RU2241036C2 - Method for preparing gamma-aminobutyric acid (gaba) - Google Patents
Method for preparing gamma-aminobutyric acid (gaba) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2241036C2 RU2241036C2 RU2002116774/13A RU2002116774A RU2241036C2 RU 2241036 C2 RU2241036 C2 RU 2241036C2 RU 2002116774/13 A RU2002116774/13 A RU 2002116774/13A RU 2002116774 A RU2002116774 A RU 2002116774A RU 2241036 C2 RU2241036 C2 RU 2241036C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- gaba
- isoleucine
- aminobutyric acid
- gamma
- auxotrophic
- Prior art date
Links
Abstract
Description
Область техникиTechnical field
Настоящее изобретение относится к микробиологической промышленности и медицине и касается способа получения гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) с использованием ауксотрофных по L-изолейцину бактерий, принадлежащих к роду Escherichia.The present invention relates to the microbiological industry and medicine and relates to a method for producing gamma-aminobutyric acid (GABA) using L-isoleucine auxotrophic bacteria belonging to the genus Escherichia.
Предшествующий уровень техникиState of the art
Гамма-аминомасляная кислота (ГАМК) считается одним из основных ингибирующих аминокислотных медиаторов нервных импульсов в мозгу млекопитающих. Будучи широко (хотя и неравномерно) распространенным в мозгу млекопитающих, ГАМК является, как предполагается, медиатором приблизтельно 30% синапсов в мозгу. ГАМК является посредником в множестве функций синапсов посредством образования комплексов с белками (рецепторами ГАМК), расположенными как на клетках, так и на нервных окончаниях. Постсинаптический ответ на ГАМК происходит путем изменения проводимости хлоридов, что, как правило, хотя и не обязательно, приводит к гиперполяризации клетки (WO 0200221 A1). Поскольку ГАМК является эффективным нейромедиатором, она используется в медицине для лечения нарушений мозговой деятельности, таких как амнезия, парафазия (нарушение речи), гемиплегия (паралич половины тела), гипертонии и других. Также ГАМК может использоваться в качестве карциностатического агента (JP 60139622 A2).Gamma-aminobutyric acid (GABA) is considered one of the main inhibitory amino acid mediators of nerve impulses in the brain of mammals. Being widely (albeit unevenly) distributed in the brain of mammals, GABA is believed to be a mediator of approximately 30% of synapses in the brain. GABA mediates the many functions of synapses through the formation of complexes with proteins (GABA receptors) located both on the cells and on the nerve endings. The postsynaptic response to GABA occurs by changing the conductivity of the chlorides, which, as a rule, although not necessarily, leads to hyperpolarization of the cell (WO 0200221 A1). Since GABA is an effective neurotransmitter, it is used in medicine to treat brain disorders such as amnesia, paraphase (speech impairment), hemiplegia (paralysis of half the body), hypertension, and others. GABA can also be used as a carcinostatic agent (JP 60139622 A2).
Известны химические методы синтеза ГАМК (Garmaise et al, Canad. J.Chemistry, 1956, 34, 742-748; Авторское свидетельство СССР №452196). Для медицинских целей также может быть испльзована пища, обогащенная ГАМК. Известны различные продукты, получаемые из растений, обогащенных ГАМК. К ним относятся листья чая (выложенная заявка Японии 9-205989), листья кофе (выложенная заявка Японии 8-173111), растения рода крестоцветных и их сок (Европейская заявка ЕР 1082911 А2), нитевидные грибы (JP 2000060536 A2), порошок или сок растений вида Brassicaceous (JP 2001136929 А2) и другие.Known chemical methods for the synthesis of GABA (Garmaise et al, Canad. J. Chemistry, 1956, 34, 742-748; USSR Author's Certificate No. 452196). GABA enriched foods may also be used for medical purposes. Various products known from GABA-enriched plants are known. These include tea leaves (Japanese laid-out application 9-205989), coffee leaves (Japanese laid-out application 8-173111), cruciferous plants and their juice (European application EP 1082911 A2), filamentous mushrooms (JP 2000060536 A2), powder or juice plants of the species Brassicaceous (JP 2001136929 A2) and others.
