RU2263144C2 - Strain cod of severe acute respiratory syndrome virus of genus coronavirus designated for development of agents and methods for biological protection - Google Patents
Strain cod of severe acute respiratory syndrome virus of genus coronavirus designated for development of agents and methods for biological protection Download PDFInfo
- Publication number
- RU2263144C2 RU2263144C2 RU2003136244/13A RU2003136244A RU2263144C2 RU 2263144 C2 RU2263144 C2 RU 2263144C2 RU 2003136244/13 A RU2003136244/13 A RU 2003136244/13A RU 2003136244 A RU2003136244 A RU 2003136244A RU 2263144 C2 RU2263144 C2 RU 2263144C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strain
- virus
- acute respiratory
- respiratory syndrome
- severe acute
- Prior art date
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области вирусологии.The invention relates to the field of virology.
Изобретение может быть использовано в вирусологических, серологических, иммунологических и молекулярно-биологических методах исследования для специфического выявления РНК коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома (далее - ТОРС) с помощью полимеразной цепной реакции, антител к нему с помощью иммуноферментного анализа, а также разработки средств и методов биологической защиты.The invention can be used in virological, serological, immunological and molecular biological research methods for the specific detection of coronavirus RNA of severe acute respiratory syndrome (hereinafter - SARS) using polymerase chain reaction, antibodies to it using enzyme immunoassay, as well as the development of tools and methods biological protection.
В марте 2003 года специалистами в Центрах по контролю и профилактике заболеваний (CDC) во Вьетнаме, Сингапуре, Таиланде, Китае (Гонконге), Канаде, Тайване и США был впервые выделен возбудитель вирусной природы из биопроб от больных людей с подозрением на тяжелый острый респираторный синдром ("атипичную пневмонию"). В результате ПЦР-анализа, электронной микроскопии, а также секвенирования всего генома выделенных штаммов возбудителя идентифицирован новый коронавирус, отнесенный к четвертому генотипу [1, 2].In March 2003, specialists from the Centers for Disease Control and Prevention (CDC) in Vietnam, Singapore, Thailand, China (Hong Kong), Canada, Taiwan and the United States were the first to isolate a viral pathogen from bioassays from sick people with suspected severe acute respiratory syndrome ("SARS"). As a result of PCR analysis, electron microscopy, as well as sequencing of the entire genome of the isolated pathogen strains, a new coronavirus identified in the fourth genotype was identified [1, 2].
В Российской Федерации, по данным Госсанэпиднадзора, зафиксировано 27 случаев заболевания с подозрением на ТОРС, но подтвердился лишь один. Так, в мае 2003 года из элюата носоглоточного смыва больного С., госпитализированного в районную больницу г.Благовещенска, специалистами ВЦ НИИМ МО РФ был выделен и идентифицирован возбудитель ТОРС, получивший название штамм СоД и относящийся к новому коронавирусу человека IV генотипа [3].In the Russian Federation, according to the Sanitary Inspection, 27 cases of the disease with suspected SARS were recorded, but only one was confirmed. So, in May 2003, from the eluate of the nasopharyngeal rinse of patient S. hospitalized in the regional hospital of Blagoveshchensk, the pathogen SARS, which was named the strain of SOD and belongs to the new human coronavirus of genotype IV, was isolated and identified by the specialists of the Scientific Research Institute of NIIM of the RF [3].
Возможность возникновения повторной эпидемии ТОРС, вызванной новым коронавирусом, обуславливает необходимость разработки средств идентификации возбудителя и диагностики вызываемого им заболевания, а также поиска эффективных средств и методов биологической защиты с использованием выделенного штамма СоД.The possibility of a repeated SARS epidemic caused by the new coronavirus necessitates the development of means for identifying the pathogen and diagnosing the disease caused by it, as well as the search for effective means and methods of biological protection using an isolated strain of SOD.
