RU2234217C1

RU2234217C1 - Method for structural stabilization of biotissues

Info

Publication number: RU2234217C1
Application number: RU2004101381/15A
Authority: RU
Inventors: В.И. Гавриленков (RU); В.И. Гавриленков; Д.В. Маслевцов (RU); Д.В. Маслевцов
Priority date: 2003-12-31
Filing date: 2003-12-31
Publication date: 2004-08-20

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: the innovation deals with the methods of structural stabilization of biotissues used for prosthetics and plasty in case of correction of valvular heart failure. Biotissues should be treated with solution containing diglycidyl ether of ethylene glycol at concentration of 1-1.8% and, additionally, monoglycidyl ether of ethylene glycol at 1-1.8% concentration at pH being 8.6-9.0 Treatment of biotissues in solution flow additionally exceeds their biomechanical and hydrodynamic properties. The method enables to achieve the desired proteolytic resistance of biotissues in more shortened period of time and improve their functional characteristics.

EFFECT: higher efficiency of stabilization.

3 dwg, 2 tbl

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к способам структурной стабилизации биотканей для протезирования и пластики, преимущественно при изготовлении ксеногенных биологических протезов клапанов сердца, используемых в клинической практике для коррекции клапанных пороков сердца.The invention relates to medicine, namely to methods for structural stabilization of biological tissues for prosthetics and plastics, mainly in the manufacture of xenogenic biological prosthetic heart valves, used in clinical practice for the correction of valvular heart defects.

Структурная стабилизация биопротезов производится с целью получения биологической инертности их ткани (устранения иммуногенности и обеспечения устойчивости к ферментативному лизису). Это достигается путем химической обработки биоткани веществами, способными образовывать прочные поперечные связи с молекулами коллагена.Structural stabilization of bioprostheses is carried out with the aim of obtaining biological inertness of their tissue (eliminating immunogenicity and ensuring resistance to enzymatic lysis). This is achieved by chemical treatment of biological tissue with substances capable of forming strong cross-links with collagen molecules.

Известен способ структурной стабилизации биотканей, включающий обработку глутаральдегидом (CarpentierA., Lemaigre G., Robert L. et al. Biological factors affecting long-term results of valvular heterografts // J. Thorac. Cardiovasc. Surg. -1969. - Vol. 58, N 4. - P. 467-483). Данный химический агент обеспечивает стерильность, существенно повышает механическую прочность ткани биопротеза и устойчивость к действию протеолитических ферментов. Однако глутаральдегид изменяет физико-химические и механические свойства биотканей. Потеря гидрофильных свойств и девитализация клеток ксеноткани провоцируют образование центров дистрофической кальцификации. Изменение вязкоупругих свойств ткани ксенографта под воздействием глутаральдегида приводит к ухудшению в целом макробиомеханики биопротеза и образованию стресс-деформаций преимущественно в области комиссур (особенно при наличии стента), что также провоцирует развитие локусов тканевой дегенерации и кальцификации. Свободные остатки глутаральдегида, обладающие цитотоксическим воздействием на окружающие ткани больного, усугубляют дистрофическую кальцификацию.A known method of structural stabilization of biological tissues, including treatment with glutaraldehyde (Carpentier A., Lemaigre G., Robert L. et al. Biological factors affecting long-term results of valvular heterografts // J. Thorac. Cardiovasc. Surg. -1969. - Vol. 58. , N 4. - P. 467-483). This chemical agent provides sterility, significantly increases the mechanical strength of the bioprosthesis tissue and resistance to proteolytic enzymes. However, glutaraldehyde alters the physicochemical and mechanical properties of biological tissues. Loss of hydrophilic properties and devitalization of xenotissue cells provoke the formation of dystrophic calcification centers. Changes in the viscoelastic properties of xenograft tissue under the influence of glutaraldehyde lead to a general deterioration in the macrobiomechanics of the bioprosthesis and the formation of stress deformations mainly in the area of commissures (especially in the presence of a stent), which also provokes the development of tissue degeneration and calcification loci. Free glutaraldehyde residues, which have a cytotoxic effect on the surrounding tissues of the patient, exacerbate dystrophic calcification.

