RU2249218C2

RU2249218C2 - Quick method for carrying out microwave-mediated solid-state immunoenzyme analysis

Info

Publication number: RU2249218C2
Application number: RU2003105687/15A
Authority: RU
Inventors: Прадееп НАХАР (IN); Прадееп НАХАР; Утпал БОРА (IN); Утпал БОРА; Гаинда Лал ШАРМА (IN); Гаинда Лал ШАРМА
Original assignee: Каунсил Оф Сайентифик Энд Индастриал Рисерч
Priority date: 2000-08-16
Filing date: 2000-08-16
Publication date: 2005-03-27

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: method involves applying ELISA. When doing it, antigen or antibody is immobilized on activated substrate. Microwave radiation is applied at frequency taken within the limits of 2300 and 2500 MHz at each stage from 5 to 200 s. Device has loading chamber, reaction chamber having magnetron, air-exhauster and unit for focusing light, chamber for washing and drying base plate or unit, detection chamber, platform for transferring base plates and computer means.

EFFECT: accelerated analysis method.

14 cl, 8 tbl

Description

Область изобретенияField of Invention

Настоящее изобретение относится к быстрому способу для осуществления СВЧ-опосредованного ELISA (MELISA). Более конкретно настоящее изобретение относится к быстрому и эффективному способу для СВЧ-опосредованного ELISA (MELISA), где все главные этапы ELISA могут быть осуществлены под воздействием микроволнового излучения через короткий период времени. Этот способ предназначен для использования в клинической диагностике, молекулярной биологии, сельском хозяйстве, пищевой промышленности, защиты в окружающей среды и тому подобное.The present invention relates to a fast method for implementing microwave-mediated ELISA (MELISA). More specifically, the present invention relates to a fast and efficient method for microwave-mediated ELISA (MELISA), where all the main steps of ELISA can be carried out under the influence of microwave radiation after a short period of time. This method is intended for use in clinical diagnostics, molecular biology, agriculture, food industry, environmental protection and the like.

Способ ELISA согласно настоящему изобретению является простым, сберегающим время и исключает требующую большого времени трудоемкую процедуру. Этот способ имеет потенциальную возможность для автоматизации.The ELISA method according to the present invention is simple, time-saving and eliminates the time-consuming laborious procedure. This method has the potential for automation.

Этот способ имеет преимущество перед существующими способами для ELISA, которые требуют большого времени, как правило, находящегося в пределах от нескольких часов до 2 дней, в то время как способ согласно настоящему изобретению занимает менее чем 10 минут. Он является предпочтительным для использования при диагностике заболеваний, где требуются быстрые результаты.This method has an advantage over existing ELISA methods, which require a lot of time, typically ranging from a few hours to 2 days, while the method according to the present invention takes less than 10 minutes. It is preferred for use in the diagnosis of diseases where quick results are required.

Уровень техникиState of the art

Иммуносорбентный твердофазный анализ (ELISA) представляет собой очень чувствительный способ, используемый для полуколичественного или количественного определения концентрации определенных антигенов и антител. Анализ (ELISA) стал полезным инструментом при диагностике заболеваний как у животных, так и у растений. Кроме этого, его другие применения включают в себя скрининг моноклональных антител в ходе их продуцирования (Douillard, J.Y. and Hoffman, T., 1983), детектирование остатков пестицидов в урожае зерновых (Van Emon, J.M. and Lopez-Avila, V., 1992) и в образцах, взятых из окружающей среды, подобных почве и воде (Linde, D.G. and Goh, K.S., 1995), детектирование апоптоза в культуре тканей и тому подобное (Salgame, P. et al, 1996). Для осуществления ELISA повсеместно используется полистироловый планшет для микротитрования, поскольку он является прозрачным, дешевым, легко доступным, может быть сформован в любой желаемой форме и обладает свойством связывания белков путем адсорбции. Обычные способы ELISA основываются на иммобилизации антигена или антитела на поверхности лунок полистиролового планшета для микротитрования путем адсорбции. Это приписывается нековалентному взаимодействию между биологической молекулой и полистирольной поверхностью.Immunosorbent solid phase analysis (ELISA) is a very sensitive method used for the semi-quantitative or quantitative determination of the concentration of certain antigens and antibodies. Analysis (ELISA) has become a useful tool in the diagnosis of diseases in both animals and plants. In addition, its other uses include screening for monoclonal antibodies during their production (Douillard, JY and Hoffman, T., 1983), detecting pesticide residues in a cereal crop (Van Emon, JM and Lopez-Avila, V., 1992) and in samples taken from environments like soil and water (Linde, DG and Goh, KS, 1995), detection of apoptosis in tissue culture and the like (Salgame, P. et al, 1996). For the implementation of ELISA, a polystyrene microtiter plate is widely used, since it is transparent, cheap, easily accessible, can be formed in any desired form and has the property of protein binding by adsorption. Conventional ELISA methods are based on the immobilization of an antigen or antibody on the surface of the wells of a polystyrene microtiter plate by adsorption. This is attributed to the non-covalent interaction between the biological molecule and the polystyrene surface.

Однако адсорбция обычно представляет собой слишком неэффективный процесс для получения хороших выходов и не всегда осуществляется в зависимости от дозы. Для преодоления неэффективности обычных способов многими осуществляется ковалентная иммобилизация биологических молекул на планшете для микротитрования (Satoh, A. et al, 1999). Также сообщалось о ковалентном связывании иммуногенов на привитых пластиковых поверхностях (Larsson, P.M. et al, 1987). Несмотря на это, обычный способ ELISA требует для завершения очень длительного периода времени, изменяющегося от нескольких часов до 2 дней. Это является главным недостатком различных способов ELISA, основанных либо на адсорбции, либо на ковалентном связывании. В случае необходимости оказания срочной медицинской помощи, теряется ценное время при осуществлении диагностики перед введением пациенту лекарственных средств. В сельском хозяйстве ELISA используется для детектирования остатков пестицидов в собранном урожае и в образцах, взятых из окружающей среды. Экспорт и маркетинг собранного урожая могут замедляться вследствие этой задержки при использовании способа ELISA, что приводит к потере валютных средств.However, adsorption is usually too inefficient to produce good yields and is not always dose dependent. To overcome the inefficiency of conventional methods, many covalently immobilize biological molecules on a microtiter plate (Satoh, A. et al, 1999). Covalent binding of immunogens on grafted plastic surfaces has also been reported (Larsson, P.M. et al, 1987). Despite this, the conventional ELISA method requires a very long period of time, varying from several hours to 2 days, to complete. This is a major disadvantage of various ELISA methods, based either on adsorption or on covalent binding. If urgent medical care is needed, valuable time is wasted during the diagnosis before administering drugs to the patient. In agriculture, ELISA is used to detect pesticide residues in the harvested crop and in environmental samples. Export and marketing of harvested crops may slow down due to this delay when using the ELISA method, which leads to the loss of foreign currency.

Авторы разработали новый и уникальный способ, при котором ELISA может осуществляться быстро, с помощью использования микроволнового (СВЧ) излучения. Микроволновое излучение известно как ускоряющее иммуногистохимию в течение примерно десятка лет (Boon. M.E and Kok, L.P., 1992; Boon, M.E. et al, 1989; Boon, M.E. et al, PCT заявка на патент WO 89703038; Chiu, K.Y. and Chan, K.W., 1987; Hjerpe, A. et al, 1988).The authors have developed a new and unique way in which ELISA can be carried out quickly using microwave (microwave) radiation. Microwave radiation has been known to accelerate immunohistochemistry for about a decade (Boon. ME and Kok, LP, 1992; Boon, ME et al, 1989; Boon, ME et al, PCT patent application WO 89703038; Chiu, KY and Chan, KW , 1987; Hjerpe, A. et al, 1988).

О ковалентной иммобилизации антигена или антитела на полистирольной поверхности под воздействием микроволнового излучения до сих пор не сообщалось. И в самом деле, осуществление всех главных этапов способа ELISA под воздействием микроволнового излучения, за короткое время, для детектирования малых количеств антигена или антитела, с помощью измерения оптической плотности не были известны из уровня техники.Covalent immobilization of an antigen or antibody on a polystyrene surface under the influence of microwave radiation has not yet been reported. In fact, the implementation of all the main steps of the ELISA method under the influence of microwave radiation, in a short time, to detect small amounts of antigen or antibody by measuring optical density were not known from the prior art.

Однако известны попытки осуществления одного из этапов ELISA под воздействием микроволнового излучения (Hjerpe, A. et al, 1988), где полистироловые планшеты для ELISA сначала покрывают антиканцероэмбрионным антигеном кролика, путем инкубирования в течение ночи, при температуре 4°C, с последующим инкубированием антигена (CEA). На следующем этапе, то есть после добавления связанных с ферментом антител, авторы изучали воздействие микроволнового излучения на реакции антиген-антитело.However, attempts to carry out one of the ELISA steps under the influence of microwave radiation are known (Hjerpe, A. et al, 1988), where the polystyrene ELISA plates are first coated with rabbit anticanceroembryonic antigen by incubation overnight at 4 ° C, followed by incubation of the antigen (CEA). In the next step, that is, after adding antibodies associated with the enzyme, the authors studied the effect of microwave radiation on antigen-antibody reactions.

В другом эксперименте тех же авторов планшеты для ELISA сначала покрывались сывороткой нормальных мышей, путем инкубирования в течение ночи, при температуре 4°C, с последующим инкубированием в течение ночи вместе с немеченным Ig кролика антимышь. на следующем этапе они добавляли комплексы PAP (пероксидаза-антипероксидаза) мыши и определяли воздействие микроволнового излучения на временные константы реакций на этом последнем этапе.In another experiment of the same authors, ELISA plates were first coated with the serum of normal mice by incubation overnight at 4 ° C, followed by incubation overnight with unlabeled rabbit Ig anti-mouse. at the next stage, they added mouse PAP (peroxidase-antiperoxidase) complexes and determined the effect of microwave radiation on the reaction time constants at this last stage.

В третьем эксперименте Hjerpe, A. et.al сначала покрывали планшеты неспецифичной сывороткой мышей, с последующим инкубированием вместе с биотинилированным IgG лошади антимышь. Затем планшеты использовались для исследования воздействия микроволнового излучения при последующем связывании биотинавидиновых комплексов.In a third experiment, Hjerpe, A. et.al first coated the plates with non-specific mouse serum, followed by incubation with the anti-mouse biotinylated horse IgG. Then the tablets were used to study the effects of microwave radiation during subsequent binding of biotinavidin complexes.

Во всех указанных выше экспериментах выходы реакций были меньшими у образцов, подвергавшихся воздействию микроволнового излучения, при сравнении с теми, которые обрабатывались без стимуляции с помощью микроволнового излучения. Эксперименты продемонстрировали, что микроволновое излучение вызывает главные потери реакционной способности, и общие выходы составляли приблизительно от 10 до 15%, если сравнивать с теми, которые обычно получались без использования микроволновой печи. Согласно авторам при микроволновой методике уменьшение значений может быть вызвано слишком высокими температурами в лунках, несмотря на тот факт, что в качестве меры компенсации использовались загрузка воды (пробирка с водой, чтобы поглощать избыток СВЧ-энергий) и охлаждаемый нижний планшет.In all the above experiments, the reaction yields were lower for samples exposed to microwave radiation, compared with those that were treated without stimulation using microwave radiation. Experiments have shown that microwave radiation causes major loss of reactivity, and the total yields are approximately 10 to 15%, when compared with those normally obtained without a microwave oven. According to the authors, in the microwave method, a decrease in the values can be caused by too high temperatures in the wells, despite the fact that a load of water (a test tube with water to absorb excess microwave energy) and a cooled bottom plate were used as a compensation measure.

В дальнейшем эксперименте ELISA авторы (Koh и Boon, 1992) использовали оптоволоконный термометр для ограничения температуры в пределах ниже 40°C. Здесь также использовалась загрузка воды, составляющая 200 мл водопроводной воды. Наряду с этим жидкость в лунках перемешивалась путем медленной продувки воздуха через раствор с помощью тонких пластиковых наконечников, которые были вставлены в лунки. В эксперименте авторов осуществляются только два этапа, а именно этап связывания антитела и конъюгата под воздействием микроволнового излучения, в течение 6 минут, при 150 ватт, каждая.In a further ELISA experiment, the authors (Koh and Boon, 1992) used a fiber optic thermometer to limit the temperature to below 40 ° C. A water charge of 200 ml of tap water was also used here. In addition, the liquid in the wells was mixed by slowly blowing air through the solution using thin plastic tips that were inserted into the wells. In the experiment of the authors, only two stages are carried out, namely, the stage of binding of the antibody and conjugate under the influence of microwave radiation, for 6 minutes, at 150 watts each.

В другом эксперименте этапы связывания антитела, антигена и конъюгата осуществляются за 15, 30 и 30 минут, соответственно, используя 45-50% микроволновой мощности на каждом этапе.In another experiment, the steps of binding an antibody, antigen, and conjugate are performed in 15, 30, and 30 minutes, respectively, using 45-50% of the microwave power at each step.

Оставшиеся этапы в обоих экспериментах осуществляются с помощью обычной процедуры.The remaining steps in both experiments are carried out using the usual procedure.

Но в указанных выше экспериментах значения ELISA, как обнаружено, являются гораздо меньшими, чем при традиционном способе.But in the above experiments, the ELISA values were found to be much smaller than with the traditional method.

