RU2240135C1 - Cell culture comprising precursor cells of osteogenesis, implant based on thereof and its applying for recovery bone integrity - Google Patents
Cell culture comprising precursor cells of osteogenesis, implant based on thereof and its applying for recovery bone integrity Download PDFInfo
- Publication number
- RU2240135C1 RU2240135C1 RU2003104494/15A RU2003104494A RU2240135C1 RU 2240135 C1 RU2240135 C1 RU 2240135C1 RU 2003104494/15 A RU2003104494/15 A RU 2003104494/15A RU 2003104494 A RU2003104494 A RU 2003104494A RU 2240135 C1 RU2240135 C1 RU 2240135C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- bone
- osteogenesis
- implant
- stromal
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к клеточной терапии, и касается культуры клеток, содержащей клетки-предшественники остеогенеза, имплантата, обладающего остеогенной активностью, способа получения этого имплантата и способа восстановления целостности кости.The invention relates to medicine, namely to cell therapy, and relates to a cell culture containing osteogenesis precursor cells, an implant having osteogenic activity, a method for producing this implant and a method for restoring bone integrity.
Известен способ стимуляции остеорепаративного процесса костной ткани путем привнесения клеток костного мозга в зону дефекта без фиксации [1]. Недостатком данного способа является невозможность создания необходимой концентрации клеток, участвующих в регенерации кости, из-за вымывания их из зоны дефекта.A known method of stimulating the osteoreparative process of bone tissue by introducing bone marrow cells into the defect zone without fixation [1]. The disadvantage of this method is the inability to create the necessary concentration of cells involved in bone regeneration, due to leaching them from the defect zone.
Известен способ лечения дефектов костей [2], основанный на выделении из костного мозга и размножении в монослойных культурах in vitro стромальных фибробластов костного мозга, заполнение ими трехмерного каркаса с последующей трансплантацией в область дефекта. Данный способ значительно эффективнее предыдущих, но также имеет ряд существенных недостатков:There is a method of treating bone defects [2], based on the isolation of bone marrow stromal fibroblasts from a bone marrow and propagation in monolayer cultures in vitro, filling them with a three-dimensional skeleton, followed by transplantation into the defect area. This method is much more effective than the previous ones, but also has a number of significant disadvantages:
- чрезвычайно длительные сроки культивирования костномозговых клеток для получения остеогенных клеток (1,5-2,0 месяца);- extremely long periods of cultivation of bone marrow cells to obtain osteogenic cells (1.5-2.0 months);
- удаление при культивировании клеток лимфо-макрофагального ряда, которые индуцируют процессы регенерации поврежденной ткани [3];- removal during cultivation of cells of the macrophage series, which induce the regeneration of damaged tissue [3];
- необходимость при культивировании использовать гетерологические фидерные клеточные культуры.- the need for cultivation to use heterologous feeder cell cultures.
Дальнейшие успехи в разработке методов стимуляции костеобразования связаны с открытием сигналов, стимулирующих рост костной ткани, т.е. выращиванием мезенхимальных стволовых клеток в культуральной среде с направленной дифференциацией их в остеогенные, что позволило исключить использование гетерологичных фидерных культур.Further progress in the development of methods for stimulating bone formation is associated with the discovery of signals that stimulate bone growth, i.e. by culturing mesenchymal stem cells in a culture medium with directed differentiation into osteogenic ones, which made it possible to exclude the use of heterologous feeder cultures.
Так, в способе восстановления целостности кости [4], который основан на получении стромальных остеобластоидных клеток путем предварительной процедуры выделения и подготовки их к трансплантации, включающем резецирование аутологичной кости посредством трипсинизации ее измельченных фрагментов, помещением выделенных клеток в культуральные условия с использованием в качестве индукторов остеогенеза аскорбата натрия, гидрокортизона и метилпреднизолона. Клетки пересевают на 12-14 день на микроносители (коллагеновый или гидроксиапатит) с последующим накоплением необходимого количества стромальных клеток, далее проводят инкубацию микроносителей с губчатым каркасом (костный матрикс или пористый гидроксиапатит), предварительно обработанным раствором поли-L-лизина или раствором фибронектина. Подготовленный таким образом комбинированный трансплантат помещают в зону дефекта кости. Общее время подготовки трансплантата к использованию с момента резецирования кости составляет не менее 1-1,5 месяцев, указанный трансплантат использовался в эксперименте только на кроликах.Thus, in a method for restoring bone integrity [4], which is based on obtaining stromal osteoblastoid cells by a preliminary procedure for isolation and preparing them for transplantation, including resection of an autologous bone by trypsinization of its crushed fragments, placing the selected cells in culture using osteogenesis as inducers sodium ascorbate, hydrocortisone and methylprednisolone. Cells are subcultured on days 12-14 on microcarriers (collagen or hydroxyapatite) with the subsequent accumulation of the required number of stromal cells, then the microcarriers are incubated with a spongy skeleton (bone matrix or porous hydroxyapatite), a pre-treated solution of poly-L-lysine or fibronectin solution. The combined graft thus prepared is placed in the area of the bone defect. The total time for preparation of the graft for use from the moment of bone resection is at least 1-1.5 months; this graft was used in the experiment only on rabbits.
