RU2247780C2 - Method for assay of respiratory control in microorganisms population - Google Patents
Method for assay of respiratory control in microorganisms population Download PDFInfo
- Publication number
- RU2247780C2 RU2247780C2 RU2003105709/13A RU2003105709A RU2247780C2 RU 2247780 C2 RU2247780 C2 RU 2247780C2 RU 2003105709/13 A RU2003105709/13 A RU 2003105709/13A RU 2003105709 A RU2003105709 A RU 2003105709A RU 2247780 C2 RU2247780 C2 RU 2247780C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- population
- respiration
- glucose
- bacterial population
- respiratory control
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к способам исследования бактериальных клеток методами полярографии, в частности к способу определения дыхательного контроля (ДК) популяции бактерий, и может быть использовано для оценки качества вакцин, их полуфабрикатов и других бактерийных препаратов на основе вегетативных форм микробов по степени энергозависимой регуляции дыхательной активности бактериальных культур.The invention relates to methods for studying bacterial cells by polarography, in particular to a method for determining respiratory control (DC) of a bacterial population, and can be used to assess the quality of vaccines, their semi-finished products and other bacterial preparations based on vegetative forms of microbes according to the degree of volatile regulation of bacterial respiratory activity cultures.
Известен способ определения дыхательного контроля у пробы митохондрий, выделенных из клеток эукариот (способ определения ДК по Чансу-Уильямсу), состоящий в одномоментном добавлении сукцината в среду инкубации деэнергизованных митохондрий, содержащей ортофосфат и АДФ, либо в одномоментном добавлении АДФ в среду инкубации энергизованных митохондрий, окисляющих сукцинат в присутствии ортофосфата, АДФ и измерении отношения увеличившейся при этом добавлении скорости потребления кислорода митохондриями (быстрая фаза активного дыхания - V3) к уменьшившейся через несколько минут скорости потребления кислорода (медленная фаза контролируемого дыхания - V4), то есть ДК=V3/V4 [Chance В., Williams G.R. The respiratory chain and oxidative phosphorylation / Adv. Enzymol., 1956. - No 17. - P.65-134; Патологическая физиология. Учебник для мед. вузов /Под ред. А.Д.Адо, М.А.Адо, В.И.Пыцкого и др. - М., 2000, Триада-Х. - С.23-25]. По величине ДК судят об уровне сохранения физиологической работоспособности митохондрий, нарушении их биоэнергетических функций как наиболее ранних признаках патологических изменений в клетках эукариот.A known method for determining respiratory control in a sample of mitochondria isolated from eukaryotic cells (a method for determining DC according to Chance-Williams), consisting in the simultaneous addition of succinate to the incubation medium of deenergized mitochondria containing orthophosphate and ADP, or in the simultaneous addition of ADP to the incubation medium of energized mit oxidizing succinates in the presence of orthophosphate, ADP and measuring the ratio of mitochondria increased oxygen consumption with this addition (fast phase of active respiration - V 3 ) to a decrease in oxygen consumption rate after a few minutes (the slow phase of controlled respiration is V 4 ), that is, DC = V 3 / V 4 [Chance B., Williams GR The respiratory chain and oxidative phosphorylation / Adv. Enzymol., 1956 .-- No. 17 .-- P.65-134; Pathological physiology. Textbook for honey. Universities / Ed. A.D. Ado, M.A. Ado, V.I. Pytsky and others .-- M., 2000, Triad-X. - S.23-25]. By the value of DCs, the level of preservation of the physiological performance of mitochondria, the violation of their bioenergetic functions as the earliest signs of pathological changes in eukaryotic cells is judged.
Общим с заявленным способом является методический прием формирования in vitro последовательности метаболических состояний изучаемого биологического объекта, а именно:In common with the claimed method is a methodological method of forming in vitro a sequence of metabolic states of the studied biological object, namely:
1) активация дыхательной активности (V3), вызванная окислением одного из метаболитов цикла Кребса (сукцината) при добавлении АДФ, как результат низкоэнергетического сдвига;1) activation of respiratory activity (V 3 ), caused by the oxidation of one of the metabolites of the Krebs cycle (succinate) when ADP is added, as a result of a low-energy shift;
2) регулируемое (контролируемое) торможение дыхательной активности (V4), вызванное превращением добавленной АДФ в АТФ в реакции окислительного фосфорилирования при утилизации одного из метаболитов цикла Кребса (сукцината), как результат накопления макроэргического продукта и увеличения мембранного потенциала митохондрий.2) regulated (controlled) inhibition of respiratory activity (V 4 ), caused by the conversion of added ADP to ATP in the oxidative phosphorylation reaction during the utilization of one of the Krebs cycle metabolites (succinate), as a result of the accumulation of a macroergic product and an increase in the mitochondrial membrane potential.
Недостатком данного способа является неоднократно экспериментально подтвержденная невозможность моделирования in vitro метаболических состояний популяции бактерий при добавлении к ней экзогенной АДФ и, как следствие, невозможность определения у бактериальной популяции дыхательного контроля по Чансу-Уильямсу, поскольку интактные бактерии непроницаемы для экзогенной АДФ, и они не содержат транслоказы адениннуклеотидов [Лукоянова М.А., Тихонова Г.В. Организация дыхательной цепи и аккумуляция энергии у бактерий. Итоги науки и техники //Сер. Биол. химия. - ВИНИТИ. - М., 1982. - №17. - Р.33-74.]. Создание специальных условий в опытах с интактными бактериями, например применение креатинкиназной фосфатакцепторной системы и ингибитора гликолиза в системе "гексокиназной ловушки" [Голубинский Е.П., Рублев Б.Д., Кирдеев В. К. Окислительное фосфорилирование у чумного микроба / Вопросы мед. химии, - 1971. - No 16(5). - С.512-515; Канчух А.А., Голубинский Е.П., Иванова B.C. Использование гексокиназной и креатинкиназной систем для измерения окислительного фосфорилирования у чумного микроба / Биохимия. - 1973. - №38(2). - С.246-249], а также опыты с изолированными мембранными препаратами бактерий [Burstein С., Tiankova L., Kepes A. Respiratory control in Escherichia coli К 12 / Eur. J.Biochem. - 1979. - No 94. - P.387-392.; Haddock B.A., lones C.W. Bacterial respiration /J. Bacteriol.- 1977. - No 41(1). - P.47-99] позволяли регистрировать лишь незначительную активацию дыхания экзогенным АДФ (V3), но не последующее ауторегулируемое торможение активного дыхания популяции бактерий (V4).The disadvantage of this method is the repeatedly experimentally confirmed impossibility of modeling in vitro metabolic states of a bacterial population when exogenous ADP is added to it and, as a consequence, the inability to determine the bacterial population of the respiratory control according to Chance-Williams, since intact bacteria are impermeable to exogenous ADP, and they do not contain translocases of adenine nucleotides [Lukoyanova MA, Tikhonova GV The organization of the respiratory chain and the accumulation of energy in bacteria. Results of science and technology // Ser. Biol. chemistry. - VINITI. - M., 1982. - No. 17. - R.33-74.]. Creation of special conditions in experiments with intact bacteria, for example, the use of a creatine kinase phosphate receptor system and a glycolysis inhibitor in the hexokinase trap system [Golubinsky EP, Rublev BD, Kirdeev VK. Oxidative phosphorylation in the plague microbe / Questions honey. chemistry, - 1971. - No 16 (5). - S.512-515; Kanchukh A.A., Golubinsky E.P., Ivanova BC Use of hexokinase and creatine kinase systems for measuring oxidative phosphorylation in a plague microbe / Biochemistry. - 1973. - No. 38 (2). - S.246-249], as well as experiments with isolated membrane preparations of bacteria [Burstein C., Tiankova L., Kepes A. Respiratory control in Escherichia coli K 12 / Eur. J. Biochem. - 1979.- No. 94.- P.387-392 .; Haddock BA, lones CW Bacterial respiration / J. Bacteriol. 1977 .-- No. 41 (1). - P.47-99] allowed to register only a slight activation of respiration by exogenous ADP (V 3 ), but not subsequent autoregulated inhibition of active respiration of the bacterial population (V 4 ).
