RU2262941C2 - Способ иммунотерапии злокачественных опухолей головного мозга - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к медицине, а именно к способам лечения онкологических заболеваний. Способ характеризуется тем, что после удаления злокачественной опухоли головного мозга последовательно проводят курсы: цитокинотерапии, включающей в себя 3 внутримышечные инъекции лейкинферона с интервалом 48 ч, адоптивной иммунотерапии лимфокин-активированными киллерными клетками (ЛАКК), генерированными в присутствии рекомбинантного интерлейкина-2 (ИЛ-2). При этом ЛАКК вводят в ложе удаленной опухоли в комбинации с ИЛ-2 в виде 2 процедур с интервалом 24 ч. Затем проводят курс адоптивной иммунотерапии цитотоксическими лимфоцитами (ЦТЛ), генерированными путем культивирования мононуклеарных клеток крови больного с дендритными клетками, нагруженными опухолевым антигеном, в присутствии рекомбинантного ИЛ-2, и вводят их в комбинации с ним в ложе удаленной опухоли в виде двух процедур с интервалом 48 ч. Для получения дендритных клеток у больного до операции из крови выделяют моноциты и культивируют с гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором и интерфероном-α с дозреванием дендритных клеток в присутствии кондиционной среды моноцитов и инкубацией дендритных клеток в присутствии антигенного материала опухоли для их нагрузки опухолевым антигеном. После иммунотерапии ЦТЛ проводят курс вакцинотерапии дендритными клетками, нагруженными опухолевым антигеном, в сочетании с подкожными инъекциями ИЛ-2. Способ позволяет индуцировать высокий специфический противоопухолевый иммунный ответ с улучшением качества жизни и увеличением продолжительности безрецидивного периода. 2 з.п. ф-лы.

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к способам лечения онкологических заболеваний, и может быть использовано в иммунотерапии злокачественных опухолей головного мозга.

Существует два подхода к иммунотерапии злокачественных опухолей - неспецифическая и антиген-специфическая иммунотерапия.

В рамках первого подхода наиболее широко в настоящее время используются цитокины при лечении опухолей различной локализации. Так, известен способ лечения полипов желудка (патент №2111007, А 61 К 38/20, 1998 г.), в котором используют иммунокорригирующую терапию с помощью лейкинферона, который вводят в подслизистый слой желудка, сочетая местное лечение лейкинфероном с введением его в прямую кишку. Однако полипы желудка относятся к доброкачественным заболеваниям, и местное введение лейкинферона в данном способе было направлено на усиление лейкоцитарно-макрофагальной инфильтрации в области роста полипа, что может приводить к нарушению его кровоснабжения или к развитию неспецифических иммунных реакций, блокирующих дальнейший рост доброкачественной опухоли. Тем не менее, такой подход может оказаться неэффективным при злокачественных опухолях, поскольку не позволяет индуцировать специфический противоопухолевый иммунный ответ.

В рамках второго подхода известен способ лечения опухолей головного мозга (патент RU №2192263, А 61 К 35/14, 2000 г.), по которому из периферической крови больного выделяют моноциты и культивируют с ростовыми факторами, далее в среду к полученным из моноцитов дендритным клеткам, а также путем электрокорпорации внутрь клеток добавляют антигенный материал, приготовленный из опухоли больного, затем дендритные клетки вводят внутрикожно, и дополнительно проводят иммуномодуляцию, используя активированные с помощью фитогемагглютинина лимфоциты больного. Данный способ позволяет стабилизировать состояние больного по шкале социальной адаптации Карновского и достичь 5-месячного периода, свободного от прогрессии опухоли. Однако при этом способе не в полном объеме задействуются существующие в организме механизмы противоопухолевой защиты. Кроме того, из описания патента не ясно какова эффективность предложенного способа в отношении индукции противоопухолевого иммунного ответа, развитие которого было бы подтверждено соответствующими лабораторными тестами.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ лечения злокачественных опухолей головного мозга, при котором используется комбинированный подход, сочетающий в себе элементы неспецифической и антиген-специфической иммунотерапии (RU 2197985 С2, 10.05.2000 г.). По данному способу послеоперационная локорегиональная (в ложе удаленной опухоли) иммунотерапия аутологичными лимфокин-активированными киллерными клетками (ЛАК-клетками) в сочетании с интерлейкином-2 (ИЛ-2) комбинируется с введением цитотоксических лимфоцитов, стимулированных опухолевым антигеном в присутствии ИЛ-2, после чего проводится курс иммунотерапии аутологичными иммуностимулирующими факторами. Однако при этом способе для генерации цитотоксических лимфоцитов не используются «профессиональные» антиген-презентирующие клетки (дендритные клетки), и отсутствуют доказательства индукции эффективного противоопухолевого специфического иммунного ответа, за счет чего достигается улучшение качества жизни и увеличение продолжительности безрецедивного периода у больных с внутримозговыми опухолями.