Известен способ консервирования биоткани для протезирования клапанов сердца и сосудов 2-5% раствором диглицидилового эфира этиленгликоля в течение 21 суток (патент РФ №2008767) с целью подавления процессов кальцификации и дополнительной фиксации гепарина с целью повышения резистентности к тромбообразованию. Биоткани, стабилизированные эпоксидами, обладают лучшими вязкоупругими свойствами по сравнению с тканями, обработанными глутаральдегидом. Данный способ принят авторами за прототип.A known method of preserving biological tissue for prosthetics of the heart and blood vessels with a 2-5% solution of diglycidyl ether of ethylene glycol for 21 days (RF patent No. 20078767) in order to suppress calcification processes and additional fixation of heparin in order to increase resistance to thrombosis. Epoxy-stabilized biotissues have better viscoelastic properties than those treated with glutaraldehyde. This method is adopted by the authors for the prototype.

К недостаткам прототипа следует отнести невысокие биомеханические и гидродинамические характеристики биопротезов, а также большое время (21 сутки) обработки биоткани.The disadvantages of the prototype include the low biomechanical and hydrodynamic characteristics of bioprostheses, as well as the long time (21 days) of processing biological tissue.

Задачей изобретения является улучшение биомеханических и гидродинамических характеристик биопротезов при сохранении необходимой протеолитической устойчивости биологической ткани и сокращение времени обработки.The objective of the invention is to improve the biomechanical and hydrodynamic characteristics of bioprostheses while maintaining the necessary proteolytic stability of biological tissue and reduce processing time.

Поставленная задача решается тем, что в известном способе структурной стабилизации биотканей, включающем обработку диглицидиловым эфиром этиленгликоля, согласно изобретению обработку осуществляют раствором, содержащим диглицидиловый эфир этиленгликоля (ДЭ) в концентрации 1-1,8% и дополнительно моноглицидиловый эфир этиленгликоля (МЭ) в концентрации 1-1,8% при рН 8,6-9,0.The problem is solved in that in the known method of structural stabilization of biological tissues, including treatment with diglycidyl ether of ethylene glycol, according to the invention, the processing is carried out with a solution containing diglycidyl ether of ethylene glycol (DE) in a concentration of 1-1.8% and additionally monoglycidyl ether of ethylene glycol (ME) in a concentration 1-1.8% at a pH of 8.6-9.0.

Структурная стабилизация биотканей в потоке раствора дополнительно повышает их биомеханические и гидродинамические свойства.Structural stabilization of biological tissues in a solution stream additionally increases their biomechanical and hydrodynamic properties.

На фиг.1 изображена диаграмма показателей фиксации и стабилизации биотканей при различных режимах обработки; на фиг.2 - графики изменения показателя фиксации биоткани при различных рН раствора; на фиг.3 - графики изменения показателя стабилизации биоткани при различных рН раствора.Figure 1 shows a diagram of the indicators of fixation and stabilization of biological tissues under various processing conditions; figure 2 - graphs of changes in the rate of fixation of biological tissue at different pH of the solution; figure 3 - graphs of changes in the stabilization rate of biological tissue at different pH of the solution.

Способ осуществляют, например, следующим образом.The method is carried out, for example, as follows.

Очищенный и отмытый ксеногенный клапанно-аортальный комплекс погружают в раствор, содержащий диглицидиловый эфир этиленгликоля в концентрации 1-1,8% и моноглицидиловый эфир этиленгликоля в концентрации 1-1,8% при рН 8,6-9,0 (трис-HCl буфер, 0.05 М). Соотношение массы биоткани к массе раствора должно составлять 1:15-30. Время обработки - 48 часов.The purified and washed xenogenic valve-aortic complex is immersed in a solution containing ethylene glycol diglycidyl ether at a concentration of 1-1.8% and ethylene glycol monoglycidyl ether at a concentration of 1-1.8% at pH 8.6-9.0 (Tris-HCl buffer , 0.05 M). The ratio of the mass of biological tissue to the mass of the solution should be 1: 15-30. Processing time - 48 hours.

