RU2260598C2

RU2260598C2 - Peptide eliciting capacity to inhibit migration of monocytic cells stimulated by protein mcp-1

Info

Publication number: RU2260598C2
Application number: RU2003131626/04A
Authority: RU
Inventors: Е.И. Чазов (RU); Е.И. Чазов; М.В. Сидорова (RU); М.В. Сидорова; А.С. Молокоедов (RU); А.С. Молокоедов; Т.И. Арефьева (RU); Т.И. Арефьева; Н.Б. Кухтина (RU); Н.Б. Кухтина; Т.Л. Красникова (RU); Т.Л. Красникова; Ж.Д. Беспалова (RU); Ж.Д. Беспалова; В.Н. Бушуев (RU); В.Н. Бушуев
Original assignee: Российский кардиологический научно-производственный комплекс Министерства здравоохранения РФ
Priority date: 2003-10-29
Filing date: 2003-10-29
Publication date: 2005-09-20
Also published as: RU2003131626A

Abstract

FIELD: medicine, peptides.

SUBSTANCE: invention relates to biologically active peptides able to inhibit motility of cells stimulated by the chemokine MCP-1. Invention proposes peptide of the formula: H-DHLDKQTQTPKT-OH and its pharmaceutically acceptable salts. The claimed peptide can be used in cardiology for covering stents in angioplasty in aims for prophylaxis of restenosis.

EFFECT: valuable medicinal properties of peptide.

1 sch, 2 ex

Description

Предлагаемое изобретение относится к биологически активным пептидам и белкам, способным ингибировать подвижность клеток, стимулированную хемокином МСР-1, а также к лекарственным средствам на их основе. The present invention relates to biologically active peptides and proteins capable of inhibiting cell motility stimulated by the chemokine MCP-1, as well as to drugs based on them.

Известно, что при непосредственном участии хемотаксических цитокинов - хемокинов в организме осуществляется привлечение лейкоцитов в участки воспаления, их активация и дифференцировка. Кроме того, известно, что воспаление является неотъемлемым компонентом многих патологических состояний, таких как онкогенез, атеросклероз, аутоиммунные заболевания, болезнь Альцгеймера и др. [1]. Хемокины - это семейство небольших по массе основных белков (8-12 кДа), действие которых осуществляется через специальные хемокиновые рецепторы. Установлено, что в патогенезе атеросклероза ведущая роль принадлежит хемокину МСР-1 (monocyte chemoattractant protein-1), который экспрессируется макрофагами, гладкомышечными и эндотелиальными клетками стенки сосуда [2]. Ниже представлена аминокислотная последовательность МСР-1 человека:It is known that with the direct participation of chemotactic cytokines - chemokines in the body, leukocytes are attracted to the sites of inflammation, their activation and differentiation. In addition, it is known that inflammation is an integral component of many pathological conditions, such as oncogenesis, atherosclerosis, autoimmune diseases, Alzheimer's disease, etc. [1]. Chemokines are a family of low-mass basic proteins (8-12 kDa), the action of which is via special chemokine receptors. It has been established that the leading role in the pathogenesis of atherosclerosis belongs to the chemokine MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1), which is expressed by macrophages, smooth muscle and endothelial cells of the vessel wall [2]. The following is the amino acid sequence of human MCP-1:

Присутствие в атеросклеротической бляшке моноцитов/макрофагов и Т-клеток свидетельствует о развитии локального воспалительного процесса в сосудистой стенке [3]. Значительная роль МСР-1 в развитии воспаления и, в частности, в атерогенезе [4] вызвала необходимость синтеза ингибиторов МСР-1.The presence of monocytes / macrophages and T cells in the atherosclerotic plaque indicates the development of a local inflammatory process in the vascular wall [3]. The significant role of MCP-1 in the development of inflammation and, in particular, in atherogenesis [4] necessitated the synthesis of MCP-1 inhibitors.