Задача заявляемого изобретения: создать способ лечения злокачественных опухолей головного мозга, основанный на применении новых методов антиген-специфической иммунотерапии, позволяющий увеличить продолжительность безрецидивного периода у больных, повышающий уровень качества их жизни..

Технический результат состоит в эффективной индукции противоопухолевого иммунного ответа как на местном уровне - в ложе удаленной опухоли и перифокальной зоне, так и на системном уровне. Это достигается за счет того, что после нейрохирургического вмешательства и удаления опухолевого субстрата проводят курс цитокинотерапии, включающий в себя 3 внутримышечные инъекции лейкинферона в дозе 10000 ME интерферона-α с интервалом 48 ч, за ним следует курс адоптивной иммунотерапии лимфокин-активированными киллерными клетками, которые генерируют в присутствии рекомбинантного интерлейкина-2 в дозе 50 ЕД/мл, и вводят в ложе удаленной опухоли в комбинации с интерлейкином-2 в дозе 250 000 ЕД, причем курс адоптивной иммунотерапии включает в себя две процедуры генерации и локорегионального введения лимфокин-активированных киллерных клеток, которые проводят с интервалом 24 ч; затем курс адоптивной иммунотерапии цитотоксическими лимфоцитами, которые генерируют в результате 5-дневного культивирования мононуклеарных клеток периферической крови больного в соотношении 50:1 с дендритными клетками, нагруженными опухолевым антигеном, в присутствии рекомбинантного интерлейкина-2 в дозе 50 ЕД/мл, и вводят в ложе удаленной опухоли в комбинации с интерлейкином-2 в дозе 250 000 ЕД, причем курс адоптивной иммунотерапии включает в себя две процедуры генерации и локорегионального введения антиген-специфических цитотоксических лимфоцитов, которые проводят с интервалом 48 ч; для получения дендритных клеток у больного до операции из 250-300 мл периферической крови выделяют моноциты, которые культивируют с гранулоцитарно-макрофагальным колониостимулирующим фактором и интерфероном-альфа в течение 72 ч, затем проводят дозревание дендритных клеток в присутствии кондиционной среды моноцитов в течение 24 ч, после чего дендритные клетки инкубируют 1 ч при 37°С в присутствии антигенного материала из опухолевого субстрата, который получают от больного в результате выполнения нейрохирургического вмешательства; и после завершения иммунотерапии цитотоксическими лимфоцитами проводят курс вакцинотерапии дендритными клетками, нагруженными опухолевым антигеном, в виде 4-6 подкожных инъекций с интервалом 2 недели в сочетании с подкожными инъекциями интерлейкина-2 в дозе 250 000 ЕД.

Полученные дендритные клетки, нагруженные опухолевым антигеном, криоконсервируют в концентрации 20,0×10⁶ мл и хранят при -80°С до последующего использования для генерации антиген-специфических цитотоксических лимфоцитов, а также при проведении курса вакцинотерапии.

В качестве антигенного материала для нагрузки дендритных клеток используют лизат опухолевых клеток в концентрации по белку 0,1 мг/мл.