Известен способ определения дыхательного контроля у популяции бактерий по величине стимуляции дыхания покоящихся клеток Escherichia coli разобщителем карбонилцианид-р-трихлорметоксифенилгидразоном [Burstein С., Tiankova L., Kepes A. Respiratory control in Escherichia coli К 12 / Eur. J.Biochem. - 1979. - No 94. - P.387-392].A known method of determining respiratory control in a bacterial population by the magnitude of the stimulation of respiration of resting cells of Escherichia coli by uncoupling carbonyl cyanide-p-trichloromethoxyphenylhydrazone [Burstein C., Tiankova L., Kepes A. Respiratory control in Escherichia coli K 12 / Eur. J. Biochem. - 1979. - No 94. - P.387-392].
Общим с заявленным способом является объект исследования - популяция бактерий, а также методический прием полярографической регистрации скорости дыхания популяции бактерий с использованием платинового электрода.In common with the claimed method is the object of study - a population of bacteria, as well as a methodological method for polarographic registration of the respiratory rate of a bacterial population using a platinum electrode.
Недостаток способа заключается в использовании разобщителя-протонофора для определения дыхательного контроля, что позволяет оценить лишь влияние величины протонного заряда цитоплазматической мембраны бактерий на регуляцию их дыхательной активности и не учитывает вклад других регуляторов, а именно: АТФ, АДФ, АМФ, НАД· Н, НАД+ и др. Следствием этого является сложность физиологической интерпретации получаемых результатов определения дыхательного контроля, который, например, не выявляется у растущей популяции Escherichia coli. Кроме того, способ требует применения дополнительных приемов истощения бактерий по эндогенным субстратам, для чего проводится предварительная интенсивная аэрация клеточной суспензии при 37° С до 30 минут, что неизбежно влияет на метаболический статус исследуемой популяции и искажает результаты опытов, свидетельством чему является то обстоятельство, что полученные авторами экспериментальные данные статистически не подтверждены, в то время как определяемые этим способом значения дыхательного контроля в разных условиях варьируют от 1,0 до 9,0.The disadvantage of this method is the use of a protonophore uncoupler to determine respiratory control, which allows one to estimate only the influence of the proton charge of the cytoplasmic membrane of bacteria on the regulation of their respiratory activity and does not take into account the contribution of other regulators, namely: ATP, ADP, AMP, NAD · N, NAD + and others. The consequence of this is the complexity of the physiological interpretation of the results of determining the respiratory control, which, for example, is not detected in a growing population of Escherichia coli. In addition, the method requires the use of additional methods of bacterial depletion on endogenous substrates, for which preliminary intensive aeration of the cell suspension is carried out at 37 ° C for up to 30 minutes, which inevitably affects the metabolic status of the studied population and distorts the experimental results, which is evidenced by the fact that the experimental data obtained by the authors are not statistically confirmed, while the values of respiratory control determined by this method in different conditions vary from 1.0 d about 9.0.
Наиболее близким к заявляемому техническому решению является способ [Tsuchiya Т., Rosen В.Р. Respiratory control in Escherichia coli / FEBS Lett. - 1980. - No.120(1). - Р.128-130], основанный на одномоментном добавлении в инкубационную среду с дышащей популяцией бактерий углеводов - олигосахаридов, являющихся субстратами Δ μ
Общим с заявляемым способом является методический прием полярографического измерения дыхательной активности популяции бактерий с помощью платинового электрода в ячейке объемом 2 см3, заполненной средой инкубации, который включает предварительное инкубирование микробной популяции для получения стабильного уровня эндогенного дыхания клеток, одномоментное введение в среду инкубации субстрата углеводной природы и количественный анализ динамики убыли кислорода из среды инкубации, а также то, что активация дыхания при добавлении углеводов вызвана инициацией окисления эндогенных субстратов в исследуемой популяции бактерий.In common with the claimed method is a methodological method for the polarographic measurement of the respiratory activity of a bacterial population using a platinum electrode in a 2 cm 3 cell filled with an incubation medium, which includes preliminary incubation of the microbial population to obtain a stable level of endogenous cell respiration, simultaneous introduction of a carbohydrate substrate into the incubation medium and a quantitative analysis of the dynamics of oxygen loss from the incubation medium, as well as the fact that respiratory activation upon the addition of carbohydrates Odes is caused by the initiation of oxidation of endogenous substrates in the studied bacterial population.
К недостаткам этого способа следует отнести применение и качестве одномоментно добавляемых в среду инкубации популяции бактерий неметаболизируемых веществ олигосахаридной природы - субстратов лактозотранспортной системы в заведомо высокой конечной концентрации 10 мМ (10000 нмоль/см3), что не позволяет регистрировать такую форму дыхательного контроля, как ауторегулируемое торможение активного дыхания популяции бактерий. Кроме того, по условиям способа бактериальные клетки дважды отмываются в буферном растворе и подвергаются дополнительному стрессовому воздействию интенсивного аэрирования и голодания, что, безусловно, отрицательно влияет на их исходный физиологический и энергетический статус. Изложенные недостатки ограничивают области применения способа. Сравнительный анализ величин дыхательного контроля возможен только у популяций, состоящих из родительских штаммов и штаммов-мутантов, несущих конститутивные признаки дефектности по ферментным системам транспорта, дыхания и окислительного фосфорилирования.The disadvantages of this method include the use and quality of non-metabolizable oligosaccharide substances, substrates of the lactose transport system in a known high final concentration of 10 mM (10,000 nmol / cm 3 ), which does not allow recording such a form of respiratory control as autoregulated inhibition of active respiration of a population of bacteria. In addition, according to the conditions of the method, bacterial cells are washed twice in a buffer solution and are subjected to additional stressful effects of intensive aeration and starvation, which, of course, negatively affects their initial physiological and energy status. The above disadvantages limit the scope of the method. A comparative analysis of the values of respiratory control is possible only in populations consisting of parental strains and mutant strains carrying constitutive signs of defectiveness in the enzyme systems of transport, respiration, and oxidative phosphorylation.
Задачей изобретения является разработка способа определения дыхательного контроля у популяции бактерий по степени ауторегулируемого торможения активного дыхания клеток, которое непосредственно связано с биоэнергетической эффективностью метаболических процессов в микробной популяции.The objective of the invention is to develop a method for determining respiratory control in a bacterial population by the degree of autoregulated inhibition of active respiration of cells, which is directly related to the bioenergy efficiency of metabolic processes in the microbial population.