Известны вещества непептидной (пиринидилимидазольной) природы, тормозящие миграцию моноцитарных клеток посредством блокирования некоторых звеньев внутриклеточной сигнализации [5], вследствие чего в отличие от пептидов препараты такого класса часто являются токсичными.Substances of a non-peptide (pyrinidilimidazole) nature are known that inhibit the migration of monocytic cells by blocking some units of intracellular signaling [5], as a result of which, in contrast to peptides, drugs of this class are often toxic.

Известно [6], что пептид последовательности 51-62 МСР-1 (Н-EICADPKQKWVQ-OH) ингибирует миграцию моноцитов крови человека и клеток моноцитарной линии ТНР-1, стимулированных хемокинами, и не оказывает влияния на миграцию клеток, вызванную хемоаттрактантами нехимокиновой природы.It is known [6] that the peptide of sequence 51-62 MCP-1 (H-EICADPKQKWVQ-OH) inhibits the migration of human blood monocytes and cells of the THP-1 monocytic line stimulated by chemokines and does not affect cell migration caused by chemoattractants of non-chemokine nature.

Известно, что аналог пептида последовательности 51-62 МСР-1 с заменой аланина на лейцин в положении 4 и валина на изолейцин в положении 11: H-EICLDPKQKWIQ-OH в 3-4 раза более активен, чем пептид 51-62 МСР-1, и согласно Reckless и Grainger [6] является лучшим кандидатом для проявления ингибирующей активности in vivo. It is known that the analogue of the peptide of sequence 51-62 MCP-1 with the replacement of alanine with leucine at position 4 and valine with isoleucine at position 11: H-EICLDPKQKWIQ-OH is 3-4 times more active than peptide 51-62 MCP-1, and according to Reckless and Grainger [6], it is the best candidate for in vivo inhibitory activity.

Известен также пептид следующей структуры [7]:A peptide of the following structure is also known [7]:

представляющий собой ретроэнантиоаналог пептида последовательности 51-62 МСР-1. Этот пептид в настоящее время является наиболее эффективным в качестве ингибитора миграции клеток in vitro и выбран в качестве прототипа заявляемого изобретения.

which is a retroenantio analog of a peptide of sequence 51-62 MCP-1. This peptide is currently the most effective as an inhibitor of cell migration in vitro and is selected as a prototype of the claimed invention.

Недостатками прототипа являются сложность синтеза, обусловленная наличием дисульфидной связи в составе структуры пептида, что, как правило, приводит к уменьшению выхода целевого продукта за счет стадии циклизации, а также дороговизна синтеза (все аминокислоты, входящие в состав этого пептида D-конфигурации, что в несколько раз увеличивает стоимость исходных продуктов для синтеза этого пептида по сравнению с аналогичными пептидами, состоящими из остатков L-аминокислот).The disadvantages of the prototype are the complexity of the synthesis, due to the presence of a disulfide bond in the structure of the peptide, which, as a rule, leads to a decrease in the yield of the target product due to the cyclization stage, as well as the high cost of synthesis (all amino acids that make up this peptide of the D configuration, which several times increases the cost of the starting products for the synthesis of this peptide compared to similar peptides consisting of residues of L-amino acids).

Известно также, что С-концевая область хемокина МСР-1 не имеет функционального значения в стимуляции клеточной миграции [8, 9] и пептиды из этой области не конкурируют с меченым МСР-1 при взамодействии с рецепторами ТНР-1 клеток [10].It is also known that the C-terminal region of the MCP-1 chemokine does not have functional significance in stimulating cell migration [8, 9] and peptides from this region do not compete with labeled MCP-1 when interacting with THP-1 receptors of cells [10].

