RU2255977C1 - Способ определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза - Google Patents
Способ определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза Download PDFInfo
- Publication number
- RU2255977C1 RU2255977C1 RU2003133099/13A RU2003133099A RU2255977C1 RU 2255977 C1 RU2255977 C1 RU 2255977C1 RU 2003133099/13 A RU2003133099/13 A RU 2003133099/13A RU 2003133099 A RU2003133099 A RU 2003133099A RU 2255977 C1 RU2255977 C1 RU 2255977C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- tuberculosis
- medium
- mycobacteria
- test tubes
- antituberculous
- Prior art date
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к микробиологической диагностике лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам и может найти применение в бактериологических лабораториях противотуберкулезных учреждений. Предлагаемый способ определения лекарственной чувствительности M.tuberculosis осуществляют на питательной среде, состоящей из двух слоев. Для приготовления двухслойной среды стерильный ПФД (перфтордекалин) в количестве 2 мл помещают в пробирку, на него наслаивают 2 мл обогащенной среды Школьниковой. Таким образом формируют систему, нижнюю фазу которой составляет более тяжелый ПФД, а верхнюю - питательный бульон. Для разведения в среде готовят навески основных противотуберкулезных препаратов из чистых субстанций, затем порошки разводят стерильной дистиллированной водой, раствор вносят в питательную среду по 0,1 мл. В результате окончательная концентрация каждого из препаратов в среде соответствует критической. Тестируемый штамм в виде микробной взвеси вносят в каждую пробирку по 0,2 мл. Микробный рост в пробирках с противотуберкулезными препаратами оценивают по сравнению с ростом в контроле с помощью 2% раствора ТТХ (трифенил-тетразолия хлористого), который добавляют по 0,1 мл в каждую из 5 пробирок на 8 день культивирования. Затем пробирки инкубируют еще 24 часа, в течение этого периода колонии микобактерий, выросшие на границе фаз, окрашиваются в бордовый цвет. Культуру считают устойчивой, если интенсивность окрашивания колоний, выросших на границе фаз, в пробирке с препаратом примерно соответствует интенсивности окраски в контроле. При сравнении результатов точности определения лекарственной чувствительности с референс-методами получено полное совпадение результатов, однако способ по изобретению позволит сократить длительность определения до 9-ти дней. 1 з.п. ф-лы, 2 табл.
Description
Изобретение относится к области медицины, а именно к микробиологической диагностике лекарственной чувствительности M.tuberculosis к противотуберкулезным препаратам, и может найти применение в бактериологических лабораториях противотуберкулезных учреждений в условиях ограниченного финансирования.
Известен метод определения ЛЧ микобактерий с помощью ручной флюоресцентной системы BBL MGIT (BD). Индикация роста микобактерий в этой системе осуществляется по флюоресценции индикатора, расположенного в придонной части пробирки MGIT (Mycobacteria Growth Indicator Tube), содержащей бульон Middlebrook 7H9. Для оценки результатов в этой системе необходим источник ультрафиолетового излучения - трансиллюминатор (длина волны 365 нм) или прибор MicroMGIT. Кроме того, альтернативу классическим методикам представляют бактериологические системы, основанные на бульонном культивировании с помощью анализаторов: полуавтоматического радиометрического ВАСТЕС 460 и полностью автоматизированного ВАСТЕС MGIT 960, которые хорошо совместимы между собой по результатам. Определение ЛЧ с использованием ручной бактериологической системы BBL MGIT или анализаторов ВАСТЕС 460 и ВАСТЕС 960 занимает по времени 3-4 недель, при этом тестирование связано с дорогостоящим оборудованием и реактивами, что делает его неприемлемым при недостаточных ресурсах здравоохранения (Проблемы туберкулеза. – 2002 - №1, - стр.58-62).
Наиболее близким ускоренным и дешевым способом определения ЛЧ M.tuberculosis является способ посева микробных клеток в жидкую обогащенную среду Школьниковой с противотуберкулезными препаратами с последующим определением роста M.tuberculosis.
