RU2241992C1 - Method for determining free radical oxidation and antioxidation systems condition on injured skin areas of vitiligo patients - Google Patents
Method for determining free radical oxidation and antioxidation systems condition on injured skin areas of vitiligo patientsInfo
- Publication number
- RU2241992C1 RU2241992C1 RU2003115963/15A RU2003115963A RU2241992C1 RU 2241992 C1 RU2241992 C1 RU 2241992C1 RU 2003115963/15 A RU2003115963/15 A RU 2003115963/15A RU 2003115963 A RU2003115963 A RU 2003115963A RU 2241992 C1 RU2241992 C1 RU 2241992C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- free radical
- skin
- radical oxidation
- unchanged
- activity
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области медицины, а именно к дерматологии, и может быть использовано при диагностике и выборе тактики лечения больных витилиго, а также в биохимии для исследования патогенетических механизмов развития данного заболевания.The invention relates to medicine, namely to dermatology, and can be used in the diagnosis and selection of treatment tactics for vitiligo patients, as well as in biochemistry for studying the pathogenetic mechanisms of the development of this disease.
Витилиго является заболеванием с недостаточно изученной этиологией и патогенезом, поэтому применение адекватного лечения этого заболевания затруднительно. В последние 5 лет активно стал обсуждаться вопрос об активации свободнорадикального окисления в коже, а также снижении активности антиоксидантных систем как основных звеньев патогенеза витилиго. В связи с этим важным является выбор адекватного, доступного и информативного способа оценки свободнорадикальных реакций и антиоксидантных систем в коже при этом заболевании с целью выбора патогенетически обоснованного способа его диагностики и лечения.Vitiligo is a disease with insufficiently studied etiology and pathogenesis, therefore the use of adequate treatment for this disease is difficult. In the last 5 years, the issue of activation of free radical oxidation in the skin, as well as a decrease in the activity of antioxidant systems as the main links in the pathogenesis of vitiligo, has been actively discussed. In this regard, it is important to choose an adequate, affordable and informative method for assessing free radical reactions and antioxidant systems in the skin in this disease in order to select a pathogenetically substantiated method for its diagnosis and treatment.
Известен способ оценки свободнорадикального окисления в коже с помощью спектроскопии электронного парамагнитного резонанса (Fuchs J., Herrling Th., Groth N. Detection of free radicals in skin: a review of the literature and new developments. / In: Oxidants and antioxidants in cutaneous biology. Eds: Thiele J., Elsner P. Current Problems in Dermatology, 2001, vol.29, p.1-17), заключающийся в идентификации и определении концентрации продуктов свободнорадикального окисления по резонансному поглощению микроволнового излучения в образцах неизмененной кожи, имеющих парамагнитные центры. В связи с коротким временем жизни свободных радикалов их регистрация возможна либо в глубоко замороженных образцах, либо с помощью специфических спиновых ловушек, которые перехватывают радикалы и переводят их в более устойчивую форму, позволяющую зарегистрировать эндогенные свободнорадикальные состояния. Результат исследования оценивают по амплитуде спектра электронного парамагнитного резонанса. Этот способ применяют в последние 5-7 лет для изучения патогенеза заболеваний кожи.A known method for assessing free radical oxidation in the skin using electron paramagnetic resonance spectroscopy (Fuchs J., Herrling Th., Groth N. Detection of free radicals in skin: a review of the literature and new developments. / In: Oxidants and antioxidants in cutaneous biology Eds: Thiele J., Elsner P. Current Problems in Dermatology, 2001, vol. 29, p.1-17), which consists in identifying and determining the concentration of free radical oxidation products by the resonance absorption of microwave radiation in unmodified skin samples having paramagnetic centers . Due to the short lifetime of free radicals, their registration is possible either in deep-frozen samples or with the help of specific spin traps that trap radicals and translate them into a more stable form, allowing the detection of endogenous free radical states. The result of the study is estimated by the amplitude of the spectrum of electron paramagnetic resonance. This method is used in the last 5-7 years to study the pathogenesis of skin diseases.
Недостатком этого способа является возможность регистрации только промежуточных продуктов свободнорадикального окисления, которые обычно находятся в низких концентрациях, что требует высокой чувствительности метода, т.е. применения специального, дорогостоящего оборудования, позволяющего многократно накапливать сигналы и проводить их математическую обработку. Сложность, трудоемкость, необходимость специально подготовленного высококвалифицированного персонала и высокая стоимость ограничивают функциональные возможности метода.The disadvantage of this method is the ability to register only intermediate products of free radical oxidation, which are usually in low concentrations, which requires high sensitivity of the method, i.e. the use of special, expensive equipment that allows you to repeatedly accumulate signals and carry out their mathematical processing. Complexity, laboriousness, the need for specially trained highly qualified personnel and high cost limit the functionality of the method.