Указанный метод имеет преимущества по сравнению с методом, описываемым в источнике [2], который состоит в том, что позволяет исходно увеличить количество остеобластоидных клеток за счет трипсинизации кусочков резецированной аутологичной кости; покрытие губчатого каркаса поли-L-лизином или фибронектином существенно повышает адгезивные свойства матрикса для всех видов клеток; использование микроносителей с выращенными на их поверхности клетками препятствует вымыванию клеток из губчатого каркаса и сокращает время инкубации для его заполнения перед трансплантацией.The specified method has advantages over the method described in the source [2], which consists in the fact that it allows you to initially increase the number of osteoblastoid cells due to trypsinization of pieces of resected autologous bone; coating the spongy framework with poly-L-lysine or fibronectin significantly increases the adhesive properties of the matrix for all types of cells; the use of microcarriers with cells grown on their surface prevents the leaching of cells from the spongy framework and reduces the incubation time to fill it before transplantation.
Однако указанный способ имеет ряд недостатков:However, this method has several disadvantages:
- он не сопровождается хирургической реваскуляризацией трансплантата и может быть использован для устранения только небольших дефектов;- it is not accompanied by surgical revascularization of the graft and can be used to eliminate only small defects;
- метод предусматривает длительный период подготовки трансплантата к использованию;- the method provides for a long period of preparation of the transplant for use;
- является травматичным, т.к. связан с предварительной операцией по резецированию собственной здоровой кости;- is traumatic, because associated with a preliminary operation to resect their own healthy bone;
- отсутствие стандартизации пористости губчатого каркаса не позволяет точно характеризовать степень его заполнения клетками, привнесенными на микроносителях.- the lack of standardization of the porosity of the spongy framework does not allow to accurately characterize the degree of its filling with cells introduced on microcarriers.
Известен метод образования кости in vitro [5], который заключается в заборе костного мозга у крыс, выделении из него стромальных клеток и культивировании их в течение 4 недель в среде с добавлением фетальной сыворотки теленка, антибиотиков и индукторов остеогенеза - аскорбиновой кислоты, β-глицерофосфата и дексаметазона. Аскорбиновая кислота добавляется для синтеза коллагена и остеогенеза, а также она регулирует синтез АТФ-азы, щелочной фосфатазы и синтез белков в культурах остеобласто-подобных клеток. β-глицерофосфат используется как источник органического фосфора, являясь важным компонентом минерализации. Дексаметазон, являясь синтетическим глюкокортикоидом, индуцирует пролиферацию и заключительную стадию дифференциации остеогенных клеток. Культуру остеогенных клеток человека приготавливают таким же образом, но с использованием аутологичной сыворотки. Через 4 недели наблюдается образование трехмерной минерализованной узелковой структуры, которая содержит минерализованные коллагеновые нити, косте-специфический протеин - остеопонтин, а также отмечено присутствие щелочной фосфатазы, характерной для остеобластных клеток. Культивирование клеток в таких же условиях на гидроксиапатитных блоках показало их минерализацию через 8 недель. Предлагается использование таких клеток в различных имплантатах, однако результаты имплантации клеток при их подкожном введении в области спины экспериментальным животным (крысам) в материалах этого документа не представлены.A known method of bone formation in vitro [5], which consists in taking bone marrow from rats, isolating stromal cells from it, and culturing them for 4 weeks in a medium supplemented with fetal calf serum, antibiotics and osteogenesis inducers — ascorbic acid, β-glycerophosphate and dexamethasone. Ascorbic acid is added for collagen synthesis and osteogenesis, and it also regulates the synthesis of ATPase, alkaline phosphatase and protein synthesis in cultures of osteoblast-like cells. β-glycerophosphate is used as a source of organic phosphorus, being an important component of mineralization. Dexamethasone, being a synthetic glucocorticoid, induces proliferation and the final stage of differentiation of osteogenic cells. A culture of human osteogenic cells is prepared in the same way, but using autologous serum. After 4 weeks, the formation of a three-dimensional mineralized nodular structure is observed, which contains mineralized collagen fibers, a bone-specific protein - osteopontin, and the presence of alkaline phosphatase, characteristic of osteoblastic cells, is noted. Cell cultivation under the same conditions on hydroxyapatite blocks showed their mineralization after 8 weeks. The use of such cells in various implants is proposed, however, the results of cell implantation during their subcutaneous administration in the back region of experimental animals (rats) are not presented in the materials of this document.
Заявка РСТ [6] посвящена процессу направленной дифференциации стромальных клеток, выделенных из клеток костного мозга в тканеспецифические клетки, в том числе и в остеобласты. Такая дифференциация осуществляется посредством их инкубации в искусственной синтетической среде в присутствии трехмерных биосовместимых и биодеградируемых производных гиалуроновой кислоты с добавлением в среду 10%-ной фетальной сыворотки теленка с использованием в качестве индукторов остеогенеза аскорбиновой кислоты и дексаметазона. Однако перед использованием производных гиалуроновой кислоты они обязательно предварительно замачиваются в водном растворе гидроксиапатита. Устойчивую фенотипическую экспрессию остеоцитов наблюдают морфологически, а также окрашиванием клеток на присутствие щелочной фосфатазы. Однако о применении такого материала с выросшими остеоцитами не сообщается.PCT application [6] is devoted to the process of directed differentiation of stromal cells isolated from bone marrow cells into tissue-specific cells, including osteoblasts. Such differentiation is carried out by incubating them in an artificial synthetic medium in the presence of three-dimensional biocompatible and biodegradable hyaluronic acid derivatives with the addition of 10% fetal calf serum to the medium using ascorbic acid and dexamethasone as inducers of osteogenesis. However, before using derivatives of hyaluronic acid, they must be pre-soaked in an aqueous solution of hydroxyapatite. Stable phenotypic expression of osteocytes is observed morphologically, as well as staining of cells for the presence of alkaline phosphatase. However, the use of such material with grown osteocytes has not been reported.
