RU2233327C2 - Biocatalyst and method for its preparing - Google Patents
Biocatalyst and method for its preparing Download PDFInfo
- Publication number
- RU2233327C2 RU2233327C2 RU2002122032/13A RU2002122032A RU2233327C2 RU 2233327 C2 RU2233327 C2 RU 2233327C2 RU 2002122032/13 A RU2002122032/13 A RU 2002122032/13A RU 2002122032 A RU2002122032 A RU 2002122032A RU 2233327 C2 RU2233327 C2 RU 2233327C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- enzyme
- biocatalyst
- enzymes
- preparation
- gel
- Prior art date
Links
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к способу получения иммобилизованных биокатализаторов на основе ферментов, включенных в матрицу гелевого носителя, которые способны осуществлять энзиматическую трансформацию соответствующих субстратов в периодических или непрерывных режимах.The invention relates to biotechnology, specifically to a method for producing immobilized biocatalysts based on enzymes included in a matrix of gel media, which are capable of carrying out enzymatic transformation of the corresponding substrates in batch or continuous modes.
Известно, что иммобилизация ферментов позволяет значительно повысить технологичность их применения, прежде всего из-за возможности перехода от одноразового к многократному использованию биокатализаторов [Иммобилизованные клетки и ферменты. // Под ред. Дж.Вудорда, пер. с англ. М.: Мир, 1988, с.12-29]. При этом одним из наиболее эффективных приемов иммобилизации ферментов является их включение в матрицу различных полимерных гелей за счет физического захвата или химического присоединения [Березин И.В., Клячко Н.Л., Левашов Ф.В., Мартинек К., Можаев В.В., Хмельницкий Ю.Л. Иммобилизованные ферменты. - М.: Высшая школа, 1987, с.47-96].It is known that the immobilization of enzymes can significantly improve the manufacturability of their use, primarily because of the possibility of the transition from single to multiple use of biocatalysts [Immobilized cells and enzymes. // Ed. J. Woodord, trans. from English M.: Mir, 1988, pp. 12-29]. In this case, one of the most effective methods of immobilizing enzymes is their inclusion in the matrix of various polymer gels due to physical capture or chemical addition [Berezin IV, Klyachko NL, Levashov F.V., Martinek K., Mozhaev V. V., Khmelnitsky Yu.L. Immobilized enzymes. - M.: Higher School, 1987, p. 47-96].
Известен биокатализатор, представляющий собой фермент липазу, физически включенную в частицы высококонцентрированного 30-50% желатинового геля [US Pat. №6280983 (1999) Enzyme immobilization in a gel containing 30 to 50 percent gelatin]. Способ получения этого биокатализатора предусматривает приготовление смеси водорастворимого фермента, желатина и воды при соотношении 8,8-88 мг липазы на 1,4 г желатина и 1,8 г воды (т.е. концентрация фермента находится в пределах от 0,275 до 2,75 мас.%), нагревание смеси до температуры, при которой растворяется желатин (обычно это температуры выше 40-50°С), а затем охлаждение полученного раствора ниже температуры гелеобразования желатина (от 30 до 5°С) и механическое измельчение полученного геля для получения частиц биокатализатора. Этот биокатализатор обладает липазной активностью и может быть использован в реакциях переэтерификации триглицеридов. Несмотря на простоту приготовления подобного биокатализатора, данное техническое решение имеет ряд недостатков:Known biocatalyst, which is a lipase enzyme, physically incorporated into the particles of a highly concentrated 30-50% gelatin gel [US Pat. No. 6280983 (1999) Enzyme immobilization in a gel containing 30 to 50 percent gelatin]. A method for producing this biocatalyst involves preparing a mixture of a water-soluble enzyme, gelatin and water in a ratio of 8.8-88 mg of lipase per 1.4 g of gelatin and 1.8 g of water (i.e., the concentration of the enzyme is in the range from 0.275 to 2.75 wt.%), heating the mixture to a temperature at which gelatin dissolves (usually temperatures above 40-50 ° C), and then cooling the resulting solution below the gelation temperature of gelatin (30 to 5 ° C) and mechanical grinding of the obtained gel to obtain particles of biocatalyst. This biocatalyst has lipase activity and can be used in transesterification of triglycerides. Despite the simplicity of the preparation of such a biocatalyst, this technical solution has several disadvantages:
а) Получение биокатализаторов такого типа ограничено только термостабильными ферментами, поскольку сначала необходимо нагревать смесь фермента с гелеобразователем - желатином для получения исходного раствора, желируюшего при последующем охлаждении; чувствительные же к нафеванию ферменты в этих условиях инактивируются.a) Obtaining biocatalysts of this type is limited only by thermostable enzymes, since it is first necessary to heat the mixture of the enzyme with a gelling agent - gelatin to obtain the initial solution, gelling during subsequent cooling; susceptible to frosting enzymes under these conditions are inactivated.