Известен способ оценки свободнорадикального окисления в коже по измерению уровня одного из продуктов этого процесса - малонового диальдегида и его производных (Сергеев П.В., Ухина Т.В., Шимановский Н.Л. Влияние разных лекарственных форм прогестерона на перекисное окисление липидов и редокс-систему глутатиона в тканях кожи крыс при экспериментальном дерматите / Бюл. эксперим. биологии и медицины, 2000, том 129, №1, стр.186-188). Способ заключается в проведении реакции между малоновым диальдегидом и его производными, содержащимися в ткани, и тиобарбитуровой кислотой. В результате этой реакции образуется окрашенное соединение - триметиновый комплекс, в котором на одну молекулу малонового диальдегида приходится две молекулы тиобарбитуровой кислоты (Ohkawa H., Ohishi N., Yagi К. Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction / Analyt Biochem, 1979, v.95, р.351-358). Интенсивность окрашивания триметинового комплекса затем регистрируется на спектрофотометре, что позволяет проводить количественное определение уровня малонового диальдегида в образце ткани.A known method for assessing free radical oxidation in the skin by measuring the level of one of the products of this process - malondialdehyde and its derivatives (Sergeev P.V., Ukhina T.V., Shimanovsky N.L. Effect of different dosage forms of progesterone on lipid peroxidation and redox -system of glutathione in rat skin tissues in experimental dermatitis / Bull.Experimental Biology and Medicine, 2000, Volume 129, No. 1, pp. 186-188). The method consists in carrying out the reaction between malondialdehyde and its derivatives contained in the tissue, and thiobarbituric acid. As a result of this reaction, a colored compound is formed - the trimethine complex, in which two molecules of thiobarbituric acid fall on one molecule of malondialdehyde (Ohkawa H., Ohishi N., Yagi K. Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction / Analyt Biochem, 1979, v. 95, p. 351-358). The trimethine complex staining intensity is then recorded on a spectrophotometer, which allows a quantitative determination of the level of malondialdehyde in a tissue sample.
Несмотря на доступность, этот способ малоинформативен, поскольку с его помощью в коже измеряют только начальный, исходный уровень продуктов окисления. Однако чувствительность кожи к повреждающим агентам может быть оценена только по реакции ткани на индукцию свободнорадикального окисления. Именно скорость накопления продуктов индуцированного свободнорадикального окисления, но не их начальный уровень, прямо коррелирует с состоянием ткани (Arkhipenko Yu.V., Sazontova T.G., Rice-Evans С. Hypertrophy and regression of rat heart: free radical ralated metabolic systems. / Pathophysiology, 1997, v.4, №4, р.241-248).Despite the availability, this method is uninformative, since it only measures the initial, initial level of oxidation products in the skin. However, the sensitivity of the skin to damaging agents can only be assessed by the response of the tissue to the induction of free radical oxidation. It is the rate of accumulation of products of induced free radical oxidation, but not their initial level, that directly correlates with the state of the tissue (Arkhipenko Yu.V., Sazontova TG, Rice-Evans C. Hypertrophy and regression of rat heart: free radical ralated metabolic systems. / Pathophysiology, 1997, v.4, No. 4, p. 241-248).
Кроме того, способ определения малонового диальдегида в коже не применяли у людей, страдающих витилиго, а использовали только при экспериментальной работе на животных и при исследовании патогенеза псориаза и контактного дерматита.In addition, the method for determining malondialdehyde in the skin was not used in people suffering from vitiligo, but was used only in experimental work on animals and in the study of the pathogenesis of psoriasis and contact dermatitis.
В качестве ближайшего аналога принят способ определения состояния свободнорадикального окисления в периферической крови у больных витилиго (Dell'Anna M.L., Maresca V., Briganti S. et al. Mitochondrial impairment in peripheral blood mononuclear cells during the active phase of vitiligo / J. Invest Dermatol, 2001, v.117(4), p.908-913). Способ основан на изучении повреждений, вызванных активными формами кислорода, в эритроцитах и моноцитах периферической крови у больных витилиго. Состояние свободнорадикального окисления определяют по способности активных форм кислорода повреждать мембраны и нарушать мембранный потенциал митохондрий, изменения которого и регистрируют с помощью специальных электродов.As the closest analogue, a method for determining the state of free radical oxidation in peripheral blood in vitiligo patients (Dell'Anna ML, Maresca V., Briganti S. et al. Mitochondrial impairment in peripheral blood mononuclear cells during the active phase of vitiligo / J. Invest Dermatol 2001, v. 117 (4), p. 908-913). The method is based on the study of injuries caused by reactive oxygen species in red blood cells and peripheral blood monocytes in vitiligo patients. The state of free radical oxidation is determined by the ability of reactive oxygen species to damage membranes and disrupt the membrane potential of mitochondria, the changes of which are recorded using special electrodes.
Однако помимо сложности и трудоемкости регистрации этот способ является опосредованным, поскольку измеряется не уровень свободнорадикальных продуктов, а повреждение мембраны, которое помимо действия активных форм кислорода зависит от целого ряда факторов, например содержания в мембране ненасыщенных, жирных кислот, уровня металлов с переменной валентностью и других факторов. Кроме того, оцененный таким способом уровень свободнорадикальных продуктов в форменных элементах крови может не соответствовать состоянию свободнорадикального процесса в коже и, таким образом, не является надежным диагностическим параметром.However, in addition to the complexity and complexity of registration, this method is indirect, since it is not the level of free radical products that is measured, but damage to the membrane, which, in addition to the action of reactive oxygen species, depends on a number of factors, for example, the content of unsaturated, fatty acids, the level of metals with variable valency and others factors. In addition, the level of free radical products estimated in this way in the blood cells may not correspond to the state of the free radical process in the skin and, therefore, is not a reliable diagnostic parameter.