Поставленная задача решается благодаря тому, что в заявляемом способе определения дыхательного контроля у популяции бактерий предусмотрены следующие отличия:The problem is solved due to the fact that in the inventive method for determining respiratory control in a population of bacteria, the following differences are provided:
для определения дыхательного контроля не требуется отмывка и истощение по эндогенным субстратам исследуемой бактериальной популяции. В качестве анализируемой пробы используется бактериальная популяция in situ (в составе жидких культур любого происхождения, а также в составе сухих культур после их регидратации в щадящих условиях);to determine respiratory control, washing and depletion of the studied bacterial population by endogenous substrates is not required. The bacterial population in situ is used as an analyzed sample (as a part of liquid cultures of any origin, as well as as part of dry cultures after their rehydration under gentle conditions);
в качестве одномоментно добавляемого в среду инкубации со стабильно дышащей на эндогенных субстратах популяции бактерий используется хорошо утилизируемый этими микроорганизмами углевод моносахаридной природы - Д(+)глюкоза в микроконцентрациях (10... .25 нмоль/см3);as a single-stage incubation with a bacterial population that stably breathes on endogenous substrates, a monosaccharide carbohydrate well utilized by these microorganisms — D (+) glucose in micro-concentrations (10 ... .25 nmol / cm 3 );
по полярограмме дыхания популяции бактерий регистрируется не только увеличение скорости убыли кислорода из среды инкубации, но и последующее ее торможение через 2... 5 минут либо отсутствие этого торможения в течение всего времени дыхания, вплоть до исчерпания кислорода в среде инкубации;according to the polarogram of the respiration of the bacterial population, not only an increase in the rate of oxygen loss from the incubation medium is recorded, but also its subsequent inhibition after 2 ... 5 minutes or the absence of this inhibition during the entire time of respiration, up to the exhaustion of oxygen in the incubation medium;
количественное определение дыхательного контроля у популяции бактерий производят по соотношению скоростей до и после торможения активного дыхания бактерий, утилизирующих глюкозу.quantitative determination of respiratory control in a bacterial population is carried out by the ratio of rates before and after inhibition of active respiration of bacteria utilizing glucose.
Указанные отличия обусловлены следующими причинами:These differences are due to the following reasons:
исключение этапа предварительной подготовки бактериальной популяции, связанной со стрессовыми воздействиями на клетки (отмывка и голодание), обеспечивает проведение анализа в физиологических условиях, то есть позволяет регистрировать величину дыхательного контроля, близкую к условиям in situ;the exception of the stage of preliminary preparation of the bacterial population associated with stressful effects on the cells (washing and starvation), provides an analysis in physiological conditions, that is, it allows you to record the amount of respiratory control close to in situ conditions;
глюкоза является универсальным энергетическим субстратом питания бактерий и часто используется в качестве основного источника углерода и энергии при выращивании микробных культур, в связи с чем бактериальные клетки всегда содержат конститутивные системы транспорта и катаболизма этого моносахарида в отличие от олигосахаридов, использующих индуцибельную лактозопермеазную систему транспорта, а также менее эффективные и ограниченные по составу ферментные системы внутриклеточного расщепления этих веществ [Готтшалк Г. Метаболизм бактерий / Пер. с англ. под ред. Е.Н.Кондратьевой. - М., Мир, 1982. - С.19-42, 93-95; Степанов А.С., Наумов А.В., Кондрашин Ю.И. Система транспорта Д-глюкозы и метил-α -Д-глюкопиранозида у чумного микроба // В кн.: Патологическая физиология особо опасных инфекций. Труды противочумного учреждения. - Саратов, 1984. - С.16-21]; использование глюкозы в микроколичествах (10... 25 нмоль) позволяет регистрировать эффект ауторегулируемого торможения активного дыхания популяции бактерий, утилизирующих этот углевод, либо отсутствие эффекта торможения дыхания даже после потребления бактериями кислорода в количествах, превышающих стехиометрически рассчитанное (60... 150 нмоль) на полное окисление одномоментно введенного в среду инкубации моносахарида. Последнее обусловлено тем обстоятельством, что у популяции бактерий под влиянием, например, стрессовых воздействий ("замораживание-оттаивание", длительное хранение при околонулевых и отрицательных температурах и др.) происходит нарушение регуляции дыхательной активности, опосредованное структурно-функциональными повреждениями цитоплазматической мембраны, в которой интегрированы системы транспорта, окислительного фосфорилирования и комплексы дыхательных ферментов (дегидрогеназы, цитохромы, убихиноны и др.).glucose is a universal energy substrate for the nutrition of bacteria and is often used as the main source of carbon and energy for growing microbial cultures, and therefore bacterial cells always contain constitutive systems of transport and catabolism of this monosaccharide, in contrast to oligosaccharides using an inducible lactose-permease transport system, as well as less effective and limited in composition enzyme systems of intracellular cleavage of these substances [Gottshalk G. Metabolism bact ry / Trans. from English under the editorship of E.N. Kondratieva. - M., Mir, 1982.- S. 19-42, 93-95; Stepanov A.S., Naumov A.V., Kondrashin Yu.I. The transport system of D-glucose and methyl-α-D-glucopyranoside in the plague microbe // In: Pathological physiology of especially dangerous infections. Proceedings of the anti-plague institution. - Saratov, 1984. - S.16-21]; the use of glucose in micro quantities (10 ... 25 nmol) makes it possible to record the effect of autoregulated inhibition of active respiration of a population of bacteria utilizing this carbohydrate, or the absence of the effect of inhibition of respiration even after bacteria consume oxygen in amounts exceeding stoichiometrically calculated (60 ... 150 nmol) the complete oxidation of the monosaccharide introduced simultaneously into the incubation medium. The latter is due to the fact that in a bacterial population, under the influence, for example, of stressful effects (“freezing-thawing”, long-term storage at near-zero and freezing temperatures, etc.), the regulation of respiratory activity is mediated by structural and functional damage to the cytoplasmic membrane, in which integrated transport systems, oxidative phosphorylation and complexes of respiratory enzymes (dehydrogenases, cytochromes, ubiquinones, etc.).
Способ включает следующие этапы:The method includes the following steps:
приготовление среды инкубации и раствора Д(+)глюкозы;preparation of the incubation medium and a solution of D (+) glucose;
подготовка к работе полярографической установки;preparation for the polarographic installation;
подготовка к анализу исследуемой пробы;preparation for the analysis of the test sample;
проведение анализа (с записью динамики дыхательной активности исследуемой популяции бактерий на диаграммную ленту самописца);analysis (with recording the dynamics of respiratory activity of the studied bacterial population on the chart tape of the recorder);
расчет коэффициента дыхательного контроля (ДК).calculation of the coefficient of respiratory control (DC).
Приготовление среды инкубации и раствора Д(+)глюкозы:Preparation of incubation medium and a solution of D (+) glucose:
для приготовления среды инкубации в мерную колбу (V=1000,0 мл) помещают 4,0 г КН2РО4, 32,2 г Na2HPO4· 12H2O и 0,8 г МgСl2· 6Н2О, добавлением дистиллированной воды объем раствора доводят до метки;To prepare the incubation medium, 4.0 g KH 2 PO 4 , 32.2 g Na 2 HPO 4 · 12H 2 O and 0.8 g MgCl 2 · 6H 2 O are added to a volumetric flask (V = 1000.0 ml) by adding distilled water the volume of the solution is adjusted to the mark;
для приготовления раствора Д(+)глюкозы в мерную колбу (V=10,0 мл) помещают 18 мг углевода, добавлением среды инкубации объем раствора доводят до метки, последующим разведением концентрацию полученного 0,01 М раствора глюкозы доводят до любой в диапазоне 0,001... 0,0025 М (по выбору исследователя).to prepare a solution of D (+) glucose, 18 mg of carbohydrate is placed in a volumetric flask (V = 10.0 ml), the volume of the solution is adjusted to the mark by adding the incubation medium, followed by dilution, the concentration of the obtained 0.01 M glucose solution is adjusted to any in the range of 0.001. .. 0,0025 M (at the discretion of the researcher).