Наиболее близким источником информации является публикация, касающаяся регенерации и приращения кости с использованием мезенхимальных стволовых клеток [7], которые получают из костного мозга нормальных волонтеров (людей), выращивают их в синтетической среде с 10%-ной фетальной бычьей сывороткой, неадгезированные клетки удаляют, а адгезированные клетки выращивают со сменой среды дважды в неделю и получают первичную культуру на 13 день. Далее клетки серийно размножают, помещая их в чашки с плотностью 3×10 клеток/см2 с добавлением свежей среды и остеогенных факторов, таких как дексаметазон, аскорбиновая кислота и β-глицерофосфат. В течение каждых 4 дней просчитывается число клеток, определяют щелочную фосфатазу, а также степень минерализации матрикса. Имплантат готовят посредством инкубации керамических блоков, представляющих собой пористый гидроксиапатит/β-трикальций фосфатные блоки с размерами пор 200-450 мкм, которые имеют форму в виде цилиндров ~4 мм в диаметре и 8 мм в длину с центральным каналом диаметром=1 мм или в форме куба с размером сторон 3×3×3 мм. Цилиндры или кубы, предварительно покрытые человеческим фибронектином, инкубируют в клеточной суспензии, содержащей 7,5×106 клеток/мл, в течение 2 часов при 37°С, после чего считают имплантаты готовыми к трансплантации. Приготовление имплантата составляло не менее 8 недель. Однако активность таких имплантатов, содержащих стромальные клетки человека, была проверена только на экспериментальных животных - крысах с обширным повреждением бедра. Полученные результаты указывают на то, что произведенные в культуре клеток человеческие стволовые мезенхимальные клетки, покрывающие соответствующие носители, способны устранить клинически значимый костный дефект на хорошо разработанной модели костной репарации. При этом остеогенная потенция человеческих мезенхимальных клеток была также продемонстрирована на подкожных имплантатах и в исследованиях in vitro. Авторы отмечают свой приоритет, т.к. ими впервые было продемонстрировано, что указанные клетки обладают способностью костеобразования в зонах, которые нуждаются в репарации.The closest source of information is the publication related to bone regeneration and growth using mesenchymal stem cells [7], which are obtained from the bone marrow of normal volunteers (people), they are grown in a synthetic medium with 10% fetal bovine serum, non-adherent cells are removed, and adherent cells are grown with a change of medium twice a week and receive the primary culture on day 13. Next, the cells are serially propagated by placing them in plates with a density of 3 × 10 cells / cm 2 with the addition of fresh medium and osteogenic factors such as dexamethasone, ascorbic acid and β-glycerophosphate. For every 4 days, the number of cells is calculated, alkaline phosphatase is determined, as well as the degree of matrix mineralization. The implant is prepared by incubating ceramic blocks, which are porous hydroxyapatite / β-tricalcium phosphate blocks with pore sizes of 200-450 μm, which are in the form of cylinders ~ 4 mm in diameter and 8 mm in length with a central channel with a diameter of = 1 mm or cube shape with a side size of 3 × 3 × 3 mm. Cylinders or cubes pre-coated with human fibronectin are incubated in a cell suspension containing 7.5 × 10 6 cells / ml for 2 hours at 37 ° C, after which the implants are considered ready for transplantation. The preparation of the implant was at least 8 weeks. However, the activity of such implants containing human stromal cells was tested only in experimental animals - rats with extensive hip damage. The results indicate that human stem mesenchymal cells produced in cell culture covering the appropriate carriers are capable of eliminating a clinically significant bone defect in a well-developed model of bone repair. Moreover, the osteogenic potency of human mesenchymal cells has also been demonstrated on subcutaneous implants and in vitro studies. The authors mark their priority, as they were the first to demonstrate that these cells have the ability to bone formation in areas that need repair.
Однако ни в одном из представленных источников не описано применение таких имплантированных клеток для устранения костного дефекта у человека.However, none of the sources presented describes the use of such implanted cells to eliminate a bone defect in humans.
В свете изложенного, задача предлагаемого изобретения заключается в разработке культуры мезенхимальных стволовых клеток человека, которые при имплантации in vivo способны к устранению дефекта костной ткани у человека, в том числе и значительного.In light of the foregoing, the objective of the invention is to develop a culture of human mesenchymal stem cells, which, when implanted in vivo, are capable of eliminating a defect in bone tissue in humans, including a significant one.
Указанная задача решается посредством введения в зону дефекта кости не только клеток стромального ряда, но и лимфо-макрофагального, культивируемых in vitro в присутствии индукторов дифференцировки. направляющих в сторону образования остеобластных и остеокластных клеток, а также секреции цитокинов, стимулирующих костеобразование.This problem is solved by introducing into the bone defect zone not only stromal cells, but also lympho-macrophage cells cultured in vitro in the presence of differentiation inducers. directing towards the formation of osteoblastic and osteoclastic cells, as well as the secretion of cytokines, stimulating bone formation.