б) С другой стороны, такой биокатализатор нельзя использовать при повышенных температурах из-за недостаточной термостабильности желатинового геля, который выше ~40°С расплавляется.b) On the other hand, such a biocatalyst cannot be used at elevated temperatures due to the insufficient thermal stability of the gelatin gel, which melts above ~ 40 ° C.
в) Кроме того, так нельзя иммобилизовать протеолитические ферменты, которые гидролизуют сам белковый носитель, т.е. нарушают целостность биокатализатора.c) In addition, it is impossible to immobilize proteolytic enzymes that hydrolyze the protein carrier itself, i.e. violate the integrity of the biocatalyst.
г) И, наконец, биокатализатор, сформированный по данному способу, является очень хрупким, т.е. его нельзя использовать с реакторах с интенсивным перемешиванием.d) And finally, the biocatalyst formed by this method is very fragile, i.e. it cannot be used with intensively stirred reactors.
Известен биокатализатор и способ его получения [US Pat. №6303290 (2001) Encapsulation of biomatenals in porous glass-like matrices prepared via an aqueous colloidal sol-gel process], когда фермент (например, цитохром С, каталаза, рибонуклеаза и др.) физически включен в матрицу носителя - неорганический гель - силикагель. Данный биокатализатор получают путем смешения золя кремниевой кислоты с раствором фермента при рН от 6,2 до 8,2 и поддержанием необходимой ионной силы среды добавлением соли (например, NaCl) с последующим формованием системы и превращением золя в гель, который далее высушивают при температуре около 4°С. В зависимости от режима сушки получают материал с порами в диапазоне от 1 до 100 нм.Known biocatalyst and method thereof [US Pat. No. 6303290 (2001) Encapsulation of biomatenals in porous glass-like matrices prepared via an aqueous colloidal sol-gel process], when the enzyme (for example, cytochrome C, catalase, ribonuclease, etc.) is physically included in the carrier matrix — inorganic gel — silica gel . This biocatalyst is obtained by mixing a silicic acid sol with an enzyme solution at a pH of 6.2 to 8.2 and maintaining the necessary ionic strength of the medium by adding salt (for example, NaCl), followed by molding of the system and turning the sol into a gel, which is then dried at a temperature of 4 ° C. Depending on the drying mode, a material with pores in the range from 1 to 100 nm is obtained.
Недостатками этого технического решения являются:The disadvantages of this technical solution are:
а) Несмотря на высокую статическую механическую прочность матрицы неорганического носителя, он является очень хрупким материалом, легко подвергаемым абразивной эрозии в реакторах с перемешиванием.a) Despite the high static mechanical strength of the matrix of the inorganic carrier, it is a very brittle material that is easily subjected to abrasive erosion in stirred reactors.
б) Кремнеземные матрицы гидролитически нестабильны при щелочных значениях рН, т.е. соответствующий биокатализатор постепенно растворяется даже в слабощелочных средах, теряя свои эксплуатационные характеристики.b) Silica matrices are hydrolytically unstable at alkaline pH values, i.e. the corresponding biocatalyst gradually dissolves even in slightly alkaline environments, losing its performance characteristics.