Задачей, стоящей перед авторами настоящего изобретения, явился поиск и синтез пептидов, ингибирующих МСР-1-стимулированную миграцию моноцитарных клеток, причем синтез таких пептидов должен быть значительно проще и дешевле по сравнению с синтезом пептида-прототипа. Актуальность такого исследования связана, в частности, с поиском соединений для покрытия стентов, используемых при коронарной ангиопластике у больных с ишемической болезнью сердца для предупреждения развития рестенозов (повторного сужения сосудов).The challenge facing the authors of the present invention was the search and synthesis of peptides that inhibit MCP-1-stimulated migration of monocytic cells, and the synthesis of such peptides should be much simpler and cheaper compared to the synthesis of the prototype peptide. The relevance of this study is associated, in particular, with the search for compounds to cover stents used in coronary angioplasty in patients with coronary heart disease to prevent the development of restenosis (repeated narrowing of blood vessels).

Поставленная задача решается путем синтеза пептида формулы: Н-DHLDKQTQTPKT-OH или его фармацевтически приемлемых солей. В структуре заявляемого пептида по сравнению с прототипом отсутствует дисульфидная связь, что всегда упрощает синтез и очистку целевого продукта. Заявляемый пептид содержит одинаковое с прототипом количество аминокислотных остатков - 12, но все они - L-конфигурации, благодаря чему затраты на синтез уменьшаются в несколько раз, поскольку D-аминокислиты гораздо дороже L-аминокислот.The problem is solved by synthesis of a peptide of the formula: H-DHLDKQTQTPKT-OH or its pharmaceutically acceptable salts. In the structure of the claimed peptide in comparison with the prototype there is no disulfide bond, which always simplifies the synthesis and purification of the target product. The inventive peptide contains the same amount of amino acid residues as the prototype — 12, but all of them are L-configurations, due to which synthesis costs are reduced several times, since D-amino acids are much more expensive than L-amino acids.

Неочевидность изобретения обусловлена тем, что поставленная задача решается путем синтеза пептида последовательности 66-76 МСР-1 из С-концевой части молекулы МСР-1, хотя из литературы известно, что С-концевая область хемокина МСР-1 не имеет функционального значения в стимуляции клеточной миграции [8.9] и пептиды из этой области не конкурируют с меченым МСР-1 при взамодействии с рецепторами ТНР-1 клеток [10]. Таким образом, из литературных данных не следовало, что поиск пептидных ингибиторов МСР-1 стимулированной подвижности моноцитарых клеток из С-концевой части молекулы МСР-1 может привести к желаемым результатам. Заявляемый пептид нетоксичен, поскольку является фрагментом эндогенного белка МСР-1.The non-obviousness of the invention is due to the fact that the task is solved by synthesizing a peptide of sequence 66-76 MCP-1 from the C-terminal part of the MCP-1 molecule, although it is known from the literature that the C-terminal region of the MCP-1 chemokine does not have a functional value in stimulating cell migration [8.9] and peptides from this region do not compete with labeled MCP-1 when interacting with THP-1 cell receptors [10]. Thus, it did not follow from the literature that the search for peptide inhibitors of MCP-1 stimulated motility of monocytic cells from the C-terminal part of the MCP-1 molecule can lead to the desired results. The inventive peptide is non-toxic, as it is a fragment of the endogenous protein MCP-1.

Следует отметить, что наряду с заявляемым пептидом подобной ингибирующей активностью могут обладать и его аналоги общей формулы: X₁-DHLDKQTQTPKT-X₂, или их фармацевтически приемлемые соли, или их эфиры, или амиды, где X₁-H, низший ацил или X₁ содержит один или несколько аминокислотных остатков, причем аминокислоты выбраны из алифатической, ароматической или гетероциклической групп, Х₂-ОН, либо - NH₂, или содержит один или несколько аминокислотных остатков, причем аминокислоты выбраны из алифатической, ароматической или гетероциклической групп. Так, в литературе [10] имеются данные о том, что амидирование фрагментов МСР-1 усиливает их активность.It should be noted that, along with the claimed peptide, similar inhibitors of the general formula: X ₁ -DHLDKQTQTPKT-X ₂ , or their pharmaceutically acceptable salts, or their esters, or amides, where X ₁ -H, lower acyl or X, can possess similar inhibitory activity ₁ contains one or more amino acid residues, the amino acids selected from aliphatic, aromatic or heterocyclic groups, X ₂ —OH, or —NH ₂ , or contains one or more amino acid residues, the amino acids selected from aliphatic, aromatic or heterocyclic groups. So, in the literature [10] there is evidence that the amidation of fragments of MCP-1 enhances their activity.