Описаны микробиологические способы получения ГАМК с использованием бактерий Е. coli ВКПМ В-7460 и ВКПМ В7452, содержащих плазмиду с геном глутаматдекарбоксилазы (патент РФ №2143002), Bad. cadaveris ATCC 9760 (JP69-01197), Е. coli ATCC 9637 (JP70-15437) и Arthrobacter simplex ATCC 15799 (JP69-01196).Microbiological methods for producing GABA using E. coli bacteria VKPM B-7460 and VKPM B7452 containing a plasmid with the glutamate decarboxylase gene (RF patent No. 2143002), Bad are described. cadaveris ATCC 9760 (JP69-01197), E. coli ATCC 9637 (JP70-15437) and Arthrobacter simplex ATCC 15799 (JP69-01196).
Но до настоящего времени не было сообщений, описывающих тот факт, что ауксотрофные по L-изолейцину бактерии, принадлежащие к роду Escherichia, могут продуцировать ГАМК в условиях, когда такие бактерии выращиваются в питательной среде, содержащей значительное количество L-изолейцина.But so far there have been no reports describing the fact that bacteria auxotrophic for L-isoleucine belonging to the genus Escherichia can produce GABA under conditions when such bacteria are grown in a nutrient medium containing a significant amount of L-isoleucine.
Описание изобретенияDescription of the invention
Объектом настоящего изобретения является способ получения гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК), включающий стадии выращивания ауксотрофной по L-изолейцину бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, в питательной среде, содержащей значительное количество L-изолейцина.The object of the present invention is a method for producing gamma-aminobutyric acid (GABA), comprising the steps of growing an auxotrophic L-isoleucine bacterium belonging to the genus Escherichia in a nutrient medium containing a significant amount of L-isoleucine.
Цель была достигнута путем установления того факта, что ауксотрофные по L-изолейцину бактерии, принадлежащие к роду Escherichia, в ходе выращивания в питательной среде, содержащей L-изолейцин в количестве, большем, чем это необходимо для комплементации ауксотрофии по L-изолейцину, могут продуцировать ГАМК.The goal was achieved by establishing the fact that bacteria auxotrophic for L-isoleucine belonging to the genus Escherichia, when grown in a nutrient medium containing L-isoleucine in an amount greater than that necessary to complement auxotrophy for L-isoleucine, can produce GABA.
Таким образом было совершено настоящее изобретение.Thus, the present invention has been completed.
Так, настоящее изобретение включает следующее.Thus, the present invention includes the following.
1) Способ получения гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК), включающий стадии:1) A method for producing gamma-aminobutyric acid (GABA), comprising the steps of:
- выращивания ауксотрофной по L-изолейцину бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, в питательной среде, содержащей не менее 100 мг/л L-изолейцина, с целью продукции и накопления гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК), и- growing an auxotrophic L-isoleucine bacterium belonging to the genus Escherichia in a nutrient medium containing at least 100 mg / l L-isoleucine, with the aim of producing and accumulating gamma-aminobutyric acid (GABA), and
- выделения гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) из культуральной жидкости.- allocation of gamma-aminobutyric acid (GABA) from the culture fluid.
2) Способ в соответствии с 1), в котором бактерия модифицирована с целью увеличения экспрессии генов биосинтеза L-глутамата.2) The method according to 1), wherein the bacterium is modified to increase the expression of L-glutamate biosynthesis genes.
3) Способ в соответствии с 1), в котором используется бактерия Escherichia coli VL334thrC+ или Escherichia coli 702ilvA (ВКПМ B-8012).3) The method in accordance with 1), which uses the bacterium Escherichia coli VL334thrC + or Escherichia coli 702ilvA (VKPM B-8012).