в) Силикагели обладают выраженными адсорбционными свойствами, что приводит к нежелательным эффектам неспецифической сорбции субстратов или продуктов ферментативных реакций материалом носителя.c) Silica gels have pronounced adsorption properties, which leads to undesirable effects of non-specific sorption of substrates or products of enzymatic reactions with a carrier material.
Известен биокатализатор и способ его получения, когда иммобилизованный включением в гелевый носитель фермент - пенициллин-G-ацилаза - еще дополнительно связывается с полимерной матрицей химически [WO №04086 (1997) Penicillin G acylase immobilized with a cross-linked mixture of gelled gelatin and amino polymer]. Согласно этому техническому решению при включении указанного фермента в матрицу желатинового геля в исходный горячий (примерно 50°С) раствор, используемый для приготовления носителя, кроме желатина и фермента еще дополнительно вносятся аминосодержащий водорастворимый полимер (например, хитозан или полиэтиленимин) и химический сшиватель (например, глутаровый альдегид). В результате после охлаждения и завершения химической реакции получается ферментсодержащий смешанный желатинхитозановый гель, поперечно-сшитый альдиминовыми ковалентными связями. Такой биокатализатор проявляет высокую стабильность и синтазную активность при получении полусинтетических пенициллинов.A biocatalyst and a method for its preparation are known when the enzyme immobilized by incorporation into a gel carrier, penicillin-G-acylase, is further chemically bound to the polymer matrix [WO No. 04086 (1997) Penicillin G acylase immobilized with a cross-linked mixture of gelled gelatin and amino polymer]. According to this technical solution, when the specified enzyme is included in the gelatin gel matrix in the initial hot (about 50 ° C) solution used to prepare the carrier, in addition to gelatin and the enzyme, an additional amine-containing water-soluble polymer (for example, chitosan or polyethyleneimine) and a chemical crosslinker (for example glutaraldehyde). As a result, after cooling and completion of the chemical reaction, an enzyme-containing mixed gelatin chitosan gel is obtained, cross-linked with aldimine covalent bonds. Such a biocatalyst exhibits high stability and synthase activity in the preparation of semi-synthetic penicillins.
Недостатки этого технического решения:The disadvantages of this technical solution:
а) Подобного типа биокатализаторы имеют весьма ограниченное применение, т.к. лишь очень немногие ферменты выдерживают такое сочетание неблагоприятных факторов как нагревание и присутствие глутарового альдегида.a) This type of biocatalysts have very limited use, because only very few enzymes withstand such a combination of adverse factors as heating and the presence of glutaraldehyde.
б) Сшитый желатиновый гель обладает хрупкостью и быстро истирается в реакторах с интенсивным перемешиванием.b) Crosslinked gelatin gel is brittle and quickly attrition in reactors with vigorous stirring.
в) В случае образования осадка продукта энзиматической реакции (что часто имеет место даже при умеренных концентрациях таких полусинтетических пенициллинов, как бензилпенициллин) его растущие кристаллы разрушают (разрывают) сшитый гелевый носитель из-за микропористой структуры и недостаточной эластичности такого геля.c) In the case of the formation of a precipitate of the product of an enzymatic reaction (which often takes place even at moderate concentrations of semisynthetic penicillins such as benzylpenicillin), its growing crystals destroy (tear) the crosslinked gel carrier due to the microporous structure and insufficient elasticity of such a gel.