Способ осуществляется следующим образом. После нейрохирургического вмешательства и удаления опухолевого субстрата больному проводится курс цитокиновой терапии в виде 3-х внутримышечных инъекций лейкинферона в дозе 10 000 ME интерферона-α через 48 ч. После завершения цитокинотерапии лейкинфероном проводят курс адоптивной иммунотерапии с использованием аутологичных ЛАК-клеток, которые генерируются в результате 48-часового культивирования мононуклеарных клеток периферической крови больного. В стерильный флакон вводят 10 тыс. ЕД гепарина, забирают 300 мл венозной крови больного, добавляют 60 мл раствора желатиноля и инкубируют 45 мин при 37°С. Отмытую эритроцитарную массу возвращают больному в день гемоэксфузии. Собранную лейковзвесь собирают в отдельный флакон, центрифугируют при 1000 об/мин 20 мин и удаляют надосадок. Клетки лейковзвеси однократно отмывают фосфат-забуференным физиологическим раствором, наслаивают на градиент плотности фиколла-верографина и центрифугируют в течение 20 мин при 3000 об/мин. Собранные из интерфазы мононуклеарные клетки (МНК) двукратно отмывают, и ресуспендируют в культуральной среде RPMI-1640, дополненной 5% сыворотки доноров АВ (IV) группы, 5 мМ HEPES-буфера и гентамицином в дозе 80 Ед/мл. Клетки доводят до концентрации 1,5×10⁶ мл и культивируют в течение 48 ч с рекомбинантным ИЛ-2 в дозе 50 ЕД/мл. Курс адоптивной иммунотерапии включает в себя две процедуры получения ЛАК-клеток, которые проводятся с интервалом 24 ч. Полученные клетки вводятся локорегионально через катетер в ложе удаленной опухоли в комбинации с ИЛ-2 (препаратом «Ронколейкин») в дозе 250 000 ЕД.

Необходимым условием осуществления курса адоптивной иммунотерапии с использованием антиген-специфических цитотоксических лимфоцитов является получение дендритных клеток и их нагрузка опухолевым антигенным материалом, которые выполняются на предварительном этапе. Для генерации дендритных клеток у больного за 1-2 дня до нейрохирургического вмешательства проводится гемоэксфузия в объеме 250-300 мл венозной крови. МНК, выделенные из крови больного по описанной выше методике, в концентрации 3×10⁶ мл инкубируются 2 ч при 37°С в полной культуральной среде в стерильных пластиковых чашках Петри (d=90 мм). Прилипающая к пластику фракция клеток моноцитарного ряда далее культивируется в течение 72 ч в присутствии гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (препарат «Лейкомакс») и интерферона-альфа (препарат «Реаферон») в дозе по 1000 ЕД/мл.

Дозревание дендритных клеток проводится в течение дополнительных 24 ч в присутствии кондиционной среды моноцитов (30% v/v). Полученные дендритные клетки нагружают опухолевым антигеном (0,1 мг/мл) во время часовой инкубации при 37°С. Затем дендритные клетки, нагруженные опухолевым антигеном, криконсервируются в растворе 10% DMSO и 90% альбумина в концентрации 20,0×10⁶ мл и хранятся при -80°С до последующего использования для генерации антиген-специфических цитотоксических лимфоцитов, а также при проведении курса вакцинотерапии. Антигенный материал для нагрузки дендритных клеток, получают из фрагмента аутологичной опухоли больного, удаленной во время нейрохирургического вмешательства. Суспензию выделенных опухолевых клеток подвергают 5-кратному замораживанию/размораживанию (соответственно, в жидком азоте и при 37°С), затем опухолевый лизат центрифугируют, надосадок собирают и определяют концентрацию антигенного материала (в мг/мл по белку). Полученный раствор опухолевых антигенов хранят в замороженном виде.

