согласно заявляемому методу, в исходном образце. Время проведения всего анализа составляет 2 суток.- Determination of cell numbers by the bioluminescent method and mathematical processing of the kinetic data of the growth of individual bacterial cultures is carried out as described in Example 1, taking into account the known average values of the specific concentration of ATP, characteristic of cells of Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium sp. u Streptococcus thermophilus, which are, respectively, (1.5 ± 0.1) × 10 ^-17 , (4.2 ± 0.6) × 10 ^-17 and (2.7 ± 0.8) × 10 ^-17 mol / cell In Tab. 1 shows the concentration of cells determined, according to the claimed method, in the original sample. The entire analysis takes 2 days.

Таким образом, заявляемый способ дифференцированного определения численности бактерий в смешанных культурах, по сравнению с аналогами и прототипом, обладает рядом существенных преимуществ:Thus, the claimed method of differentially determining the number of bacteria in mixed cultures, compared with analogues and prototype, has several significant advantages:

- способ позволяет параллельно количественно идентифицировать бактериальные клетки разных таксономических групп, одновременно присутствующие в смешанных культурах, вместо одной отдельно взятой, как в прототипе;- the method allows parallel quantitative identification of bacterial cells of different taxonomic groups, simultaneously present in mixed cultures, instead of one separately taken, as in the prototype;

- способ позволяет существенно (до 9 раз) повысить точность дифференцированного определения численности клеток, особенно для бактерий, рост которых возможен только на жидких питательных средах, и поэтому подсчет колониеобразующих единиц для них традиционным методом на твердых питательных средах принципиально не возможен (Примеры 1-5);- the method allows to significantly (up to 9 times) increase the accuracy of differentiated determination of the number of cells, especially for bacteria, the growth of which is possible only on liquid nutrient media, and therefore the calculation of colony forming units for them by the traditional method on solid nutrient media is fundamentally impossible (Examples 1-5 );

- способ позволяет расширить концентрационный диапазон определения численности бактерий и снизить предел дифференцированного обнаружения до 1-10 кл/мл (Примеры 4 и 5);- the method allows to expand the concentration range for determining the number of bacteria and reduce the limit of differential detection to 1-10 cells / ml (Examples 4 and 5);

- способ позволяет существенно (в 3-4 раза) сократить общее время анализа, особенно для клеток бактерий с низкими скоростями роста и при исходно низких концентрациях клеток в анализируемых образцах (Примеры 1-7);- the method allows to significantly (3-4 times) reduce the total analysis time, especially for bacterial cells with low growth rates and at initially low cell concentrations in the analyzed samples (Examples 1-7);

- способ может быть применен для дифференцированного количественного определения широкого спектра бактерий, представляющих собой природные или генно-инженерные клетки и характеризующихся разными структурами клеточной стенки, ферментативными активностями, анаэробным или аэробным метаболизмом, а также обитающих в различных биосистемах или используемых в разных биотехнологических процессах (Примеры 1-7).- the method can be used for differentiated quantitative determination of a wide range of bacteria, which are natural or genetically engineered cells and characterized by different cell wall structures, enzymatic activities, anaerobic or aerobic metabolism, as well as living in different biosystems or used in different biotechnological processes (Examples 1-7).

Claims

A method for differentially determining the number of bacteria in mixed cultures, characterized in that the samples of mixed cultures are sown on liquid selective nutrient media, the number of cells accumulating in the media during the growth of bacteria is determined by a bioluminescent method, the kinetic data of the growth of individual bacteria are mathematically processed, and the initial concentration of bacteria is established belonging to different taxonomic groups.