В практике диагностических исследований для решения этих задач наиболее часто применяют серологические и молекулярно-биологические методы, чувствительность и специфичность которых во многом определяется качеством антигенсодержащего субстрата. В настоящее время широкое распространение получили методы ИФА и ПЦР, основанные на использовании инактивированных антигенов возбудителей, обеспечивающие высокую специфичность, чувствительность методов и воспроизводимость результатов.In the practice of diagnostic studies, serological and molecular biological methods are most often used to solve these problems, the sensitivity and specificity of which is largely determined by the quality of the antigen-containing substrate. Currently, ELISA and PCR methods based on the use of inactivated antigens of pathogens are widely used, providing high specificity, sensitivity of methods and reproducibility of results.
Необходимым элементом при конструировании диагностических тест-систем для идентификации возбудителя и диагностики вызываемого им заболевания, а также поиска эффективных средств и методов биологической защиты в отношении ТОРС является наличие культуры штамма иммунологически полноценного антигена биологически активного вируса, обладающего выраженными патогенными, иммуногенными и протективными свойствами. Такого рода исследования предполагают разработку методики выделения возбудителя из клинического материала, выбор оптимального субстрата накопления вируса ТОРС, получения культуры штамма и рабочих культур, способа концентрирования и очистки, а также метода щадящей инактивации. Кроме того, необходимо провести выбор животных-продуцентов гипериммунных сывороток по отношению к возбудителю ТОРС и методов получения высокоочищенных препаратов антител к нему. Для оценки эффективности имеющихся и разработки новых неспецифических и специфических медицинских средств защиты необходимо выбрать наиболее чувствительный вид животного к возбудителю ТОРС, воспроизводящий основные патогенетические синдромы и симптомы заболевания.A necessary element in the construction of diagnostic test systems for identifying the pathogen and diagnosing the disease caused by it, as well as searching for effective biological protection methods and methods for SARS, is the presence of a culture of a strain of an immunologically complete antigen of a biologically active virus with pronounced pathogenic, immunogenic and protective properties. Such studies suggest the development of a method for isolating the pathogen from clinical material, the selection of the optimal substrate for the accumulation of the SARS virus, obtaining a strain culture and working cultures, a method of concentration and purification, as well as a gentle inactivation method. In addition, it is necessary to make a selection of animal producers of hyperimmune sera in relation to the pathogen SARS and methods for producing highly purified preparations of antibodies to it. To assess the effectiveness of existing and the development of new non-specific and specific medical remedies, it is necessary to choose the most sensitive animal species to the SARS pathogen, reproducing the main pathogenetic syndromes and symptoms of the disease.
Выделенный штамм СоД вируса ТОРС не имеет аналогов в Российской Федерации.The isolated SOD virus strain SARS has no analogues in the Russian Federation.
Целью настоящего изобретения является получение штамма нового коронавируса IV генотипа, предназначенного для приготовления антигенсодержащего субстрата в ИФА при идентификации данного возбудителя и диагностики вызываемого им заболевания, а также идентификации РНК вируса ТОРС в ОТ-ПЦР и оценки эффективности средств и методов биологической защиты в отношении возбудителя ТОРС.The aim of the present invention is to obtain a strain of a new coronavirus IV genotype, intended for the preparation of an antigen-containing substrate in ELISA for the identification of this pathogen and the diagnosis of the disease caused by it, as well as the identification of TARS virus RNA in RT-PCR and the evaluation of the effectiveness of biological protection agents and methods against the TARS pathogen .
Сущность изобретения состоит в том, что впервые в Российской Федерации в результате вирусологических исследований выделен в мае 2003 г. новый коронавирус IV генотипа - вирус ТОРС, штамм СоД из носоглоточного смыва больного человека, госпитализированного в городе Благовещенске Амурской области. Штамм СоД обладает биологическими характеристиками, позволяющими использовать данный коронавирус в конструировании иммунобиологических препаратов (диагностических тест-систем, иммуноглобулина, вакцины) и оценке их эффективности.The essence of the invention lies in the fact that for the first time in the Russian Federation, as a result of virological studies, a new genotype IV coronavirus was isolated in May 2003 - the SARS virus, a strain of CoD from the nasopharyngeal washout of a sick person hospitalized in the city of Blagoveshchensk, Amur Region. Strain SOD has biological characteristics that allow the use of this coronavirus in the design of immunobiological preparations (diagnostic test systems, immunoglobulin, vaccines) and the assessment of their effectiveness.