Непосредственно сам курс адоптивной иммунотерапии с использованием антиген-специфических цитотоксических лимфоцитов начинают через 72 ч после завершения курса ЛАК-терапии. Для этого МНК, выделенные из 300 мл крови больного по описанной выше методике, в соотношении 50: 1 культивируют совместно с дендритньми клетками, нагруженными опухолевым антигеном, в присутствии рекомбинантного ИЛ-2 в дозе 50 ЕД/мл в течение 5 сут. Курс адоптивной иммунотерапии включает в себя две процедуры получения антиген-специфических цитотоксических лимфоцитов, которые проводятся с интервалом 48 ч. Полученные клетки вводятся локорегионально, через катетер в ложе удаленной опухоли в комбинации с ИЛ-2 (препаратом «Ронколейкин») в дозе 250 000 ЕД.

Завершающий этап сочетанной иммунотерапии предусматривает проведение курса вакцинотерапии в виде подкожных инъекций дендритных клеток, нагруженных антигенным материалом из опухоли больного. При этом используется от 4 до 6 инъекций дендритных клеток в дозе 10×10⁶/введение с кратностью вакцинаций - 1 раз в 2 недели. Введение дендритных клеток больному может проводиться как в условиях стационара, так и в амбулаторном режиме. При этом каждая вакцинация дендритными клетками комбинируется с одновременным использованием ИЛ-2 (препарата «Ронколейкин»), который в дозе 250 000 ЕД вводится также подкожно в область, близлежащую к месту введения дендритных клеток.

Данный способ лечения злокачественных опухолей головного мозга был проверен в клинических условиях на базе нейрохирургического отделения НИИ травматологии и ортопедии МЗ РФ, г. Новосибирск. Предложенным способом было пролечено 12 больных (7 мужчин и 5 женщин в возрасте от 23 до 62 лет) с гистологически верифицированным диагнозом анапластической астроцитомы (10 пациентов) и глиобластомы (2 больных). Всем больным было проведено оперативное лечение - была выполнена субтотальная резекция опухоли, которая осуществлялась в пределах визуально определяемых границ. После костно-пластической трепанации черепа в проекции опухоли под увеличением ×4,4 патологический опухолевый субстрат удаляли с использованием микрохирургической техники и ультразвукового аспиратора. Затем осуществляли тщательный гемостаз и производили пластику твердой мозговой оболочки гомотрансплантатом. Через контраппертуру (в 1 см от основного разреза) в ложе удаленной опухоли устанавливался хлорвиниловый катетер, который фиксировался лигатурами. В послеоперационном периоде проводилась сочетанная иммунотерапия в соответствии с разработанным способом. Курсовое лечение по предложенному протоколу было хорошо переносимым и не сопровождалось развитием каких-либо серьезных побочных или токсических реакций. Напротив, многие больные отмечали субъективное улучшение, что проявлялось статистически значимым увеличением среднего индекса качества жизни по шкале Карновского.

Оценку противоопухолевого иммунного ответа проводили перед началом курса цитокинотерапии лейкинфероном (исходный уровень) и после завершения адоптивной клеточной иммунотерапии с использованием ЛАК-клеток/цитотоксических Т-лимфоцитов при проведении вакцинаций дендритными клетками. Выраженность специфического иммунного ответа против опухолевых антигенов оценивали в кожном тесте (по образованию папул в месте внутрикожного введения аутологичного опухолевого антигена в дозе 0,1 мг/мл) и/или в культуре in vitro по усилению функциональной активности эффекторных клеток, опосредующих реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ-эффекторов), в ответ на стимуляцию специфическим антигеном из аутологичной опухоли в дозе 0,1 и 0,01 мг/мл [1]. На начальном этапе проведения сочетанной иммунотерапии у больных не выявлялся какой-либо значимый уровень антиген-специфического иммунного ответа ни в кожном тесте, ни в культуре in vitro. В то же время индукция эффективного противоопухолевого иммунного ответа по результатам кожной пробы и/или по усилению активности ГЗТ-эффекторов в культуре in vitro после завершения курса клеточной адоптивной иммунотерапии либо на этапе проведения вакцинаций дендритными клетками была документирована в 75% случаев (у 9 из 12 больных). По предложенному способу частота развития антиген-специфических иммунных реакций была на 30,6% выше, чем, например, при изолированном проведении курса вакцинотерапии дендритными клетками, нагруженными опухолевым антигеном (44,4%) [2]. Таким образом, использование предложенного способа позволяет более эффективно индуцировать противоопухолевый иммунный ответ у больных со злокачественными опухолями головного мозга.