Известен биокатализатор [Yu.N.Belokon’, К.A.Kochetkov., F.M.Plieva, N.S.Ikonnikov, V.I.Maleev, V.S.Parmar, R.Kumar, V.I.Lozinsky. Enantioselective hydrolysis of a Schiff's base of D, L-phenylalanine ethyl ester in water-poor media through the reaction catalyzed with α-chymotrypsin immobilyzed in hydrophilic macroporous gel support. // Appl. Biochem.Biotechnol., 88 (1-3), 97-106 (2000)], в котором этот недостаток преодолен. Биокатализатор представляет собой фермент α-химитрипсин, ковалентно присоединенный к эластичному макропористому носителю - криогелю поливинилового спирта (ПВС) [Лозинский В.И. Криотропное гелеобразование растворов поливинилового спирта. // Усп.химии, 67 (7), 641-655 (1998)]. В случае использования такого биокатализатора в энзиматической реакции стереоспецифического гидролиза этилового эфира рацемического фенилаланина, проводимого в среде с низким содержанием воды, образующийся продукт - Л-фенилаланин выпадает в осадок, но его кристаллы не разрушают биокатализатор, т.к. матрица носителя является макропористой, т.е. имеется свободное пространство для роста кристаллов. Способ получения такого биокатализатора включает три основных стадии: формирование гелевого носителя, введение в его структуру реакционноспособных группировок (в частности, альдегидных групп, что осуществляется обработкой гранул геля 5-15% водным раствором глутарового альдегида при рН 1) и ковалентное присоединение фермента к активированной матрице.The known biocatalyst [Yu.N. Belokon ’, K.A. Kochetkov., F.M. Plieva, N.S. Ikonnikov, V.I. Malev, V.S. Parmar, R. Kumar, V.I. Lozinsky. Enantioselective hydrolysis of a Schiff's base of D, L-phenylalanine ethyl ester in water-poor media through the reaction catalyzed with α-chymotrypsin immobilyzed in hydrophilic macroporous gel support. // Appl. Biochem. Biotechnol., 88 (1-3), 97-106 (2000)], in which this disadvantage is overcome. The biocatalyst is an enzyme α-chymitrypsin covalently attached to an elastic macroporous carrier - polyvinyl alcohol (PVA) cryogel [Lozinsky V.I. Cryotropic gelation of solutions of polyvinyl alcohol. // Usp. Chemistry, 67 (7), 641-655 (1998)]. In the case of using such a biocatalyst in the enzymatic reaction of stereospecific hydrolysis of racemic phenylalanine ethyl ester, carried out in a medium with a low water content, the resulting product - L-phenylalanine precipitates, but its crystals do not destroy the biocatalyst, because the carrier matrix is macroporous, i.e. there is free space for crystal growth. The method for producing such a biocatalyst includes three main stages: the formation of a gel carrier, the introduction of reactive groups (in particular, aldehyde groups, which is carried out by treating the gel granules with a 5-15% aqueous solution of glutaraldehyde at pH 1) and covalent attachment of the enzyme to the activated matrix .
Недостатком этого технического решения является довольно низкое содержание фермента - не более 5-10 мг белка на 1 г влажного биокатализатора, т.е. в процентном отношении емкость системы по активному началу составляет лишь 0,5-1,0 мас.%.The disadvantage of this technical solution is the rather low content of the enzyme - not more than 5-10 mg of protein per 1 g of wet biocatalyst, i.e. in percentage terms, the capacity of the system for the active principle is only 0.5-1.0 wt.%.
Известен биокатализатор, у которого матрица полимерного носителя также готовится из ПВС [H.Groeger, E.Capan, A.Barthuber, K.-D.Vorlop. Asymmetric synthesis of an (R)-cyanohydrin using enzymes entrapped in lens-shaped gels. // Organic Letters, 3 (13), 1969-1972 (2001): методика получения биокатализатора описана в дополнительных материалах к статье, имеющихся в открытом доступе на интернет-сайте данного журнала: http://pubs.acs.org]. Этот биокатализатор представляет собой фермент (R)-оксинитрилазу, ковалентный конъюгат которой с хитозаном физически включен в матрицу геля ПВС (так называемый LentiKat® gel).A biocatalyst is known in which the matrix of the polymer carrier is also prepared from PVA [H. Groeger, E. Capan, A. Barthuber, K.-D. Vorlop. Asymmetric synthesis of an (R) -cyanohydrin using enzymes entrapped in lens-shaped gels. // Organic Letters, 3 (13), 1969-1972 (2001): the procedure for obtaining the biocatalyst is described in additional materials to the article, available on the public website of this journal: http://pubs.acs.org]. This biocatalyst is an (R) -oxynitrile enzyme whose covalent conjugate with chitosan is physically incorporated into the PVA gel matrix (the so-called LentiKat® gel).