(Драбкина P.O. Микробиология туберкулеза. - М.: Медгиз, 1963, - 225 стр.).
Однако известный способ не обеспечивает необходимый рост M.tuberculosis, эффективность, скорость и точность определения ЛЧ.
Целью предложенного способа является увеличение скорости роста М. tuberculosis, повышение точности и сокращение срока определения ЛЧ M.tuberculosis, что повышает эффективность определения ЛЧ к противотуберкулезным препаратам и как следствие своевременное назначение необходимой противотуберкулезной терапии и коррекцию проводимого лечения.
Указанная цель достигается тем, что создают двухфазную жидкую среду, в качестве нижней фазы в которой используют перфтордекалин-газовую подложку - с концентрацией свободных ионов менее 10-6 М, при соотношении слоев обогащенной среды Школьниковой к подложке, равном 1:1, с последующей оценкой метаболической активности микробных клеток с помощью 2%-ного трифенил-тетразолия хлористого.
Использование газовой подложки дает возможность улучшить аэрацию растущей культуры и замедлить развитие ацидоза за счет газообмена между средой и подложкой и на разделе фаз проводить калориметрическую оценку наличия или отсутствия роста M.tuberculosis посредством 2%-ного трифенил-тетразолия хлористого (далее - ТТХ), который в течение 24 часов окрашивает активно растущую микробную популяцию.
В присутствии растущих микобактерий бесцветный ТТХ изменяет свой цвет на бордовый/малиновый, окрашивая микроколонии. Величину микобактериального роста, который располагается преимущественно на границе фаз, значительно легче оценить визуально при использовании ТТХ.
Предлагаемый способ определения лекарственной чувствительности М. tuberculosis с использованием двухфазной среды с ПФД осуществляется следующим образом.
Для приготовления двухфазной среды стерильный ПФД в количестве 2 мл помещался в пробирку, на него наслаивали 2 мл обогащенной среды Школьниковой. Таким образом, формировалась двухфазная система, нижнюю фазу которой составлял более тяжелый ПФД, а верхнюю - питательный бульон - обогащенная среда Школьниковой.
Готовили навески основных противотуберкулезных препаратов из чистых субстанций, затем порошки разводили стерильной дистиллированной водой, раствор вносили в питательную среду по 0,1 мл. В результате окончательная концентрация каждого из препаратов в среде соответствовала приведенной в таблице 1.
Таблица 1
Критические (низкие) концентрации препаратов (мкг/мл) в пробирках
Среда для определения ЛЧ | Противотуберкулезные препараты, содержащиеся в средах | |||
Стрептомицин | Изониазид | Рифампицин | Этамбутол | |
Школьниковой | 0,8* | 0,1* | 1,0* | 3,5* |
В таблице 2 представлены все необходимые при постановке теста компоненты, которые вносились в 4 пробирки с противотуберкулезными препаратами и 1 пробирку для контроля роста.
Таблица 2
Определение лекарственной чувствительности M.tuberculosis с использованием двухфазной системы
Препарат | ПФД | Обогащенная среда Шк. | Р-р препарата | Дистил. вода | Микробная взвесь | ТТХ |
Стрептомицин | 2,0 | 2,0 | 0,1 | 0,2 | 0,1 | |
Изониазид | 2,0 | 2,0 | 0,1 | 0,2 | 0,1 | |
Рифампицин | 2,0 | 2,0 | 0,1 | 0,2 | 0,1 | |
Этамбутол | 2,0 | 2,0 | 0,1 | 0,2 | 0,1 | |
Контроль роста (без препарата) | 2,0 | 2,0 | 0,1 | 0,2 | 0,1 |
Объектом исследования служили три культуры микобактерий:
M.tuberculosis H37Rv, лабораторный штамм, чувствительный к
противотуберкулезным препаратам;
M.tuberculosis, клинический изолят, устойчивый к изониазиду;
M.tuberculosis, клинический изолят, устойчивый к стрептомицину,
изониазиду, рифампицину и этамбутолу.