В структуре заявляемого пептида по сравнению с прототипом отсутствует дисульфидная связь, что всегда упрощает синтез и очистку целевого продукта. Заявляемый пептид содержит одинаковое с прототипом количество аминокислотных остатков - 12, но все они - L-конфигурации, благодаря чему затраты на синтез пептида уменьшаются в несколько раз, поскольку D-аминокислоты гораздо дороже L-аминокислот.In the structure of the claimed peptide in comparison with the prototype there is no disulfide bond, which always simplifies the synthesis and purification of the target product. The inventive peptide contains the same amount of amino acid residues as the prototype — 12, but all of them are L-configurations, due to which the costs of peptide synthesis are reduced by several times, since D-amino acids are much more expensive than L-amino acids.

Синтез заявляемого пептида осуществляется по стандартной технологии пептидного синтеза на твердой фазе [11] с применением Fmoc-(9-флуоренилметоксикарбонил)-технологии. В качестве нерастворимого носителя использовали сополимер стирола с 1% дивинилбензола с кислотолабильными якорными группами. Для блокирования функциональных групп боковых цепей аминокислот применяли следующие защиты: трет-бутильную для карбоксильных групп аспарагиновой и глутаминовой кислот и гидроксильных функций серина и треонина; трет-бутилоксикарбонильную (Boc) - защиту для ε-аминогруппы лизина; 2, 2, 5, 7, 8-пентаметилхроман-6-сульфонильную (Pmc) - защиту для гуанидиновой функции аргинина; третильную (Trt) - группу для карбоксамидной функции глутамина. Пептидную цепь наращивали по одной аминокислоте, начиная синтез с С-конца. Для создания амидных связей использовали N,N' - диизопропилкарбодиимид в присутствии 1- гидроксибензотриазола (DIC/HOBt-метод). Для заключительного деблокирования и отщепления пептидов от носителя применяли трифторуксусную кислоту со скэвенджерами. Сырой продукт твердофазного синтеза очищали с использованием препаративной ВЭЖХ.The synthesis of the claimed peptide is carried out according to the standard technology of peptide synthesis on the solid phase [11] using the Fmoc- (9-fluorenylmethoxycarbonyl) technology. A copolymer of styrene with 1% divinylbenzene with acid labile anchor groups was used as an insoluble carrier. The following protections were used to block the functional groups of the amino acid side chains: tert-butyl for the carboxyl groups of aspartic and glutamic acids and the hydroxyl functions of serine and threonine; tert-butyloxycarbonyl (Boc) - protection for the ε-amino group of lysine; 2, 2, 5, 7, 8-pentamethylchroman-6-sulfonyl (Pmc) - protection for guanidine function of arginine; tertiary (Trt) is a group for the carboxamide function of glutamine. The peptide chain was increased by one amino acid, starting synthesis from the C-terminus. To create amide bonds, N, N '- diisopropylcarbodiimide was used in the presence of 1-hydroxybenzotriazole (DIC / HOBt method). Trifluoroacetic acid with scavengers was used for the final release and cleavage of the peptides from the carrier. The crude solid phase synthesis product was purified using preparative HPLC.