Согласно авторам более длительное время экспонирования дает более высокое значение экстинкции (показатель ELISA), но преимущество во времени выглядит непривлекательно. В действительности, такое преимущество отсутствует при использовании времени экспонирования 30 минут или более. Слишком короткие периоды времена экспонирования приводят к значениям экстинкции, которые являются скорее низкими и не могут быть использованы.According to the authors, a longer exposure time gives a higher extinction value (ELISA score), but the time advantage seems unattractive. In fact, there is no such advantage when using exposure time of 30 minutes or more. Excessively short exposure times lead to extinction values that are rather low and cannot be used.

Способы ELISA с экспонированием для микроволнового излучения, о которых сообщалось, имеют несколько недостатков, таких как (1) результаты (значения ELISA) являются гораздо меньшими, чем при обычной процедуре, (2) преимущество по времени не является привлекательным. Может быть возможным получение сравнимых результатов (значений ELISA) путем осуществления ELISA вне микроволновой печи за то же самое время, (3) процедура требует загрузки воды, (4) требуется система охлаждения или охлаждаемый нижний планшет, (5) требуется система перемешивания в лунках планшета для микротитрования, (6) не все этапы осуществляются с помощью энергии микроволнового излучения, и процедура ELISA, о которой сообщается, имеет очень низкий потенциал для автоматизации, если вообще имеет какой-либо.The reported ELISA methods for microwave exposure that have been reported have several drawbacks, such as (1) the results (ELISA values) are much smaller than with the conventional procedure, (2) the time advantage is not attractive. It may be possible to obtain comparable results (ELISA values) by performing an ELISA outside the microwave oven at the same time, (3) the procedure requires loading of water, (4) a cooling system or a cooled bottom plate is required, (5) a mixing system in the wells is required for microtiter, (6) not all steps are carried out using microwave energy, and the ELISA reported is of very low potential for automation, if any.

Авторы настоящего изобретения устраняют все указанные выше недостатки. На самом деле, подобно тепловой энергии, микроволновое излучение также может активировать или инактивировать биологическую молекулу. При отсутствии соответствующих условий микроволновое излучение может вызвать частичное или полное разрушение биологической молекулы, приводя к низкому или нежелательному значению ELISA. В способе согласно настоящему изобретению используются соответствующие условия, большинство из которых представляет собой противоположность способу, известному из уровня техники, или неизвестно в данной области. В способе согласно настоящему изобретению все этапы, исключая проявление окраски, осуществляются при стимуляции под воздействием микроволнового излучения. Этап блокирования не осуществлялся под воздействием микроволнового излучения в известном из уровня технике способе, поскольку он дает неспецифическое связывание, в то время как авторы изобрели способ, где этап блокирования осуществляется в течение короткого времени под воздействием микроволнового излучения. Более длительное время экспонирования для микроволнового излучения в способе, известном из уровня техники, приводит к более высокому значению ELISA, в то время как при осуществлении способа согласно настоящему изобретению он приводит к разрушению материала или к неспецифическому связыванию. Это может происходить из-за того, что загрузка воды или система охлаждения, используемая в способе, известном из литературы, поглощает большую часть энергии микроволнового излучения, давая минимальное воздействие микроволнового излучения и значительное воздействие времени, в обычном способе. В противоположность этому способ согласно настоящему изобретению не требует никакой загрузки воды, системы охлаждения или системы перемешивания. Более того, в способе согласно настоящему изобретению для ELISA требуется время, примерно в 200 раз меньшее (исключая этап проявления окраски) чем для традиционного способа (который занимает примерно 18 часов), со сравнимым или даже лучшим показателем ELISA. Кроме того, он также обладает хорошим потенциалом для автоматизации.The authors of the present invention eliminate all of the above disadvantages. In fact, like thermal energy, microwave radiation can also activate or inactivate a biological molecule. In the absence of appropriate conditions, microwave radiation can cause partial or complete destruction of the biological molecule, leading to a low or undesirable ELISA value. Appropriate conditions are used in the method of the present invention, most of which are the opposite of the method known in the art or unknown in the art. In the method according to the present invention, all steps, excluding the appearance of color, are carried out under stimulation under the influence of microwave radiation. The blocking step was not carried out under the influence of microwave radiation in a method known from the prior art, since it gives non-specific binding, while the inventors have invented a method where the blocking step is carried out for a short time under the influence of microwave radiation. A longer exposure time for microwave radiation in a method known from the prior art leads to a higher ELISA, while when implementing the method according to the present invention, it leads to destruction of the material or to non-specific binding. This may be due to the fact that the water charge or cooling system used in the method known from the literature absorbs most of the energy of microwave radiation, giving minimal exposure to microwave radiation and a significant effect of time, in a conventional method. In contrast, the method according to the present invention does not require any loading of water, cooling system or mixing system. Moreover, in the method according to the present invention, an ELISA requires a time of about 200 times less (excluding the color development step) than for the traditional method (which takes about 18 hours), with a comparable or even better ELISA. In addition, it also has good potential for automation.

Известный из уровня техники ELISA осуществляется на планшете для микротитрования, который не связывает биологическую молекулу с помощью ковалентной связи. На самом деле, известно, что микроволновое излучение может легко воздействовать на целостность нековалентного вторичного связывания, такого как водородные связи, гидрофобные связи и ван-дер-Ваальсово взаимодействие.The ELISA of the prior art is carried out on a microtiter plate that does not bind the biological molecule by covalent bonding. In fact, it is known that microwave radiation can easily affect the integrity of non-covalent secondary binding, such as hydrogen bonds, hydrophobic bonds, and van der Waals interaction.

Цели изобретенияOBJECTS OF THE INVENTION

Главной целью настоящего изобретения является создание быстрого и эффективного способа для иммуносорбентного твердофазного анализа, для спектрофотометрического детектирования малых количеств антигена или антитела с целью быстрой диагностики заболеваний.The main objective of the present invention is to provide a quick and effective method for immunosorbent solid-phase analysis, for spectrophotometric detection of small amounts of antigen or antibody for the rapid diagnosis of diseases.

Другой целью настоящего изобретения является создание способа, который является простым, воспроизводимым и не требует дополнительного опыта или дорогостоящего оборудования.Another objective of the present invention is to provide a method that is simple, reproducible and does not require additional experience or expensive equipment.

Другой целью настоящего изобретения является создание быстрой реализации способа, который имеет потенциал для автоматизации и который может свести к минимуму ошибку оператора, которая обычно изменяется от одного человека к другому.Another objective of the present invention is to provide a quick implementation of a method that has the potential for automation and which can minimize operator error, which usually varies from one person to another.

Краткое описание изобретенияSUMMARY OF THE INVENTION

Имея в виду достижение целей и преодоление недостатков известного способа ELISA, предусматривается быстрый и эффективный способ для СВЧ-опосредованного ELISA (MELISA), который включает в себя этапы: (i) ковалентную иммобилизацию антигена или антитела на активированной твердой поверхности с помощью воздействия микроволнового излучения, (ii) блокировки свободной поверхности с помощью блокирующего агента путем краткого воздействия микроволнового излучения, (iii) связывания антитела или антигена с помощью контролируемого воздействия микроволнового излучения, (iv) связывания конъюгата с помощью контролируемого воздействия микроволнового излучения, (v) добавления красителя и субстрата в лунки и (vi) измерения значения коэффициента поглощения.In order to achieve the goals and overcome the disadvantages of the known ELISA method, a fast and effective method for microwave-mediated ELISA (MELISA) is provided, which includes the steps of: (i) covalent immobilization of an antigen or antibody on an activated solid surface by exposure to microwave radiation, (ii) blocking the free surface with a blocking agent by brief exposure to microwave radiation, (iii) binding of an antibody or antigen via a controlled exposure to microwave radiation, (iv) conjugate binding via controlled exposure to microwave radiation, (v) adding dye and substrate to the wells, and (vi) measuring the absorption coefficient.

Процедура СВЧ-опосредованного ELISA (MELISA) осуществляется на активированной поверхности за очень короткое время (около 10 минут) и с такой же эффективностью, как и у обычного ELISA, производимого при 37°C, за 16-18 час.The microwave-mediated ELISA (MELISA) procedure is carried out on an activated surface in a very short time (about 10 minutes) and with the same efficiency as a conventional ELISA produced at 37 ° C in 16-18 hours.

Настоящее изобретение обеспечивает возможность автоматизации или полуавтоматизации способа ELISA.The present invention enables the automation or semi-automation of an ELISA method.

Микроволновое излучение является известным как воздействующее на целостность нековалентного вторичного связывания, такого как водородные связи, гидрофобные взаимодействия и ван-дер-Ваальсово взаимодействие.Microwave radiation is known as affecting the integrity of non-covalent secondary binding, such as hydrogen bonds, hydrophobic interactions and van der Waals interaction.

Для преодоления этой проблемы авторы активируют поверхность лунок планшетов для микротитрования перед использованием. Активированная поверхность иммобилизирует антиген с помощью ковалентной связи при кратком экспонировании для микроволнового излучения. Этот ковалентно иммобилизованный антиген является достаточно стабильным для того, чтобы выдерживать повторяющиеся, но краткие периоды экспонирования для микроволнового излучения, которые являются необходимыми для осуществления последующих этапов ELISA. Последующие этапы связывания биологической молекулы в процедуре ELISA осуществляются с помощью нековалентного связывания, которое является восприимчивым к энергии микроволнового излучения. Эти проблемы преодолеваются путем контроля времени и энергии микроволнового излучения, подводимого на каждом этапе.To overcome this problem, the authors activate the surface of the wells of microtiter plates before use. The activated surface immobilizes the antigen via a covalent bond upon brief exposure for microwave radiation. This covalently immobilized antigen is stable enough to withstand the repeated but brief exposure periods for microwave radiation, which are necessary for the subsequent ELISA steps. The subsequent steps of binding a biological molecule in an ELISA procedure are carried out using non-covalent binding, which is susceptible to microwave energy. These problems are overcome by controlling the time and energy of the microwave radiation supplied at each stage.

Новизна настоящего изобретения заключается в том, что ELISA осуществляется на активированной поверхности, способной к формированию ковалентной связи с белковым лигандом.The novelty of the present invention lies in the fact that ELISA is carried out on an activated surface capable of forming a covalent bond with a protein ligand.

СВЧ-опосредованная ковалентная иммобилизация биологической молекулы, более предпочтительно антигена или антитела, на активированной поверхности представляет собой другой новый существенный признак настоящего изобретения.Microwave-mediated covalent immobilization of a biological molecule, more preferably an antigen or antibody, on an activated surface is another new significant feature of the present invention.

Контролируемое воздействие микроволнового излучения на каждом этапе процедуры ELISA представляет собой другой новый подход.The controlled exposure to microwave radiation at every step of the ELISA procedure represents another new approach.

В способе согласно настоящему изобретению все этапы ELISA, такие как связывание антигена, блокировка, связывание антитела и конъюгата, осуществляются под воздействием микроволнового излучения, и только взаимодействие фермент-субстрат осуществляется вне микроволновой печи при комнатной температуре. Способ ELISA согласно настоящему изобретению является очень быстрой, со сравнимым или даже лучшим показателем ELISA, чем у традиционного способа.In the method according to the present invention, all ELISA steps, such as antigen binding, blocking, antibody and conjugate binding, are carried out under the influence of microwave radiation, and only the enzyme-substrate interaction is carried out outside the microwave oven at room temperature. The ELISA method according to the present invention is very fast, with a comparable or even better ELISA score than the traditional method.

Другим новым отличительным признаком настоящего изобретения является то, что способ ELISA согласно настоящему изобретению не требует никакой загрузки воды или системы перемешивания.Another new feature of the present invention is that the ELISA method according to the present invention does not require any loading of water or a mixing system.

Другим новым отличительным признаком настоящего изобретения является то, что способ ELISA согласно настоящему изобретению может быть полностью или частично автоматизирован с использованием специально сконструированного устройства.Another new feature of the present invention is that the ELISA method according to the present invention can be fully or partially automated using a specially designed device.

Другим новым отличительным признаком настоящего изобретения является то, что способ согласно настоящему изобретению может быть использован в других иммунологических анализах, таких как радиоиммуннологический анализ, радиологический иммуносорбентный анализ, радиологический аллергосорбентный анализ, иммунологический анализ с помощью биотин-авидина/стрептавидина, имммуноблоттинг, иммуноокрашивание и тому подобное, наряду с различными типами ELISA, такими как непосредственный ELISA, опосредованный ELISA, сэндвич-ELISA и тому подобное.Another new feature of the present invention is that the method according to the present invention can be used in other immunological analyzes, such as radioimmunological analysis, radiological immunosorbent analysis, radiological allergenic analysis, immunological analysis using biotin-avidin / streptavidin, immunoblotting, immunostaining and the like similar, along with various types of ELISA, such as direct ELISA, mediated ELISA, sandwich ELISA and the like.

Подробное описание изобретенияDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Настоящее изобретение предусматривает новый подход к методике иммуносорбентного твердофазного анализа на активированном планшете для микротитрования, модуле или лунке, путем экспонирования для микроволнового излучения. Активированная поверхность иммобилизует антиген путем ковалентного связывания под воздействием микроволнового излучения. Этот ковалентно иммобилизованный антиген является достаточно стабильным для того, чтобы выдержать повторяющееся, но краткое экспонирование для микроволнового излучения, которое необходимо для осуществления следующих далее этапов ELISA. ELISA представляет собой многоэтапный и деликатный процесс, где несоответствующие условия на любом этапе могут повредить результатам в целом.The present invention provides a new approach to the method of immunosorbent solid-phase analysis on an activated microtiter plate, module or well, by exposure to microwave radiation. The activated surface immobilizes the antigen by covalent binding under the influence of microwave radiation. This covalently immobilized antigen is stable enough to withstand the repeated but brief exposure for microwave radiation, which is necessary for the implementation of the following ELISA steps. ELISA is a multi-stage and delicate process where inappropriate conditions at any stage can damage the overall results.