Биологическая активность эталонной культуры возбудителя ТОРС в культуре клеток Vero Е6 составила 7,1 lg ЦПД50·см-3. Принадлежность к новому коронавирусу человека IV генотипа доказана с помощью ОТ-ПЦР-тест-системы, иммуноэлектронной микроскопии, а также путем секвенирования генома выделенного штамма возбудителя.The biological activity of the reference culture of the SARS pathogen in the Vero E6 cell culture was 7.1 lg of a 50 -cm -3 CPD. Belonging to the new human coronavirus of genotype IV was proved using the RT-PCR test system, immunoelectronic microscopy, and also by sequencing the genome of an isolated pathogen strain.
Штамм СоД вируса ТОРС размножается в культурах клеток Vero E6 и GMK-AH-1(D). Он не вызывает гибели кроликов, белых мышей (в том числе новорожденных) при подкожном, внутримышечном, интраназальном, внутрибрюшинном и пероральном способах его введения. К новому коронавирусу чувствительны сирийские хомяки массой от 50 до 70 г, инфицированные перорально.The strain SOD of the SARS virus propagates in cell cultures of Vero E6 and GMK-AH-1 (D). It does not cause the death of rabbits, white mice (including newborns) with subcutaneous, intramuscular, intranasal, intraperitoneal and oral methods of administration. Syrian hamsters weighing 50 to 70 g, infected orally, are sensitive to the new coronavirus.
Пример выполненияExecution example
Полученный штамм СоД коронавируса возбудителя ТОРС обладает нижеописанными характеристиками.The resulting SOD strain of coronavirus pathogen SARS has the following characteristics.
1. Родословная штамма СоД вируса ТОРС представлена в соответствии с чертежом.1. The pedigree of the strain CoD of the SARS virus is presented in accordance with the drawing.
2. Число пассажей к моменту паспортизации 1.2. The number of passages at the time of certification 1.
3. Стандартные условия выращивания in vitro3. Standard in vitro growing conditions
Множественность инфицирования in vitro от 0,0004 до 0,01 БОЕ·кл-1. Среда культивирования - культура клеток Vero-Е6. Температура культивирования вируса ТОРС (37±0,5)°С.The multiplicity of infection in vitro from 0.0004 to 0.01 PFU · cells -1 . The culture medium is Vero-E6 cell culture. The temperature of cultivation of the SARS virus (37 ± 0.5) ° C.
4. Биологические свойства штамма4. Biological properties of the strain
Отличительной характеристикой возбудителя ТОРС от других коронавирусов человека является высокая репродуктивная способность в постоянной (перевиваемой) культуре клеток почки африканской зеленой мартышки (Vero-Е6). Оказывает цитопатическое действие на культуру клеток Vero-Е6 через время от 24 до 72 часов после инфицирования.A distinctive characteristic of the SARS pathogen from other human coronaviruses is its high reproductive ability in a constant (transplantable) culture of African green monkey kidney cells (Vero-E6). It has a cytopathic effect on Vero-E6 cell culture 24 to 72 hours after infection.