Сущность изобретенияSUMMARY OF THE INVENTION
Сущность изобретения заключается в культуре клеток, содержащей клетки стромального и лимфо-макрофагального ряда костного мозга млекопитающих, культивированные в питательной среде с 10%-ной бычьей эмбриональной сывороткой в течение 4-7 дней с использованием в качестве индукторов остеогенеза - инсулина, дексаметазона и β-глицерофосфата с 24-часовой обработкой 5-азацитидином в середине цикла и формирующие монослойную культуру с адгезивной способностью не менее 4×104 клеток/см2.The invention consists in a cell culture containing cells of the stromal and lympho-macrophage row of mammalian bone marrow, cultured in a nutrient medium with 10% bovine embryonic serum for 4-7 days using osteogenesis - insulin, dexamethasone and β- as inducers glycerophosphate with 24-hour treatment with 5-azacytidine in the middle of the cycle and forming a monolayer culture with an adhesive capacity of at least 4 × 10 4 cells / cm 2 .
Еще одним аспектом изобретения является то, что в указанной культуре клетки стромального и лимфо-макрофагального ряда костного мозга представлены клетками человека.Another aspect of the invention is that in this culture, cells of the stromal and lympho-macrophage row of the bone marrow are represented by human cells.
Другим аспектом изобретения является то, что указанные клетки являются клетками крысы, морской свинки, кролика, кошки или собаки.Another aspect of the invention is that said cells are rat, guinea pig, rabbit, cat or dog cells.
Аутологичный имплантат, который используется в ходе операции по устранению костного дефекта и являющийся имплантатом, обладающий остеогенной активностью, представляет собой трехмерный аллогенный костный матрикс или губку из биодеградируемого материала, полученные культивированием на них клеток стромального и лимфо-макрофагального ряда аутологичного костного мозга млекопитающих в питательной среде с 10%-ной бычьей эмбриональной сывороткой в течение 4-7 дней с использованием в качестве индукторов остеогенеза - инсулина, дексаметазона и β-глицерофосфата с 24-часовой обработкой 5-азацитидином в середине цикла и формирующие монослойную культуру с адгезивной способностью не менее 4×104 клеток/см2 и 3×105 клеток/см3 губки из биодеградируемого материала.An autologous implant that is used during the operation to repair a bone defect and is an implant with osteogenic activity is a three-dimensional allogeneic bone matrix or a sponge made of biodegradable material obtained by culturing stromal and lympho-macrophage cells of an autologous mammalian bone marrow in a nutrient medium with 10% bovine embryonic serum for 4-7 days using osteogenesis - insulin, dexamethasone as inducers and β-glycerophosphate with 24-hour treatment with 5-azacytidine in the middle of the cycle and forming a monolayer culture with an adhesive capacity of at least 4 × 10 4 cells / cm 2 and 3 × 10 5 cells / cm 3 sponges from biodegradable material.
Преимущественно в имплантате клетки млекопитающих являются клетками человека.Mostly in the implant, mammalian cells are human cells.
Еще одним вариантом изобретения является то, что имплантат, представляющий собой аллогенный костный матрикс, выполнен в виде соломки (хвороста) деминерализованной кости, имеющей среднее сечение 1,5-2,0 мм2 и длину 50-100 мм.Another embodiment of the invention is that the implant, which is an allogeneic bone matrix, is made in the form of straws (brushwood) of demineralized bone having an average cross section of 1.5-2.0 mm 2 and a length of 50-100 mm.
Также дополнительно имплантат изготавливают в виде губки из биодеградируемого материала, представляющей собой пластинку толщиной 1,5±0,5 мм шириной 30±5 мм и длиной - в зависимости от длины окружности места стыка имплантата и собственной кости пациента.In addition, the implant is made in the form of a sponge from a biodegradable material, which is a plate 1.5 ± 0.5 mm thick, 30 ± 5 mm wide and long, depending on the circumference of the junction of the implant and the patient’s own bone.
Способ получения имплантата заключается в том, что его иготавливают путем адгезии клеток стромального и лимфо-макрофагального ряда аутологичного костного мозга на поверхности аллогенного костного матрикса или губки из биодеградируемого материала, предварительно покрытых поли-L-орнитином с последующим их высушиванием при комнатной температуре и набуханием перед использованием в изотоническом растворе с рН 7,2-7,4, при этом адгезия осуществляется в течение 2 дней посредством культивирования клеток в питательной среде с 10%-ной бычьей эмбриональной сывороткой с добавлением в среду в качестве индукторов остеогенеза - инсулина, дексаметазона и β-глицерофосфата с последующей 24-часовой обработкой 5-азацитидином, сменой среды и дополнительным культивированием в течение 1-4 дней в среде без 5-азацитидина.The method of obtaining the implant is that it is implanted by adhesion of cells of the stromal and lympho-macrophage row of an autologous bone marrow on the surface of an allogeneic bone matrix or sponge from biodegradable material, previously coated with poly-L-ornithine, followed by drying at room temperature and swelling before use in an isotonic solution with a pH of 7.2-7.4, while adhesion is carried out for 2 days by culturing cells in a nutrient medium with 10% bovine embryo tional Serum supplemented with a medium as inducers of osteogenesis - insulin, dexamethasone and β-glycerophosphate, followed by 24-hour treatment with 5-azacytidine, and an additional change of the medium by culturing for 1-4 days in medium without 5-azacytidine.