В способе согласно настоящему изобретению инертная твердая поверхность, такая как полистирол, активируется с помощью фотохимической реакции в сухом состоянии, с использованием фотоактивируемого соединения. Активирование твердой подложки осуществляется путем экспонирования подложки, покрытой фотоактивируемым соединением, для УФ-излучения или яркого солнечного света. Эта активированная подложка используется для СВЧ-опосредованного ELISA (MELISA) и для контроля ELISA с целью детектирования антител, например, E.histolytica и Aspergillus fumigatus. При использовании необработанной подложки на ней не удается связать биологические молекулы под воздействием микроволнового излучения за такое короткое время.In the method according to the present invention, an inert solid surface, such as polystyrene, is activated by a dry photochemical reaction using a photoactivated compound. Activation of a solid substrate is accomplished by exposing the substrate coated with a photoactivated compound for UV radiation or bright sunlight. This activated substrate is used for microwave-mediated ELISA (MELISA) and for ELISA control in order to detect antibodies, for example, E.histolytica and Aspergillus fumigatus. When using an untreated substrate, it is not possible to bind biological molecules under the influence of microwave radiation in such a short time.

Воздействие микроволнового излучения осуществляется внутри бытовой микроволновой печи (BPL-Sanyo, India), работающей на частоте примерно 2450 МГц.Microwave radiation is carried out inside a household microwave oven (BPL-Sanyo, India) operating at a frequency of approximately 2450 MHz.

Амёбный антиген получают из культуры E.histolytica согласно опубликованному способу (Sawhney, S., et al, 1980; Sharma, G.L. et al, 1984). Концентрация белков антигенов составляет 1,54 мг на мл, как определяется согласно способу Lowry et.al. (Lowry, O.H., et al, 1951). Антиген разбавляют перед осуществлением ELISA, и для нанесения на лунки используется концентрация 1,0 мкг на лунку.Amoebic antigen is obtained from a culture of E.histolytica according to a published method (Sawhney, S., et al, 1980; Sharma, G. L. et al, 1984). The concentration of antigen proteins is 1.54 mg per ml, as determined according to the method of Lowry et.al. (Lowry, O. H., et al, 1951). The antigen is diluted before ELISA, and a concentration of 1.0 μg per well is used for application to the wells.

Фосфатный солевой буфер (PBS), pH 7,2, 0,01 M используется в качестве буфера для покрытия.Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.2, 0.01 M is used as a coating buffer.

Фосфатный солевой буфер (PBS), pH 7,2, 0,01 M, вместе с 0,1% Tween 20, используется в качестве буфера для промывки.Phosphate Salt Buffer (PBS), pH 7.2, 0.01 M, together with 0.1% Tween 20, is used as a wash buffer.

Блокирующий раствор изготавливается путем растворения 2% BSA в 0,01 M PBS, pH 7,2.A blocking solution is prepared by dissolving 2% BSA in 0.01 M PBS, pH 7.2.

Раствор субстрата приготавливают с помощью добавления 0,067% o-фенилендиамина и 0,043% H₂O₂ в 0,1 M фосфатцитратный буфер, pH 4,5.A substrate solution is prepared by adding 0.067% o-phenylenediamine and 0.043% H ₂ O ₂ in 0.1 M phosphate citrate buffer, pH 4.5.

Гипериммунные сыворотки для E.histolytica выращивают в кроликах Newzealand White согласно способам Sawhney et al (Sawhney et. al, 1980). Титры антитела в сыворотках проверяются путем исследования с помощью диффузии в геле.Hyperimmune sera for E.histolytica are grown in Newzealand White rabbits according to the methods of Sawhney et al (Sawhney et. Al, 1980). Serum antibody titers are checked by gel diffusion assay.

Антитело (+ve сыворотки) разбавляют перед осуществлением ELISA и для экспериментов используется разбавление 1:300 в PBS.The antibody (+ ve serum) is diluted before ELISA and a 1: 300 dilution in PBS is used for experiments.

У кроликов берут кровь через ушную вену перед введением иммунизирующей дозы антигена E.histolytica с целью получения сывороток для отрицательного контроля (сыворотки -ve). Используется по 100 мкл разбавленных (1:300) сывороток -ve на каждую лунку.In rabbits, blood is drawn through the ear vein before administration of an immunizing dose of E.histolytica antigen to obtain negative control sera (-ve serum). 100 μl of diluted (1: 300) -ve serum is used per well.

IgG Антикролик, конъюгированный с пероксидазой хрена, покупают у Sigma в виде лиофилизированного порошка.IgG Horseradish peroxidase conjugated anti-rabbit is purchased from Sigma as a lyophilized powder.

После восстановления оптимальное разбавление, как обнаружено, составляет 1:4000, что определяется с помощью титрования в шахматном порядке, которое используется в экспериментах.After reconstitution, the optimal dilution was found to be 1: 4000, which was determined using checkerboard titration, which was used in the experiments.

ELISA представляет собой способ из 5 этапов, а именно связывание антигена, блокировка, связывание антитела, связывание конъюгата и проявление окраски. Каждый этап MELISA оптимизируется путем осуществления следующих далее этапов, согласно обычному способу ELISA. Традиционный ELISA осуществляется путем выдерживания, в течение ночи, покрытых антигеном активированных лунок при 4°C, блокировки лунок через 2 час, при 37°C, с последующим связыванием антитела и конъюгата при 37°C, на 2 ч, каждое, и проявления окраски, то есть взаимодействия фермент-субстрат, при комнатной температуре, в течение 5 минут, с последующим измерением коэффициента поглощения.An ELISA is a 5-step method, namely antigen binding, blocking, antibody binding, conjugate binding and staining. Each MELISA step is optimized by performing the following steps according to the conventional ELISA method. A traditional ELISA is performed by maintaining, overnight, antigen-coated activated wells at 4 ° C, blocking the wells after 2 hours, at 37 ° C, followed by binding of the antibody and conjugate at 37 ° C, for 2 hours each, and staining , that is, the enzyme-substrate interaction, at room temperature, for 5 minutes, followed by measurement of the absorption coefficient.

В способе согласно настоящему изобретению первый этап ELISA осуществляется путем ковалентной иммобилизации амёбного антигена на активированном полистироловом планшете с микролунками, под воздействием микроволнового излучения при 700 ватт, с различной длительностью по времени. Связывание, детектируемое уже через 10 секунд, увеличивается с увеличением времени воздействия излучения (таблица 1). Через 90 секунд связывание антигена становится более или менее таким же, как через 70 секунд воздействия микроволнового излучения. Следовательно, оптимальное время для иммобилизации антигена принимается равным 70 секунд. В контрольных экспериментах, осуществляемых в течение такого же времени, то есть 70 секунд, при 37°C, никакого связывания антигена с активированной полистирольной поверхностью не наблюдается.In the method according to the present invention, the first ELISA step is carried out by covalent immobilization of amoebic antigen on an activated polystyrene microwell plate, under the influence of microwave radiation at 700 watts, with different time durations. Binding, detected after 10 seconds, increases with increasing time of exposure to radiation (table 1). After 90 seconds, antigen binding becomes more or less the same as after 70 seconds of exposure to microwave radiation. Therefore, the optimal time for immobilization of the antigen is taken to be 70 seconds. In control experiments carried out for the same time, that is, 70 seconds, at 37 ° C, no binding of the antigen to the activated polystyrene surface was observed.

На втором этапе MELISA осуществляется блокировка с помощью 2% BSA через 10 секунд, в микроволновой печи, при мощности 700 ватт, для блокировки свободной поверхности активированной поверхности. Дальнейшее увеличение времени воздействия микроволнового излучения демонстрирует неспецифическое связывание (таблица 2).In the second stage, MELISA is blocked using 2% BSA after 10 seconds, in the microwave, at a power of 700 watts, to block the free surface of the activated surface. A further increase in the time of exposure to microwave radiation demonstrates nonspecific binding (table 2).

На третьем этапе MELISA связывание антитела с иммобилизованным антигеном осуществляется при 155 ватт, в течение 100 секунд. Этот этап является критичным, где неправильные условия, такие как слишком большое время или повышенная выходная мощность, приводят к неспецифическому связыванию, как показано в таблице 3. При 155 ватт через 50 секунд и 100 секунд никакого неспецифического связывания не наблюдается. Хотя через 50 секунд наблюдаемое значение OD является очень низким, 100 секунд, как обнаружено, является превосходным временем, давая высокое отношение сывороток -ve к +ve. Увеличение времени до 150 секунд увеличивает неспецифическое связывание (таблица 4).In a third MELISA step, antibody binding to the immobilized antigen is carried out at 155 watts for 100 seconds. This step is critical where abnormal conditions, such as too long a time or increased output power, lead to non-specific binding, as shown in Table 3. At 155 watts after 50 seconds and 100 seconds, no non-specific binding is observed. Although after 50 seconds the observed OD value is very low, 100 seconds was found to be an excellent time, giving a high serum ratio of -ve to + ve. Increasing the time to 150 seconds increases non-specific binding (table 4).

На четвертом этапе MELISA осуществляется связывание конъюгата с помощью воздействия микроволнового излучения, при 155 ватт, в течение различных периодов времени. Превосходный результат получается через 100 секунд (таблица 6). Неправильные условия, такие как слишком большое время или более высокая энергия, например 700 ватт, приводят к неспецифическому связыванию (таблица 5).In the fourth step of MELISA, conjugate is bound by microwave irradiation at 155 watts for various periods of time. An excellent result is obtained after 100 seconds (table 6). Improper conditions, such as taking too long or higher energy, such as 700 watts, result in non-specific binding (Table 5).

На каждом этапе осуществляется контрольный эксперимент путем проведения такого же эксперимента вне микроволновой печи, в течение такого же периода времени. Во всех этих экспериментах получают пренебрежимо малый или нежелательный показатель ELISA (неспецифическое связывание).At each stage, a control experiment is carried out by conducting the same experiment outside the microwave for the same period of time. In all of these experiments, a negligible or undesirable ELISA (non-specific binding) is obtained.

После оптимизации каждого этапа MELISA авторы осуществляют все этапы при оптимизированных условиях воздействия микроволнового излучения без повреждения биологических молекул. Для достижения указанной оптимизации авторы получают иммобилизованный антиген на активированной лунке через 70 секунд, блокировку через 10 секунд, связывание антитела через 100 секунд и связывание конъюгата через 100 секунд воздействия микроволнового излучения. Общее время, требуемое для всех этих этапов, составляет 280 секунд, только с помощью способа согласно настоящему изобретению, в то время как обычный ELISA осуществляется примерно через 18 часов.After optimizing each MELISA step, the authors carry out all steps under optimized conditions for exposure to microwave radiation without damaging the biological molecules. To achieve this optimization, the authors receive an immobilized antigen on an activated well after 70 seconds, blocking after 10 seconds, binding of the antibody after 100 seconds and binding of the conjugate after 100 seconds of exposure to microwave radiation. The total time required for all of these steps is 280 seconds, only using the method according to the present invention, while the usual ELISA is carried out after about 18 hours.

MELISA и ELISA для детектирования антител E.histolytica повторяют при сходных экспериментальных условиях несколько раз, и результаты, как обнаружено, являются в высшей степени воспроизводимыми, как показано в таблице 7.MELISA and ELISA for the detection of E.histolytica antibodies are repeated several times under similar experimental conditions, and the results are found to be highly reproducible, as shown in Table 7.

Способ MELISA дополнительно проверяется путем детектирования антитела Aspergillus fumigatus из сывороток пациентов. Антиген A.fumigatus получают из статической культуры согласно опубликованному способу (Banerjee, B., et al, 1990).The MELISA method is further verified by detecting Aspergillus fumigatus antibodies from patient sera. A. fumigatus antigen is obtained from a static culture according to a published method (Banerjee, B., et al, 1990).

Концентрация белков антигена, как обнаружено, составляет 12,5 мг на мл, как определено с помощью способа Lowry et al. (Lowry et al, 1951). Иммуннореакционная способность антигена проверяется путем использования гипериммунной сыворотки, выращенной в кроликах Newzealand White.The concentration of antigen proteins was found to be 12.5 mg per ml, as determined by the method of Lowry et al. (Lowry et al, 1951). The antigen immunoreactivity is tested by using hyperimmune serum grown in Newzealand White rabbits.

Образцы сывороток получают от 10 пациентов с аллергическим бронхопульмонарным аспергиллозом (ABPA). Все эти пациенты удовлетворяют клиническим критериям ABPA, как описано ранее (Rosenberg, M., et al, 1997).Serum samples are obtained from 10 patients with allergic bronchopulmonary aspergillosis (ABPA). All of these patients meet the clinical criteria for ABPA as previously described (Rosenberg, M., et al, 1997).

Образцы сывороток для отрицательного контроля берут от 10 добровольцев, которые, очевидно, являются здоровыми и не имеют никакого респираторного или иного заболевания.Serum samples for negative control are taken from 10 volunteers who are obviously healthy and have no respiratory or other illness.