Подготовка к работе полярографической установки:Preparation for operation of the polarographic installation:
в заявляемом способе используют полярографическую установку лабораторного изготовления с термостатируемой полярографической ячейкой и электрической схемой питания электродов (делитель напряжения) [Руководство по изучению биологического окисления полярографическим методом / Под ред. Г.М.Франка. - М.: Наука, 1973. - С.8-25, 50-59, 81-85] либо полярограф промышленного изготовления типа ОН-102 (ОН-105); Венгрия [Метаболизм микроорганизмов (практикум) / Под ред. Н.С.Егорова. - М.: Изд-во Моск. ун-та, 1986. - С.34-38];In the present method, a laboratory-made polarographic apparatus is used with a thermostatically controlled polarographic cell and an electrode power circuit (voltage divider) [Guide to the study of biological oxidation by the polarographic method / Ed. G.M. Frank. - M .: Nauka, 1973. - S.8-25, 50-59, 81-85] or a polarograph of industrial manufacture of the type OH-102 (OH-105); Hungary [Metabolism of Microorganisms (Workshop) / Ed. N.S. Egorova. - M.: Publishing House Mosk. University, 1986. - S.34-38];
в качестве электродов применяют платиновый электрод измерения ЭПВ-1 и хлорсеребряный электрод сравнения ЭВЛ-1МЗ из комплектов рН-метра-милливольтметра рН-121, либо универсального иономера-потенциометра ЭВ-74, либо аналогичные;as electrodes, a platinum electrode for measuring EPV-1 and a silver chloride reference electrode EVL-1MZ from sets of a pH-millivoltmeter pH-121, or a universal ionomer-potentiometer EV-74, or similar, are used;
за 30 мин до начала анализа включают полярограф (делитель напряжения), самописец и термостат;30 minutes before the start of the analysis include a polarograph (voltage divider), recorder and thermostat;
полярографическую ячейку заполняют средой инкубации, в центральное отверстие плотно вставляют платиновый электрод ЭПВ-1, в одно из боковых отверстий - агар-солевой мостик, обеспечивающий контакт с вспомогательным электродом ЭВЛ-1МЗ;the polarographic cell is filled with the incubation medium, the EPV-1 platinum electrode is tightly inserted into the central hole, the agar-salt bridge providing contact with the auxiliary EVL-1MZ electrode is placed in one of the side holes;
включают магнитную мешалку и перемешивают среду в ячейке в течение 3... 4 минут, после чего удаляют с помощью салфеток остатки среды с поверхности ячейки и контролируют отсутствие в ячейке пузырьков воздуха: при наличии последних удаляют их, выключив мешалку и добавив в ячейку среду инкубации;they turn on the magnetic stirrer and mix the medium in the cell for 3 ... 4 minutes, after which they remove the remaining media from the cell surface with napkins and control the absence of air bubbles in the cell: if there are any, remove them by turning off the stirrer and adding the incubation medium to the cell ;
температуру среды инкубации поддерживают в физиологических пределах в зависимости от вида исследуемых бактерий (например, для бактерий Y.pestis и E.coli - 26... 28° С, либо 36... 38° С);the temperature of the incubation medium is maintained within physiological limits, depending on the type of studied bacteria (for example, for bacteria Y. pestis and E. coli - 26 ... 28 ° C, or 36 ... 38 ° C);
на платиновый и хлорсеребряный электроды с помощью полярографа (делителя напряжения) подают потенциал 0,6 В ("минус" - на платиновом электроде);using a polarograph (voltage divider), a potential of 0.6 V is applied to the platinum and silver chloride electrodes (minus on the platinum electrode);
устанавливают скорость протяжки диаграммной ленты самописца 20 мм/мин и приступают к выполнению анализа после установления постоянного уровня диффузионного тока (прямая линия по направлению движения диаграммной ленты в крайнем положении шкалы самописца), который соответствует 100% исходного содержания растворенного в среде кислорода (для перевода пера самописца в крайнее положение используют потенциометры настройки полярографа либо делителя напряжения).set the drawing speed of the chart tape of the recorder to 20 mm / min and start the analysis after establishing a constant level of diffusion current (a straight line in the direction of movement of the chart tape in the extreme position of the chart), which corresponds to 100% of the initial content of oxygen dissolved in the medium (to transfer the pen the recorder to the extreme position use the potentiometer settings of the polarograph or voltage divider).
Подготовка к анализу исследуемой пробы:Preparation for the analysis of the test sample:
через боковое отверстие полярографической ячейки в среду инкубации вводят 10... 50 мкл исследуемой пробы популяции бактерий из расчета создания в среде общей концентрации, например, (1... 3)· 109 клеток/см3, с тем, чтобы отклонение пера самописца в сторону уменьшения силы тока ("белковый бросок") не превышало 20% ширины диаграммной ленты, а скорость эндогенного дыхания популяции составляла 2... 10 мм/мин.through the lateral opening of the polarographic cell, 10 ... 50 μl of the studied sample of the bacterial population is injected into the incubation medium in order to create a total concentration in the medium, for example, (1 ... 3) · 10 9 cells / cm 3 so that the deviation of the pen the recorder in the direction of decreasing the current strength (“protein throw”) did not exceed 20% of the width of the diagram strip, and the endogenous respiration rate of the population was 2 ... 10 mm / min.
Проведение анализа:Analysis:
на фоне стабильного уровня эндогенного дыхания популяции бактерий (через 5... 10 минут после введения пробы) с помощью автоматической пипетки в среду одномоментно вводят 20 мкл раствора глюкозы в выбранной из диапазона 0,001... 0,0025 М концентрации и регистрируют на ленте самописца динамику убыли кислорода из среды инкубации;Against the background of a stable level of endogenous respiration of the bacterial population (5 ... 10 minutes after the injection of the sample), 20 μl of glucose solution in a concentration selected from the range of 0.001 ... 0.0025 M are immediately injected into the medium using an automatic pipette and recorded on a recorder tape dynamics of oxygen loss from the incubation medium;
регистрацию динамики убыли кислорода прекращают через 3... 5 минут при отсутствии стимуляции дыхания глюкозой, либо через 5... 7 минут после смены быстрой фазы дыхания медленной, либо до исчерпания кислорода в среде инкубации при отсутствии торможения быстрой фазы дыхания популяции бактерий, после чего регистрацию прекращают, трижды промывают ячейку и платиновый электрод дистиллированной водой.dynamics loss of oxygen is stopped recording after 3 ... 5 minutes in the absence of stimulation of respiration by glucose, or 5 ... 7 minutes after changing the fast phase of respiration to slow, or until oxygen is exhausted in the incubation medium in the absence of inhibition of the fast phase of respiration of the bacterial population, after where the registration is stopped, the cell and the platinum electrode are washed three times with distilled water.