5. Устойчивость штамма5. Stability of the strain
Хранение в течение 5 месяцев (срок наблюдения) лиофилизированной эталонной культуры штамма СоД при температуре минут (20±2,0)°С вызывает снижение биологической активности вируса на 0,2 IgБОЕ см-3. Хранение в течение пяти месяцев (срок наблюдения) жидкой рабочей культуры штамма СоД при температуре минус (20±2)°С вызывает снижение биологической активности вируса на (0,6±0,2) lgБОЕ см-3.Storage for 5 months (observation period) of the lyophilized reference culture of the CoD strain at a temperature of minutes (20 ± 2.0) ° C causes a decrease in the biological activity of the virus by 0.2 IgBOE cm -3 . Storage for five months (observation period) of the liquid working culture of the CoD strain at a temperature of minus (20 ± 2) ° C causes a decrease in the biological activity of the virus by (0.6 ± 0.2) lgBOE cm -3 .
6. Контроль контаминации культуры штамма 6. Control of strain culture contamination
Грибковая и бактериальная микрофлора в культуре штамма СоД вируса ТОРС отсутствует.There is no fungal and bacterial microflora in the culture of the SOD strain of the SARS virus.
7. Способ лиофилизации7. The method of lyophilization
10% вируссодержащей суспензии культуры клеток Vero-Е6 на 10% растворе сахарозы в дистиллированной воде с 10% желтка куриного яйца.10% virus-containing suspension of Vero-E6 cell culture in a 10% solution of sucrose in distilled water with 10% chicken yolk.
8. Характеристика эталонного штамма СоД вируса ТОРС представлена в таблице.8. The characteristics of the reference strain of CoD virus SARS are presented in the table.
Примером наилучшего использования штамма СоД вируса ТОРС может являться его использование в качестве основы для конструирования ИФА-тест-системы, предназначенной для определения антител к вирусу ТОРС в крови людей и ПЦР-тест-системы, предназначенной для выявления РНК вируса ТОРС в биопробах, полученных от больных людей.An example of the best use of the SARS CoD virus strain can be its use as a basis for the construction of an ELISA test system designed to determine antibodies to the SARS virus in human blood and a PCR test system designed to detect SARS virus RNA in biological samples obtained from sick people.
Ампулу с культурой штамма извлекают из холодильника, температура хранения (20±2)°С. Монослой клеток Vero E6 инфицируют вирусом ТОРС в дозе 0,005 БОЕ·кл-1. Продолжительность культивирования составляет 48 часов при температуре (37±0,5)°С.The ampoule with the strain culture is removed from the refrigerator, storage temperature (20 ± 2) ° C. A monolayer of Vero E6 cells is infected with SARS virus at a dose of 0.005 PFU · cells -1 . The cultivation time is 48 hours at a temperature of (37 ± 0.5) ° C.
Вируссодержащую культуральную жидкость сливают, клеточный детрит осаждают с помощью низкоскоростного центрифугирования (2000 об/мин в течение 10 минут). Вирус концентрируют при использовании системы полиэтиленгликоль - 6000 - NaCl (7%-0,3 М) 24 часа при температуре (4±2)°С и осаждают центрифугированием при 2500 об·мин-1 в течение 20 минут. Осадок ресуспендируют в NTE-буфере и вирус осаждают в ступенчатом градиенте концентрации сахарозы от 10 до 60%. Центрифугирование проводят в роторе SW 27 в течение 2,5 часов при 25000 об·мин-1 при температуре (4±2)°С.The virus-containing culture fluid is drained, cell detritus precipitated by low speed centrifugation (2000 rpm for 10 minutes). The virus is concentrated using the polyethylene glycol - 6000 - NaCl (7% -0.3 M) system for 24 hours at a temperature of (4 ± 2) ° C and precipitated by centrifugation at 2500 rpm -1 for 20 minutes. The precipitate was resuspended in NTE buffer and the virus was precipitated in a stepwise gradient of sucrose concentration from 10 to 60%. Centrifugation is carried out in the rotor of SW 27 for 2.5 hours at 25,000 rpm -1 at a temperature of (4 ± 2) ° C.