Собранные положительные и отрицательные сыворотки берутся в качестве контролей для ELISA, которые, как обнаружено, сравнимы как для MELISA, так и для обычного ELISA.The collected positive and negative sera are taken as controls for ELISA, which are found to be comparable for both MELISA and conventional ELISA.

Пероксидазу хрена, коъюгированную с IgG анти-человек, покупают у Sigma в виде лиофилизированного порошка. После восстановления оптимальное разбавление конъюгата, как обнаружено, составляет 1:4000, как определяется с помощью титрования в шахматном порядке.Horseradish peroxidase conjugated to anti-human IgG is purchased from Sigma as a lyophilized powder. After reconstitution, the optimum dilution of the conjugate was found to be 1: 4000, as determined by checkerboard titration.

Антитело A.fumigatus (присутствующее в сыворотках пациента), детектируемое с помощью способа по настоящему изобретению, совпадает с результатами обычной процедуры ELISA (таблица 8).The A. fumigatus antibody (present in the patient's sera) detectable by the method of the present invention is consistent with the results of a conventional ELISA procedure (table 8).

Результатам,

полученным в различных экспериментах, присваиваются сравнительные оценки:The results

obtained in various experiments, comparative evaluations are assigned:

Превосходно

Fine

Очень хорошо

Very well

Хорошо

Good

Плохо

poorly

Нежелательные результаты или их отсутствие

-Undesirable results or lack thereof

-

Общее время, требуемое для MELISA, составляет менее чем 10 минут. Однако время, требуемое для каждого этапа, может изменяться в зависимости от вида биологических молекул, при этом превосходные результаты могут быть получены с помощью небольшой модификации условий реакции, то есть небольшого изменения в длительности и энергии воздействующего микроволнового излучения.The total time required for MELISA is less than 10 minutes. However, the time required for each step can vary depending on the type of biological molecules, and excellent results can be obtained by slightly modifying the reaction conditions, that is, a slight change in the duration and energy of the exposed microwave radiation.

Соответственно, настоящее изобретение предусматривает быстрый способ СВЧ-опосредованного иммуносорбентного твердофазного анализа, характеризующийся использованием активированной твердой подложки, где указанный способ включает в себя:Accordingly, the present invention provides a quick method of microwave-mediated immunosorbent solid phase analysis, characterized by using an activated solid support, where the specified method includes:

(a) создание активированной твердой подложки,(a) the creation of an activated solid substrate,

(b) загрузку биологической молекулы, выбранной из антигена или антитела, путем растворения указанной биологической молекулы в буфере, наносимом в активированную лунку указанной твердой подложки, и помещения указанной лунки внутри микроволновой печи, с последующим воздействием на указанную лунку микроволновым излучением с частотой, находящейся в пределах между 2300 и 2500 МГц, с выходной мощностью, находящейся в пределах между 600 и 900 ватт, в течение периода времени, находящегося в пределах от 50 до 100 секунд, с последующей тщательной промывкой лунки с помощью соответствующего буфера для промывки,(b) loading a biological molecule selected from an antigen or antibody by dissolving said biological molecule in a buffer applied to an activated well of said solid support and placing said well inside a microwave oven, followed by microwave irradiation of said well with a frequency located in between 2300 and 2500 MHz, with an output power ranging between 600 and 900 watts, for a period of time ranging from 50 to 100 seconds, followed by thorough washing with unki using the appropriate buffer for washing,

(c) блокирование свободных центров связывания лунки с иммобилизованными биологическими молекулами, как она получена после этапа (b), выше, путем загрузки блокирующего раствора в указанную лунку и воздействия на нее, внутри микроволновой печи, микроволновым излучением с частотой от 2300 до 2500 МГц, с выходной мощностью, находящейся в пределах между 600 и 800 ватт, в течение периода времени, находящегося в пределах от 5 до 20 секунд, и промывки указанной лунки соответствующим буфером для промывки,(c) blocking the free binding sites of the well with immobilized biological molecules, as obtained after step (b), above, by loading the blocking solution into said well and exposing it, inside the microwave oven, with microwave radiation from 2300 to 2500 MHz, with an output power ranging between 600 and 800 watts, for a period of time ranging from 5 to 20 seconds, and washing the indicated well with an appropriate washing buffer,

(d) загрузку соответствующего антитела или антигена, растворенного в буфере, в лунку с иммобилизованным антигеном или антителом, как она получена после этапа (c), выше, с последующим воздействием на указанную лунку, внутри микроволновой печи, микроволновым излучением с частотой от 2300 до 2500 МГц, с выходной мощностью, находящейся в пределах от 50 до 200 ватт, в течение периода времени, находящегося в пределах от 90 до 200 секунд, с последующей промывкой с помощью буфера для промывки,(d) loading the corresponding antibody or antigen dissolved in the buffer into a well with an immobilized antigen or antibody, as obtained after step (c) above, followed by exposing the said hole inside the microwave oven to microwave radiation with a frequency of 2300 to 2500 MHz, with an output power in the range of 50 to 200 watts, for a period of time in the range of 90 to 200 seconds, followed by washing with a washing buffer,

(e) загрузку соответствующего конъюгата фермента, растворенного в соответствующем буфере, в указанную выше лунку, полученную после этапа (d), и воздействие на указанную лунку, внутри микроволновой печи, микроволновым излучением с частотой от 2300 до 2500 МГц, с выходной мощностью, находящейся в пределах от 100 до 300 ватт, в течение периода времени, находящегося в пределах от 50 до 150 секунд, с последующей промывкой с помощью буфера для промывки,(e) loading the appropriate conjugate of the enzyme dissolved in the appropriate buffer into the above well obtained after step (d) and exposing the indicated well inside the microwave oven to microwave radiation at a frequency of 2300 to 2500 MHz with an output power located in the range from 100 to 300 watts, for a period of time ranging from 50 to 150 seconds, followed by washing with a washing buffer,

(f) добавление субстрата-красителя буфера в указанную выше лунку, как она получена после этапа (e), выше, и выдерживание ее в течение периода времени, находящегося пределах от 4 до 10 минут, в темноте, с последующим добавлением стоп-раствора и измерением оптической плотности раствора с помощью спектрофотометра, на соответствующей длине волны.(f) adding a dye substrate buffer to the above well as obtained after step (e) above, and holding it for a period of time ranging from 4 to 10 minutes in the dark, followed by the addition of a stop solution and measuring the optical density of the solution using a spectrophotometer at the appropriate wavelength.

В одном из вариантов реализации согласно настоящему изобретению используемая твердая подложка выбирается из группы, состоящей из таких материалов, как полистирол, полипропилен, полиэтилен, стекло, целлюлоза, нитроцеллюлоза, силикагель, поливинилхлорид, полианилин и тому подобное.In one embodiment of the invention, the solid support used is selected from the group consisting of materials such as polystyrene, polypropylene, polyethylene, glass, cellulose, nitrocellulose, silica gel, polyvinyl chloride, polyaniline and the like.

В одном из вариантов реализации согласно настоящему изобретению предпочтительная используемая твердая подложка представляет собой полистирол.In one embodiment of the invention, the preferred solid support used is polystyrene.

Еще в одном варианте реализации, твердая подложка выбирается из любой конфигурации, формы и размера, такой как листы, пластины, из тест-частиц, таких как шарики и микросферы, пробирок, тест-палочки, тест-полоски, лунка, планшет ELISA, микролуночный планшет или модуль.In yet another embodiment, the solid substrate is selected from any configuration, shape and size, such as sheets, plates, from test particles such as balls and microspheres, tubes, test sticks, test strips, well, ELISA plate, microwell tablet or module.

В одном из вариантов реализации согласно настоящему изобретению твердая подложка, используемая для иммобилизации биологических молекул, выбирается из любых подложек, имеющих, по меньшей мере, одну активную функциональную группу, способную к связыванию молекул-лигандов посредством ковалентной связи.In one embodiment of the invention, the solid support used to immobilize the biological molecules is selected from any support having at least one active functional group capable of binding ligand molecules via covalent bonding.

Еще в одном варианте реализации согласно настоящему изобретению функциональная группа выбирается из галогенида, альдегида, ацетила, эпоксида, сукцинамида, изотиоцианата, ацилазида и тому подобное.In yet another embodiment, according to the present invention, the functional group is selected from halide, aldehyde, acetyl, epoxide, succinamide, isothiocyanate, acylazide, and the like.

Еще в одном варианте реализации согласно настоящему изобретению функциональная группа может присутствовать в самой подложке или может быть введена с помощью обычных химических, или фотохимических, или иных способов, известных в данной области.In yet another embodiment, according to the present invention, the functional group may be present in the substrate itself or may be introduced using conventional chemical, or photochemical, or other methods known in the art.

Еще в одном варианте реализации согласно настоящему изобретению функциональная группа вводится на твердую подложку с помощью фотохимической реакции в сухих условиях с использованием фотоактивируемого соединения, которое выбирается из 4-фтор-3-нитроазидобензола, N-гидроксисульфосукцинимидил 4-азидобензоата, N-гидроксисульфосукцинимидил 4-азидосалициловой кислоты и тому подобное.In yet another embodiment of the present invention, the functional group is introduced onto a solid support by a photochemical reaction under dry conditions using a photoactivable compound selected from 4-fluoro-3-nitroazidobenzene, N-hydroxysulfosuccinimidyl 4-azidobenzoate, N-hydroxysulfosuccinimidyl 4-azidosalicylic acids and the like.

Еще в одном варианте реализации согласно настоящему изобретению полистирольная поверхность активируется путем нанесения 1-фтор-2-нитро-азидобензола и экспонирования покрытой подложки в сухих условиях для УФ-излучения на 365 нм.In yet another embodiment, according to the present invention, the polystyrene surface is activated by applying 1-fluoro-2-nitro-azidobenzene and exposing the coated substrate in dry conditions for UV radiation at 365 nm.

Еще в одном варианте реализации согласно настоящему изобретению источник света для фотохимической реакции выбирается из УФ-лампы, лазерного луча, яркого солнечного света или чего-либо подобного.In another embodiment, according to the present invention, the light source for the photochemical reaction is selected from a UV lamp, a laser beam, bright sunlight, or the like.

Еще в одном варианте реализации согласно настоящему изобретению время для фотохимического взаимодействия с целью активирования твердой подложки выбирается от 10 секунд до 10 час.In yet another embodiment, according to the present invention, the time for photochemical interaction to activate a solid substrate is selected from 10 seconds to 10 hours.

Еще в одном варианте реализации микроволновое излучение формируется в микроволновом устройстве, выбранном из бытовой микроволновой печи, специально сконструированной микроволновой печи или любого устройства или камеры, в котором генерируется микроволновое излучение, и тому подобное.In yet another embodiment, microwave radiation is generated in a microwave device selected from a household microwave oven, a specially designed microwave oven, or any device or chamber in which microwave radiation is generated, and the like.

Еще в одном предпочтительном варианте реализации согласно настоящему изобретению первый этап ELISA осуществляется с помощью ковалентного связывания антигена или антитела на активированном планшете под воздействием микроволнового излучения с частотой от 2300 до 2500 МГц, с выходной мощностью, находящейся в пределах между 600-900 ватт, в течение короткого периода времени, находящегося в пределах от 50 до 100 секунд.In yet another preferred embodiment according to the present invention, the first ELISA step is performed by covalently binding an antigen or antibody on an activated plate under the influence of microwave radiation at a frequency of 2300 to 2500 MHz, with an output power ranging between 600-900 watts, for a short period of time ranging from 50 to 100 seconds.

Еще в одном предпочтительном варианте реализации согласно настоящему изобретению второй этап ELISA, то есть этап блокировки осуществляется с помощью воздействия микроволнового излучения, с частотой от 2300 до 2500 МГц, с выходной мощностью, находящейся в пределах между 600-800 ватт, в течение короткого периода времени, находящегося в пределах от 5 до 20 секунд.In another preferred embodiment according to the present invention, the second ELISA step, that is, the blocking step is carried out by exposure to microwave radiation, with a frequency of 2300 to 2500 MHz, with an output power ranging between 600-800 watts, for a short period ranging from 5 to 20 seconds.

Еще в одном предпочтительном варианте реализации согласно настоящему изобретению третий этап ELISA, то есть связывание соответствующего антитела или антигена, осуществляется путем воздействия микроволнового излучения с частотой от 2300 до 2500 МГц, с выходной мощностью от 50 до 200 ватт, в течение периода времени, находящегося в пределах от 90 до 200 секунд.In yet another preferred embodiment according to the present invention, the third ELISA step, that is, the binding of the corresponding antibody or antigen, is carried out by exposure to microwave radiation at a frequency of 2300 to 2500 MHz, with an output power of 50 to 200 watts, for a period of time in ranging from 90 to 200 seconds.

Еще в одном предпочтительном варианте реализации согласно настоящему изобретению четвертый этап ELISA, то есть связывание фермент-конъюгат, осуществляется с помощью воздействия микроволнового излучения, с частотой от 2300 до 2500 МГц, с выходной мощностью от 100 до 300 ватт, в течение периода времени, находящегося в пределах от 50 до 150 секунд.In another preferred embodiment according to the present invention, the fourth ELISA step, that is, enzyme-conjugate binding, is carried out by exposure to microwave radiation, with a frequency of 2300 to 2500 MHz, with an output power of 100 to 300 watts, for a period of time ranging from 50 to 150 seconds.