Ниже приведены клинические примеры, поясняющие данный способ лечения злокачественных опухолей головного мозга.

Пример 1. Больной 3., 62 года, ИБ №455/03, находился в клинике нейрохирургии с диагнозом: внутримозговая злокачественная опухоль правой теменно-затылочной области (полиморфно-клеточная глиобластома).

Поступил в клинику 20.02.2003 с жалобами на слабость в левых конечностях, головную боль преимущественно в лобной и затылочной областях, снижение зрения, неуверенность при ходьбе. Анамнез заболевания: течение заболевания прогредиентное. Считает себя больным с осени 2002, когда начали беспокоить головные боли, шаткость при ходьбе. Через месяц после манифестации заболевания пациент заметил быстро нарастающую слабость в левой ноге, затем в руке. Лечился в стационаре г. Нижневартовска, где на компьютерной томографии выявлена опухоль в глубинных отделах правой теменной доли.

В неврологическом статусе: В сознании. Контактен. Глазные щели D=S. Зрачки D=S, фотореакция живая. Слабость конвергенции слева. Парез мимической мускулатуры слева по центральному типу. Язык по средней линии. Глубокий левосторонний гемипарез с плегией в руке: сила в левой руке - 0, в левой ноге - 2,5 балла. Рефлексы с рук живые, S>D, брюшные низкие, коленные оживлены, S>D, ахилловы и подошвенные средней живости, S>D. Симптом Маринеску-Радовичи с обеих сторон. Астереогноз в левой руке. Чувствительность в норме. Координаторные пробы справа выполняет удовлетворительно, слева проверить невозможно. Оценка по шкале Карновского 60 баллов. Осмотр окулиста: Vis OD/OS=0,4/0,1. Глазное дно: начальные застойные диски зрительных нервов обоих глаз. ЭЭГ: Диффузная дизритмия, дисфункция неспецифических срединных структур. В правом полушарии регистрируются патологические медленные колебания тета-диапазона, которые интенсифицируются при гипервентиляции. ЭхоЭС: смещение М-эха справа налево в средних отделах на 9 мм, в передних отделах - на 5 мм. Признаки внутричерепной гипертензии. ЯМРТ с контрастным усилением "Омнисканом": внутримозговая опухоль с кистозными включениями в правой теменной доле с выраженным масс-эффектом, вызывающая компрессию правого бокового желудочка и смещение срединных структур.

27.02.2003 выполнена операция: костно-пластическая трепанация черепа в правой теменно-затылочной области, субтотальная резекция внутримозговой опухоли.

После нейрохирургического вмешательства больному проведена сочетанная иммунотерапия по предложенному способу. 10.03.2003, 12.03.2003 и 14.03.2003 выполнен курс цитокиновой терапии в виде внутримышечных инъекций лейкинферона (по 1 ампуле, №3, с интервалом 48 ч). 18.03.2003 и 19.03.2003 проведены гемоэксфузии в объеме 300 мл крови для генерации ЛАК-клеток. Через 48 ч (20.03.2003 и 21.03.2003) путем стереотаксической пункции в асептических условиях в ложе удаленной опухоли введены аутологичные лимфокин-активированные киллерные клетки в общей дозе 380×10⁶ в комбинации с интерлейкином-2 (Ронколейкин, 250 000 ЕД).