Из каждой культуры готовили микробную взвесь в физиологическом растворе с 0,05% твина-80 по стандарту мутности ГИСК, соответствующему 5×108 микробных тел/мл, затем взвесь разводили 1:10. Тестируемый штамм в виде микробной взвеси вносили в каждую пробирку по 0,2 мл.
Микробный рост в пробирках с противотуберкулезными препаратами оценивали по сравнению с ростом в контроле с помощью 2% раствора ТТХ, который добавляли по 0,1 мл в каждую из 5 пробирок на 8 день культивирования. Затем пробирки инкубировались еще 24 часа, в течение этого периода колонии микобактерий, выросшие на границе фаз, окрашивались в бордовый цвет. Культуру считали устойчивой, если интенсивность окрашивания колоний, выросших на границе фаз, в пробирке с препаратом примерно соответствовала интенсивности окраски в контроле.
Полученный результат определения лекарственной чувствительности сравнивался с референс-методами, которые регламентированы приказом МЗ РФ №109 от 2003 г.: на плотной среде Левенштейна-Йенсена (Л-Й) и с помощью оборудования BBL MGIT AST, в котором используются жидкие среды и флуоресцентный метод.
На плотной среде Левенштейна-Йенсена (Л-Й) удается обнаружить лекарственно устойчивые мутанты в культуре М. tuberculosis в течение 3-4 недель. Наиболее существенным недостатком этого метода является длительный срок исследования, значительно осложняющий своевременное назначение необходимой противотуберкулезной терапии и коррекцию проводимого лечения. Недостатком метода с применением оборудования BBL MGIT AST, в котором используются жидкие среды и флуоресцентный метод, является его высокая стоимость, поскольку требуется дорогое импортное оборудование и дорогие реактивы.
Пример 1 осуществления определения ЛЧ M.tuberculosis в жидкой двухфазной среде.
Для определения ЛЧ M.tuberculosis отбирали 30 изолятов M.tuberculosis, выделенных от больных с различными формами туберкулеза легких. Из них 16 культур M.tuberculosis были чувствительными, а 14 - устойчивыми к противотуберкулезным препаратам первого ряда.
Внесение противотуберкулезных препаратов: стрептомицина (S), изониазида (I), рифампицина (R) и этамбутола (Е), а также инокуляцию исследуемой культуры M.tuberculosis в двухфазную систему культивирования производили в соответствии со схемой, приведенной выше.
Результаты, полученные разработанным способом, сравнивали с данными определения ЛЧ, полученными классическим методом абсолютных концентраций на плотных средах Ливенштейна-Йенсена и методом с применением оборудования BBL MGIT AST, которые рассматривались в качестве референс-методов. Получено полное совпадение результатов чувствительности микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам. Однако на плотных средах исследование заняло 28 дней, на жидких средах с применением оборудования BBL MGIT AST - 20 дней, а предлагаемым способом - всего 9 дней, при этом способ низкозатратен и удобен в исполнении.
Наиболее важным для лечения и прогноза заболевания является выявление мультирезистентности, то есть определение чувствительности M.tuberculosis к рифампицину и изониазиду.
Таким образом, предлагаемый способ, не требующий дорогостоящего оборудования и реактивов, сопоставим по результатам с традиционными методами и позволяет определить ЛЧ культур M.tuberculosis, что самое главное - к рифампицину и изониазиду, в течение 9 дней, что в несколько раз быстрее, чем другими методами, и позволяет осуществить своевременное назначение необходимой противотуберкулезной терапии и коррекцию проводимого лечения.