Расчет коэффициента дыхательного контроля (ДК):The calculation of the coefficient of respiratory control (DC):
по полярограмме дыхания, типичный вид которой приведен на чертеже, рассчитывают для исследуемой популяции бактерий величину дыхательного контроля как отношение скорости в быстрой фазе окисления (V3) к скорости в медленной фазе окисления (V4);according to the polarogram of respiration, a typical view of which is shown in the drawing, the respiratory control value is calculated for the studied bacterial population as the ratio of the rate in the fast oxidation phase (V 3 ) to the velocity in the slow oxidation phase (V 4 );
поскольку показатель ДК является относительным, расчет скоростей дыхания V3 и V4 носит условный характер: каждая из них численно равна длине катета в (миллиметрах), противолежащего углу между вектором дыхания и направлением движения диаграммы, причем длину прилежащего катета выбирают равной 20 мм, и при скорости протяжки ленты 20 мм/мин этот катет на абсциссе времени численно равен 1 минуте;since the DC index is relative, the calculation of the respiration rates V 3 and V 4 is conditional: each of them is numerically equal to the length of the leg in (millimeters), the opposite angle between the respiration vector and the direction of movement of the diagram, and the length of the adjacent leg is chosen to be 20 mm, and when the speed of the tape is 20 mm / min, this leg on the time abscissa is numerically equal to 1 minute;
пример расчета: ДК=V3/V4=20 мм/8 мм=2,50 отн.ед;calculation example: DK = V 3 / V 4 = 20 mm / 8 mm = 2.50 rel.ed;
окончательный результат анализа оформляется в виде среднего арифметического трех определений.the final result of the analysis is made out in the form of an arithmetic mean of three definitions.
Значимость заявляемого способа и рассчитываемого параметра дыхательного контроля для физиолого-биохимической оценки эффективности регуляции дыхательной активности популяции бактерий обоснована в экспериментах с культурами чумного микроба вирулентного (1300) и вакцинного (ЕВ) штаммов, также с культурами кишечной палочки (штамм К12), окислительный метаболизм и дыхательный аппарат которых весьма схожи [Голубинский Е.П. Дыхательный аппарат и окислительный метаболизм чумного микроба: Автореферат дис... на соискание ученой степени д-ра мед. наук. - ВНИИПЧИ "Микроб", Саратов, 1974. - 34 с.; Haddock В.A., lones C.W. Bacterial respiration / J. Bacteriol, 1977. - Vol.41. - No 1. - P.47-99; Ingledew W.J., Poole P.K. The respiratory chain of Escherichia coli. / Microbiol. Rev., 1984. - Vol.48. - No.3. - P.222-271]. Статистическая обработка экспериментальных данных произведена в соответствии с рекомендациями, изложенными в учебном пособии [Г.Ф.Лакин. Биометрия / Учебное пособие. - 3-е изд., перераб. и дополн., М., Высшая школа, 1980. - С.83-116, 142-163].The significance of the proposed method and the calculated parameter of respiratory control for physiological and biochemical assessment of the effectiveness of the regulation of the respiratory activity of a bacterial population is justified in experiments with cultures of the plague microbe of virulent (1300) and vaccine (EB) strains, as well as cultures of E. coli (strain K12), oxidative metabolism and whose breathing apparatus is very similar [Golubinsky EP Respiratory apparatus and oxidative metabolism of the plague microbe: Abstract of thesis ... for the degree of Dr. med. sciences. - VNIIPCHI "Microbe", Saratov, 1974. - 34 p .; Haddock B.A., lones C.W. Bacterial respiration / J. Bacteriol, 1977 .-- Vol. 41. - No 1. - P.47-99; Ingledew W.J., Poole P.K. The respiratory chain of Escherichia coli. / Microbiol. Rev., 1984. - Vol. 48. - No.3. - P.222-271]. Statistical processing of experimental data was carried out in accordance with the recommendations set forth in the manual [G.F. Lakin. Biometry / Textbook. - 3rd ed., Revised. and add., M., Higher School, 1980. - S. 83-116, 142-163].
Как следует из полярограммы, приведенной на чертеже, за период фазы быстрого окисления 25 нмоль глюкозы популяция бактерий потребляет, как правило, 30... 40 нмоль кислорода (Δ О2). Однако в некоторых опытах торможения дыхания популяции бактерий не происходит и после потребления 150 нмоль О2, необходимых для полного окисления всей добавленной глюкозыAs follows from the polarogram shown in the drawing, during the period of the rapid oxidation phase of 25 nmol of glucose, the bacterial population consumes, as a rule, 30 ... 40 nmol of oxygen (Δ О 2 ). However, in some experiments inhibition of respiration, a bacterial population does not occur even after consumption of 150 nmol O 2 , which is necessary for the complete oxidation of all added glucose
(ДК=1,00), либо это торможение слабо выражено (ДК=1,10... 1,30).(DK = 1.00), or this inhibition is weakly expressed (DK = 1.10 ... 1.30).
Регистрируемая в опытах вариабельность значений дыхательного контроля (1,0<ДК<3,0), а также отсутствие в ряде случаев двухфазности процесса дыхания клеток (ДК=1,00) имеют следующее теоретическое и экспериментальное объяснение.The variability of the values of the respiratory control recorded in the experiments (1.0 <DK <3.0), as well as the absence in some cases of two-phase process of cell respiration (DK = 1.00) have the following theoretical and experimental explanation.
Первичные этапы катаболизма глюкозы у бактерий включают транспорт углевода и превращение его в глюкозо-6-фосфат и фруктозо-1,6-дифосфат. Поскольку эти процессы требуют затраты энергии АТФ, следует предположить, что внутриклеточное отношение [АТФ]/[АДФ] у бактерий уменьшается, а активация дыхания, как и в способе по прототипу при утилизации олигосахаридов, в значительной мере обусловлена окислением эндогенных субстратов в дыхательной цепи для компенсации низкоэнергетического сдвига. Для подтверждения этого предположения в предварительных опытах с культурами чумного микроба и кишечной палочки показано, что продолжительность фазы активного дыхания (Δ t) популяций бактерий, окисляющих глюкозу в микроколичествах, совпадает по времени с продолжительностью ее полного потребления клетками из среды инкубации (таблица 1).The primary stages of glucose catabolism in bacteria include the transport of carbohydrate and its conversion to glucose-6-phosphate and fructose-1,6-diphosphate. Since these processes require energy consumption of ATP, it should be assumed that the intracellular ratio [ATP] / [ADP] in bacteria decreases, and the activation of respiration, as in the prototype method for utilization of oligosaccharides, is largely due to the oxidation of endogenous substrates in the respiratory chain for compensation for low-energy shift. To confirm this assumption, in preliminary experiments with plague microbe and Escherichia coli cultures, it was shown that the duration of the active respiration phase (Δ t) of the bacteria populations that oxidize glucose in micro quantities coincides in time with the duration of its complete consumption by cells from the incubation medium (table 1).