Далее настоящее изобретение будет описано более подробно. Способом согласно настоящему изобретению является способ получения гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК), включающий стадии:The present invention will now be described in more detail. The method according to the present invention is a method for producing gamma-aminobutyric acid (GABA), comprising the steps of:
- выращивания ауксотрофной по L-изолейцину бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, в питательной среде, содержащей не менее 100 мг/л L-изолейцина, с целью продукции и накопления гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК), и- growing an auxotrophic L-isoleucine bacterium belonging to the genus Escherichia in a nutrient medium containing at least 100 mg / l L-isoleucine, with the aim of producing and accumulating gamma-aminobutyric acid (GABA), and
- выделения гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) из культуральной жидкости. Термин “ауксотрофная по L-изолейцину бактерия” означает, что указанная бактерия требует наличия L-изолейцина в питательной среде для своего роста. В данном случае “ауксотрофной по L-изолейцину бактерией” является бактерия, которая требует наличия в питательной среде не менее 10 мг/л L-изолейцина. Поэтому концентрация L-изолейцина в питательной среде для ауксотрофной по L-изолейцину бактерии составляет обычно не менее 10 мг/л. Способы получения ауксотрофных по L-изолейцину бактерий хорошо известны и описаны, например, в Европейском патенте ЕР 1172433.- allocation of gamma-aminobutyric acid (GABA) from the culture fluid. The term “L-isoleucine auxotrophic bacterium” means that said bacterium requires the presence of L-isoleucine in a nutrient medium for its growth. In this case, a “bacterium auxotrophic for L-isoleucine" is a bacterium that requires at least 10 mg / L of L-isoleucine in the nutrient medium. Therefore, the concentration of L-isoleucine in a nutrient medium for an auxotrophic L-isoleucine bacterium is usually not less than 10 mg / L. Methods for producing auxotrophic L-isoleucine bacteria are well known and described, for example, in European patent EP 1172433.
Термин “бактерия, принадлежащая к роду Escherichia” означает, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, использованного в настоящем изобретении, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (Е. coif).The term “bacterium belonging to the genus Escherichia” means that the bacterium belongs to the genus Escherichia in accordance with the classification known to the person skilled in the field of microbiology. As an example of a microorganism belonging to the genus Escherichia used in the present invention, the bacterium Escherichia coli (E. coif) can be mentioned.
Примерами ауксотрофных по L-изолейцину бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, являются штаммы, дефицитные по гену ilvA, такие как штаммы Е. coli B7ILE (VKPM B-8013), VL334thrC+ 702ilvA (VKPM В-8012) и 237 (VKPM В-7925), описанные в Европейском патенте ЕР 1172433.Examples of auxotrophic L-isoleucine bacteria belonging to the genus Escherichia are strains deficient in the ilvA gene, such as strains of E. coli B7ILE (VKPM B-8013), VL334thrC + 702ilvA (VKPM B-8012) and 237 (VKPM B-8012) 7925) described in European patent EP 1172433.
Авторы настоящего изобретения установили, что ауксотрофные по L-изолейцину бактерии, принадлежащие к роду Escherichia, в ходе выращивания в питательной среде, содержащей L-изолейцин в количестве, большем, чем это необходимо для комплементации ауксотрофии по L-изолейцину, могут продуцировать ГАМК. Другими словами, в условиях, когда потребность в L-изолейцине не является фактором, лимитирующим рост ауксотрофных по L-изолейцину бактерий, выращивание указанных бактерий приводит к накоплению ГАМК в культуральной жидкости. Концентрация L-изолейцина должна быть не менее 100 мг/л. Детальный механизм установленного факта остается неустановленным.The authors of the present invention have found that L-isoleucine auxotrophic bacteria belonging to the genus Escherichia, when grown in a growth medium containing L-isoleucine in an amount greater than that necessary to complement L-isoleucine auxotrophy, can produce GABA. In other words, under conditions where the need for L-isoleucine is not a factor limiting the growth of bacteria auxotrophic for L-isoleucine, the growth of these bacteria leads to the accumulation of GABA in the culture fluid. The concentration of L-isoleucine should be at least 100 mg / L. The detailed mechanism of the established fact remains unidentified.