Пример 1. Синтез пептида H-DHLDKQTQTPKT-OH. Пептид синтезировали по стандартной программе для однократной конденсации Fmoc-аминокислот. Согласно этой программе синтетический цикл включал 20-минутную активацию 1 ммоль присоединяемой аминокислоты в присутствии эквивалентных количеств DIC и НОВТ в NMP (N-метилпирролидоне), деблокирование α-аминогрупп 20% раствором пиперидина в NMP в течение 20 мин, конденсацию с 1 ммоль (4-кратным избытком) ацилирующего агента в NMP в течение 37 мин и все необходимые промежуточные промывки пептидилполимера. Example 1. The synthesis of the peptide H-DHLDKQTQTPKT-OH. The peptide was synthesized according to the standard program for a single condensation of Fmoc amino acids. According to this program, the synthetic cycle included a 20-minute activation of 1 mmol of the attached amino acid in the presence of equivalent amounts of DIC and HOBT in NMP (N-methylpyrrolidone), the release of α-amino groups with a 20% solution of piperidine in NMP for 20 minutes, condensation with 1 mmol (4 -fold excess) of the acylating agent in NMP for 37 min and all necessary intermediate washes of the peptidyl polymer.

Для заключительного деблокирования и отщепления пептида от носителя пептидилполимеры суспендировали в 10 мл деблокирующей смеси: трифторуксусная кислота (TFA) - фенол - триизобутилсилан (TIBS) - тиоанизол - 1,2-этандитиол (EDT) (8.25: 0.5: 0.5: 0.5: 0.25) и перемешивали при 20°С 2 ч. Смолу отфильтровывали, промывали TFA (2×1 мл), фильтрат упаривали до объема 3-5 мл и прибавляли 100 мл сухого эфира или этилацетата. Осадок отфильтровывали, промывали эфиром и этилацетатом, сушили.For the final release and cleavage of the peptide from the carrier, the peptidyl polymers were suspended in 10 ml of the unlocking mixture: trifluoroacetic acid (TFA) - phenol - triisobutylsilane (TIBS) - thioanisole - 1,2-ethanedithiol (EDT) (8.25: 0.5: 0.5: 0.5: 0.25) and stirred at 20 ° C for 2 hours. The resin was filtered off, washed with TFA (2 × 1 ml), the filtrate was evaporated to a volume of 3-5 ml and 100 ml of dry ether or ethyl acetate was added. The precipitate was filtered off, washed with ether and ethyl acetate, and dried.

Очистка пептида. Полученный сырой продукт растворяли в 5-10% уксусной кислоте (АсОН) и хроматографировали на колонке (25×250 мм) с Диасорбом-130Т C₁₆, 10 мкм. Элюцию проводили градиентом концентрации (0.5% в минуту) СН₃CN в 0.01М ацетате аммония, рН 4.5 со скоростью потока 12 мл/мин. Фракции, соответствующие целевому продукту, объединяли, упаривали, остаток растворяли в воде и лиофилизовали. Чистота полученного продукта - 96% по данным высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Выход в расчете на стартовую аминокислоту составил 46%. Для C₅₉P₉₈N₁₈O₂₂ найдено: MALDI-MS (масс-спектрометрия с лазерной десорбцией): m/z [М+Н]⁺ 1411,7, вычислено [М+Н]⁺ 1411,5. Структура полученного соединения подтверждена спектром ядерного магнитного резонанса (¹Н-ЯМР).Purification of the peptide. The resulting crude product was dissolved in 5-10% acetic acid (AcOH) and chromatographed on a column (25 × 250 mm) with Diasorb-130T C ₁₆ , 10 μm. Elution was carried out with a concentration gradient (0.5% per minute) of CH ₃ CN in 0.01 M ammonium acetate, pH 4.5 with a flow rate of 12 ml / min. The fractions corresponding to the target product were combined, evaporated, the residue was dissolved in water and lyophilized. The purity of the obtained product is 96% according to high performance liquid chromatography (HPLC). The yield per starting amino acid was 46%. For C ₅₉ P ₉₈ N ₁₈ O ₂₂ found: MALDI-MS (laser desorption mass spectrometry): m / z [M + H] ⁺ 1411.7, calculated [M + H] ⁺ 1411.5. The structure of the obtained compound was confirmed by a nuclear magnetic resonance spectrum ( ¹ H-NMR).