Другими подтверждениями сформулированного предположения явились приведенные в таблице 2 данные, которые показывают, что ингибирование гликолиза моноиодацетатом натрия (МИА) устраняет эффект стимуляции дыхания популяции бактерий глюкозой в микроколичестве (СД=1,00) только после ее повторного добавления. В то же время добавление на этом фоне экзогенного пирувата - одного из С3 - продуктов катаболического расщепления глюкозы и одновременно ключевого субстрата цикла трикарбоновых кислот - приводит к новой стимуляции дыхания популяции бактерий (СД>1,00). Эти экспериментальные данные свидетельствуют в пользу того, что механизм стимулирующего действия глюкозы в микроколичествах не отличается от такового у ее биохимического аналога α -метил-β -D-глюкопиранозида (α -МГ), метаболизм которого ограничивается первичными актами фосфорилирования при его переносе в клетки бактерий [Степанов А.С., Наумов А.В., Кондрашин Ю.И. Система транспорта Д-глюкозы и метил-α -Д-глюкопиранозида у чумного микроба // В кн.: Патологическая физиология особо опасных инфекций. Труды противочумного учреждения. - Саратов, 1984. - С.16-21]. Однако для регистрации стимулирующего действия α -МГ требуются значительно большие его количества, как и в прототипном способе - на примере олигосахаридов.Other confirmations of the formulated assumption were the data presented in Table 2, which show that the inhibition of glycolysis by sodium monoiodoacetate (MIA) eliminates the effect of stimulation of the respiration of the bacterial population by glucose in micro amounts (DM = 1.00) only after its repeated addition. At the same time, the addition of exogenous pyruvate, one of the C 3 products of the catabolic breakdown of glucose and at the same time a key substrate of the tricarboxylic acid cycle, against this background, leads to a new stimulation of the respiration of the bacterial population (DM> 1.00). These experimental data support the fact that the mechanism of the stimulating effect of glucose in trace amounts does not differ from that of its biochemical analogue of α-methyl-β-D-glucopyranoside (α-MG), the metabolism of which is limited to primary phosphorylation events when it is transferred to bacterial cells [Stepanov A.S., Naumov A.V., Kondrashin Yu.I. The transport system of D-glucose and methyl-α-D-glucopyranoside in the plague microbe // In: Pathological physiology of especially dangerous infections. Proceedings of the anti-plague institution. - Saratov, 1984. - S.16-21]. However, to register the stimulating effect of α -MH, significantly larger amounts are required, as in the prototype method, using oligosaccharides as an example.
Таким образом, совпадение продолжительности активного дыхания (Δ t) и продолжительности аккумуляции глюкозы в микроколичествах, а также результаты, представленные в таблице 2, подтверждают, что активация дыхания бактерий при добавлении микроколичеств глюкозы связана с инициацией окисления эндогенных субстратов, компенсирующего затраты энергии на транспорт и первичные реакции фосфорилирования утилизируемого углевода. Фаза активного дыхания продолжается до тех пop, пока происходит энергопотребляющий процесс утилизации глюкозы, т.е. создаются условия для сдвига равновесия реакции "фосфорилирование АДФ 
В то же время степень ауторегулируемого торможения дыхания популяции бактерий, окисляющих глюкозу, характеризуемая величиной ДК, то есть переход ее в состояние "отдыха”" (V4) после периода активного дыхания (V3) представляет собой по аналогии с митохондриями наиболее информативный показатель эффективности энергетической регуляции окислительного обмена.At the same time, the degree of autoregulated inhibition of respiration of a population of bacteria oxidizing glucose, characterized by the value of DC, that is, its transition to a “rest” state (V 4 ) after a period of active respiration (V 3 ) is, by analogy with mitochondria, the most informative indicator of effectiveness energy regulation of oxidative metabolism.
Для подтверждения этого в качестве добавок, снижающих энергизованность клеток в составе популяции бактерий, использовали разобщитель - протонофор 2,4-динитрофенол (2,4-ДНФ) в конечной концентрации 0,1 мМ и неметаболизируемый аналог глюкозы α -МГ (10 мМ), энергозависимый транспорт которого в клетки связан с затратами энергии АТФ. Избирательное ингибирование протонтранслоцирующей аденозинтрифосфатазы (АТФ-азы) дициклогексилкарбодиимидом (ДЦКД) в концентрации 5 мМ, напротив, способствует энергизации клеток в экспоненциальной фазе развития, когда активность данного фермента наиболее высока [Burstein С., Tiankova L., Kepes A. Respiratory control in Escherichia coli К 12 / Eur. J.Biochem,- 1979, No 94. - P.387-392]. Результаты исследования закономерностей ауторегуляции дыхательной активности популяции бактерий под влиянием энергизующих и деэнергизующих добавок представлены в таблице 3.To confirm this, as an additive that reduces the energy of cells in the bacterial population, we used a uncoupler, protonophore 2,4-dinitrophenol (2,4-DNP) at a final concentration of 0.1 mM and a non-metabolizable glucose analog α-MG (10 mM), whose volatile transport into cells is associated with the expenditure of ATP energy. Selective inhibition of proton-translocating adenosine triphosphatase (ATPase) with dicyclohexylcarbodiimide (DCCD) at a concentration of 5 mM, on the contrary, promotes cell energy in the exponential phase of development, when the activity of this enzyme is highest [Burstein C., Tiankova L., Kepes A. Respiratory control in Escherichia coli K 12 / Eur. J. Biochem, 1979, No. 94. - P.387-392]. The results of the study of the patterns of autoregulation of the respiratory activity of a bacterial population under the influence of energetic and deenergizing additives are presented in table 3.
Из данных таблицы 3 следует, что воздействия, приводящие к разобщению окислительного фосфорилирования и деэнергизации клеток, вызывают ослабление ауторегулируемого торможения окислительной активности, что проявляется в увеличении скорости дыхания популяции бактерий в состоянии "отдыха" (V4) и, как следствие, в снижении величины ДК. Напротив, энергизация клеток, обработанных ДЦКД, приводит к достоверному снижению скорости дыхания V4 и достоверному увеличению значений ДК. Диапазон и направленность изменений других параметров дыхания в этих опытах не адекватна характеру воздействий на клеточный метаболизм и не поддается однозначной трактовке.From the data in Table 3 it follows that the effects leading to the dissociation of oxidative phosphorylation and deenergization of cells cause a weakening of the self-regulating inhibition of oxidative activity, which is manifested in an increase in the respiration rate of the bacterial population in a “rest” state (V 4 ) and, as a consequence, in a decrease in DK. On the contrary, the energization of cells treated with DCCD leads to a significant decrease in the respiration rate V 4 and a significant increase in DC values. The range and direction of changes in other respiration parameters in these experiments are not adequate to the nature of the effects on cellular metabolism and cannot be unambiguously interpreted.
Сравнительную оценку значимости показателей дыхательного контроля по заявляемому (ДК) и прототипному (RCI) способам их определения для характеристики биоэнергетического статуса популяции бактерий осуществили в опытах с культурами чумного микроба (штамм 1300), подвергнутым экспериментальным повреждающим воздействиям: трехкратное "замораживание-оттаивание" в диапазоне температур минус 20° С... плюс 20° С; обработка поверхностно-активным веществом (ПАВ) толуолом в конечной концентрации 0,1%; прогрев культур при температуре (45± 0,5)° С в течение 60 минут; длительное хранение культур (6 и 12 месяцев) в замороженном состоянии при температуре (минус 20±2)° С.A comparative assessment of the significance of respiratory control indicators according to the claimed (DC) and prototype (RCI) methods for their determination to characterize the bioenergetic status of the bacterial population was carried out in experiments with plague microbe cultures (strain 1300) subjected to experimental damaging effects: three times "freezing-thawing" in the range temperatures minus 20 ° С ... plus 20 ° С; treatment with a surface-active substance (surfactant) toluene in a final concentration of 0.1%; heating crops at a temperature of (45 ± 0.5) ° C for 60 minutes; long-term storage of crops (6 and 12 months) in a frozen state at a temperature of (minus 20 ± 2) ° C.