Согласно настоящему изобретению выращивание, выделение и очистка ГАМК из культуральной или подобной ей жидкости может быть осуществлена способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых ГАМК продуцируется с использованием бактерий.According to the present invention, the cultivation, isolation and purification of GABA from a culture or similar liquid can be carried out in a manner similar to traditional fermentation methods in which GABA is produced using bacteria.
Питательная среда, используемая для выращивания, может быть как синтетической, так и натуральной, при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и необходимое количество L-изолейцина, необходимого для роста бактерии. Количество L-изолейцина, используемое в способе согласно настоящему изобретению, должно быть не менее 100 мг/л. К источникам углерода относятся различные углеводы, такие как глюкоза и сахароза, а также различные органические кислоты. В зависимости от характера ассимиляции используемого микроорганизма, могут использоваться спирты, такие как этанол и глицерин. В качестве источника азота могут использоваться различные неорганические соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов, ферментолизат микроорганизмов. В качестве минеральных добавок могут использоваться фосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные им соединения. В качестве витаминов могут использоваться тиамин и дрожжевой экстракт.The nutrient medium used for growing can be either synthetic or natural, provided that the medium contains sources of carbon, nitrogen, mineral additives and the required amount of L-isoleucine necessary for bacterial growth. The amount of L-isoleucine used in the method according to the present invention should be at least 100 mg / L. Carbon sources include various carbohydrates such as glucose and sucrose, as well as various organic acids. Depending on the nature of the assimilation of the microorganism used, alcohols such as ethanol and glycerin may be used. Various inorganic ammonium salts, such as ammonia and ammonium sulfate, other nitrogen compounds, such as amines, natural nitrogen sources, such as peptone, soybean hydrolyzate, microorganism fermentolizate, can be used as a nitrogen source. As mineral additives, potassium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, iron sulfate, manganese sulfate, calcium chloride and the like can be used. Thiamine and yeast extract can be used as vitamins.
Выращивание осуществляется предпочтительно в аэробных условиях, таких как перемешивание культуральной жидкости на качалке, взбалтывание с аэрацией, при температуре в пределах от 20 до 40°С, предпочтительно в пределах от 30 до 38°С. рН среды поддерживают в пределах от 5 до 9, предпочтительно от 6.5 до 7.2. рН среды может регулироваться аммиаком, карбонатом кальция, различными кислотами, основаниями и буферными растворами. Обычно выращивание в течение от 1 до 5 дней приводит к накоплению целевой кислоты в культуральной жидкости.The cultivation is preferably carried out under aerobic conditions, such as mixing the culture fluid on a rocking chair, shaking with aeration, at a temperature in the range from 20 to 40 ° C, preferably in the range from 30 to 38 ° C. The pH of the medium is maintained in the range from 5 to 9, preferably from 6.5 to 7.2. The pH of the medium can be adjusted by ammonia, calcium carbonate, various acids, bases and buffer solutions. Usually, cultivation for 1 to 5 days leads to the accumulation of the target acid in the culture fluid.
После выращивания твердые остатки, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрацией через мембрану, а затем ГАМК может быть выделена и очищена методами ионообменной хроматографии, концентрирования и кристаллизации.After growth, solid residues, such as cells, can be removed from the culture fluid by centrifugation or filtration through a membrane, and then GABA can be isolated and purified by ion exchange chromatography, concentration and crystallization.
Наилучший способ осуществления изобретенияBEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Более детально настоящее изобретение будет разъяснено ниже со ссылкой на Примеры.In more detail, the present invention will be explained below with reference to Examples.
Пример 1. Продукция ГАМК с использованием дефицитного по гену ilvA штамма Е. coli VL334thrC+.Example 1. The production of GABA using a deficient in the ilvA gene of E. coli strain VL334thrC + .