Культуру штамма СоД вируса ТОРС извлекают шприцем из опалесцирующего кольца на границе раздела раствора сахарозы от 10 до 60%-ной концентрации и диализуют против NTE-буфера в течение 24 часов при температуре (4±2)°С.The culture of the SARS CoD virus strain is removed by syringe from an opalescent ring at the interface of a sucrose solution from 10 to 60% concentration and dialyzed against NTE buffer for 24 hours at a temperature of (4 ± 2) ° С.
Полученный препарат представляет собой концентрированный очищенный препарат вируса ТОРС штамм СоД, который может быть использован:The resulting preparation is a concentrated purified preparation of the SARS virus strain CoD, which can be used:
- в качестве диагностикума в ИФА-тест-системе для определения антител к вирусу ТОРС в крови людей;- as a diagnosticum in the ELISA test system for determining antibodies to the SARS virus in human blood;
- в качестве положительного контрольного образца в ПЦР-тест-системе для выявления РНК вируса ТОРС.- as a positive control sample in a PCR test system for the detection of SARS virus RNA.
Штамм СоД вируса ТОРС депонирован в Специализированную коллекцию вирусов Вирусологического центра НИИ микробиологии Министерства обороны Российской Федерации за №1136.The strain SARS virus CoD was deposited in the Specialized Virus Collection of the Virology Center of the Research Institute of Microbiology of the Ministry of Defense of the Russian Federation No. 1136.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВLIST OF USED SOURCES
1. N.Lee, D.Hui, A.Wu, P.Chan et al. A Major Otbreak of Severe Acute Respiratory Syndrome on Hong Kong// N.Engl. J.Med. - 2003. - Vol.348. - №20.1. N. Lee, D. Hui, A. Wu, P. Chan et al. A Major Otbreak of Severe Acute Respiratory Syndrome on Hong Kong // N.Engl. J.Med. - 2003. - Vol. 348. - No. 20.
2. T.G.Ksiazek, D.Erdman, C.S.Goldsmith, S.R.Zaki et al. A Novel Coronavirus Associated with Severe Acute Respiratory Syndrome// N.Engl. J.Med. - 2003. - Vol.348, №20. - Р. - 1947.-1958.2. T. G. G. Xiazek, D. Erdman, C. S. Goldsmith, S. R. Zaki et al. A Novel Coronavirus Associated with Severe Acute Respiratory Syndrome // N. Engl. J.Med. - 2003. - Vol.348, No. 20. - R. - 1947.-1958.
3. Онищенко Г.Г., Марков В.И., Максимов В.А. и др. Выделение и идентификация возбудителя тяжелого острого респираторного заболевания от больного атипичной пневмонией// ЖМЭИ. - 2003. - №5. - С.109-112.3. Onishchenko G. G., Markov V. I., Maksimov V. A. et al. Isolation and identification of the causative agent of severe acute respiratory disease from a patient with SARS // ZhMEI. - 2003. - No. 5. - S.109-112.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2003136244/13A RU2263144C2 (en) | 2003-12-17 | 2003-12-17 | Strain cod of severe acute respiratory syndrome virus of genus coronavirus designated for development of agents and methods for biological protection |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2003136244/13A RU2263144C2 (en) | 2003-12-17 | 2003-12-17 | Strain cod of severe acute respiratory syndrome virus of genus coronavirus designated for development of agents and methods for biological protection |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2003136244A RU2003136244A (en) | 2005-05-20 |
| RU2263144C2 true RU2263144C2 (en) | 2005-10-27 |
Family
ID=35820287
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2003136244/13A RU2263144C2 (en) | 2003-12-17 | 2003-12-17 | Strain cod of severe acute respiratory syndrome virus of genus coronavirus designated for development of agents and methods for biological protection |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2263144C2 (en) |
-
2003