Тестирование синтезированного пептида проводилось по оценке его влияния на миграцию промоноцитарных клеток линии ТНР-1 и моноцитов периферической крови человека, стимулированную МСР-1.Testing of the synthesized peptide was carried out to assess its effect on the migration of promonocytic cells of the THP-1 line and monocytes of human peripheral blood, stimulated by MCP-1.

Пример 2. Определение миграционной способности клеток. Миграционную способность клеток оценивали, используя камеру Бойдена [12]. В нижние ячейки камеры Бойдена помещали раствор МСР-1, 50-100 нг/мл, в верхние ячейки камеры вносили по 50 мкл суспензии клеток. Верхние и нижние ячейки разделяли поликарбонатной мембраной с размером пор 5 мкм (для оценки миграции моноцитов) и 8 мкм (для оценки миграции клеток ТНР-1). Камеру переносили в СО₂-инкубатор на 1 час (при исследовании миграции моноцитов) или на 3 часа (при изучении миграции клеток ТНР-1). Непромигрировавшие клетки счищали, клетки, оставшиеся на фильтре, фиксировали в метаноле 5 мин и окрашивали красителем Гимза. Мембрану с прокрашенными клетками сканировали на сканере HP ScanJet 5300С и обсчитывали при помощи программы SigmaGel. Данные представляли в относительных единицах, представляющих отношение клеточной миграции в опыте к контрольной величине, полученной при оценке миграции клеток, прошедших сквозь фильтр в отсутствии хемоаттрактанта.Example 2. Determination of the migratory ability of cells. Migration ability of cells was evaluated using a Boyden chamber [12]. A solution of MCP-1, 50-100 ng / ml, was placed in the lower cells of the Boyden chamber, 50 μl of cell suspension was added to the upper cells of the chamber. The upper and lower cells were separated by a polycarbonate membrane with a pore size of 5 μm (to assess the migration of monocytes) and 8 μm (to assess the migration of THP-1 cells). The camera was transferred to a CO ₂ incubator for 1 hour (when studying the migration of monocytes) or for 3 hours (when studying the migration of THP-1 cells). Non-migrating cells were cleaned, the cells remaining on the filter were fixed in methanol for 5 min and stained with Giemsa stain. The stained cell membrane was scanned on an HP ScanJet 5300C scanner and counted using the SigmaGel program. Data were presented in relative units, representing the ratio of cell migration in the experiment to the control value obtained by evaluating the migration of cells that passed through the filter in the absence of a chemoattractant.

Пептид растворяли в бидистиллированной Н₂О в концентрации 10 мМ и добавляли как в клеточную суспензию перед внесением в микрокамеру, так и в нижние ячейки микрокамеры. Конечная концентрация пептидов составляла 100 мкМ. Достоверность различий в данных по миграции клеток оценивали с помощью t-критерия Стьюдента.The peptide was dissolved in bidistilled H ₂ O at a concentration of 10 mM and added both to the cell suspension before entering the microcamera and to the lower cells of the microcamera. The final concentration of peptides was 100 μM. The significance of differences in cell migration data was evaluated using Student's t-test.

Было показано, что заявляемый пептид ингибировал МСР-1-опосредованную миграцию клеток ТНР-1 на 30±5%, в то время как пептид-прототип ингибировал МСР-1-опосредованную миграцию клеток ТНР-1 на 15±5%. Было показано также, что заявляемый пептид ингибировал миграцию моноцитов в условиях модели in vitro на 21±5%, в то время как пептид-прототип ингибировал миграцию моноцитов в условиях модели in vitro на 32±7%. Эти данные свидетельствуют о сходном ингибирующем влиянии заявляемого пептида и прототипа. Полученные данные проиллюстрированы на приведенном чертеже.It was shown that the claimed peptide inhibited MCP-1-mediated migration of THP-1 cells by 30 ± 5%, while the prototype peptide inhibited MCP-1-mediated migration of THP-1 cells by 15 ± 5%. It was also shown that the claimed peptide inhibited the migration of monocytes in the in vitro model by 21 ± 5%, while the prototype peptide inhibited the migration of monocytes in the in vitro model by 32 ± 7%. These data indicate a similar inhibitory effect of the claimed peptide and prototype. The data obtained are illustrated in the drawing.