Штамм VL334 (ВКПМ В-1641) является ауксотрофным по L-изолейцину и L-треонину штаммом, содержащим мутации в генах thrC и ilvA (патент США 4278765). Природный аллель гена thrC был перенесен методом общей трансдукции с использованием бактериофага Р1, выращенного на клетках природного штамма Е. coli К12 (ВКПМ В-7). В результате был получен ауксотрофный по L-изолейцину штамм VL334thrC+. Указанный штамм обладал способностью к продукции L-глутаминовой кислоты (Европейский патент ЕР 1172433).Strain VL334 (VKPM B-1641) is a L-isoleucine and L-threonine auxotrophic strain containing mutations in the thrC and ilvA genes (US Pat. No. 4,278,765). The natural allele of the thrC gene was transferred by general transduction using bacteriophage P1 grown on cells of the natural E. coli K12 strain (VKPM B-7). As a result, the strain VL334thrC + auxotrophic for L-isoleucine was obtained. The specified strain had the ability to produce L-glutamic acid (European patent EP 1172433).
Питательная среда для ферментации содержала 60 г/л глюкозы, 25 г/л сульфата аммония, 2 г/л КН2PO4, 1 г/л MgSO4, 0.1 мг/мл тиамина и 25 г/л мела (рН 7.2). L-изолейцин добавляли в различных концентрациях. Глюкозу и мел стерилизовали раздельно. 2 мл питательной среды были помещены в пробирки и инокулированы одной петлей микроорганизма. Выращивание проводили при 30°С в печение 3 дней с перемешиванием.The fermentation medium contained 60 g / l glucose, 25 g / l ammonium sulfate, 2 g / l KH 2 PO 4 , 1 g / l MgSO 4 , 0.1 mg / ml thiamine and 25 g / l chalk (pH 7.2). L-isoleucine was added in various concentrations. Glucose and chalk were sterilized separately. 2 ml of culture medium were placed in test tubes and inoculated with one loop of the microorganism. Cultivation was carried out at 30 ° C for 3 days with stirring.
ГАМК определяли с помощью метода “Waters Accq-Tag Amino Acid Analysis Method” в соответствии с рекомендациями производителя. Указанный метод заключается в получении производных пептидов и аминокислот из гидролизованных белков перед нанесением на колонку с последующим разделением полученных производных с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ с флюоресцентной детекцией. Коэффициент удерживания (RC) определяется как отношение времени удерживания пика вещества (RT) к времени удерживания L-фенилаланина (рН элюента 5.05). RC L-пролина = 0.695, RC ГАМК=0.701. Длина волны возбуждения флюоресцентного детектора была 250 нм, область длин волн испускания была 320-560 нм. Максимум испускания для L-пролина составлял 395 нм, максимум испускания для ГАМК составлял 395 нм и 460 нм. Подлинность ГАМК также была подтверждена методами масс-спектроскопии и ЯМР.GABA was determined using the Waters Accq-Tag Amino Acid Analysis Method in accordance with the manufacturer's recommendations. The specified method consists in obtaining derivatives of peptides and amino acids from hydrolyzed proteins before application to the column, followed by separation of the obtained derivatives using reverse-phase HPLC with fluorescence detection. The retention coefficient (RC) is defined as the ratio of the retention time of the peak of the substance (RT) to the retention time of L-phenylalanine (pH of the eluent 5.05). RC L-proline = 0.695, RC GABA = 0.701. The excitation wavelength of the fluorescent detector was 250 nm, the emission wavelength range was 320-560 nm. The maximum emission for L-proline was 395 nm, the maximum emission for GABA was 395 nm and 460 nm. The authenticity of GABA has also been confirmed by mass spectroscopy and NMR.
Количество ГАМК и L-глутаминовой кислоты измеряли с помощью бумажной хроматографии (состав подвижной фазы: бутанол уксусная кислота вода =4:1:1). Результаты выращивания представлены в таблице 1.The amount of GABA and L-glutamic acid was measured by paper chromatography (mobile phase composition: butanol, acetic acid, water = 4: 1: 1). The results of the cultivation are presented in table 1.