Через 72 ч начат курс адоптивной иммунотерапии с использованием антиген-специфических цитотоксических лимфоцитов. 24.03.2003 проведена гемоэксфузия в объеме 300 мл крови, через 48 ч (26.03.2003) - повторная гемоэксфузия в том же объеме. После 5-суточного культивирования выделенных из крови МНК в соотношении 50:1 с дендритными клетками, нагруженными опухолевым антигеном, в присутствии рекомбинантного ИЛ-2 в дозе 50 ЕД/мл, полученные антиген-специфические цитотоксические Т-лимфоциты путем стереотаксической пункции в асептических условиях введены (29.03.2003 и 31.03.2003) в ложе удаленной опухоли в общей дозе 277×10⁶ в комбинации с интерлейкином-2 (Ронколейкин, 250 000 ЕД).

Завершающий курс вакцинотерапии в виде подкожных инъекций ИЛ-2 (Ронколейкин по 250 000 ЕД) и дендритных клеток (10×10⁶), нагруженных аутологичным опухолевым антигеном, начат 10.04.2003 г. Было проведено 6 вакцинаций с интервалом в 2 недели (10.04; 24.04; 08,05; 22.05; 05.06; и 19.06.2003). Курс вакцинотерапии проводился в амбулаторном режиме, поскольку больной был выписан из стационара 04.04.2003 в удовлетворительном состоянии с оценкой по шкале Карновского 90 баллов.

Исходный уровень противоопухолевого иммунного ответа определяли перед началом курса цитокинотерапии лейкинфероном (06.03.2003). Наличие у больного специфических иммунных реакций против аутологичных опухолевых антигенов не было выявлено ни в кожном тесте, ни в культуре in vitro при исследовании активности ГЗТ-эффекторов. При этом не отмечалось образование папулы в месте внутрикожного введения антигена, а индекс стимуляции опухолевым антигеном ГЗТ-эффекторов составлял 0,62 расч.ед. После завершения курса адоптивной клеточной иммунотерапии с использованием ЛАК-клеток/цитотоксических Т-лимфоцитов у больного появился специфический противоопухолевый иммунный ответ, который регистрировался по усиление активности ГЗТ-эффекторов в ответ на стимуляцию опухолевым антигеном (03.04.2003, накануне выписки больного из стационара, индекс антигенной стимуляции составлял 2,6 расч.ед.). Развитие противоопухолевых иммунных реакций в кожной пробе было выявлено после третьей вакцинации дендритными клетками. У больного в месте внутрикожного введения опухолевого антигена (20.05.2003) через 48 ч в день проведения 4-ой процедуры вакцинации (22.05.2003) было отмечено папулообразование. Диаметр папулы - 7 мм.

В настоящее время больной находится под диспансерным наблюдением, данных за рецидив нет. Спустя 10 мес после операции состояние пациента компенсированное. Головные боли не беспокоят. Отмечается значительный регресс неврологической симптоматики, восстановление силы в левых конечностях. Оценка по шкале Карновского - 90 баллов.

Пример 2. Больная К., 30 лет, ИБ №572/03, находилась в клинике нейрохирургии с диагнозом: внутримозговая злокачественная опухоль правой теменной области (фибриллярно-протоплазматическая астроцитома I степени анаплазии).

Поступила в клинику 11.03.2003 с жалобами на затруднения при произнесении слов, повышенную утомляемость, раздражительность. Анамнез заболевания: считает себя больной с октября 2001, когда впервые отметила приступы подергиваний в пальцах рук, без потери сознания, без предвестников. Обратилась к невропатологу по месту жительства, по его рекомендации принимала фенобарбитал. Вышеописанные приступы повторялись по несколько раз в день. С 26.01.03 - несколько фокальных эпилептических припадков в виде фасцикуляций в кистях рук, в бедрах. На ЯМРТ обнаружена опухоль правой теменной доли с ростом в правую височную долю с кистозным и солидным компонентами.