Задачей изобретения является создание эффективного, простого и точного способа определения состояния свободнорадикального окисления и антиоксидантных систем в участках поражения кожи у больных витилиго.The objective of the invention is to provide an effective, simple and accurate method for determining the state of free radical oxidation and antioxidant systems in areas of skin lesions in patients with vitiligo.
Сущность изобретения состоит в том, что способ определения состояния свободнорадикального окисления и антиоксидантных систем в участках поражения кожи у больных витилиго характеризуется тем, что производят забор образцов пораженной и неизмененной кожи, замораживают в жидком азоте, измельчают, гомогенизируют в два этапа с последующим отделением аликвот супернатанта, определяют в них спектрофотометрически активность ферментов антиоксидантной системы - каталазы, супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы - и устанавливают характер ее изменения в сторону повышения, снижения или его отсутствие в пораженной коже по сравнению с неизмененной, в соответствии с которым выбирают систему индукции свободнорадикального окисления, затем аликвоты гомогената разводят средой гомогенизирования, помещают в микроячейки, преинкубируют, после чего добавляют выбранную ранее систему индукции и проводят реакцию индуцирования свободнорадикального окисления при 37° С в течение 20-40 минут, отделяют аликвоты, добавляют их в количестве 50 мкл к 150 мкл реагента, содержащего 0,9-1,2% 2-тиобарбитуровую кислоту, 0,54% додецилсульфат натрия и 10,8-15,3% уксусную кислоту, полученные образцы преинкубируют, затем нагревают до 95° С и инкубируют в течение 40 минут, после появления окрашивания осевший коагулированный белок отделяют, а в полученных супернатантах определяют степень окрашивания на спектрофотометре, регистрируя спектр поглощения тиобарбитурат-активных продуктов в диапазоне 480-590 нм, находят его максимум, по которому определяют концентрацию продуктов индуцированного свободнорадикального окисления при различных временных интервалах инкубации образцов, строят график зависимости их накопления от времени инкубации, по которому определяют скорость их накопления, и при ее превышении более чем на 30% в пораженной коже по сравнению с неизмененной и одновременно сниженной или неизмененной активности ферментов определяют состояние активации свободнорадикального окисления и снижение активности антиоксидантных систем и устанавливают соответственно свободнорадикальный характер повреждения кожи.The essence of the invention lies in the fact that the method for determining the state of free radical oxidation and antioxidant systems in areas of skin lesions in patients with vitiligo is characterized in that samples of affected and unchanged skin are sampled, frozen in liquid nitrogen, crushed, homogenized in two stages, followed by separation of aliquots of the supernatant , determine in them spectrophotometrically the activity of enzymes of the antioxidant system - catalase, superoxide dismutase, glutathione peroxidase and glutathione reductase - and mouth The nature of its change in the direction of increase, decrease, or its absence in the affected skin is compared to unchanged, according to which the free radical oxidation induction system is chosen, then aliquots of the homogenate are diluted with a homogenization medium, placed in micro-cells, and incubated, after which the previously selected induction system is added and carry out the reaction of inducing free radical oxidation at 37 ° C for 20-40 minutes, aliquots are separated, add them in an amount of 50 μl to 150 μl of reagent containing 0.9-1.2% 2-thiobarbituric acid, 0.54% sodium dodecyl sulfate and 10.8-15.3% acetic acid, the obtained samples are incubated, then heated to 95 ° C and incubated for 40 minutes, after occurrence staining, the settled coagulated protein is separated, and the degree of staining is determined on the spectrophotometer in the obtained supernatants by recording the absorption spectrum of thiobarbiturate-active products in the range of 480-590 nm, and its maximum is determined by which the concentration of the products of induced free radical oxidation is determined at various the variable incubation intervals of the samples, build a graph of the dependence of their accumulation on the incubation time, which determines the rate of their accumulation, and when it is exceeded by more than 30% in the affected skin compared to unchanged and at the same time reduced or unchanged enzyme activity, the state of activation of free radical oxidation is determined and a decrease in the activity of antioxidant systems and establish the correspondingly free-radical nature of skin damage.
Использование изобретения позволяет получить следующий технический результат.Using the invention allows to obtain the following technical result.
Способ позволяет впервые объективно и точно определить истинное соотношение свободнорадикальных процессов и антирадикальной защиты в поврежденной коже в очагах витилиго, оценить по этим показателям степень выраженности патологического процесса и чувствительность кожи в очагах витилиго к действию экзогенных повреждающих факторов, связанных с активными формами кислорода, и подобрать адекватную данному состоянию кожи терапию.The method allows for the first time to objectively and accurately determine the true ratio of free radical processes and anti-radical protection in damaged skin in vitiligo foci, to evaluate the severity of the pathological process and the sensitivity of the skin in vitiligo foci to the action of exogenous damaging factors associated with reactive oxygen species, and to select an adequate given skin condition therapy.
Весь процесс диагностики, включая забор ткани, занимает несколько часов. Способ прост в исполнении, не требует сложного оборудования или дорогостоящих расходных материалов, при этом высокоинформативен.The entire diagnostic process, including tissue sampling, takes several hours. The method is simple to implement, does not require sophisticated equipment or expensive consumables, while highly informative.