Способ получения этого биокатализатора состоит из следующих стадий:The method of obtaining this biocatalyst consists of the following stages:
а) Сначала получают сшитый конъюгат фермента с полиаминосахаридом - хитозаном, для чего 1,5 г хитозана растворяют в 98,5 г 0,5%-ной водной уксусной кислоты, после чего с помощью 1 М раствора NaOH доводят рН раствора до 5,5. К 4,0 г полученного раствора прибавляют при перемешивании 7,9 г водного раствора ферментного препарата с концентрацией белка 7,6 мг/мл и удельной оксинитрилазной активностью 13,6 ед./мг белка, куда после перемешивания прибавляют 0,2 мл 50%-ного водного раствора глутарового альдегида. Затем перемешивают реакционную массу при 4°С в течение 16 ч. Сенергированную жидкость отделяют центрифугированием и получают сшитый конъюгат (R)-оксинитрилазы с хитозаном. Этот препарат содержит около 30 мг белка (или примерно 408 единиц ферментативной активности) на 1 г общего веса.a) First, a cross-linked conjugate of the enzyme with a polyaminosaccharide - chitosan is obtained, for which 1.5 g of chitosan is dissolved in 98.5 g of 0.5% aqueous acetic acid, after which the pH of the solution is adjusted to 5.5 with a 1 M NaOH solution . To 4.0 g of the resulting solution, 7.9 g of an aqueous solution of the enzyme preparation with a protein concentration of 7.6 mg / ml and specific hydroxy nitrilase activity of 13.6 units / mg of protein is added with stirring, where 0.2 ml of 50% are added after mixing aqueous solution of glutaraldehyde. Then the reaction mixture was stirred at 4 ° C for 16 hours. The senergated liquid was separated by centrifugation to obtain a crosslinked conjugate of (R) -oxynitrile with chitosan. This preparation contains about 30 mg of protein (or approximately 408 units of enzymatic activity) per 1 g of total weight.
б) Далее проводят операцию включения полученного конъюгата в гель поливинилового спирта, для чего 2,07 г конъюгата смешивают с 7,9 г воды и 74 г раствора ПВС (общий вес раствора ~84 г, т.е. концентрация белка в нем составляет около 0,7 мг/мл или 0,07%), а затем наносят по каплям раствор полученной смеси на металлическую плиту, где за счет подсыхания на воздухе и протекающего при этом желирования ПВС каждая капля превращается в небольшую линзочку толщиной около 0,5 мм и диаметром от 3 до 5 мм (определяется степенью дегидратации при сушке). В принципе, каждую такую частицу можно рассматривать как маленькую полимерную пленку - хорошие пленкообразующие свойства ПВС широко известны [Мнацаканов С.С. Поливиниловый спирт. // В кн. “Энциклопедия полимеров”. М.: Советская энциклопедия, 1974, т.2, с.787-792]. В зависимости от влажности препарата ферментативная активность такого биокатализатора составляет от 8 до 40 ед./г или в пересчете на массу белка от 0,588 до 2,94 мг/г (0,059-0,294 мас.%).b) Next, the operation of incorporating the conjugate into a gel of polyvinyl alcohol is carried out, for which 2.07 g of the conjugate is mixed with 7.9 g of water and 74 g of a PVA solution (the total weight of the solution is ~ 84 g, i.e., the protein concentration in it is about 0.7 mg / ml or 0.07%), and then a solution of the resulting mixture is applied dropwise to a metal plate, where each drop turns into a small lens with a thickness of about 0.5 mm due to drying in the air and the gelation of PVA proceeding during this process diameter from 3 to 5 mm (determined by the degree of dehydration during drying). In principle, each such particle can be considered as a small polymer film - the good film-forming properties of PVA are widely known [S. Mnatsakanov Polyvinyl alcohol. // In the book. Encyclopedia of Polymers. M .: Soviet Encyclopedia, 1974, v.2, p. 787-792]. Depending on the humidity of the preparation, the enzymatic activity of such a biocatalyst is from 8 to 40 units / g, or in terms of the weight of the protein from 0.588 to 2.94 mg / g (0.059-0.294 wt.%).