В ходе экспериментов оценивали устойчивость бактерий к повреждающим воздействиям по сохранению ими способности к образованию колоний на плотной питательной среде (ППС) в чашках Петри, то есть определением биологической концентрации (БК) микробных культур. Показатель сохранения жизнеспособности выражали в доле бактерий, сохранивших способность к колонеобразованию, принимая значение БК исходной популяции бактерий за 100%. Учитывая то обстоятельство, что основными мишенями подобного рода повреждающих воздействий являются мембранные структуры бактериальных клеток, выполняющие не только энергетические, но и барьерные функции, в качестве другого показателя устойчивости популяции бактерий использовали степень нарушения барьерных функций клеток, определяемую по параметру СДНАД·Н [С.Г.Игнатов, В.А.Красильников, В.В.Перелыгин и др. Исследование мембранного аппарата Escherichia coli после низкотемпературного замораживания /Биохимия, 1980.- Т.46. - С.1996-2003].In the course of the experiments, the resistance of bacteria to damaging effects was assessed by their preservation of the ability to form colonies on a solid nutrient medium (PPS) in Petri dishes, that is, by determining the biological concentration (BC) of microbial cultures. Viability preservation rate was expressed in the proportion of bacteria that retained the ability to colony forming, taking the BC value of the initial bacterial population as 100%. Considering the fact that the main targets of this kind of damaging effects are the membrane structures of bacterial cells that perform not only energy but also barrier functions, the degree of impairment of the barrier functions of the cells, determined by the SD NAD · N [C . G. Ignatov, V. A. Krasilnikov, V. V. Perelygin, et al. Study of the membrane apparatus of Escherichia coli after low-temperature freezing / Biochemistry, 1980.- T. 46. - S.1996-2003].
Экзогенный никотинамидадениндинуклеотид восстановленный (НАД·Н) не проникает в интактные клетки бактерий (СДнАд·н=1,00), однако нарушение избирательной проницаемости барьерных структур и, прежде всего, цитоплазматической мембраны (ЦПМ) приводит к его проникновению на внутреннюю сторону ЦПМ, где интегрирован его специфический фермент НАД· Н - дегидрогеназа. Результатом этого взаимодействия является стимуляция дыхания поврежденных клеток при добавлении в среду инкубации экзогенного НАД-Н (СДНАД· Н>1,00), причем выраженность эффекта стимуляции тем выше, чем сильнее нарушение избирательной проницаемости клеточных мембран.Exogenous reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NAD · H) does not penetrate into intact bacteria cells (DM nAD · n = 1.00), however, violation of the selective permeability of barrier structures and, above all, the cytoplasmic membrane (CPM) leads to its penetration to the inner side of the CPM, where its specific enzyme NAD · H - dehydrogenase is integrated. The result of this interaction is the stimulation of respiration of damaged cells when exogenous NAD-H is added to the incubation medium (DM NAD · H > 1.00), and the severity of the stimulation effect is higher, the greater the violation of the selective permeability of cell membranes.
Конечная концентрация субстратов в пробах в серии опытов, результаты которых представлены в таблице 4, составляла: НАД· Н - 50 мМ; олигосахаридов - 10 мМ; глюкозы - 10 мкМ и 25 мкМ.The final concentration of substrates in the samples in a series of experiments, the results of which are presented in table 4, was: NAD · N - 50 mm; oligosaccharides - 10 mM; glucose - 10 μM and 25 μM.
Как следует из данных таблицы 4, по мере усиления повреждающих воздействий в популяции снижается относительная доля жизнеспособных клеток, возрастает степень нарушения барьерных функций бактериальных мембран и снижается уровень энергозависимой регуляции дыхательной активности, определяемой по параметру ДК, вплоть до утраты дыхательного контроля (ДК=1,00). В то же время параметр RCI, определяемый по прототипу, принимает минимальное значение уже после относительно мягкого воздействия на популяцию бактерий "замораживанием-оттаиванием" и при усилении интенсивности повреждающих воздействий на популяцию эндогенное дыхание бактерий олигосахаридами не стимулируется (RCI=1,00).As follows from the data in Table 4, as the damaging effects in the population increase, the relative proportion of viable cells decreases, the degree of violation of the barrier functions of bacterial membranes increases, and the level of energy-dependent regulation of respiratory activity determined by the DC parameter decreases, up to the loss of respiratory control (DK = 1, 00). At the same time, the RCI parameter, determined by the prototype, takes on a minimum value after a relatively mild exposure to the bacterial population by “freezing-thawing” and when the intensity of the damaging effects on the population increases, the endogenous respiration of bacteria is not stimulated by oligosaccharides (RCI = 1.00).
В таблице 5 приводятся значения коэффициента корреляции (r) между параметрами дыхательного контроля, определяемыми по прототипу (RCI) и предлагаемому (ДК) способу, и биологическими показателями бактериальной популяции, представленными в таблице 4. Значения r рассчитаны для выборок, каждая из которых состоит из 36 независимых определений показателя (для 6 микробных культур в каждом из 6 опытов). Сильная коррелятивная связь (r>0,7) выявлена между показателем дыхательного контроля (ДК) и сохраняемостью жизнеспособных клеток, а также степенью нарушения барьерных функций клеточных мембран. Для показателя RCI соответствующие значения r меньше 0,5.Table 5 shows the values of the correlation coefficient (r) between the parameters of the respiratory control, determined by the prototype (RCI) and the proposed (DC) method, and the biological indicators of the bacterial population, presented in table 4. The values of r are calculated for samples, each of which consists of 36 independent definitions of the indicator (for 6 microbial cultures in each of 6 experiments). A strong correlative relationship (r> 0.7) was found between the respiratory control index (DC) and the viability of viable cells, as well as the degree of violation of the barrier functions of cell membranes. For RCI, the corresponding r values are less than 0.5.
Свидетельством применимости параметра ДК для оценки качества лиофильно высушенных эталонных культур чумного микроба (штамм EV), используемых для приготовления на их основе чумных вакцин, являются результаты, представленные в таблице 6.Evidence of the applicability of the DC parameter for assessing the quality of lyophilized dried plague microbe reference cultures (strain EV) used to prepare plague vaccines based on them is the results presented in table 6.
Разнокачественные эталонные культуры вакцин штамма EV серий 47, 71 и 79 использовались для приготовления посевных культур и далее - нативных культур при выращивании последних в аппаратах вместимостью 100 дм3 методом глубинного культивирования с принудительной аэрацией и дробным добавлением в ферментеры глюкозы как основного источника углерода и энергии. Согласно технологическим условиям показатели выхода биомассы и потребления за весь цикл культивирования глюкозы (27... 30 часов) являются наиболее значимыми параметрами качества получаемых нативных культур. Перед измерением параметров дыхательного контроля эталонные культуры регидратировали в физиологическом растворе.Different-quality reference cultures of vaccines of strain EV of series 47, 71 and 79 were used to prepare inoculum crops and then native crops when growing the latter in apparatus with a capacity of 100 dm 3 by the method of deep cultivation with forced aeration and fractional addition of glucose to the fermenters as the main source of carbon and energy. According to technological conditions, indicators of biomass yield and consumption for the entire cycle of glucose cultivation (27 ... 30 hours) are the most significant quality parameters of the resulting native crops. Before measuring the parameters of respiratory control, reference cultures were rehydrated in physiological saline.