Способ может быть эффективно использован не только в биохимической, но и в любой клинической лаборатории, позволяя решить вопрос об адекватной оценке про- и антиоксидантных систем в образцах кожи при витилиго, что позволяет наиболее объективно выбрать способ лечения и методику его проведения в каждом конкретном случае. Особенное внимание к данному способу может быть проявлено в случаях сложной патологии, когда витилиго отягощено аллергическими проявлениями, онкологическими изменениями и т.д., т.е. в тех случаях, когда не существует объективных критериев решения вопроса о назначении определенных лекарственных средств, способных изменить баланс между оксидантами и антиоксидантами в клетке.The method can be effectively used not only in biochemical, but also in any clinical laboratory, allowing to solve the problem of adequate assessment of pro- and antioxidant systems in skin samples with vitiligo, which allows you to most objectively choose a treatment method and methodology for its implementation in each case. Particular attention to this method can be shown in cases of complex pathology, when vitiligo is burdened by allergic manifestations, oncological changes, etc., i.e. in those cases when there are no objective criteria for resolving the issue of prescribing certain drugs that can change the balance between oxidants and antioxidants in the cell.
Технический результат достигается за счет того, что авторами впервые предложено проводить сравнительное исследование ткани, взятой непосредственно из патологического очага кожи больного витилиго и из не измененной на вид кожи того же больного. Впервые предложен точный и информативный, адекватный состоянию ткани способ оценки свободнорадикальных реакций и антиоксидантных систем в коже у больных витилиго, который основан на определении чувствительности измененной ткани кожи к индуцированному свободнорадикальному окислению при существующем в этом участке кожи уровне антирадикальной защиты.The technical result is achieved due to the fact that the authors for the first time proposed to conduct a comparative study of tissue taken directly from a pathological lesion of the skin of a patient with vitiligo and not changed in appearance of the skin of the same patient. For the first time, an accurate and informative, adequate to the state of the tissue, method for assessing free radical reactions and antioxidant systems in the skin of vitiligo patients has been proposed, which is based on determining the sensitivity of altered skin tissue to induced free radical oxidation with the existing level of anti-radical protection in this skin area.
По изменению соотношения между параметрами прооксидантных и антиоксидантных систем в очаге измененной кожи при витилиго по сравнению с неизмененной кожей у того же больного впервые предложено оценивать смещение равновесия в сторону окислительных процессов в очаге витилиго. Впервые показана эффективность определения соотношения между измененной чувствительностью ткани к индукции свободнорадикального окисления in vitro (изменение скорости накопления продуктов индуцированного свободнорадикального окисления) и активностью антиоксидантной защиты для патогенетически обоснованного диагноза свободнорадикального повреждения меланоцитов при витилиго и выбора лечения для того или иного пациента.By changing the ratio between the parameters of prooxidant and antioxidant systems in the focus of altered skin with vitiligo compared with unchanged skin in the same patient, it was proposed for the first time to evaluate the equilibrium shift towards oxidative processes in the focus of vitiligo. For the first time, the effectiveness of determining the relationship between the altered sensitivity of tissue to induction of free radical oxidation in vitro (change in the rate of accumulation of products of induced free radical oxidation) and the activity of antioxidant protection for a pathogenetically based diagnosis of free radical damage to melanocytes in vitiligo and the choice of treatment for a particular patient is shown.
Способ осуществляется следующим образом.The method is as follows.
Производят забор биоптатов кожи больного витилиго из пораженного (депигментированного) и видимо неизмененного участков кожи. Для этого под местной анестезией с помощью дерматологического пробойника препарируют образец кожи. Образцы пораженной и неизмененной кожи быстро замораживают в жидком азоте вплоть до определения биохимических параметров. Время от начала процедуры забора биоптатов до замораживания не должно превышать 15 секунд. Взятые пробы взвешивают и измельчают в ступке с использованием инертных тефлоновых или кварцевых гранул в течение 50 секунд при температуре 4° С, затем продолжают измельчение в гомогенизаторе тефлон-стекло в среде гомогенизирования, содержащей 20 мМ Tris-HCl (pH 7,4) и 100 мM NaCl, в соотношении ткань-среда, равном 1:5. Затем еще раз повторяют предыдущий этап гомогенизации. Общее время гомогенизирования не превышает 3,5 мин и гомогенизацию проводят при температуре 4° С. Полученные образцы центрифугируют в микропробирках при 1500 оборотах в минуту в течение 10 минут и отбирают аликвоты супернатанта для проведения свободнорадикального окисления и определения активности ферментов антиоксидантной защиты.Biopsy samples of the skin of a patient with vitiligo are collected from the affected (depigmented) and apparently unchanged skin areas. For this, a skin sample is prepared under local anesthesia using a dermatological punch. Samples of affected and unchanged skin are rapidly frozen in liquid nitrogen until biochemical parameters are determined. The time from the start of the biopsy specimen collection procedure to freezing should not exceed 15 seconds. The samples are weighed and ground in a mortar using inert Teflon or quartz granules for 50 seconds at 4 ° C, then grinding in a Teflon-glass homogenizer is continued in a homogenization medium containing 20 mM Tris-HCl (pH 7.4) and 100 mM NaCl, in a tissue-medium ratio of 1: 5. Then, the previous homogenization step is repeated again. The total homogenization time does not exceed 3.5 minutes and the homogenization is carried out at a temperature of 4 ° C. The obtained samples are centrifuged in microtubes at 1500 rpm for 10 minutes and aliquots of the supernatant are taken to conduct free radical oxidation and determine the activity of antioxidant defense enzymes.