Claims (2)
1. Способ определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза путем посева микробных клеток в жидкую обогащенную среду Школьниковой с противотуберкулезным препаратом, отличающийся тем, что посев осуществляют в двуслойную среду, нижний слой которой представляет собой перфтордекалин с концентрацией свободных ионов менее 10-6 М и количеством недофторированных примесей менее 0,003 мас.%, а верхний слой - обогащенная среда Школьниковой при соотношении слоев 1:1, с последующей оценкой метаболической активности микробных клеток, и по степени метаболической активности определяют чувствительность или резистентность микобактерий к противотуберкулезному препарату.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что метаболическую активность определяют с помощью окрашивания микробных клеток растворов трифенил-тетразолия хлористого.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2003133099/13A RU2255977C1 (ru) | 2003-11-12 | 2003-11-12 | Способ определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2003133099/13A RU2255977C1 (ru) | 2003-11-12 | 2003-11-12 | Способ определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2003133099A RU2003133099A (ru) | 2005-04-20 |
RU2255977C1 true RU2255977C1 (ru) | 2005-07-10 |
Family
ID=35634634
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2003133099/13A RU2255977C1 (ru) | 2003-11-12 | 2003-11-12 | Способ определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2255977C1 (ru) |
-
2003
- 2003-11-12 RU RU2003133099/13A patent/RU2255977C1/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования, под ред. М.О.БИРГЕРА, М., Мед., 1982, с.274-276. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2003133099A (ru) | 2005-04-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Heifets et al. | Current laboratory methods for the diagnosis of tuberculosis | |
Roberts et al. | Evaluation of the BACTEC radiometric method for recovery of mycobacteria and drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis from acid-fast smear-positive specimens | |
Walters et al. | Testing of susceptibility of Mycobacterium tuberculosis to isoniazid and rifampin by mycobacterium growth indicator tube method | |
EP0589634B1 (en) | Enhanced detection of microorganisms in samples | |
Runyon et al. | Ascitic fluid pH and lactate: insensitive and nonspecific tests in detecting ascitic fluid infection | |
CN102449137B (zh) | 包括结核分枝杆菌复合群分枝杆菌的分枝杆菌培养基和培养方法 | |
US5316918A (en) | Method and apparatus for testing MAI (mycobacterium avium-intracellulare) for antimicrobial agent sensitivity | |
AU672138B2 (en) | Method and apparatus for determining the sensitivity of MAI (mycobacterium avium-intracellulare) to different antibiotics and dosages thereof | |
KR20160045171A (ko) | 고정화제를 이용한 단일 세포 추적을 위한 신규한 생리 활성 검사용 구조물 | |
Heifets | Conventional methods for antimicrobial susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis | |
CN101130808B (zh) | 分枝杆菌快速培养药敏及鉴定微量检测法及装置 | |
Wallace et al. | Culturing mycobacteria | |
Heifets | Drug susceptibility testing | |
RU2255977C1 (ru) | Способ определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза | |
Fredricks et al. | Rapid pyrazinamide susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis by flow cytometry | |
Vincké et al. | Rapid susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis by a radiometric technique | |
RU2098486C1 (ru) | Способ диагностики бактериемии | |
DeCoster et al. | Susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis: comparison of the BACTEC TB-460 method and flow cytometric assay with the proportion method | |
Pohlod et al. | Structures suggesting cell-wall-deficient forms detected in circulating erythrocytes by fluorochrome staining | |
RU2315113C2 (ru) | Способ диагностики чувствительности mycobacterium tuberculosis к противотуберкулезным препаратам | |
CN102703572B (zh) | 检测结核杆菌药敏性的方法及培养基 | |
Cambau et al. | 7. First-and second-line drug susceptibility testing for Mycobacterium tuberculosis complex | |
RU2238316C2 (ru) | Способ определения гемолитической активности и ее типа у b.anthracis | |
RU2289813C2 (ru) | Способ выявления форм трихомонад | |
RU2470071C2 (ru) | ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ УСКОРЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ M. tuberculosis К ОСНОВНЫМ ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНЫМ ПРЕПАРАТАМ |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20051113 |