Заявляемый пептид нетоксичен, поскольку является фрагментом эндогенного белка МСР-1.The inventive peptide is non-toxic, as it is a fragment of the endogenous protein MCP-1.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫLIST OF REFERENCES

1. Baggiolini M. //Nature. 1998. V.392. P. 565-568.1. Baggiolini M. // Nature. 1998. V.392. P. 565-568.

2. Libby P. //J. Intern. Med. 2000. V.247. P.349-358.2. Libby P. // J. Intern. Med. 2000. V.247. P.349-358.

3. Ross R. // Am Heart J. 1999. V.138. P. 419-420.3. Ross R. // Am Heart J. 1999. V.138. P. 419-420.

4. Rollins B.L. // Blood. 1997. V.90. P.909-928.4. Rollins B.L. // Blood. 1997. V.90. P.909-928.

5. Lee J.C. // Immunophatology. 2000. V. 47. P. 185-201.5. Lee J.C. // Immunophatology. 2000.V. 47.P. 185-201.

6. Reckleess J., Grainger D. J. II Biochem. J. 1999. V. 340. P. 803-Gong J.-H., Clark-Levis I. // J Exp.Med. 1995. V 181. P. 631-640.6. Reckleess J., Grainger D. J. II Biochem. J. 1999. V. 340. P. 803-Gong J.-H., Clark-Levis I. // J Exp.Med. 1995. V 181. P. 631-640.

7. Reckleess J., Tatalick L. M., Grainger D. J. // Immunology. 2001. V. 103. P. 1-17.7. Reckleess J., Tatalick L. M., Grainger D. J. // Immunology. 2001. V. 103. P. 1-17.

8. Нап К.Н., Green S.R., Tangirala R.K., Tanaka S., Quenhenberger O. // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 32055-32062.8. Nap K.N., Green S.R., Tangirala R.K., Tanaka S., Quenhenberger O. // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 32055-32062.

9. Jarnagin К., Grunherger D., Mulkins M., Wong В., Hemmerich S., Paavola C; Bloom A., Bhakta S., Diehl F., Freedman R., McCarley D., Polsky I., Ping-Tsou A., Kosaka A., Handel T.M. // Biochemistry. 1999. V.38. P. 16167-16177.9. Jarnagin K., Grunherger D., Mulkins M., Wong B., Hemmerich S., Paavola C; Bloom A., Bhakta S., Diehl F., Freedman R., McCarley D., Polsky I., Ping-Tsou A., Kosaka A., Handel T.M. // Biochemistry. 1999. V.38. P. 16167-16177.

10. Steitz S.A.. Hasegava K., Chiang S.-L., Coob R.R., Castro MA, Lobl T.J\ Yamada M., Lazarides E., Cardarelli HP.M. //FEBS Letters. 1998. V.430. P. 158-164.10. Steitz S.A .. Hasegava K., Chiang S.-L., Coob R.R., Castro MA, Lobl T.J. \ Yamada M., Lazarides E., Cardarelli HP.M. // FEBS Letters. 1998. V.430. P. 158-164.

11. Neimark J. and Brian J. P.// Peptide Research. 1993. V/6. P 216.11. Neimark J. and Brian J. P. // Peptide Research. 1993. V / 6. P 216

12. Valente A.J., Rozek M.M., Schwartz C.J., Graves D.T. //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991. V. 176. P. 309-314.12. Valente A.J., Rozek M.M., Schwartz C.J., Graves D.T. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991. V. 176. P. 309-314.

13. Falk W., Goodwin R. H. Jr., Leonard E.J. // J. Immunol. Methods. 1980. V. 33. P.239-247.13. Falk W., Goodwin R. H. Jr., Leonard E.J. // J. Immunol. Methods 1980. V. 33. P.239-247.

Claims

The peptide H-DHLDKQTQTPKT-OH and its pharmaceutically acceptable salts.