Данные таблицы 6 свидетельствуют о том, что наиболее высокие значения биомассы и потребления глюкозы бактериями характерны для нативных культур, выращенных на основе эталонов серии 71 и, особенно, серии 79. Для этих вакцин значения ДК>1,00, причем максимальные значения ДК соответствуют максимальным значениям показателей качества нативных культур. Для всех исследованных эталонных культур вакцин значения дыхательного контроля по прототипу (RCI) не превышали минимального значения 1,00, что не позволяет дифференцировать культуры по этому параметру.The data in table 6 indicate that the highest values of biomass and glucose consumption by bacteria are characteristic of native cultures grown on the basis of the standards of the 71 series and, especially, the 79 series. For these vaccines, the DK values are> 1.00, and the maximum DK values correspond to values of quality indicators of native cultures. For all investigated reference vaccine cultures, the values of the respiratory control according to the prototype (RCI) did not exceed the minimum value of 1.00, which does not allow to differentiate the cultures according to this parameter.
Продолжительность фазы активного дыхания и время аккумуляции глюкозы микробной популяцией, состоящей из
1млрд. живых бактерий (
The duration of the active respiration phase and the time of glucose accumulation by the microbial population, consisting of
1 billion live bacteria (
1) Время аккумуляции глюкозы измеряли по ее убыли из среды инкубации с использованием анализатора глюкозы фирмы "Beck-mаn", США
2) 1,8 мкг соответствует 10 нмоль глюкозы в среде инкубации
3) 4,5 мкг соответствует 25 нмоль глюкозы в среде инкубацииNotes:
1) The glucose accumulation time was measured by its decrease from the incubation medium using a glucose analyzer (Beck-man, USA)
2) 1.8 μg corresponds to 10 nmol glucose in the incubation medium
3) 4.5 μg corresponds to 25 nmol glucose in the incubation medium
Стимуляция дыхания популяции чумного микроба (штамм 1300) различными субстратами (
Stimulation of the respiration of the plague microbe population (strain 1300) by various substrates (
Изменение параметров дыхания популяции бактерий Y.pestis (штамм 1300) под действием разобщителя 2,4-динитрофенола (2,4-ДНФ), неметаболизируемого α -метил-β -D-[Улюкопиранозида (α -МГ) и ингибитора АТФ-азы дициклогексил-карбодиимида (ДЦКД), (
Changes in respiration parameters of a population of bacteria Y. pestis (strain 1300) under the action of a uncoupler of 2,4-dinitrophenol (2,4-DNP), non-metabolizable α-methyl-β-D- [Ulucopyranoside (α-MG) and ATPase inhibitor dicyclohexyl -carbodiimide (DCCD), (
1) За 100% принимаются значения параметров дыхания популяции бактерий в контрольной пробе (без добавок 2,4-ДНФ, α -МГ, ДЦКД)
2) n - количество исследованных популяций бактерийNotes:
1) The respiration parameters of the bacterial population in the control sample (without the addition of 2,4-DNP, α-MG, DCCD) are taken as 100%
2) n is the number of studied bacterial populations
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2003105709/13A RU2247780C2 (en) | 2003-02-26 | 2003-02-26 | Method for assay of respiratory control in microorganisms population |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2003105709/13A RU2247780C2 (en) | 2003-02-26 | 2003-02-26 | Method for assay of respiratory control in microorganisms population |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2003105709A RU2003105709A (en) | 2004-11-10 |
| RU2247780C2 true RU2247780C2 (en) | 2005-03-10 |
Family
ID=35364920
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2003105709/13A RU2247780C2 (en) | 2003-02-26 | 2003-02-26 | Method for assay of respiratory control in microorganisms population |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2247780C2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU192836U1 (en) * | 2019-05-13 | 2019-10-02 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Тульский государственный университет" (ТулГУ) | Device for rapid analysis of the biochemical oxygen consumption index |
-
2003
- 2003-02-26 RU RU2003105709/13A patent/RU2247780C2/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| TOMOFUSA TSUCHIYA, BARRY P. POSEN Respiratory control in Escherichia coli, FEBS Letters, 198, v.120, N1, p.128-130. АДО А.Д. Патологическая физиология Учебник для мед.вузов, М., 2000, Триада-Х, с.23-25. BURSTEIN C. ET.AL. Respiratory control in Escherichia coli K12. Eur. J. Biochem, 1979, № 94, p.387-392. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU192836U1 (en) * | 2019-05-13 | 2019-10-02 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Тульский государственный университет" (ТулГУ) | Device for rapid analysis of the biochemical oxygen consumption index |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Clark Jr et al. | Differential anodic enzyme polarography for the measurement of glucose | |
| Hohorst | L-(+)-lactate: determination with lactic dehydrogenase and DPN | |
| Najjar | [36] Phosphoglucomutase from muscle | |
| Jeener et al. | Cytological study of Thermobacterium acidophilus R 26 cultured in absence of deoxyribonucleosides or uracil | |
| EP0309429A2 (en) | Luminometric assay of cellular ATP | |
| Thalmann et al. | II Quantitative Study of Selected Enzymes Involved in Energy Metabolism of the Cochlear Duct | |
| Kuss et al. | Electrochemical recognition and quantification of cytochrome c expression in Bacillus subtilis and aerobe/anaerobe Escherichia coli using N, N, N′, N′-tetramethyl-para-phenylene-diamine (TMPD) | |
| Matsumae et al. | Evaluation of the differentiation status of single embryonic stem cells using scanning electrochemical microscopy | |
| Lemasters et al. | Adenosine triphosphate: continuous measurement in mitochondrial suspensions by firefly luciferase luminescence | |
| Balin et al. | Effects of ambient oxygen concentration on the growth and antioxidant defenses of of human cell cultures established from fetal and postnatal skin | |
| Bettaieb et al. | Immobilization of E. coli bacteria in three-dimensional matrices for ISFET biosensor design | |
| Morton et al. | Cellular oxidative phosphorylation. I. Measurement in intact spermatozoa and other cells | |
| RU2247780C2 (en) | Method for assay of respiratory control in microorganisms population | |
| Hamilton et al. | Transport of phosphate in membrane vesicles from mouse fibroblasts transformed by simian virus 40. | |
| Brock et al. | The△ pH-driven, ATP-independent Protein Translocation Mechanism in the Chloroplast Thylakoid Membrane: KINETICS AND ENERGETICS | |
| Vrbová et al. | Preparation and utilization of a biosensor based on galactose oxidase | |
| Soldatkin et al. | Microbiosensor based on glucose oxidase and hexokinase co-immobilised on platinum microelectrode for selective ATP detection | |
| TW200817520A (en) | Detection of microorganisms and devices therefor | |
| Raabo | Determination of serum lactic dehydrogenase by the tetrazolium salt method | |
| Fujikawa-Yamamoto et al. | Spontaneous polyploidization results in apoptosis in a Meth-A tumor cell line | |
| Tsuchida et al. | Application of l‐(+)‐lactate electrode for clinical analysis and monitoring of tissue culture medium | |
| Saeed et al. | Lactate dehydrogenase C4 (LDH-C4) is essential for the sperm count and motility: A case-control study | |
| Shi et al. | The study of Nafion/xanthine oxidase/Au colloid chemically modified biosensor and its application in the determination of hypoxanthine in myocardial cells in vivo | |
| Hrudka | Cytochemical demonstration of catabolic activity in spermatozoa by the formazan test | |
| Lehrer et al. | The Quantitative Histochemistry of Supramedullary Neurons of Puffer Fishes: I. Enzymes of Glucose Metabolism |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20080227 |