Еще одним аспектом способа получения имплантата является то, что культивирование клеток осуществляют в течение 4-7 дней при 37°С путем их инкубации в атмосфере воздуха с 5% СO2 при 99%-ной влажности.Another aspect of the method of obtaining the implant is that the cells are cultured for 4-7 days at 37 ° C by incubation in air with 5% CO 2 at 99% humidity.
Преимущественно питательная среда содержит 0,4-0,8 мкМ инсулина, 10-15 нМ дексаметазона и 7,0 мМ β-глицерофосфата.Mostly the nutrient medium contains 0.4-0.8 μm insulin, 10-15 nM dexamethasone and 7.0 mm β-glycerophosphate.
Дополнительно питательная среда в качестве индуктора остеогенеза может содержать аскорбиновую кислоту в концентрации 0,2 мМ.Additionally, the nutrient medium as an osteogenesis inducer may contain ascorbic acid at a concentration of 0.2 mM.
Преимущественно обработку 5-азацитидином в течение 24 часов осуществляют в концентрации 3,0-10,0 мкМ.Advantageously, treatment with 5-azacytidine for 24 hours is carried out at a concentration of 3.0-10.0 μM.
Способ восстановления целостности кости заключается в том, что костный дефект заполняют реваскуляризованным аутотрансплантатом, представляющим собой часть здоровой кости с надкостницей или отсепарированную надкостницу в случае использования имплантата, представляющего собой аллогенный костный матрикс, выполненный в виде соломки (хвороста), а дистальные и проксимальные области дополнительно окутывают и уплотняют имплантатом, выполненным в виде губки из биодеградируемого материала.A method for restoring bone integrity is that a bone defect is filled with a revascularized autograft, which is part of a healthy bone with a periosteum or a separated periosteum in the case of using an implant, which is an allogeneic bone matrix made in the form of straws (brushwood), and the distal and proximal areas are additionally envelop and seal with an implant made in the form of a sponge from biodegradable material.
Примеры и осуществление изобретенияExamples and implementation of the invention
Пример 1. Получение клеточной культуры, содержащей клетки предшественники остеогенеза. Стандартный стерильный аллогенный костный матрикс, представляющий собой высушенную деминерализованную кость, полученную по способу [8], из Центрального научно-исследовательского института травматологии и ортопедии им. Н.Н. Приорова и стерильную губку из биодеградируемого материала (коллагена), полученного из Лужского завода “Белкозин”, пропитывают 0,01%-ным раствором поли-L-орнитина и высушивают в потоке стерильного воздуха до полного высыхания. За 24 часа до заселения костномозговыми клетками костный матрикс и губку стерильно замачивают в стандартном растворе Эрла или Хэнкса, содержащем 25 мМ HEPES, рН 7,2-7,4, при комнатной температуре.Example 1. Obtaining a cell culture containing cells precursors of osteogenesis. Standard sterile allogeneic bone matrix, which is a dried demineralized bone obtained by the method [8], from the Central Research Institute of Traumatology and Orthopedics. N.N. Priorova and a sterile sponge made of biodegradable material (collagen) obtained from the Luga plant “Belkozin” are impregnated with a 0.01% solution of poly-L-ornithine and dried in a stream of sterile air until completely dry. 24 hours before the colonization of bone marrow cells, the bone matrix and sponge are sterilely soaked in a standard Earle or Hanks solution containing 25 mM HEPES, pH 7.2-7.4, at room temperature.
Забор клеточного материала и его культивирование для получения клеток-предшественников остеогенеза. Под местным обезболиванием пунктируют подвздошную кость пациента и забирают костный мозг в объеме 40-150 мл в стерильную емкость с раствором Хэнкса, содержащим 200 мкг/мл гентамицин, 10,0 мкг/мл инсулин, 0,25 мкМ дексометазон, 250 ед/мл гепарина, за 4-7 дней до основного оперативного вмешательства. Суспензию клеток центрифугируют 5 мин при 1500 об/мин, осадок клеток ресуспендируют в лизирующем растворе (114 мМ NH4Cl; 7,5 мМ КНСО3; 100 мкМ EDTA) в соотношении 1:4 от исходного объема аспирата, в течение 5-10 мин и центрифугируют 3 мин при 1500 об/мин при комнатной температуре. Гемолизированный супернатант полностью удаляют отсасыванием. Добиваются полного лизиса эритроцитов, для чего процедуру лизирования проводят дважды или трижды с последующим отмыванием клеток центрифугированием. Клеточный осадок, свободный от эритроидных и тромбоцитарных форм, ресуспендируют в ростовой среде Искова, содержащей 0.58 г/л глютамина, 50 мкг/л гентамицина, 10% бычьей эмбриональной сыворотки, 0,4 мкМ инсулина, 10 нМ дексаметазона и 7,0 мМ β-глицерофосфата, в концентрации 3×105 кл/мл. Клетки костного мозга засевают в чашки Петри, которые могут быть покрыты коллагеном, поли-L-орнитином или поли-L-лизином, фибронектином или различными смесями матриксных белков, способствующих выживанию и адгезии стволовых мезенхимальных клеток из костного мозга. Адгезированные клетки в культуре пролиферируют и начинают дифференцироваться в остеогенном направлении, при наличии в культуре стволовых гематопоэтических клеток лимфо-макрофагального ряда. На третьи сутки инкубации в культуральную среду вносят 5-азацитидин в концентрации 3,0 мкМ. Через 24 часа среду заменяют на свежую, но без 5-азацитидина и инкубацию продолжают в течение 1-4 дней. Среда инкубации может дополнительно содержать 0,2 мМ аскорбиновой кислоты. Количество жизнеспособных клеток составляет не менее 95% и в концентрации не менее 4×104 кл/см2.The collection of cell material and its cultivation to