Еще в одном предпочтительном варианте реализации согласно настоящему изобретению общее время для связывания антигена, блокировки, связывания антитела и связывания конъюгата находится в пределах от 195 до 470 секунд, при этом общее время для обычного способа, как правило, находится в пределах от 10 час до 24 час.In yet another preferred embodiment according to the present invention, the total time for antigen binding, blocking, antibody binding and conjugate binding is in the range of 195 to 470 seconds, while the total time for the conventional method is typically in the range of 10 hours to 24 hour.

Еще в одном варианте реализации согласно настоящему изобретению антиген может быть растворен в буфере для нанесения соответствующей композиции, имеющем pH, в пределах от 6,5 до 11, с молярностью, находящейся в пределах от 0,005 M до 0,1 M, совместимым с антигеном, таком как карбонатный буфер, фосфатный буфер и тому подобное.In yet another embodiment, according to the present invention, the antigen can be dissolved in a buffer for applying an appropriate composition having a pH in the range from 6.5 to 11, with a molarity ranging from 0.005 M to 0.1 M compatible with the antigen, such as carbonate buffer, phosphate buffer and the like.

Еще в одном предпочтительном варианте реализации согласно настоящему изобретению используемый буфер для промывки представляет собой смесь фосфатного буфера, имеющего pH, находящийся в пределах от 6,5 до 11, с молярностью, находящейся в пределах от 0,005 M до 0,1 M, и Tween 20, в пределах между 0,05 и 3%.In yet another preferred embodiment of the present invention, the wash buffer used is a mixture of a phosphate buffer having a pH ranging from 6.5 to 11, with a molarity ranging from 0.005 M to 0.1 M, and Tween 20 , between 0.05 and 3%.

Еще в одном предпочтительном варианте реализации согласно настоящему изобретению блокирующий реагент выбирается из бычьего сывороточного альбумина, порошкообразного снятого молока, желатина и тому подобное.In yet another preferred embodiment of the present invention, the blocking reagent is selected from bovine serum albumin, powdered skim milk, gelatin and the like.

Еще в одном варианте реализации согласно настоящему изобретению биологическая молекула выбирается из антигена или антитела. Антиген может быть любой биологической молекулой, микроорганизмом, веществом и тому подобное, которое вызывает или может, в принципе, вызывать иммунную реакцию.In yet another embodiment, according to the present invention, the biological molecule is selected from an antigen or antibody. The antigen can be any biological molecule, microorganism, substance and the like, which causes or can, in principle, cause an immune response.

Еще в одном предпочтительном варианте реализации согласно настоящему изобретению антитело выбирается из любой биологической молекулы, которая продуцируется хозяином в ответ на инокуляцию конкретным антигеном и имеет способность к специфическому связыванию антигена.In yet another preferred embodiment of the present invention, the antibody is selected from any biological molecule that is produced by the host in response to inoculation with a particular antigen and has the ability to specifically bind antigen.

Еще в одном предпочтительном варианте реализации согласно настоящему изобретению конъюгат представляет собой конкретную биологическую молекулу, содержащую антитело или антиген, конъюгированный с ферментом, выбранным из пероксидазы или щелочной фосфатазы.In yet another preferred embodiment of the invention, the conjugate is a particular biological molecule comprising an antibody or antigen conjugated to an enzyme selected from peroxidase or alkaline phosphatase.

Еще в одном предпочтительном варианте реализации согласно настоящему изобретению фермент может быть заменен меткой, выбранной из хромофора, флуорофора, и тому подобное, которая облегчает его анализ.In yet another preferred embodiment of the invention, the enzyme may be replaced by a label selected from chromophore, fluorophore, and the like, which facilitates its analysis.

Еще в одном предпочтительном варианте реализации согласно настоящему изобретению способ согласно настоящему изобретению может быть использован для других иммунологических анализов, таких как радиоиммунологический анализ, радиологический иммуносорбентный анализ, радиологический аллергосорбентный анализ, иммунологический анализ с помощью биотин-авидина/стрептавидина, иммуноблоттинг, иммуноокрашивание и тому подобное, наряду с различными типами ELISA, такими как непосредственный ELISA, опосредованный ELISA, сэндвич-ELISA и тому подобное.In yet another preferred embodiment of the present invention, the method of the present invention can be used for other immunological assays, such as radioimmunoassay, radiological immunosorbent assay, radiological allergensorbent assay, immunoassay using biotin-avidin / streptavidin, immunoblotting, immunostaining, and the like. , along with various types of ELISA, such as direct ELISA, mediated ELISA, sandwich ELISA and the like.

Настоящее изобретение, кроме того, предусматривает устройство для СВЧ-опосредованного иммуносорбентного твердофазного анализа (MELISA), содержащее (а) загрузочную камеру, для автоматической загрузки образцов или реагентов из указанной емкости, из тонкой трубки, с помощью соответствующего насоса, на активированный полистироловый планшет/модуль; (b) реакционную камеру, состоящую из магнетрона, вытяжного вентилятора, и тому подобное, для осуществления всех этапов, таких как связывание антигена, блокировка, связывание антитела и связывание конъюгата антитело-фермент, под воздействием микроволнового излучения, и взаимодействия фермента и субстрата без СВЧ-стимуляции, при температуре окружающей среды, в течение предварительно заданного времени; (с) камеру для промывки и сушки, предназначенную для автоматической промывки и сушки указанного планшета или модуля ELISA, по запрограммированной команде, после каждого этапа способа MELISA; (d) камеру для детектирования, предназначенную для колориметрического детектирования с помощью спектрофотометра; (е) движущуюся платформу, используемую для перемещения планшета/модулей ELISA из одной камеры в другую камеру; (f) компьютерные средства на основе микропроцессора для управления способом MELISA с помощью соответствующего аппаратного и программного обеспечения.The present invention also provides a device for microwave-mediated immunosorbent solid phase analysis (MELISA), containing (a) a loading chamber for automatically loading samples or reagents from the indicated container, from a thin tube, using an appropriate pump, onto an activated polystyrene plate / module; (b) a reaction chamber consisting of a magnetron, an exhaust fan, and the like, for performing all steps, such as antigen binding, blocking, antibody binding and antibody-enzyme conjugate binding, under the influence of microwave radiation, and interaction of the enzyme and substrate without microwave -stimulation, at ambient temperature, for a predetermined time; (c) a washing and drying chamber for automatically washing and drying said tablet or ELISA module, according to a programmed command, after each step of the MELISA method; (d) a detection chamber for colorimetric detection with a spectrophotometer; (e) a moving platform used to move the tablet / ELISA modules from one camera to another camera; (f) microprocessor-based computer tools for controlling the MELISA method using appropriate hardware and software.

Настоящее изобретение далее объясняется с помощью следующих далее примеров, и они не должны рассматриваться в качестве ограничивающих рамки настоящего изобретения.The present invention is further explained using the following examples, and they should not be construed as limiting the scope of the present invention.

ПРИМЕР 1EXAMPLE 1

Активирование твердой подложкиActivating a solid substrate

В лунки модуля (12-луночный полистироловый модуль, Dynatech, USA) загружают 1,82 мг 1-фтор-2-нитро-азидобензола (FNAB), растворенного в 100 мкл метанола, на одну лунку, и сушат соответствующим образом, в темноте. затем лунки, покрытые FNAB, облучают в течение 10 мин УФ-светом на 365 нм в UV Stratalinker 2400 (Stratagene®, LISA) или выдерживают на ярком солнечном свету в течение 1 час. Затем лунки промывают несколько раз метанолом для удаления несвязанного линкера и сушат при комнатной температуре. Эти активированные лунки модуля используются для иммобилизации антигенов или антител в процедуре по настоящему изобретению.1.82 mg of 1-fluoro-2-nitro-azidobenzene (FNAB) dissolved in 100 μl of methanol per well was loaded into the wells of a module (12-well polystyrene module, Dynatech, USA) and dried accordingly in the dark. the FNAB coated wells are then irradiated for 10 min with 365 nm UV light in a UV Stratalinker 2400 (Stratagene®, LISA) or exposed to bright sunlight for 1 hour. Then the wells are washed several times with methanol to remove an unbound linker and dried at room temperature. These activated module wells are used to immobilize antigens or antibodies in the procedure of the present invention.

ПРИМЕР 2EXAMPLE 2

Иммобилизация антигена Entanweba histolytica под воздействием микроволнового излученияImmobilization of Entanweba histolytica antigen by exposure to microwave radiation

Антиген E. histolytica (1 мкг), разбавленный в 100 мкл PBS, загружают в активированную лунку модуля и подвергают воздействию микроволнового излучения в течение 10 секунд, внутри бытовой микроволновой печи (BPL-Sanyo, India), работающей на частоте примерно 2450 МГц, с максимальной выходной мощностью примерно 700 ватт. Воздействие микроволнового излучения осуществляют в микроволновой печи, настроенной на максимальную мощность, на цифре 10, то есть с рабочим циклом магнетрона 100% от выходной мощности 700 ватт.E. histolytica antigen (1 μg), diluted in 100 μl of PBS, is loaded into the activated well of the module and exposed to microwave radiation for 10 seconds, inside a household microwave oven (BPL-Sanyo, India) operating at a frequency of approximately 2450 MHz, s maximum output power of approximately 700 watts. The influence of microwave radiation is carried out in a microwave oven configured for maximum power, at the figure 10, that is, with a magnetron duty cycle of 100% of the output power of 700 watts.

Лунку тщательно промывают буфером для промывки с тем, чтобы удалить несвязанный антиген. Последующие этапы осуществляются согласно традиционному способу. Так, блокирование с помощью блокирующего раствора (200 мкл), связывание антитела (100 мкл) и связывание конъюгата IgG лошади антикролик и пероксидазы хрена (100 мкл) осуществляется путем инкубирования при 37°C, в течение 2 часов, каждое. После каждого этапа лунку тщательно промывают с помощью буфера для промывки. Проявление окраски производится с использованием 100 мкл раствора субстрата. Лунка считывается на 490 нм, в ELISA Reader (Spectramax 190 микроплашетный спектрофотометр, Molecular Devices Corporation, California 94089), и измеряются значения коэффициента поглощения. Все эксперименты осуществляют троекратно, в трех лунках каждый. Подобные же эксперименты проводятся и с сыворотками -ve.The well is washed thoroughly with washing buffer so as to remove unbound antigen. Subsequent steps are carried out according to the traditional method. Thus, blocking with a blocking solution (200 μl), antibody binding (100 μl) and horse anti-rabbit IgG conjugate and horseradish peroxidase (100 μl) are carried out by incubation at 37 ° C for 2 hours, each. After each step, the well is washed thoroughly with a wash buffer. Color development is carried out using 100 μl of substrate solution. The well is read at 490 nm in an ELISA Reader (Spectramax 190 Microplate Spectrophotometer, Molecular Devices Corporation, California 94089), and absorbance values are measured. All experiments are carried out three times, in three wells each. Similar experiments are carried out with -ve serums.

Контрольный эксперимент с использованием микроволнового излучения осуществляется подобным же способом, с использованием необработанных лунок. Другой контрольный эксперимент осуществляется с использованием активированных лунок, путем инкубирования антигена при 37°C, в течение такого же периода времени, как это делается под воздействием микроволнового излучения. В обеих контрольных реакциях иммобилизации антигена не происходит.A control experiment using microwave radiation is carried out in a similar manner using untreated wells. Another control experiment is carried out using activated wells, by incubating the antigen at 37 ° C, for the same period of time as is done under the influence of microwave radiation. In both control reactions, antigen immobilization does not occur.

Весь эксперимент повторяют отдельно, варьируя время для связывания антигена по 30, 50, 70, и 90 секунд, каждый раз.The entire experiment is repeated separately, varying the time for antigen binding to 30, 50, 70, and 90 seconds, each time.

Результаты оптимизации времени связывания антигена для воздействия микроволнового излучения приведены в таблице 1.The results of optimizing the antigen binding time for exposure to microwave radiation are shown in table 1.

ПРИМЕР 3EXAMPLE 3

Блокирование свободной поверхности с помощью блокирующего агента под воздействием микроволнового излученияMicrowave free surface blocking

Антиген E.histolytica иммобилизуется под воздействием микроволнового излучения в активированной лунке модуля через 70 секунд, как указано выше. После тщательной промывки с помощью буфера для промывки в лунку добавляют 200 мкл блокирующего раствора и воздействуют на него микроволновым излучением при 700 ватт, в течение 10 секунд. Последующие стадии связывания антитела и конъюгата производят вне микроволновой печи, как описано в примере 2. Проявление окраски и измерение коэффициента поглощения также проделывают таким же образом, как и в примере 2.E.histolytica antigen is immobilized by microwave radiation in the activated module well after 70 seconds, as described above. After thorough washing with a washing buffer, 200 μl of blocking solution is added to the well and exposed to microwave at 700 watts for 10 seconds. The subsequent stages of binding of the antibody and the conjugate are carried out outside the microwave oven, as described in example 2. Color development and measurement of the absorption coefficient are also carried out in the same manner as in example 2.

Подобные эксперименты проделывают и с сыворотками -ve.Similar experiments are done with -ve serums.

Чтобы проверить оптимальность времени для блокировки, два различных эксперимента осуществляют сходным образом, за исключением того, что время экспонирования для микроволнового излучения увеличивается до 40 и 60 секунд. Все эксперименты осуществляют троекратно, в трех лунках, каждый.To check the time optimality for blocking, two different experiments are carried out in a similar manner, except that the exposure time for microwave radiation is increased to 40 and 60 seconds. All experiments are carried out three times, in three wells, each.