Определяют активность ферментов антиоксидантной системы - каталазы, супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы - известными для этих ферментов спектрофотометрическими методами: активность каталазы по методу Luck Н. (Luck И. Catalase. / In: Methods of enzymatic analyses. Editor: Bergmeyer H.U., New-York, Verlag-Chemie Academic Press, 1963, p.885-888); активность супероксиддисмутазы по методу Beauchamp С. (Beauchamp С., Fridovich I. Superoxid dismutase: improved assay and an assay applicable to acrilamide gels. / Analit Biochem, 1971, v.44, p.276-287); активность глутатионпероксидазы по методу Paglia D. (Paglia D., Valentin W. Studies of a quantitative and qualitative characterization of erythrocyte glutation peroxidase. / J. Lab Clin Methods, 1967, v.70, p.158-169); активность глутатионредуктазы по методу Beutler E. (Beutler E. Red cell metabolism. A manual of biochemical methods. / In: Orlando, Fl. Gune and Stratton inc., 1984, 188 p.), с применением микрокювет 0,1-0,2 мл и с длиной пути луча 1 см, при жесткой фиксации микрокювет в кюветодержателе.The activity of enzymes of the antioxidant system — catalase, superoxide dismutase, glutathione peroxidase and glutathione reductase — is determined by spectrophotometric methods known for these enzymes: catalase activity by the method of Luck N. (Luck I. Catalase. / In: Methods of enzymatic analyses. Editor: Bergmeyer HU, New York Verlag-Chemie Academic Press, 1963, p. 885-888); superoxide dismutase activity according to the method of Beauchamp C. (Beauchamp C., Fridovich I. Superoxid dismutase: improved assay and an assay applicable to acrilamide gels. / Analit Biochem, 1971, v. 44, p. 276-287); glutathione peroxidase activity according to the method of Paglia D. (Paglia D., Valentin W. Studies of a quantitative and qualitative characterization of erythrocyte glutation peroxidase. / J. Lab Clin Methods, 1967, v.70, p. 158-169); glutathione reductase activity according to the method of Beutler E. (Beutler E. Red cell metabolism. A manual of biochemical methods. / In: Orlando, Fl. Gune and Stratton inc., 1984, 188 p.), using microcuvettes 0.1-0, 2 ml and with a beam path length of 1 cm, with tight fixation of microcuvettes in the cell holder.
Устанавливают характер изменения активности ферментов в сторону повышения, снижения или его отсутствие в пораженной коже по сравнению с неизмененной, по которому судят о наличии активации антиоксидантной системы, ее снижении или отсутствии изменений.They establish the nature of the change in the activity of enzymes in the direction of increase, decrease or its absence in the affected skin as compared with unchanged, which is used to judge the presence of activation of the antioxidant system, its reduction or absence of changes.
Затем для последующего проведения реакции индуцированного свободнорадикального окисления выбирают систему индукции свободнорадикального окисления in vitro в зависимости от степени изменения активности ферментов антиоксидантной защиты в очаге витилиго по сравнению с участком видимо неизмененной кожи. При повышении активности ферментов антиоксидантной защиты в очаге витилиго, по сравнению с аналогичными показателями в образце участка видимо не измененной кожи этого же больного, выбирают систему окисления, содержащую 0,25 мМ аскорбиновой кислоты и 1,2-10 мкМ FeSО4· 10H2O. При отсутствии изменений или при снижении активности ферментов антиоксидантной защиты в очаге витилиго по сравнению с образцом участка видимо неизмененной кожи применяют систему, содержащую 0,1-0,75 мМ аскорбиновой кислоты.Then, for the subsequent reaction of the induced free radical oxidation, an in vitro free radical oxidation induction system is selected depending on the degree of change in the activity of antioxidant defense enzymes in the vitiligo focus compared to the area of apparently unchanged skin. With an increase in the activity of antioxidant defense enzymes in the vitiligo focus, in comparison with similar indicators in the sample of the site of apparently unchanged skin of the same patient, an oxidation system containing 0.25 mM ascorbic acid and 1.2-10 μM FeSO 4 · 10H 2 O is chosen In the absence of changes or with a decrease in the activity of antioxidant defense enzymes in the vitiligo focus as compared with the sample of the area of apparently unchanged skin, a system containing 0.1-0.75 mM ascorbic acid is used.
Аликвоты гомогената разводят в 5 раз средой гомогенизирования (содержащей 20 мМ Tris-HCl (рН 7,4) и 100 мM NaCl) и помещают в микроячейки. Затем преинкубируют полученный образец в микроячейках в течение 5 минут при 37° С и постоянным перемешивании. Концентрация белка в полученной смеси в микроячейках не должна превышать 1,5 мг/мл. Растворы аскорбиновой кислоты и FeSO4 для индуцирования свободнорадикального окисления готовят за 15 мин до начала преинкубации и добавляют в микроячейки выбранную ранее систему индукции свободнорадикального окисления в соответствующих концентрациях.Aliquots of the homogenate are diluted 5 times with homogenization medium (containing 20 mM Tris-HCl (pH 7.4) and 100 mM NaCl) and placed in microcells. Then the obtained sample is incubated in microcells for 5 minutes at 37 ° C with constant stirring. The protein concentration in the resulting mixture in microcells should not exceed 1.5 mg / ml. Solutions of ascorbic acid and FeSO 4 for inducing free radical oxidation are prepared 15 minutes before the start of preincubation and the previously selected free radical oxidation induction system in appropriate concentrations is added to the microcells.