Пример 2. Продукция ГАМК с использованием дефицитного по гену ilvA штамма Е. coli 702ilvA.Example 2. Production of GABA using an E. coli 702ilvA strain deficient in ilvA gene.
Штамм 702ilvA (ВКПМ В-8012) является штаммом, дефицитным по гену ilvA, и обладает способностью к продукции L-пролина (Европейский патент ЕР 1172433). Штамм 702ilvA выращивали в тех же условиях, которые описаны в Примере 1. Результаты выращивания представлены в таблице 2.Strain 702ilvA (VKPM B-8012) is a strain deficient in the ilvA gene and has the ability to produce L-proline (European patent EP 1172433). Strain 702ilvA was grown under the same conditions as described in Example 1. The growing results are presented in table 2.
Claims (3)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2002116774/13A RU2241036C2 (en) | 2002-06-25 | 2002-06-25 | Method for preparing gamma-aminobutyric acid (gaba) |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2002116774/13A RU2241036C2 (en) | 2002-06-25 | 2002-06-25 | Method for preparing gamma-aminobutyric acid (gaba) |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2002116774A RU2002116774A (en) | 2004-02-20 |
| RU2241036C2 true RU2241036C2 (en) | 2004-11-27 |
Family
ID=34309878
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2002116774/13A RU2241036C2 (en) | 2002-06-25 | 2002-06-25 | Method for preparing gamma-aminobutyric acid (gaba) |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2241036C2 (en) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109315493A (en) * | 2018-11-19 | 2019-02-12 | 徐州工程学院 | A kind of fermentation chickpea milk produces GABA experiment of single factor and response phase method optimization method |
-
2002
- 2002-06-25 RU RU2002116774/13A patent/RU2241036C2/en active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2002116774A (en) | 2004-02-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3151073B2 (en) | Production of amino acids by fermentation | |
| JP3006926B2 (en) | Method for producing L-threonine by fermentation method | |
| RU2207371C2 (en) | Method for preparing l-amino acids of l-glutamic acid family, strain of bacterium escherichia coli as producer of l-amino acid (variants) | |
| EP0913466A2 (en) | Method for producing L-leucine | |
| CN108841758B (en) | Corynebacterium glutamicum mutant strain and application thereof in L-leucine production | |
| JP2817157B2 (en) | Production method of L-amino acid by fermentation method | |
| JPH0549489A (en) | Method for producing l-phenylalanine by fermentation method | |
| JP3046332B2 (en) | Production of amino acids by fermentation | |
| JP3717970B2 (en) | Method for producing L-isoleucine by fermentation | |
| JP2011147459A (en) | Novel bacterial strain, method of preparing the same and use thereof in fermentation process for l-lysine production | |
| JP3245881B2 (en) | Simultaneous fermentation of basic and acidic amino acids | |
| RU2241036C2 (en) | Method for preparing gamma-aminobutyric acid (gaba) | |
| US7122369B2 (en) | Bacterial strains, methods of preparing the same and use thereof in fermentation processes for L-lysine production | |
| JPH0665314B2 (en) | Fermentation method for producing L-valine | |
| JPH09271382A (en) | Production of l-amino acid by fermentation method using ectoine | |
| JPS6296094A (en) | Production of l-glutamic acid by fermentation | |
| KR0168719B1 (en) | Preparation process of l-threonine by fermentation | |
| JPH0347840B2 (en) | ||
| KR0168720B1 (en) | Preparation process of l-threonine by fermentation | |
| JPH029795B2 (en) | ||
| JPS5934893A (en) | Preparation of l-phenylalanine by fermentation | |
| JPH0211237B2 (en) | ||
| JPH028720B2 (en) | ||
| JPH028718B2 (en) | ||
| JPH028719B2 (en) |