Для придания более высоких биомеханических и гидродинамических свойств обработку ведут в динамическом режиме - раствор подают потоком постоянного характера с малоамплитудной переменной составляющей.To give higher biomechanical and hydrodynamic properties, the treatment is carried out in a dynamic mode - the solution is supplied by a constant flow with a low-amplitude variable component.

Аналогичным образом могут быть подготовлены для протезирования биоткани сосудов, ксеноперикарда, сухожилий и прочие.Similarly, they can be prepared for prosthetics of blood vessels, xenopericardium, tendons and others.

По предложенному способу была проведена обработка 65 образцов: 15 корней аорты и 50 створок (5 групп). В качестве контроля были взяты 25 образцов: 5 корней аорты и 20 створок (2 группы), обработка которых была проведена по прототипу.According to the proposed method, 65 samples were processed: 15 aortic roots and 50 valves (5 groups). As a control, 25 samples were taken: 5 roots of the aorta and 20 valves (2 groups), the processing of which was carried out according to the prototype.

Для определения степени фиксации биоткани использовали нингидриновую реакцию надосадочной жидкости после гидролиза обработанных и нативных образцов. Оптическую плотность раствора определяли спектрофотометрически при длине волны 750 нм. По разнице экстинкции нативных (E_nativ) и фиксированных (E_fix) образцов одного корня аорты рассчитывали индекс фиксации (FI) ксеноаортальной ткани по формуле: FI=(E_nativ-E_fix)/E_nativx100% (Sung HW, Hsu CS, Lee YS. et al. Crosslinking characteristics of an epoxy-fixed porcine tendon: Effects of pH, temperature, and fixative concentration // J. Biomed. Mater. Res. -1996. - Vol. 31, N 4. - P. 511-518). Рассчитанный таким образом индекс FI отражает количество защищенных боковых цепей лизина и гидроксилизина коллагена фиксированной ткани.To determine the degree of fixation of the biological tissue, the ninhydrin reaction of the supernatant was used after hydrolysis of the treated and native samples. The optical density of the solution was determined spectrophotometrically at a wavelength of 750 nm. Based on the difference in extinction of native (E _nativ ) and fixed (E _fix ) samples of one aortic root, the fixation index (FI) of xeno-aortic tissue was calculated using the formula: FI = ( _Enativ- E _fix ) / E _nativx 100% (Sung HW, Hsu CS, Lee YS. Et al. Crosslinking characteristics of an epoxy-fixed porcine tendon: Effects of pH, temperature, and fixative concentration // J. Biomed. Mater. Res. -1996. - Vol. 31, N 4. - P. 511 -518). The FI index calculated in this way reflects the number of protected side chains of lysine and collagen hydroxylisine in fixed tissue.

Процесс структурной стабилизации коллагена полиэпоксидами заключается преимущественно в образовании поперечных связей, препятствующих ферментативному гидролизу. Для определения степени структурной стабилизации ксеноаортальной ткани использовали весовой анализ. Для этого образцы ткани отмывали, лиофилизировали и взвешивали дважды, до и после обработки коллагеназой. По разнице потерь массы нативных (Δ m_nativ) и стабилизированных (Δ m_stab) образцов рассчитывали индекс стабилизации (81) по формуле: SI=(Δ m_nativ-Δ m_stab)/Δ m_nativ× 100%. Таким образом, SI отражает плотность поперечных сшивок.The process of structural stabilization of collagen by polyepoxides consists mainly in the formation of cross-links that inhibit enzymatic hydrolysis. A weight analysis was used to determine the degree of structural stabilization of xeno-aortic tissue. For this, tissue samples were washed, lyophilized and weighed twice, before and after collagenase treatment. _{Using the} difference between the mass losses of the native (Δ m _nativ ) and stabilized (Δ m _stab ) samples, the stabilization index (81) was calculated using the formula: SI = (Δ m _nativ -Δ m _stab ) / Δ m _nativ × 100%. Thus, SI reflects the density of cross-linking.