obtain osteogenesis progenitor cells. Patient's ilium is punctured under local anesthesia and 40-150 ml of bone marrow is taken into a sterile container with Hanks solution containing 200 μg / ml gentamicin, 10.0 μg / ml insulin, 0.25 μM dexomethasone, 250 u / ml heparin , 4-7 days before the main surgical intervention. The cell suspension is centrifuged for 5 min at 1500 rpm, the cell pellet is resuspended in a lysis solution (114 mM NH 4 Cl; 7.5 mM KHCO 3 ; 100 μM EDTA) in a ratio of 1: 4 of the initial volume of aspirate, for 5-10 min and centrifuged for 3 min at 1500 rpm at room temperature. The hemolyzed supernatant is completely removed by suction. A complete lysis of red blood cells is achieved, for which the lysis procedure is carried out twice or thrice, followed by washing the cells by centrifugation. The cell pellet free of erythroid and platelet forms is resuspended in Iskov growth medium containing 0.58 g / L glutamine, 50 μg / L gentamicin, 10% bovine fetal serum, 0.4 μM insulin, 10 nM dexamethasone and 7.0 mm β -glycerophosphate, at a concentration of 3 × 10 5 cells / ml. Bone marrow cells are seeded in Petri dishes, which can be coated with collagen, poly-L-ornithine or poly-L-lysine, fibronectin, or various mixtures of matrix proteins that contribute to the survival and adhesion of stem mesenchymal cells from bone marrow. Adherent cells in the culture proliferate and begin to differentiate in the osteogenic direction, in the presence of lympho-macrophage stem cells in the culture of hematopoietic stem cells. On the third day of incubation, 5-azacytidine at a concentration of 3.0 μM was introduced into the culture medium. After 24 hours, the medium is replaced with fresh, but without 5-azacytidine, and incubation is continued for 1-4 days. The incubation medium may additionally contain 0.2 mm ascorbic acid. The number of viable cells is at least 95% and at a concentration of at least 4 × 10 4 cells / cm 2 .
Полученная культура клеток может использоваться или может пересеваться с использованием стандартной процедуры трипсинизации, и/или клеточная суспензия может быть криоконсервирована при -196°С в жидком азоте в среде для криоконсервирования, содержащей бычью эмбриональную сыворотку не менее 50% и 10%-ный диметилсульфоксид.The resulting cell culture can be used or can be reseeded using the standard trypsinization procedure, and / or the cell suspension can be cryopreserved at -196 ° C in liquid nitrogen in a cryopreservation medium containing at least 50% bovine fetal serum and 10% dimethyl sulfoxide.
Аналогичным способом может быть получена культура клеток из экспериментальных животных: крыс, кошек, кроликов, собак и морских свинок.In a similar way, a cell culture can be obtained from experimental animals: rats, cats, rabbits, dogs and guinea pigs.
Пример 2. Получение имплантата, обладающего остеогенной активностью.Example 2. Obtaining an implant having osteogenic activity.
Забор клеточного материала производят, как описано в примере 1.The sampling of the cellular material is carried out as described in example 1.
Клеточный осадок, свободный от эритроидных и тромбоцитарных форм, ресуспендируют в ростовой среде Искова, содержащей 0,58 г/л глютамина, 50 мкг/л гентамицина, 10% бычьей эмбриональной сыворотки, 0,8 мкМ инсулина, 15 нМ дексаметазона и 7,0 мМ β-глицерофосфата, в концентрации 3×105 кл/мл. Клетки костного мозга засевают в чашки Петри, в которых находятся подготовленные к адгезии клеток аллогенный костный матрикс и губка из биодеградируемого материала. На третьи сутки инкубации в питательную среду вносят 5-азацитидин до конечной концентрации 10 мкМ. Через 24 ч среду отбирают и заменяют на свежую того же состава, но без 5-азацитидина, и инкубируют 1-4 суток в асептических условиях, постоянно микроскопически контролируя жизнеспособность клеток. После чего считают трансплантат годным к применению. Перед использованием трансплантат промывают в растворе Хэнкса, содержащем 50 мкг/мл гентамицина, 0,8 мкМ инсулина, 15 нМ дексаметазона и 7,0 мМ β-глицерофосфата, для освобождения от бычьей эмбриональной сыворотки, и в этом свежем растворе при температуре 4-6°С доставляют в операционную и хранят 36 часов до применения. Полученный имплантат содержит не менее 4×104 клеток/см2 и 3×105 клеток/см3 губки.The cell pellet free of erythroid and platelet forms is resuspended in Iskov growth medium containing 0.58 g / L glutamine, 50 μg / L gentamicin, 10% bovine fetal serum, 0.8 μM insulin, 15 nM dexamethasone and 7.0 mM β-glycerophosphate, at a concentration of 3 × 10 5 cells / ml. Bone marrow cells are seeded in Petri dishes in which allogeneic bone matrix and a sponge from biodegradable material are prepared for cell adhesion. On the third day of incubation, 5-azacytidine is added to the nutrient medium to a final concentration of 10 μM. After 24 hours, the medium is selected and replaced with fresh of the same composition, but without 5-azacytidine, and incubated for 1-4 days under aseptic conditions, constantly microscopically monitoring cell viability. Then consider the transplant suitable for use. Before use, the graft is washed in a Hanks solution containing 50 μg / ml gentamicin, 0.8 μM insulin, 15 nM dexamethasone and 7.0 mm β-glycerophosphate, to release bovine fetal serum, and in this fresh solution at a temperature of 4-6 ° C delivered to the operating room and stored 36 hours before use. The resulting implant contains at least 4 × 10 4 cells / cm 2 and 3 × 10 5 cells / cm 3 sponges.