В неврологическом статусе очаговой патологии не выявлено. Оценка по шкале Карновского - 80 баллов. Осмотр окулиста; visus OD/OS=1,0/1,0. Поля зрения в норме. Глазное дно: диски зрительных нервов бледно-розовые, границы стушеваны. Застойные диски зрительных нервов. ЭЭГ: Диффузные изменения биоэлектрической активности головного мозга с признаками ирритации срединных структур, брадидизритмия. ЭхоЭГ: смещение М-эха справа налево на 3,5 мм в средних отделах. ЯМРТ: Кистозно-солидное образование правой теменной доли с распространением на правую височную долю со сдавлением заднего рога правого бокового желудочка.

12.03.2003 выполнена операция: костно-пластическая трепанация черепа в правой теменно-височной области с удалением костного лоскута, удаление внутримозговой опухоли, пластика твердой мозговой оболочки гомотрансплантатом.

После нейрохирургического вмешательства больной проведена сочетанная иммунотерапия по предложенному способу. 19.03.2003, 21.03.2003 и 23.03.2003 выполнен курс цитокиновой терапии в виде внутримышечных инъекций лейкинферона (по 1 ампуле, №3, с интервалом 48 ч). 25.03.2003 и 26.03.2003 проведены гемоэксфузии в объеме 300 мл крови для генерации ЛАК-клеток. Через 48 ч (27.03.2003 и 28.03.2003) путем стереотаксической пункции в асептических условиях в ложе удаленной опухоли введены аутологичные лимфокин-активированные киллерные клетки в общей дозе 350×10⁶ в комбинации с интерлейкином-2 (Ронколейкин, 250 000 ЕД).

Через 72 ч начат курс адоптивной иммунотерапии с использованием антиген-специфических цитотоксических лимфоцитов. 31.03.2003 проведена гемоэксфузия в объеме 300 мл крови, через 48 ч (02.04.2003) - повторная гемоэксфузия в том же объеме. После 5-суточного культивирования выделенных из крови МНК в соотношении 50: 1 с дендритными клетками, нагруженными опухолевым антигеном, в присутствии рекомбинантного ИЛ-2 в дозе 50 ЕД/мл, полученные антиген-специфические цитотоксические Т-лимфоциты путем стереотаксической пункции в асептических условиях введены (05.04.2003 и 07.04.2003) в ложе удаленной опухоли в общей дозе 280×10⁶ в комбинации с интерлейкином-2 (Ронколейкин, 250 000 ЕД).

Завершающий курс вакцинотерапии в виде подкожных инъекций ИЛ-2 (Ронколейкин по 250 000 ЕД) и дендритных клеток (10×10⁶), нагруженных аутологичным опухолевым антигеном, начат 14.04.2003 г. Было проведено 6 вакцинаций с интервалом в 2 недели (14.04; 28.04; 12.05; 26.05; 09.06 и 23.06.2003). Курс вакцинотерапии проводился в амбулаторном режиме, поскольку больная была выписана из стационара 09.04.2003 в удовлетворительном состоянии с оценкой по шкале Карновского 90 баллов.

Исходный уровень противоопухолевого иммунного ответа определяли перед началом курса цитокинотерапии лейкинфероном (17.03.2003). Наличие у больной специфических иммунных реакций против аутологичных опухолевых антигенов не было выявлено ни в кожном тесте, ни в культуре in vitro при исследовании активности ГЗТ-эффекторов. При этом не отмечалось образование папулы в месте внутрикожного введения антигена, а индекс стимуляции опухолевым антигеном ГЗТ-эффекторов составлял 1,0 расч.ед. Появление у больной специфического противоопухолевого иммунного ответа в виде усиления активности ГЗТ-эффекторов, стимулированных in vitro опухолевым антигеном, было зарегистрировано на этапе проведения курса вакцинотерапии. Так, 28.04.2003 (т.е. в день выполнения 2-ой вакцинации дендритными клетками) индекс антигенной стимуляции ГЗТ-эффекторов составлял 2,7 расч.ед. Развитие противоопухолевых иммунных реакций в кожной пробе было выявлено после третьей вакцинации дендритными клетками. У больной в месте внутрикожного введения опухолевого антигена (24.05.2003) через 48 ч в день проведения 4-ой процедуры вакцинации (26.05.2003) было отмечено папулообразование, диаметр папулы 6 мм.