- 2003-12-17 RU RU2003136244/13A patent/RU2263144C2/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ОНИЩЕНКО Г.Г. и др. Выделение и идентификация возбудителя тяжелого острого респираторного заболевания от больного атипичной пневмонией. ЖМЭИ, №5, 2003, с.109-112. LEE N., et al., "A major outbreak of severe acute respiratory syndrome in Hong Kong", N Engl J Med. 2003 May 15; 348(20): 1986-94. Epub 2003 Apr 07. K.SIAZEK T.G. et al., "A novel coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome", N Engl J Med. 2003 May 15; 348(20): 1953-66. Epub 2003 Apr 10. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2003136244A (en) | 2005-05-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Simonsen et al. | Immunity against tetanus and effect of revaccination 25-30 years after primary vaccination | |
| Mansuy et al. | Hepatitis E in the south west of France in individuals who have never visited an endemic area | |
| Kurkela et al. | Causative agent of Pogosta disease isolated from blood and skin lesions | |
| Garcia et al. | Evaluation of a Crimean-Congo hemorrhagic fever virus recombinant antigen expressed by Semliki Forest suicide virus for IgM and IgG antibody detection in human and animal sera collected in Iran | |
| Allwinn et al. | Laboratory diagnosis of influenza–virology or serology? | |
| Shien et al. | Experimental infections of rabbits with rabbit haemorrhagic disease virus monitored by polymerase chain reaction | |
| Dilnessa et al. | Cell culture, cytopathic effect and immunofluorescence diagnosis of viral infection | |
| Yoon et al. | Comparison of a commercial H1N1 enzyme-linked immunosorbent assay and hemagglutination inhibition test in detecting serum antibody against swine influenza viruses | |
| Hamblin | Bluetongue virus antigen and antibody detection, and the application of laboratory diagnostic techniques | |
| Oğuzoğlu et al. | A sheeppox virus outbreak in Central Turkey in 2003: isolation and identification of capripoxvirus ovis | |
| Avci et al. | Canine coronavirus infection in dogs in Turkey: virological and serological evidence. | |
| RU2263144C2 (en) | Strain cod of severe acute respiratory syndrome virus of genus coronavirus designated for development of agents and methods for biological protection | |
| Charan et al. | Comparison of enzyme-linked immunosorbent assay and haemagglutination inhibition test for the detection of Newcastle disease virus antibodies in human sera. | |
| Yang et al. | Rabbit hemorrhagic disease virus variant recombinant VP60 protein induces protective immunogenicity | |
| Duignan et al. | Comparative antibody response in harbour and grey seals naturally infected by a morbillivirus | |
| CN1176210C (en) | New type of coronavirus | |
| Abd El-Rahim et al. | An epizootic of equine influenza in Upper Egypt in 2000 | |
| Baumeister et al. | RSV molecular characterization and specific antibody response in young children with acute lower respiratory infection | |
| Meng | Hepatitis E virus: cross-species infection and zoonotic risk | |
| Bar-Joseph et al. | Booster immunization with a partially purified citrus tristeza virus (CTV) preparation after priming with recombinant CTV coat protein enhances the binding capacity of capture antibodies by ELISA | |
| Socha et al. | Use of rapid human respiratory syncytial virus strip tests for detection of bovine respiratory syncytial virus in experimentally vaccinated calves | |
| Wooley et al. | Correlation of cytopathic effect, fluorescent-antibody microneutralization, and plaque reduction test results for determining avian infectious bronchitis virus antibodies | |
| Singh et al. | Sero-surveillance of foot and mouth disease (FMD) virus non-structural protein (NSP) antibodies in the bovines of western Uttar Pradesh | |
| Seno et al. | Enhanced isolation of influenza virus in conventional plate cell cultures by using low-speed centrifugation from clinical specimens | |
| RU2603255C1 (en) | STRAIN A N2155/Baikal/2013 OF MURRAIN VIRUS Aphtae epizooticae TYPE A FOR CONTROL OF ANTIGENIC AND IMMUNOGENIC ACTIVITY AND TO PRODUCE BIOPREPARATIONS FOR DIAGNOSTICS AND SPECIFIC PREVENTION OF MURRAIN TYPE A |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20091218 |