Аллогенный костный матрикс перед использованием нарезают в виде соломки (хвороста), имеющей среднее сечение 1,5-2,0 мм2 и длину 50-100 мм. Губку из биодеградируемого материала нарезают в виде пластин толщиной 1,5±0,5 мм, шириной 30±5 мм и длиной в зависимости от длины окружности места стыка имплантата и собственной кости пациента, см. фиг.1.Before use, the allogeneic bone matrix is cut into straws (brushwood) having an average cross section of 1.5-2.0 mm 2 and a length of 50-100 mm. A sponge of biodegradable material is cut in the form of plates 1.5 ± 0.5 mm thick, 30 ± 5 mm wide and length depending on the circumference of the junction of the implant and the patient’s own bone, see Fig. 1.
Пример 3. Использование полученного имплантата для восстановления целостности кости. При использовании костно-надкостничного реваскуляризированного аутотрансплантата, после включения в кровоток и определения проходимости анастомозов, а также адекватности кровообращения зоны костного соединения дистального и проксимального концов окутывают и уплотняют губкой из биодеградируемого материала с адгезированными на ней аутоклетками В случае заполнения зоны дефекта аллогенным костным матриксом в виде соломки (хвороста) с адгезированными на нем аутоклетками применяют отсепарированный надкостничный реваскуляризированный аутотрансплантат с использованием окутывания и уплотнения губкой, как и в случае с использованием костно-надкостничного реваскуляризированного аутотрансплантата.Example 3. The use of the obtained implant to restore bone integrity. When using a bone-periosteal revascularized autograft, after the anastomoses are included in the bloodstream and determine the patency of the anastomoses, as well as the adequacy of blood circulation, the areas of the bone connection of the distal and proximal ends are enveloped and densified with a sponge from biodegradable material with autocells adhered to it If the defective zone is filled with allogeneic bone straws (brushwood) with autocells adhered to it use a separated periosteal revascularized minutes using autograft Wrapping and sealing sponge, as in the case of using periosteal bone autograft revascularized.
Пластика дефекта выполнена после резекции бедренной кости по поводу саркомы, проведена на 6 больных, седьмой больной имел рецидив ложного сустава бедренной кости после многократных реконструктивных операций. Костная пластика дефектов костно-надкостничным реваскуляризированным аутотрансплантатом и надкостничным реваскуляризированным аутотрансплантатом была выполнена в размере от 5 до 20 см. Для контроля использовали клинические и рентгенологические методы исследования на различных сроках наблюдения. Во всех случаях отмечено полное приживление трансплантата. При этом формирование костной мозоли и восстановление функции конечности наступало в среднем на 1,5-3 месяца раньше, чем после пластики дефектов васкуляризованным аутотрансплантатом иалоберцовой кости или надкостницы без дополнительного применения имплантата с плюрипотентными стволовыми клетками аутологичного костного мозга, см фиг.2 Срок наблюдения 3 года без побочных эффектов.Plastic surgery of the defect was performed after resection of the femur due to sarcoma, was performed on 6 patients, the seventh patient had a recurrence of the false joint of the femur after repeated reconstructive operations. Bone grafting of defects with a bone-periosteal revascularized autograft and periosteal revascularized autograft was performed in a size of 5 to 20 cm. Clinical and radiological methods of investigation at different observation periods were used for control. In all cases, complete graft engraftment was noted. At the same time, bone marrow formation and restoration of limb function occurred on average 1.5-3 months earlier than after plasty of defects with a vascularized autograft of the tibia or periosteum without additional use of an implant with pluripotent stem cells of autologous bone marrow, see figure 2 Observation period 3 years without side effects.
Таким образом, представленное изобретение показало высокую эффективность имплантатов, заселенных аутологичными клетками стромального и лимфо-макрофагального ряда, при пластике обширных костных дефектов.Thus, the presented invention has shown high efficiency of implants populated by autologous cells of the stromal and lympho-macrophage series, with plastic surgery of extensive bone defects.
При этом применение указанной культуры клеток не может быть ограничено приведенными примерами, поскольку одним из преимуществ ее получения довольно короткий период культивирования 4-7 дней, что позволяет значительно сократить сроки подготовки имплантата к применению и возможность ее использования в пластике любых костных дефектов.Moreover, the use of the indicated cell culture cannot be limited by the given examples, since one of the advantages of its preparation is a rather short cultivation period of 4-7 days, which can significantly reduce the preparation time of the implant for use and the possibility of its use in the repair of any bone defects.
Источники информацииSources of information
1. Амирбекян В.Х. и др. Тезисы докл. Научной конференции, Ереван, 1978 г.1. Amirbekyan V.Kh. et al. Abstracts dokl. Scientific Conference, Yerevan, 1978
2. SU 1400616 A1, 07.06.19882.SU 1400616 A1, 07/07/1988
3. Долгушин И.И., Эберт Л.Я., Лифшиц Р.И. Иммунология травмы. Свердловск. Медицина, 1989, с.188.3. Dolgushin II, Ebert L.Ya., Lifshits R.I. Immunology of injury. Sverdlovsk. Medicine, 1989, p. 188.