Результаты оптимизации времени блокировки под воздействием микроволнового излучения приведены в таблице 2.The results of optimizing the blocking time under the influence of microwave radiation are shown in table 2.

ПРИМЕР 4EXAMPLE 4

Связывание антитела под воздействием микроволнового излучения при высоком уровне энергииHigh Energy Antibody Binding of Antibodies

Антиген E. histolytica иммобилизуют на активированной лунке модуля под воздействием микроволнового излучения, при 700 ватт, в течение 70 секунд, с последующей блокировкой свободной поверхности с помощью блокирующего агента под воздействием микроволнового излучения, при 700 ватт, в течение 10 секунд, как в примере 3. Антиамебное антитело (100 мкл) загружают в лунку, затем лунка экспонируется для микроволнового излучения в течение 10 секунд, при 700 ватт. После соответствующей промывки лунок с помощью буфера для промывки связывание конъюгата и следующее затем проявление окраски осуществляют, как в примере 3. Подобные же эксперименты осуществляют и с сыворотками -ve. Эксперимент повторяют с варьированием времени экспонирования для микроволнового излучения, при 30, 50, 70 и 90 секунд, каждое, для связывания антител, выдерживая все остальные условия сходными. Все эксперименты осуществляют троекратно, в трех лунках, каждый.E. histolytica antigen is immobilized on the activated well of the module under the influence of microwave radiation, at 700 watts, for 70 seconds, followed by blocking of the free surface with a blocking agent under the influence of microwave radiation, at 700 watts, for 10 seconds, as in example 3 An anti-amoebic antibody (100 μl) is loaded into the well, then the well is exposed for microwave irradiation for 10 seconds at 700 watts. After appropriate washing of the wells with the washing buffer, conjugate binding and subsequent color development are carried out as in Example 3. Similar experiments were carried out with -ve serums. The experiment is repeated with varying exposure times for microwave radiation, at 30, 50, 70 and 90 seconds, each, for antibody binding, keeping all other conditions similar. All experiments are carried out three times, in three wells, each.

Результаты связывания антител под воздействием микроволнового излучения при высоком уровне энергии представлены в таблице 3.The results of antibody binding under the influence of microwave radiation at a high energy level are presented in table 3.

ПРИМЕР 5EXAMPLE 5

Связывание антител под воздействием микроволнового излучения при низком уровне энергии.Binding of antibodies under the influence of microwave radiation at a low level of energy.

Здесь производятся эксперименты по связыванию антител в условиях, сходных с теми, которые описаны в примере 4, за исключением того, что этап связывания антител осуществляется при низком уровне энергии, то есть при 155 ватт. Время экспонирования для микроволнового излучения составляет 10, 50, 100 и 150 секунд, соответственно, для четырех различных наборов экспериментов.Here, experiments are performed on antibody binding under conditions similar to those described in Example 4, except that the antibody binding step is carried out at a low energy level, i.e., at 155 watts. The exposure time for microwave radiation is 10, 50, 100 and 150 seconds, respectively, for four different sets of experiments.

Результаты по связыванию антител под воздействием микроволнового излучения при низком уровне энергии показаны в таблице 4.The results of the binding of antibodies under the influence of microwave radiation at a low energy level are shown in table 4.

ПРИМЕР 6EXAMPLE 6

Связывание конъюгата под воздействием микроволнового излучения при высоком уровне энергии.Binding of the conjugate under the influence of microwave radiation at a high level of energy.

Антиген E. histolytica иммобилизуют на активированной лунке под воздействием микроволнового излучения, при 700 ватт, через 70 секунд, с последующим блокированием под воздействием микроволнового излучения, при 700 ватт, в течение 10 секунд, и связыванием антител, при 155 ватт, в течение 100 секунд, как в примере 5.E. histolytica antigen is immobilized on an activated well under the influence of microwave radiation, at 700 watts, after 70 seconds, followed by blocking under the influence of microwave radiation, at 700 watts, for 10 seconds, and binding of antibodies, at 155 watts, for 100 seconds as in example 5.

100 мкл Конъюгата IgG-лошади антикролик и пероксидазы загружают в лунку и подвергают воздействию микроволнового излучения при 700 ватт. Время экспонирования для микроволнового излучения составляет 5, 10, 15 и 20 секунд, соответственно, для четырех различных наборов экспериментов, где все остальные условия поддерживаются сходными с теми, что в примере 5. Все эксперименты осуществляют троекратно, в трех лунках, каждый.100 μl of an IgG horse conjugate, an anti-rabbit and peroxidase are loaded into the well and exposed to microwave radiation at 700 watts. The exposure time for microwave radiation is 5, 10, 15 and 20 seconds, respectively, for four different sets of experiments, where all other conditions are maintained similar to those in example 5. All experiments are performed three times, in three wells, each.

Результаты по связыванию конъюгата под воздействием микроволнового излучения при высоком уровне энергии показаны в таблице 5.The results of conjugate binding under the influence of microwave radiation at a high energy level are shown in table 5.

ПРИМЕР 7EXAMPLE 7

Связывание конъюгата под воздействием микроволнового излучения при низком уровне энергии.The conjugate binding under the influence of microwave radiation at a low level of energy.

Здесь осуществляются эксперименты для второго связывания конъюгата-антитела в условиях, подобных тем, которые описаны в примере 6, за исключением того, что второй этап связывания конъюгата-антитела осуществляется при низком уровне энергии, то есть при 155 ватт. Время экспонирования для микроволнового излучения выдерживается равным 50, 100 и 120 секундам, соответственно, для четырех различных наборов экспериментов.Here experiments are performed for a second conjugate-antibody binding under conditions similar to those described in Example 6, except that the second step of conjugate-antibody binding is carried out at a low energy level, i.e., 155 watts. The exposure time for microwave radiation is maintained at 50, 100 and 120 seconds, respectively, for four different sets of experiments.

Результаты связывания конъюгата под воздействием микроволнового излучения при низком уровне энергии показаны в таблице 6.The results of conjugate binding under the influence of microwave radiation at a low energy level are shown in table 6.

ПРИМЕР 8EXAMPLE 8

Детектирование антител E. histolytica с помощью СВЧ-опосредованного иммуносорбентного твердофазного анализа (MELISA) и иммуносорбентного твердофазного анализа (ELISA)Detection of E. histolytica antibodies using microwave-mediated immunosorbent solid-phase analysis (MELISA) and immunosorbent solid-phase analysis (ELISA)

Антиген E. histolytica иммобилизуют на активированной лунке под воздействием микроволнового излучения, при 700 ватт, в течение 70 секунд, блокируют с помощью блокирующего раствора, под воздействием микроволнового излучения, при 700 ватт, в течение 10 секунд, связывание антител происходит при 155 ватт, через 100 секунд, а затем - связывание конъюгата с антителом, при 155 ватт, через 100 секунд, как описано выше в примерах. Подобные же эксперименты производят с сыворотками -ve. Все эксперименты осуществляют в сдвоенных лунках и повторяют 5 раз. После каждого этапа осуществляют тщательную промывку с помощью буфера для промывки.E. histolytica antigen is immobilized on an activated well under the influence of microwave radiation, at 700 watts, for 70 seconds, blocked with a blocking solution, under the influence of microwave radiation, at 700 watts, for 10 seconds, antibody binding occurs at 155 watts, through 100 seconds, and then binding of the conjugate to the antibody, at 155 watts, after 100 seconds, as described above in the examples. Similar experiments are performed with -ve serums. All experiments were performed in double wells and repeated 5 times. After each step, a thorough rinse is carried out using the wash buffer.

Обычный ELISA осуществляют с теми же реагентами, субстратом и буфером, за исключением того, что все этапы осуществляют без стимуляции микроволновым излучением. Таким образом, ELISA осуществляют путем нанесения на активированные лунки антигена в течение ночи при 4°C, с последующим блокированием, связыванием антитела и конъюгата при 37°C в течение 2 ч, каждое. Проявление окраски является одним и тем же для процедуры по настоящему изобретению и для обычной процедуры.A conventional ELISA is carried out with the same reagents, substrate and buffer, except that all steps are carried out without microwave stimulation. Thus, an ELISA is carried out by applying antigen to activated wells overnight at 4 ° C, followed by blocking, binding of the antibody and conjugate at 37 ° C for 2 hours, each. The color development is the same for the procedure of the present invention and for the conventional procedure.

Результаты детектирования антитела E.histolytica с помощью СВЧ-опосредованного иммуносорбентного твердофазного анализа (MELISA) и иммуносорбентного твердофазного анализа (ELISA), представлены в таблице 7.The results of the detection of E.histolytica antibodies using microwave-mediated immunosorbent solid phase analysis (MELISA) and immunosorbent solid phase analysis (ELISA) are presented in table 7.

ПРИМЕР 9EXAMPLE 9

Детектирование антител A.fumigatus с помощью СВЧ-опосредованного иммуносорбентного твердофазного анализа (MELISA) и иммуносорбентного твердофазного анализа (ELISA)Detection of A. fumigatus antibodies using microwave-mediated immunosorbent solid-phase analysis (MELISA) and immunosorbent solid-phase analysis (ELISA)

Детектирование антител A.fumigatus в сыворотках пациентов осуществляют с помощью способа СВЧ-опосредованного иммуносорбентного твердофазного анализа (MELISA) и иммуносорбентного твердофазного анализа (ELISA) в условиях, подобных тем, которые описаны в примере 8, за исключением того, что антиген представляет собой A.fumigatus, антитело собирают из сывороток 10 различных пациентов, контрольные сыворотки, не содержащие специфического антитела, собирают от здоровых добровольцев, и конъюгат представляет собой IgG античеловек - пероксидазу. Все эксперименты осуществляют в сдвоенных лунках.The detection of A. fumigatus antibodies in patient sera is carried out using the method of microwave-mediated immunosorbent solid phase analysis (MELISA) and immunosorbent solid phase analysis (ELISA) under conditions similar to those described in example 8, except that the antigen is A. fumigatus, the antibody is collected from the sera of 10 different patients, control sera that do not contain a specific antibody are collected from healthy volunteers, and the conjugate is an anti-human IgG peroxidase. All experiments are carried out in double wells.

Результаты детектирования антител A.fumigatus с помощью СВЧ-опосредованного иммуносорбентного твердофазного анализа (MELISA) и иммуносорбентного твердофазного анализа (ELISA) представлены в таблице 8.The results of the detection of A. fumigatus antibodies using microwave-mediated immunosorbent solid phase analysis (MELISA) and immunosorbent solid phase analysis (ELISA) are presented in table 8.

Таблица 1: Детектирование антител E.histolytica путем осуществления первого этапа согласно способу MELISA, а оставшихся этапов согласно способу ELISA.Table 1: Detection of E.histolytica antibodies by performing the first step according to the MELISA method, and the remaining steps according to the ELISA method.

MELISA: Этап-1. Иммобилизация антигена под воздействием микроволнового излучения, при 700 ватт, на активированных лунках в течение различных периодов времени, согласно таблице, контроль: 37°С, 70 секундMELISA: Step 1. Immobilization of antigen under the influence of microwave radiation, at 700 watts, on activated wells for various periods of time, according to the table, control: 37 ° C, 70 seconds

ELISA: (Этап - 2-5) Традиционный способELISA: (Step 2-5) Conventional Method

Время (в сек)Time (in sec) + ve сыворотки+ ve serum - ve сыворотки- ve serum ПримечанияNotes 1010 0.1880.188 0.1960.196 0.1910.191 0.0020.002 0.0040.004 0.0030.003 + ++++ 30thirty 0.2080.208 0.1930.193 0.1980.198 0.0050.005 0 0010 001 0.0020.002 + ++++ 50fifty 0.2260.226 0.2110.211 0.2140.214 0.0060.006 0.0020.002 0.0040.004 + + ++++ 7070 0.3630.363 0.3550.355 0.3580.358 0.0050.005 0.0010.001 0.0030.003 + + + ++ + + + 9090 0.3700.370 0.3600.360 0.3670.367 0.0010.001 0.0030.003 0.0040.004 + + + ++ + + + КонтрольThe control 0.0030.003 0.0010.001 0.0040.004 0.0060.006 0.0040.004 0.0020.002 --

Таблица 2: Детектирование антител E.histolytica путем осуществления первых двух этапов согласно способу MELISA, а оставшихся этапов - согласно способу ELISA.Table 2: Detection of E.histolytica antibodies by performing the first two steps according to the MELISA method, and the remaining steps according to the ELISA method.

MELISA: Этап-1. Связывание Ag - 70 секунд, 700 ватт. Этап-2. Блокировка - изменяемое время, согласно таблице, 700 ватт.MELISA: Step 1. Ag binding - 70 seconds, 700 watts. Stage 2. Blocking - a variable time, according to the table, 700 watts.

ELISA: (Этап – 3-5) Традиционный способ.ELISA: (Step 3-5) The traditional method.

Таблица 3: Детектирование антител E.histolytica путем осуществления первых трех этапов, согласно способу MELISA, а оставшихся этапов - согласно способу ELISA.Table 3: Detection of E.histolytica antibodies by performing the first three steps according to the MELISA method, and the remaining steps according to the ELISA method.