Проводят реакцию индуцирования свободнорадикального окисления при 37° С и при постоянном перемешивании в течение 20-40 мин в зависимости от выбранной системы окисления. Затем отделяют аликвоты для определения продуктов свободнорадикального окисления. Параллельно ставят контроль на автоокисление в тех же условиях, но без добавления индукторов окисления - аскорбиновой кислоты и FeSO4.The reaction of inducing free radical oxidation is carried out at 37 ° C and with constant stirring for 20-40 minutes, depending on the selected oxidation system. Aliquots are then separated to determine free radical oxidation products. At the same time, they put control on autooxidation under the same conditions, but without the addition of oxidation inducers - ascorbic acid and FeSO 4 .
В отобранных аликвотах определяют концентрацию продуктов свободнорадикального окисления, которую оценивают по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой. Для этого к 150 мкл реагента, содержащего 0,9-1,2% 2-тиобарбитуровую кислоту, 0,54% додецилсульфат натрия и 10,8-15,3% уксусную кислоту (рН 3,5), добавляют 50 мкл отобранных аликвот.In selected aliquots, the concentration of free radical oxidation products is determined, which is evaluated by reaction with 2-thiobarbituric acid. For this, to 50 μl of reagents containing 0.9-1.2% 2-thiobarbituric acid, 0.54% sodium dodecyl sulfate and 10.8-15.3% acetic acid (pH 3.5), add 50 μl of selected aliquots .
Полученные образцы преинкубируют при 4° С в течение 60 мин для повышения стабильности получаемых результатов (стабильность окраски, характеризующей концентрацию продуктов свободнорадикального окисления). Затем эти образцы нагревают до 95° С и инкубируют 40 мин, применяя обратные холодильники для каждой пробы во избежание выпаривания смеси. После появления окрашивания осевший, коагулированный белок отделяют от образца путем центрифугирования в микроцентрифужных пробирках при 1400g в течение 10 мин. В полученных прозрачных супернатантах определяют степень окрашивания на спектрофотометре, регистрируя спектр поглощения тиобарбитурат-активных продуктов в диапазоне 480-590 нм и находят максимум этого спектра поглощения, по которому определяют концентрацию продуктов индуцированного свободнорадикального окисления при различных временных интервалах инкубации образцов в выбранной системе окисления и выражают их в нмоль/мг белка/мл.The resulting samples are preincubated at 4 ° C for 60 min to increase the stability of the results (color stability, characterizing the concentration of free radical oxidation products). Then these samples are heated to 95 ° C and incubated for 40 min, using reflux condensers for each sample to avoid evaporation of the mixture. After the appearance of staining, the settled, coagulated protein is separated from the sample by centrifugation in microcentrifuge tubes at 1400 g for 10 min. The obtained transparent supernatants determine the degree of staining on a spectrophotometer by recording the absorption spectrum of thiobarbiturate-active products in the range of 480-590 nm and find the maximum of this absorption spectrum, which determines the concentration of the products of induced free radical oxidation at various time intervals of incubation of the samples in the selected oxidation system and express them in nmol / mg protein / ml.
После этого строят график зависимости накопления продуктов свободнорадикального окисления от времени инкубации. Скорость накопления продуктов индуцированного свободнорадикального окисления определяют по полученному графику, используя компьютерную программу из пакета Microsoft Excel.After that, a graph is built of the dependence of the accumulation of free radical oxidation products on the incubation time. The rate of accumulation of products of induced free radical oxidation is determined by the obtained schedule using a computer program from the Microsoft Excel package.
При превышении скорости накопления продуктов свободнорадикального окисления в пораженной коже (очаге витилиго) по сравнению с неизмененной более чем на 30% и одновременно сниженной или неизмененной активностью одного и более ферментов антиоксидантной системы определяют состояние активации свободнорадикального окисления, снижение активности антиоксидантных систем и устанавливают соответственно свободнорадикальный характер повреждения кожи. Это позволяет выбрать патогенетически обоснованную терапию, включающую антиоксидантные препараты. Дозы и схему назначения антиоксидантных препаратов подбирают индивидуально в зависимости от степени изменения скорости свободнорадикального окисления и степени изменения активности антиоксидантных ферментов.If the rate of accumulation of free radical oxidation products in the affected skin (vitiligo focus) is exceeded as compared to the unchanged activity of more than 30% and simultaneously reduced or unchanged activity of one or more enzymes of the antioxidant system, the state of activation of free radical oxidation is determined, the activity of antioxidant systems is reduced, and the free radical nature skin damage. This allows you to choose pathogenetically substantiated therapy, including antioxidant drugs. Doses and prescription of antioxidant drugs are selected individually depending on the degree of change in the rate of free radical oxidation and the degree of change in the activity of antioxidant enzymes.
Способ испытан на базе Российской медицинской академии последипломного образования и ГУ НИИ Общей патофизиологии и патоморфологии РАМН на 17 больных витилиго, из них 10 мужчин и 7 женщин в возрасте от 16 до 53 лет, давность заболевания от 1 до 12 лет. У всех больных был выявлен свободнорадикальный характер поражения кожи в очагах витилиго, что позволяет предположить его ведущую роль в развитии витилиго.The method was tested on the basis of the Russian Medical Academy of Postgraduate Education and the State Research Institute of General Pathophysiology and Pathomorphology of the Russian Academy of Medical Sciences for 17 patients with vitiligo, of which 10 men and 7 women aged 16 to 53 years, the disease duration from 1 to 12 years. In all patients, the free-radical nature of skin lesions in the foci of vitiligo was revealed, which suggests its leading role in the development of vitiligo.