4. RU 2167662 С1, 27.05.2001.4. RU 2167662 C1, 05.27.2001.
5. US 6152964, 28.11.2000.5. US 6152964, 11.28.2000.
6. WO 97/18842 А1, 29.05.1997.6. WO 97/18842 A1, 05/29/1997.
7. WO 97/40137 А1, 30.10.1997.7. WO 97/40137 A1, 10.30.1997.
8. RU 2147800 C1, 17.02.1999.8. RU 2147800 C1, 02.17.1999.
Claims (13)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2003104494/15A RU2240135C1 (en) | 2003-02-17 | 2003-02-17 | Cell culture comprising precursor cells of osteogenesis, implant based on thereof and its applying for recovery bone integrity |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2003104494/15A RU2240135C1 (en) | 2003-02-17 | 2003-02-17 | Cell culture comprising precursor cells of osteogenesis, implant based on thereof and its applying for recovery bone integrity |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2003104494A RU2003104494A (en) | 2004-08-20 |
| RU2240135C1 true RU2240135C1 (en) | 2004-11-20 |
Family
ID=34310406
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2003104494/15A RU2240135C1 (en) | 2003-02-17 | 2003-02-17 | Cell culture comprising precursor cells of osteogenesis, implant based on thereof and its applying for recovery bone integrity |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2240135C1 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2466408C1 (en) * | 2011-10-03 | 2012-11-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский научный центр "Восстановительная травматология и ортопедия" имени академика Г.А. Илизарова" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации | Method for assessing osteocyte involvement in bone matrix mineralisation |
| RU171990U1 (en) * | 2016-12-13 | 2017-06-23 | Александр Владимирович Колсанов | Individual reconstructive implant template |
| RU177734U1 (en) * | 2017-08-28 | 2018-03-06 | Александр Владимирович Колсанов | RECONSTRUCTIVE IMPLANT FROM LYOPHILIZED ALLOGENIC MATERIAL |
-
2003
- 2003-02-17 RU RU2003104494/15A patent/RU2240135C1/en not_active IP Right Cessation
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2466408C1 (en) * | 2011-10-03 | 2012-11-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский научный центр "Восстановительная травматология и ортопедия" имени академика Г.А. Илизарова" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации | Method for assessing osteocyte involvement in bone matrix mineralisation |
| RU171990U1 (en) * | 2016-12-13 | 2017-06-23 | Александр Владимирович Колсанов | Individual reconstructive implant template |
| RU177734U1 (en) * | 2017-08-28 | 2018-03-06 | Александр Владимирович Колсанов | RECONSTRUCTIVE IMPLANT FROM LYOPHILIZED ALLOGENIC MATERIAL |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2441994C (en) | Composition and methods for the production of biological tissues and tissue constructs | |
| US5904716A (en) | Method for reconstituting cartilage tissue using demineralized bone and product thereof | |
| ES2626567T3 (en) | Cells on a support matrix for tissue repair | |
| JP3808900B2 (en) | Biological material composed of a three-dimensional biocompatible and biodegradable matrix comprising an effective culture of bone marrow stem cells partially or fully differentiated into connective tissue cells and a hyaluronic acid derivative | |
| US6485723B1 (en) | Enhanced submucosal tissue graft constructs | |
| JP2858782B2 (en) | Production of articular cartilage and bone regenerating composition, skeletal tissue transplant, and method of regenerating skeletal tissue | |
| DeBruijn et al. | Bone induction by implants coated with cultured osteogenic bone marrow cells | |
| ES2676772T3 (en) | Tissue repair through the use of multipotent cells | |
| JPS59192364A (en) | Soft bone and repairing method thereof | |
| AU2002306835A1 (en) | Composition and Methods for the Production of Biological Tissues and Tissue Constructs | |
| JP2003510108A (en) | Biological joint structures | |
| CN102688524A (en) | Artificial cartilage containing chondrocytes obtained from costal cartilage and preparation process thereof | |
| WO2005011765A1 (en) | Method of constructing artificial joint | |
| US20040030404A1 (en) | Method for cultivating a cartilage replacement and a biomatrix produced according to this method | |
| AU766719B2 (en) | Enhanced submucosal tissue graft constructs | |
| CA2522246C (en) | Method of producing chondrocytes for transplantation | |
| CN107376025B (en) | Preparation method and application of cell-scaffold composite material for cartilage injury repair | |
| Mendes et al. | A cultured living bone equivalent enhances bone formation when compared to a cell seeding approach | |
| JP4763960B2 (en) | Human chondrocyte culture method | |
| RU2240135C1 (en) | Cell culture comprising precursor cells of osteogenesis, implant based on thereof and its applying for recovery bone integrity | |
| US20240091407A1 (en) | Cartilage tissue engineering complex and use thereof | |
| US20150344847A1 (en) | Method For Production Of Large Numbers Of Cartilage Cells With Phenotype Retention | |
| RU2167662C1 (en) | Method and graft for restoring bone integrity | |
| Gürpinar et al. | In vitro investigation of cell compatibility of pure β-TCP granules | |
| JP2003180819A (en) | Material for transplant and cellular retention carrier |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20050218 |