MELISA: Этап-1. Связывание Ag - 70 секунд, 700 ватт. Этап-2. Блокировка - 10 секунд, 700 ватт. Этап-3. Связывание антитела - изменяемое время - согласно таблице, 700 ватт. ELISA: (Этап-4 и 5) Традиционный способ.MELISA: Step 1. Ag binding - 70 seconds, 700 watts. Stage 2. Blocking - 10 seconds, 700 watts. Stage 3. Antibody binding - variable time - according to the table, 700 watts. ELISA: (Step 4 and 5) The traditional method.

Время (в сек)Time (in sec) Сыворотки +veSerum + ve сыворотки - veserum - ve Примечания Notes 1010 0.2160.216 0.2030.203 0.2110.211 0.0870.087 0.1230.123 0.0980.098 ++ 30thirty 0.3920.392 0.3530.353 0.3880.388 0.1000.100 0.1370.137 0.1140.114 -- 50fifty 1.4131.413 1.1771.177 1.2131.213 0.1940.194 0.1800.180 0.1940.194 + ++++ 7070 1.3131.313 1.2531.253 1.2761.276 1.2631.263 1.2791.279 1.2751.275 -- 9090 1.2871.287 1.2391.239 1.2381.238 1.2881.288 1.2481.248 1.2341.234 --

Таблица 4: Детектирование антител E.histolytica путем осуществления первых трех этапов, согласно способу MELISA, а оставшихся этапов - согласно способу ELISA.Table 4 : Detection of E.histolytica antibodies by performing the first three steps according to the MELISA method, and the remaining steps according to the ELISA method.

MELISA: Этап-1. Связывание Ag - 70 секунд, 700 ватт. Этап-2. Блокировка - 10 секунд, 700 ватт. Этап-3. Связывание антитела - изменяемое время - согласно таблице, 155 ватт. ELISA (Этап-4 - 5): Традиционный способ.MELISA: Step 1. Ag binding - 70 seconds, 700 watts. Stage 2. Blocking - 10 seconds, 700 watts. Stage 3. Antibody binding - variable time - according to the table, 155 watts. ELISA (Step 4-5): The traditional method.

Таблица 5: Детектирование антител E. histolytica путем осуществления первых четырех этапов, согласно способу MELISA, а последнего этапа - согласно традиционному способу.Table 5: Detection of E. histolytica antibodies by performing the first four steps, according to the MELISA method, and the last step, according to the traditional method.

MELISA: Этап-1. Связывание Ag - 70 секунд, 700 ватт. Этап-2. Блокировка - 10 секунд, 700 ватт. Этап-3. Связывание антитела - 100 секунд, 155 ватт. Этап-4. Связывание конъюгата - изменяемое время - согласно таблице, 700 ватт. Этап-5. проявление окраски - 5 минут, при комнатной температуре.MELISA: Step 1. Ag binding - 70 seconds, 700 watts. Stage 2. Blocking - 10 seconds, 700 watts. Stage 3. Antibody binding - 100 seconds, 155 watts. Stage 4. Conjugate binding - variable time - as per table, 700 watts. Stage 5. the manifestation of color - 5 minutes, at room temperature.

Время (в сек)Time (in sec) сыворотки +veserum + ve сыворотки -veserum -ve ПримечанияNotes 55 0.1470.147 0.1360.136 0.1380.138 0.0320.032 0.0200.020 0.230.23 + ++++ 1010 0.1660.166 0.1660.166 0.1680.168 0.0870.087 0.0930.093 0.850.85 ++ 15fifteen 0.1920.192 0.1710.171 0.1830.183 0.1100.110 0.1190.119 0.1160.116 -- 20twenty 0.3880.388 0.5030.503 0.4460.446 0.3120.312 0.2880.288 0.2930.293 --

Таблица 6: Детектирование антител E.histolytica путем осуществления первых четырех этапов, согласно способу MELISA, а последнему этапу - согласно традиционному способу.Table 6 : Detection of E.histolytica antibodies by the first four steps according to the MELISA method, and the last step according to the traditional method.

MELISA: Этап-1. Связывание Ag - 70 секунд, 700 ватт. Этап-2. Блокировка - 10 секунд, 700 ватт. Этап-3. Связывание антитела - 100 секунд, 155 ватт. Этап-4. Связывание конъюгата - изменяемое время - согласно таблице, 155 ватт. Этап-5. Проявление окраски - 5 минут, при комнатной температуре.MELISA: Step 1. Ag binding - 70 seconds, 700 watts. Stage 2. Blocking - 10 seconds, 700 watts. Stage 3. Antibody binding - 100 seconds, 155 watts. Stage 4. Conjugate binding - variable time - according to table, 155 watts. Stage 5. The manifestation of color - 5 minutes, at room temperature.

Время (в сек)Time (in sec) сыворотки +veserum + ve сыворотки -veserum -ve ПримечанияNotes 50fifty 0.2050.205 0.1890.189 0.1920.192 0.0210.021 0.0180.018 0.0220.022 + ++++ 100100 0.5580.558 0.5320.532 0.5430.543 0.0360.036 0.0310.031 0.0320.032 + + + ++ + + + 120120 0.1450.145 0.1930.193 0.1570.157 0.0230.023 0.0140.014 0.0230.023 ++

Таблица 7: Детектирование антител E.histolytica: Сравнение способов MELISA и ELISA.Table 7: Detection of E.histolytica antibodies: Comparison of the MELISA and ELISA methods.

MELISA: Этап-1. Связывание Ag - 70 секунд, 700 ватт. Этап-2. Блокировка - 10 секунд, 700 ватт. Этап-3. Связывание антитела - 100 секунд, 155 ватт. Этап-4. Связывание конъюгата - 100 секунд, 155 ватт. Этап-5. Проявление окраски - 5 минут, при комнатной температуре.MELISA: Step 1. Ag binding - 70 seconds, 700 watts. Stage 2. Blocking - 10 seconds, 700 watts. Stage 3. Antibody binding - 100 seconds, 155 watts. Stage 4. Conjugate binding - 100 seconds, 155 watts. Stage 5. The manifestation of color - 5 minutes, at room temperature.

ELISA: Этап-1. Cвязывание Ag - в течение ночи, при 4°C. Этап-2. Блокировка - 2 ч, при 37°C. Этап-3. Связывание антитела - 2 ч, при 37°C. Этап-4. Связывание конъюгата - 2 ч, при 37°C. Этап-5. Проявление окраски - 5 минут, при комнатной температуре.ELISA: Step 1. Ag binding - overnight at 4 ° C. Stage 2. Blocking - 2 hours at 37 ° C. Stage 3. Antibody binding - 2 hours at 37 ° C. Stage 4. Binding of the conjugate - 2 hours, at 37 ° C. Stage 5. The manifestation of color - 5 minutes, at room temperature.

Серийн. №Serial No. сыворотки +veserum + ve сыворотки -veserum -ve MELISAMELISA ELISAELISA MELISAMELISA ELISAELISA 11 0.5670.567 0.5560.556 0.5390.539 0.5600.560 0.0360.036 0.0700.070 0.0460.046 0.0400.040 22 0.5310.531 0.5560.556 0.5380.538 0.5340.534 0.0960.096 0.0560.056 0.0640.064 0.0700.070 33 0.5410.541 0.5630.563 0.5490.549 0.5470.547 0.0980.098 0.0530.053 0.0640.064 0.0500.050 44 0.5580.558 0.5450.545 0.5740.574 0.5440.544 0.0520.052 0.0800.080 0.0740.074 0.1100.110 55 0.5570.557 0.5640.564 0.5580.558 0.5400.540 0.0490.049 0.0790.079 0.0560.056 0.0900.090 Примечания Notes Воспроизводимый Reproducible ВоспроизводимыйReproducible ВоспроизводимыйReproducible ВоспроизводимыйReproducible

Таблица 8: Детектирование антител Aspergillus fumigatusTable 8: Detection of Aspergillus fumigatus Antibodies

Сравнение способов MELISA и ELISA. Следуют тем же способам, которые описаны в таблице 7.Comparison of the MELISA and ELISA methods. Follow the same methods described in table 7.

№ образцаSample No. сыворотки +veserum + ve сыворотки -veserum -ve MELISAMELISA ELISAELISA MELISAMELISA ELISAELISA 11 0.3340.334 0.3560.356 0.3390.339 0.3200.320 0.0360.036 0.0700.070 0.1160.116 0.1300.130 9nine 0.3310.331 0.3560.356 0.4380.438 0.3800.380 0.0960.096 0.0560.056 0.0940.094 0.1100.110 33 0.3510.351 0.3800.380 0.3790.379 0.4100.410 0.0980.098 0.0530.053 0.1640.164 0.1500.150 44 0.4980.498 0.5250.525 0.5740.574 0.5200.520 0.0520.052 0.0800.080 0.1740.174 0.1700.170 55 0.6850.685 0.6640.664 0.6580.658 0.6410.641 0.0490.049 0.0790.079 0.0560.056 0.0800.080 66 0.3670.367 0.3750.375 0.3720.372 0.3900.390 0.0630.063 0.0470.047 0.0930.093 0.1100.110 77 0.4300.430 0.4490.449 0.4120.412 0.4000.400 0.1140.114 0.1310.131 0.1100.110 0.1500.150 88 0.5500.550 0.5600.560 0.5270.527 0.5100.510 0.0900.090 0.0770.077 0.0980.098 0.1000.100 9nine 2.2042.204 2.0812.081 1.9841.984 2.3002.300 0.0580.058 0.0610.061 0.0730.073 0.1200.120 1010 0.3460.346 0.3410.341 0.3270.327 0.3100.310 0.0390.039 0.0370.037 0.1420.142 0.1600.160 Примечания Notes СравнимыйComparable Меньшее неспецифическое связывание в MELISA Less nonspecific binding in MELISA

Устройство для MELISADevice for MELISA

Устройство для MELISA может быть сконструировано с помощью следующих компонентов:The device for MELISA can be constructed using the following components:

(a) Загрузочная камера: она представляет собой камеру для автоматической загрузки образцов или реагентов из заданной емкости через тонкую трубку и с помощью соответствующего насоса на активированный полистироловый планшет/модуль.(a) Loading chamber: it is a chamber for automatically loading samples or reagents from a given container through a thin tube and using an appropriate pump onto an activated polystyrene plate / module.

(b) Реакционная камера: Реакционная камера состоит из магнетрона, вытяжного вентилятора и устройства фокусировки света, для осуществления этапов связывания антигена, блокировки, связывания антитела и связывания конъюгата антитела и фермента под воздействием микроволнового излучения и реакции фермента и субстрата при температуре окружающей среды через предварительно заданное время, как описывается в п.1 формулы изобретения.(b) Reaction chamber: The reaction chamber consists of a magnetron, an exhaust fan and a light focusing device, for the steps of antigen binding, blocking, antibody binding and antibody-enzyme conjugate binding under microwave irradiation and the reaction of the enzyme and substrate at ambient temperature through pre set time, as described in claim 1 of the claims.

(c) Камера для промывки и сушки: в этой камере промывка и сушка планшета или модуля ELISA осуществляются автоматически согласно команде программы после каждого этапа способа MELISA.(c) Rinsing and drying chamber: in this chamber, washing and drying of the tablet or ELISA module is carried out automatically according to the program command after each step of the MELISA method.

(d) Камера для детектирования: эта камера используется для колориметрического детектирования с помощью спектрофотометра.(d) Detection chamber: This chamber is used for colorimetric detection with a spectrophotometer.

(e) Перемещаемая платформа: она используется для переноса планшетов/модулей Elisa из одной камеры в другую камеру.(e) Roaming platform: it is used to transfer Elisa tablets / modules from one camera to another camera.

(f) Контрольный узел: он содержит компьютерные средства на основе микропроцессора для контроля способа MELISA, как описано в п.1 формулы изобретения, с помощью соответствующего аппаратного и программного обеспечения.(f) Control unit: it contains microprocessor-based computer tools for monitoring the MELISA method, as described in claim 1, using appropriate hardware and software.

Преимущества изобретенияAdvantages of the Invention

Традиционные способы ELISA, как правило, занимают от нескольких часов до 2 дней, для завершения, что является главным недостатком способа, используемого во всем мире в различных областях, кроме клинической диагностики. В случае срочной необходимости в медицинской помощи ценное время теряется при диагностике, перед тем, как пациент сможет получить необходимое лечение. По этой причине быстрое осуществление способа ELISA согласно настоящему изобретению (MELISA) будет иметь преимущество и будет полезной для диагностики заболеваний, для биомедицинских исследований и для других родственных областей. Главные преимущества способа ELISA согласно настоящему изобретению заключаются в следующем:Traditional ELISA methods, as a rule, take from several hours to 2 days to complete, which is the main disadvantage of the method used worldwide in various fields, except for clinical diagnostics. In case of urgent need for medical care, valuable time is lost in the diagnosis before the patient can receive the necessary treatment. For this reason, the rapid implementation of the ELISA method according to the present invention (MELISA) will be advantageous and will be useful for the diagnosis of diseases, for biomedical research and for other related areas. The main advantages of the ELISA method according to the present invention are as follows:

1. Способ согласно настоящему изобретению является гораздо более быстрым, чем существующие способы ELISA.1. The method according to the present invention is much faster than existing ELISA methods.

2. Общее время, требуемое в способе согласно настоящему изобретению, составляет менее чем 10 минут. Таким образом, он делает ненужной требующую большого времени, трудоемкую процедуру.2. The total time required in the method according to the present invention is less than 10 minutes. Thus, it makes a time-consuming, laborious procedure unnecessary.