В настоящее время, спустя 10 мес после операции: пациентка находится в удовлетворительном, полностью компенсированном состоянии, трудоспособна. Головные боли не беспокоят. Оценка по шкале Карновского - 100 баллов.

Таким образом, проверка предложенного подхода в клинических условиях позволяет сделать вывод, что данный способ за счет использования сочетанной иммунотерапии, включающей курсы цитокинотерапии, локорегиональной адоптивной иммунотерапии ЛАК-клетками и цитотоксическими лимфоцитами, а также вакцинотерапии дендритными клетками позволяет эффективно индуцировать специфический противоопухолевый иммунный ответ у пациентов со злокачественными опухолями головного мозга, что сопровождается улучшением качества жизни больных и увеличением продолжительности безрецедивного периода.

Литература.

1. Лозовой В.П., Кожевников B.C. Методы оценки клеточных эффекторных функций гиперчувствительности замедленного типа//Методические рекомендации МЗ СССР. - 1990, 10 с.

2. Yu J.S., Wheeler C.J., Zeltzer P.M., et al. Vaccination of malignant glioma patients with peptide-pulsed dendritic cells elicits systemic cytotoxicity and intracranial T-cell infiltration.//Cancer Res. - 2001. - Vol. 61. - P. 842-847.

Claims (3)

1. Способ иммунотерапии злокачественных опухолей головного мозга, включающий локорегиональное введение аутологичных лимфокинактивированных киллерных клеток (ЛАКК) в комбинации с интерлейкином-2 (ИЛ-2) и цитотоксических лимфоцитов (ЦТЛ), стимулированных опухолевым антигеном в присутствии ИЛ-2, в ложе опухоли после ее оперативного удаления, отличающийся тем, что после удаления опухоли проводят курс цитокинотерапии, включающий в себя 3 внутримышечные инъекции лейкинферона в дозе 10 000 ME интерферона-α с интервалом 48 ч, затем курс адаптивной иммунотерапии ЛАКК, генерированными в присутствии рекомбинантного ИЛ-2 в дозе 50 ЕД/мл, которые вводят в ложе удаленной опухоли в комбинации с ИЛ-2 в дозе 250 000 ЕД, причем этот курс включает две процедуры генерации и локорегионального введения ЛАКК с интервалом 24 ч, затем проводят курс адаптивной иммунотерапии ЦТЛ, генерированных путем 5-дневного культивирования мононуклеарных клеток периферической крови больного с дендритными клетками, нагруженными опухолевым антигеном, в присутствии рекомбинантного ИЛ-2 в дозе 50 ЕД/мл, и вводят в ложе удаленной опухоли в комбинации с ИЛ-2 в дозе 250 000 ЕД, причем этот курс включает две процедуры генерации и локорегионального введения ЦТЛ с интервалом 48 ч, для получения дендритных клеток у больного до операции из 250-300 мл периферической крови выделяют моноциты, которые культивируют с гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором и интерфероном-α в течение 72 ч с дозреванием дендритных клеток в присутствии кондиционной среды моноцитов в течение 24 ч и инкубацией дендритных клеток в присутствии антигенного материала опухоли 1 ч при 37°С для их нагрузки опухолевым антигеном, после завершения иммунотерапии ЦТЛ проводят курс вакцинотерапии дендритными клетками, нагруженными опухолевым антигеном, в виде 4-6 подкожных инъекций в дозе 10·10⁶, введение с интервалом 2 недели в сочетании с подкожными инъекциями ИЛ-2 в дозе 250 000 ЕД.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что полученные дендритные клетки, нагруженные опухолевым антигеном, криоконсервируют в концентрации 20,0·10⁶/мл и хранят при -80°С до последующего использования для генерации ЦТЛ и проведения курса вакцинотерапии.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве антигенного материала для нагрузки дендритных клеток используют лизат опухолевых клеток в концентрации по белку 0,1 мг/мл.