Пример 1. Больной К., 27 лет, страдает распространенным витилиго в течение последних 3 лет. Под местной анестезией у больного из лопаточной области взяли биоптаты пораженного и видимо неизмененного участков кожи. Образцы пораженной и неизмененной кожи немедленно заморозили в жидком азоте.Example 1. Patient K., 27 years old, suffers from widespread vitiligo for the past 3 years. Under local anesthesia, the patient received from the scapular region biopsy samples of the affected and apparently unchanged skin areas. Samples of affected and unchanged skin were immediately frozen in liquid nitrogen.
Взятые образцы измельчили и гомогенизировали. Затем определяли активность ферментов антиоксидантной системы в гомогенате каждого образца спектрофотометрическими методами. При этом в поврежденной коже выявили снижение активности каталазы на 27% по сравнению с аналогичными показателями в неизмененной коже, снижение активности супероксиддисмутазы - на 23%, снижение активности глутатионпероксидазы - на 14%, однако активность глутатионредуктазы не изменялась. Учитывая полученные данные, выбрали систему для индукции свободнорадикального окисления, содержащую 0,1 мМ аскорбиновой кислоты.The samples taken were crushed and homogenized. Then, the activity of enzymes of the antioxidant system in the homogenate of each sample was determined by spectrophotometric methods. At the same time, a decrease in catalase activity by 27% was revealed in damaged skin compared to similar indicators in unchanged skin, a decrease in superoxide dismutase activity by 23%, a decrease in glutathione peroxidase activity by 14%, however, glutathione reductase activity did not change. Considering the obtained data, we selected a system for the induction of free radical oxidation containing 0.1 mM ascorbic acid.
Аликвоты гомогената взятых биоптатов развели в 5 раз средой гомогенизирования, содержащей 20 мМ Tris-HCl (рН 7,4) и 100 мM NaCl, проинкубировали при 37° С в течение 5 минут и при постоянном перемешивании. После чего в полученную смесь добавили выбранный ранее и приготовленный непосредственно перед проведением реакции раствор аскорбиновой кислоты.Aliquots of the homogenate of the taken biopsies were diluted 5 times with a homogenization medium containing 20 mM Tris-HCl (pH 7.4) and 100 mM NaCl, incubated at 37 ° C for 5 minutes and with constant stirring. Then, a solution of ascorbic acid, previously selected and prepared immediately before the reaction, was added to the resulting mixture.
Реакция индуцирования свободнорадикального окисления проводилась при 37° С в течение 40 минут. Затем отбирались аликвоты, которые в количестве 50 мкл добавили к 150 мкл реагента, содержащего 0,9-1,2% 2-тиобарбитуровую кислоту, 0,54% додецилсульфат натрия и 10,8-15,3% уксусную кислоту (рН 3,5). Полученные образцы проинкубировали при 4° С в течение 60 мин для повышения стабильности получаемых результатов (стабильность окраски, характеризующей концентрацию продуктов свободнорадикального окисления). Затем эти образцы нагрели до 95° С и инкубировали 40 мин, применяя обратные холодильники для каждой пробы во избежание выпаривания смеси. После появления окрашивания осевший, коагулированный белок отделили от образцов путем центрифугирования в микроцентрифужных пробирках при 1400g в течение 10 мин. В полученных прозрачных супернатантах на спектрофотометре определяли степень окрашивания путем регистрирования спектра поглощения тиобарбитурат-активных продуктов в диапазоне 480-590 нм и находили максимум этого спектра поглощения. Затем строили графики зависимости накопления продуктов свободнорадикального окисления от времени инкубации. Скорость накопления продуктов индуцированного свободнорадикального окисления рассчитывается по полученным графикам (см. фиг.1 и 2).The reaction of inducing free radical oxidation was carried out at 37 ° C for 40 minutes. Aliquots were then selected, which were added in an amount of 50 μl to 150 μl of a reagent containing 0.9-1.2% 2-thiobarbituric acid, 0.54% sodium dodecyl sulfate and 10.8-15.3% acetic acid (pH 3, 5). The resulting samples were incubated at 4 ° C for 60 min to increase the stability of the results obtained (color stability, characterizing the concentration of free radical oxidation products). Then these samples were heated to 95 ° C and incubated for 40 min, using reflux condensers for each sample to avoid evaporation of the mixture. After the appearance of staining, the settled, coagulated protein was separated from the samples by centrifugation in microcentrifuge tubes at 1400 g for 10 min. In the obtained transparent supernatants, the degree of staining was determined on a spectrophotometer by recording the absorption spectrum of thiobarbiturate-active products in the range of 480-590 nm and the maximum of this absorption spectrum was found. Then, we plotted the dependence of the accumulation of free radical oxidation products on incubation time. The rate of accumulation of products of induced free radical oxidation is calculated according to the obtained graphs (see figures 1 and 2).