Результаты исследований представлены в таблице 1 и на диаграмме (фиг.1).The research results are presented in table 1 and in the diagram (figure 1).

Из полученных данных следует, что использование предложенных режимов обработки образцов (3-7 группы) позволило достичь за 48 часов высокой степени структурной стабилизации (SI=91-96%) и фиксации (FI=96-99%) биоткани, сравнимой с результатами, полученными по прототипу (1 и 2 группы).From the data obtained it follows that the use of the proposed modes of processing samples (3-7 groups) made it possible to achieve a high degree of structural stabilization (SI = 91-96%) and fixation (FI = 96-99%) of biological tissue in 48 hours, comparable with the results obtained by the prototype (1 and 2 groups).

При анализе влияния рН раствора на скорость структурирования ткани (фиг.2 и 3) было выявлено, что в нейтральном растворе (рН 7,4) фиксация и стабилизация материала происходит с одинаковой скоростью и достигает максимальных значений на 4-5 сутки. В щелочном растворе (рН 8,6-9,0) максимальная фиксация и стабилизация наступает раньше - в 1-2 сутки. Обработка биоткани в растворе с рН 10,2 приводила к максимальной стабилизации коллагена в среднем через 12 часов, однако в дальнейшем было отмечено снижение степени стабилизации ткани, объясняемое частичной денатурацией белка под воздействием высокощелочной среды.When analyzing the effect of the pH of the solution on the rate of tissue structuring (Figs. 2 and 3), it was revealed that in a neutral solution (pH 7.4), the fixation and stabilization of the material occurs at the same speed and reaches maximum values for 4-5 days. In an alkaline solution (pH 8.6-9.0), maximum fixation and stabilization occurs earlier - in 1-2 days. Processing of biological tissue in a solution with a pH of 10.2 led to maximum stabilization of collagen on average after 12 hours, however, a decrease in the degree of stabilization of the tissue, due to partial protein denaturation under the influence of a highly alkaline medium, was further noted.

Оценку функциональных характеристик ксеноаортальных клапанов, стабилизированных по патентуемому способу, и клапанов, стабилизированных по прототипу, производили по данным стендовых исследований. Характеристики основных макробиомеханических и безразмерных гидродинамических показателей двух сравниваемых групп клапанов представлены в таблице 2.Evaluation of the functional characteristics of xeno-aortic valves stabilized by the patented method, and valves stabilized by the prototype, was performed according to bench studies. The characteristics of the main macrobiomechanical and dimensionless hydrodynamic indicators of the two compared valve groups are presented in table 2.

Представленные результаты свидетельствуют, что предлагаемый способ обработки ксеногенных клапанов позволяет получить биоклапаны с высокими функциональными характеристиками, близкими к характеристикам нативных ксеноклапанов.The presented results indicate that the proposed method for processing xenogenic valves allows you to get bioplastic with high functional characteristics close to the characteristics of native xenoplastic valves.

Использование предложенного способа позволяет достигнуть необходимой протеолитической устойчивости биологической ткани биоклапанов и улучшить их функциональные характеристики.Using the proposed method allows to achieve the necessary proteolytic stability of the biological tissue of biological valves and improve their functional characteristics.

Claims

1. The method of structural stabilization of biological tissues used for prosthetics and plastics for the correction of valvular heart defects, comprising treating with ethylene glycol diglycidyl ether, characterized in that the treatment is carried out with a solution containing ethylene glycol diglycidyl ether in a concentration of 1-1.8% and additionally ethylene glycol monoglycidyl ether in concentrations of 1-1.8% at pH 8.6-9.0.

2. The method according to claim 1, characterized in that the treatment is carried out in a solution stream.