3. Способ согласно настоящему изобретению является очень чувствительным и требует очень малых количеств ценного антигена или антитела.3. The method according to the present invention is very sensitive and requires very small amounts of valuable antigen or antibody.

4. Способ согласно настоящему изобретению является очень точным, поскольку взаимодействие фермент-субстрат осуществляется в растворе и количественно характеризуется спектрофотометрически.4. The method according to the present invention is very accurate, since the interaction of the enzyme-substrate is carried out in solution and quantitatively characterized spectrophotometrically.

5. Способ является простым и не требует никакого дополнительного опыта или реагента для его осуществления.5. The method is simple and does not require any additional experience or reagent for its implementation.

6. Способ согласно настоящему изобретению является экономически эффективным и не требует никакого дополнительного оборудования, за исключением бытовой микроволновой печи, которую можно найти в большинстве лабораторий.6. The method according to the present invention is cost-effective and does not require any additional equipment, except for a household microwave oven, which can be found in most laboratories.

7. Способ согласно настоящему изобретению является воспроизводимым, что представляет собой важный критерий для ELISA.7. The method according to the present invention is reproducible, which is an important criterion for ELISA.

8. Способ обеспечивает минимальное или пренебрежимо малое неспецифическое связывание.8. The method provides minimal or negligible non-specific binding.

9. Способ имеет потенциал для автоматизации, которая может свести к минимуму ошибку оператора, которая обычно изменяется от одного человека к другому.9. The method has the potential for automation, which can minimize operator error, which usually varies from one person to another.

10. Способ согласно настоящему изобретению имеет потенциал для применения в других иммунологических анализах, таких как радиоиммунологический анализ, радиологический иммуносорбентный анализ, радиологический аллергосорбентный анализ, иммунологический анализ с помощью биотин-авидина/стрептавидина, имммуноблоттинг, иммуноокрашивание и тому подобное, наряду с различными типами ELISA, такими как непосредственный ELISA, опосредованный ELISA, сэндвич-ELISA и тому подобное.10. The method according to the present invention has the potential for use in other immunological assays, such as radioimmunological analysis, radiological immunosorbent analysis, radiological allergenic sorbent analysis, immunological analysis using biotin-avidin / streptavidin, immunoblotting, immunostaining and the like, along with various types of ELISA such as direct ELISA, mediated ELISA, sandwich ELISA and the like.

Таким образом, способ ELISA согласно настоящему изобретению является быстрым, экономичным, воспроизводимым, простым и имеет потенциал для автоматизации. Он будет иметь преимущества для лечения людей, благодаря его возрастающей важности в клинической диагностике, молекулярной биологии, сельском хозяйстве, пищевой технологии, в науке об окружающей среде, в биомедицинских исследованиях и в других родственных областях.Thus, the ELISA method according to the present invention is fast, economical, reproducible, simple and has the potential for automation. It will have advantages for treating people due to its growing importance in clinical diagnostics, molecular biology, agriculture, food technology, environmental science, biomedical research and other related fields.

ЛитератураLiterature

1. Douillard, J.Y. and Hoffman, T. (1983) Methods in Enzymology 92, 168-174.1. Douillard, J.Y. and Hoffman, T. (1983) Methods in Enzymology 92, 168-174.

2. Van Emon, J.M. and Lopez-Avila, V. (1992) Analytical Chemistry, 64. 79A-88A.2. Van Emon, J.M. and Lopez-Avila, V. (1992) Analytical Chemistry, 64. 79A-88A.

3. Linde, D.G. and Goh, K.S.(1995) Pesticide Outlook, 18-23.3. Linde, D.G. and Goh, K.S. (1995) Pesticide Outlook, 18-23.

4. Salgame, P., Varadhachary, A.S, Primiano, L.L., Finke_; IE., Muller, S. and Monestier. M. (1996) Nucleic Acids Res.25, 680-681.4. Salgame, P., Varadhachary, AS, Primiano, LL, Finke _; IE., Muller, S. and Monestier. M. (1996) Nucleic Acids Res.25, 680-681.

5. Satoh, A., Fukui, S., Yoshino, S. Shinoda, M.Kozima, K. and Matsumoto, I. (1999) Analytical Biochemistry 275, 231-235.5. Satoh, A., Fukui, S., Yoshino, S. Shinoda, M. Kozima, K. and Matsumoto, I. (1999) Analytical Biochemistry 275, 231-235.

6. Larsson, P.M., Johansson, S.G.O., Huh, A. and Gothe, S. (1987) Journal of Immimological Methods 98, 129-135.6. Larsson, P. M., Johansson, S. G. O., Huh, A. and Gothe, S. (1987) Journal of Immimological Methods 98, 129-135.

7. Boon, M.E and Kok, L.K. (1992) Microwave irradiation in immunostaining, p.256-285. In Microwave Cookbook of Pathology: The Art of Microscopic Visualisation. 3rd. Ed. Columbia press Leyden, Leiden.7. Boon, M.E and Kok, L.K. (1992) Microwave irradiation in immunostaining, p. 256-285. In Microwave Cookbook of Pathology: The Art of Microscopic Visualization. 3rd. Ed. Columbia press Leyden, Leiden.

8. Boon, M.E., Kok, L.K., Moorlag, H.E. and Suurmeijer (1989). Am.J.Clin. Pathol. 92:137-143.8. Boon, M.E., Kok, L.K., Moorlag, H.E. and Suurmeijer (1989). Am.J. Clin. Pathol. 92: 137-143.

9. Chiu, K.Y. and K.W. Chan. 1987. J.Clin.Pathol. 40:689-692.9. Chiu, K.Y. and K.W. Chan. 1987. J. Clin. Pathol. 40: 689-692.

10. Hjerpe, A., Boon, M.E. and Kok, L.P. (1988). Histochem.J. 20:388-396.10. Hjerpe, A., Boon, M.E. and Kok, L.P. (1988). Histochem.J. 20: 388-396.

11. Koh, L.P. and Boon, M.E. (1992) Microwave Cookbook for Microscopists: Art and Science of Visualization, Third Edition. Coulomb Press Leyden: The Netherlands.11. Koh, L.P. and Boon, M.E. (1992) Microwave Cookbook for Microscopists: Art and Science of Visualization, Third Edition. Coulomb Press Leyden: The Netherlands.

12. Sawhney, S. Chakravarti, R.X. Jain. P. and Vinayak, V.K. 1980. Trans.Roy.Soc.Trop.Med.Hyg. 74: 26-29.12. Sawhney, S. Chakravarti, R.X. Jain. P. and Vinayak, V.K. 1980. Trans.Roy.Soc.Trop.Med.Hyg. 74: 26-29.

13. Sharma, G.L, Naik, S.R. and Vinayak, Y.K. 1984. Aust.J.Exp.Biol.Med.Sc. 62: 117-133.13. Sharma, G. L, Naik, S.R. and Vinayak, Y.K. 1984. Aust.J.Exp.Biol.Med.Sc. 62: 117-133.

14. Lowry, O.K., Rosebrough, N.J., Fair. A.L. and Randall. R.J. 195L J.Biol.Chem. 193: 265.14. Lowry, O.K., Rosebrough, N.J., Fair. A.L. and Randall. R.J. 195L J. Biol. Chem. 193: 265.

15. Voller A., Bidwell D, Bartett A. Microplate ELISA and its application. In Imraunoenzymatic Analysis Techniques. Malvano R. ed. The Hague Martinus Nijhoff Publ. 1980, p104-115.15. Voller A., Bidwell D, Bartett A. Microplate ELISA and its application. In Imraunoenzymatic Analysis Techniques. Malvano R. ed. The Hague Martinus Nijhoff Publ. 1980, p104-115.

16. Banerjee, B., Chetty, A., Joshi, A.P., and Sarma, P.U., 1990, Asian Pacific J Allergy Immunol. 8:13-18).16. Banerjee, B., Chetty, A., Joshi, A.P., and Sarma, P.U., 1990, Asian Pacific J Allergy Immunol. 8: 13-18).

17. Rosenberg, M., Patterson, R., Mintzer, R., Cooper, B.J., Roberts, M. and Harris, K.E., Ann Intern Med 1997, 86:405-414).17. Rosenberg, M., Patterson, R., Mintzer, R., Cooper, B.J., Roberts, M. and Harris, K.E., Ann Intern Med 1997, 86: 405-414).

Другие ссылкиOther links

Патентные документыPatent documents

Apr., 1989 Boon et al PCT заявка на патент WO 897 03038.Apr., 1989 Boon et al PCT patent application WO 897 03038.

Claims

1. A quick method for microwave-mediated immunosorbent solid-phase analysis using an activated solid substrate, while this method includes the following steps:

(a) activating the surface of the holes of the solid substrate,

(b) loading a biological molecule selected from an antigen or antibody by dissolving said biological molecule in a buffer applied to an activated well of said solid support and placing said well inside a microwave oven, followed by microwave irradiation of said well with a frequency located in between 2300 and 2500 MHz, with an output power between 600 and 900 V, for a period of time between 50-100 s, followed by thorough washing of the well with appropriate wash buffer,

(c) blocking the free binding sites in the well with immobilized biological molecules, as obtained in step (b) above, by loading the blocking solution into the well and exposing it inside the microwave oven with microwave radiation at a frequency of 2300-2500 MHz, s an output power between 600 and 800 V for a period of time between 5-20 s and washing the indicated well with an appropriate washing buffer,

(d) loading the corresponding antibody or antigen dissolved in the buffer into a well with an immobilized antigen or antibody, as obtained in step (c) above, followed by exposing the indicated hole inside the microwave oven to microwave radiation at a frequency of 2300-2500 MHz with an output power in the range of 50-200 V for a period of time in the range of 90-200 s, followed by washing with a washing buffer,

(e) loading the appropriate conjugate of the enzyme dissolved in the appropriate buffer into the above well obtained in step (d) above, wherein the conjugate used is selected from a biological molecule containing an antibody or antigen conjugated to an enzyme selected from peroxidase or alkaline phosphatase, and the impact on the specified hole inside the microwave microwave oven with a frequency of 2300-2500 MHz, with an output power in the range of 100-300 V for a period of time in the range 50-150 s, followed by washing with a washing buffer,

(f) adding a buffered dye substrate to the above well, as obtained in step (e) above, and holding it for a period of time within 4-10 minutes in the dark, followed by the addition of a stop solution and measuring the optical density of the solution using a spectrophotometer at the appropriate wavelength.

2. The method according to claim 1, in which the used solid substrate is selected from the group consisting of polystyrene, polypropylene, polyethylene, glass, cellulose, nitrocellulose, silica gel, polyvinyl chloride, polyaniline and the like.

3. The method according to claim 1, wherein the preferred solid support used is polystyrene.

4. The method according to claim 1, in which the solid substrate is selected of any configuration, shape and size, such as sheets, plates, test particles, such as balls and microspheres, tubes, test sticks, test strips, well, ELISA plate, microwell plate or module.

5. The method according to claim 1, in which the solid substrate used to immobilize biological molecules is selected from any substrates having at least one active functional group selected from the group consisting of halide, aldehyde, acetyl, epoxide, succinamide , isothiocyanate, acylazide and the like.

6. The method according to claim 1, in which the functional group may be present in the substrate itself or may be introduced using conventional chemical or photochemical methods and the like.

7. The method according to claim 1, in which the antigen either induces an immune response, or can, in principle, cause it.

8. The method according to claim 1, in which the exposure to microwave radiation is carried out in a device or chamber where microwave radiation can be generated, and which is selected from a household microwave oven, a predetermined microwave oven, or any device or chamber in which microwave radiation is generated.

9. The method according to claim 1, in which the total time for antigen binding, blocking, antibody binding and conjugate binding is in the range of 195-470 s.

10. The method according to claim 1, in which the blocking agent is selected from the group consisting of bovine serum albumin, powdered skim milk and gelatin.

11. The method according to claim 1, in which the coating buffer is selected from a carbonate buffer, a phosphate buffer having a pH value in the range of 6.5-11, with a molarity in the range of 0.005-0.1 M.

12. The method according to claim 1, in which the used washing buffer is a mixture of saline phosphate buffer having a pH value in the range of 6.5-11, with a molarity in the range of 0.005-0.1 M, and Tween 20, between 0.05% -3%.

13. The method according to claim 1, which is intended for use in the analysis selected from the group with various types of ELISA, such as direct ELISA, mediated ELISA, sandwich ELISA, and the like.

14. A device for microwave-mediated immunosorbent solid phase analysis (MELISA), containing

(a) a loading chamber for automatically loading samples or reagents from a given container through a thin tube and using an appropriate pump to an activated polystyrene plate / module,

(b) a reaction chamber consisting of a magnetron, an exhaust fan and a light focusing device, for performing the steps of binding the antigen or antibody, blocking, subsequent binding of the antibody or antigen, binding of the conjugate of the antigen or antibody and the enzyme under the influence of microwave radiation and the reaction of the enzyme and substrate when ambient temperature after a predetermined time according to claim 1,

(c) a chamber for automatically washing and drying said tablet or ELISA module according to a program command after each step of the MELISA method;

(d) a detection chamber for colorimetric detection with a spectrophotometer;

(e) a relocatable platform used to transfer tablets / ELISA modules from one camera to another camera;

(f) microprocessor-based computer tools for monitoring the MELISA method according to claim 1 using appropriate hardware and software.