В результате проведенных реакций и расчетов определили, что у данного больного в участке поврежденной кожи исходный уровень продуктов свободнорадикального окисления не был изменен по сравнению с аналогичными показателями в участке неизмененной кожи, при этом скорость накопления продуктов индуцированного свободнорадикального окисления была повышена на 45%. Эти данные свидетельствуют о свободнорадикальном характере повреждения кожи в очаге витилиго, для коррекции которого рекомендовано назначение препаратов, обладающих антиоксидантным эффектом.As a result of the reactions and calculations, it was determined that in this patient in the area of damaged skin the initial level of products of free radical oxidation was not changed compared to similar indicators in the area of unchanged skin, while the rate of accumulation of products of induced free radical oxidation was increased by 45%. These data indicate the free-radical nature of skin damage in the focus of vitiligo, for the correction of which it is recommended that drugs with an antioxidant effect be prescribed.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2003115963/15A RU2241992C1 (en) | 2003-05-29 | 2003-05-29 | Method for determining free radical oxidation and antioxidation systems condition on injured skin areas of vitiligo patients |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2003115963/15A RU2241992C1 (en) | 2003-05-29 | 2003-05-29 | Method for determining free radical oxidation and antioxidation systems condition on injured skin areas of vitiligo patients |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2003115963A RU2003115963A (en) | 2004-11-27 |
| RU2241992C1 true RU2241992C1 (en) | 2004-12-10 |
Family
ID=34388139
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2003115963/15A RU2241992C1 (en) | 2003-05-29 | 2003-05-29 | Method for determining free radical oxidation and antioxidation systems condition on injured skin areas of vitiligo patients |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2241992C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2484464C1 (en) * | 2011-12-29 | 2013-06-10 | государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Сибирский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России) | Method for evaluating clinical effectiveness in vitiligo |
| RU2516925C1 (en) * | 2013-04-04 | 2014-05-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт кардиологии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук | Method for estimating effectiveness of antioxidant activity stimulation |
-
2003
- 2003-05-29 RU RU2003115963/15A patent/RU2241992C1/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| DELL'ANNA M.L. et al. Mitochondrial impairment in peripheral blood mononuclear cells during the active phase of vitiligo. J. Invest. Dermatol. 2001, vol. 117(4), p. 241-248. * |
| Справочник практического врача. Под ред. акад. АМН СССР А.И.Воробьева. Т.2. - М.: Медицина, 1990, с. 151. PASSI S. et al. Epidermal oxidative stress in vitiligo. Pigment Cell Res. 1998, v. 11(2), p. 81-85, abstr. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2484464C1 (en) * | 2011-12-29 | 2013-06-10 | государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Сибирский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России) | Method for evaluating clinical effectiveness in vitiligo |
| RU2516925C1 (en) * | 2013-04-04 | 2014-05-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт кардиологии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук | Method for estimating effectiveness of antioxidant activity stimulation |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Graff et al. | Improved myeloperoxidase assay for quantitation of neutrophil influx in a rat model of endotoxin-induced uveitis | |
| EP0533764B1 (en) | Antioxidant assay | |
| Liu et al. | The roles of free radicals in amyotrophic lateral sclerosis: reactive oxygen species and elevated oxidation of protein, DNA, and membrane phospholipids | |
| Bakry et al. | Oxidative stress in alopecia areata: a case–control study | |
| Samiec et al. | Glutathione in human plasma: decline in association with aging, age-related macular degeneration, and diabetes | |
| Gabr et al. | Role of cellular oxidative stress and cytochrome c in the pathogenesis of psoriasis | |
| Lacy et al. | Plasma hydrogen peroxide production in hypertensives and normotensive subjects at genetic risk of hypertension | |
| Vargas et al. | Evidence that oxidative stress is increased in patients with X-linked adrenoleukodystrophy | |
| Quick et al. | Rapid microplate assay for superoxide scavenging efficiency | |
| Jackson | An overview of methods for assessment of free radical activity in biology | |
| Meucci et al. | Total antioxidant capacity in patients with varicoceles | |
| Akoglu et al. | Evaluation of total oxidant and antioxidant status in localized and generalized vitiligo | |
| Köse et al. | The evaluation of lipid peroxidation and adenosine deaminase activity in patients with Behcet’s disease | |
| Camkerten et al. | Evaluation of blood oxidant/antioxidant balance in dogs with sarcoptic mange | |
| Vaccaro et al. | Oxidation products are increased in patients affected by non-segmental generalized vitiligo | |
| Kirschbaum | Total urine antioxidant capacity | |
| Mesa-Herrera et al. | A sensitive, accurate, and versatile method for the quantification of superoxide dismutase activities in biological preparations | |
| US6235495B1 (en) | Methods for the quantitation of oxidized glutathione | |
| Martı́nez-Subiela et al. | Critical differences of acute phase proteins in canine serum samples | |
| RU2241992C1 (en) | Method for determining free radical oxidation and antioxidation systems condition on injured skin areas of vitiligo patients | |
| Sepici-Dinçel et al. | The association between total antioxidant status and oxidative stress in Behçet’s disease | |
| Rinaldi et al. | Effect of cis-urocanic acid on bovine neutrophil generation of reactive oxygen species | |
| RU2436101C1 (en) | Diagnostic technique for metaboilic disorders in body in oxidative stress environment | |
| EP1500946A1 (en) | Method of evaluating antioxidation ability by measuring redox balance in vivo | |
| Üstündağ et al. | DNA integrity in patients undergoing hyperbaric oxygen (HBO) therapy |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20110530 |