Данное техническое решение как наиболее близкое к заявляемому по природе полимерной основы носителя и физическому состоянию включаемого в полимерный гель биологически-активного действующего начала (фермента) принято за прототип.This technical solution, as the closest to the claimed by the nature of the polymer base of the carrier and the physical state of the biologically active active principle (enzyme) included in the polymer gel, is taken as a prototype.
Этот биокатализатор и способ его получения имеют ряд недостатков:This biocatalyst and its production method have several disadvantages:
1. Используемый полимерный носитель - пленочный гель ПВС - имеет низкую термостабильность (нековалентные гели ПВС растворяются в водных средах при температурах всего 30-40°С [Роговина Л.3., Слонимский Г.Л., Гембицкий Л.С., Серова Е.А., Григорьева В.А., Губенкова Е.Н. Влияние растворителя на процесс студнеобразования поливинилового спирта. // Высокомолекул. соед., 15А (6), 1256-1265 (1973)], поэтому он не может быть использован для иммобилизации термостабильных ферментов, работающих при повышенных температурах.1. The used polymer carrier - PVA film gel - has low thermal stability (non-covalent PVA gels dissolve in aqueous media at temperatures of only 30-40 ° C [Rogovina L. 3., Slonimsky G. L., Gembitsky L. S., Serova E .A., Grigoryeva VA, Gubenkova EN The influence of solvent on the gelation process of polyvinyl alcohol. // High Molecular Comp. 15A (6), 1256-1265 (1973)], therefore, it cannot be used for immobilization of thermostable enzymes working at elevated temperatures.
2. Биокатализатор имеет низкое содержание фермента (не более 0,3 мас.%), т.е. обладает недостаточной удельной энзиматической активностью в расчете на вес или объем биокатализатора.2. The biocatalyst has a low enzyme content (not more than 0.3 wt.%), I.e. possesses insufficient specific enzymatic activity based on the weight or volume of the biocatalyst.
3. Биокатализаторы такого типа неэффективны для работы с высокомолекулярными субстратами, т.к. пленочный гель ПВС имеет поры размером меньше, чем полимерные макромолекулы, поэтому такие субстраты, как белки, нуклеиновые кислоты или полисахариды, не способны диффундировать в данный носитель иммобилизованных ферментов и не могут взаимодействовать с действующим началом биокатализатора.3. Biocatalysts of this type are ineffective for working with high molecular weight substrates, because PVA film gel has pores smaller than polymer macromolecules; therefore, substrates such as proteins, nucleic acids or polysaccharides are not able to diffuse immobilized enzymes into this carrier and cannot interact with the active principle of the biocatalyst.
4. Линзообразная форма биокатализатора не является оптимальной с точки зрения простоты отделения биокатализатора от реакционной среды фильтрованием, поскольку частицы такой формы способны распластываться на фильтрах, закрывая их вплоть до полного прекращения протекания фильтрата.4. The lenticular shape of the biocatalyst is not optimal from the point of view of simplicity of separating the biocatalyst from the reaction medium by filtration, since particles of this shape are able to spread on the filters, closing them until the filtrate completely stops flowing.
5. Способ получения биокатализатора не обладает универсальностью, т.к. включает иммобилизацию только исходно растворимого фермента с обязательным получением ферментхитозанового ковалентного конъюгата, другие варианты исходного фазового состояния иммобилизуемого фермента (коагулят, порошок, гель и т.д.) в способе-прототипе не предусмотрены.5. The method of obtaining the biocatalyst does not have universality, because includes the immobilization of only the initially soluble enzyme with the obligatory preparation of the enzyme chitosan covalent conjugate, other variants of the initial phase state of the immobilized enzyme (coagulate, powder, gel, etc.) are not provided in the prototype method.
Задачей предлагаемого изобретения является создание эффективного биокатализатора с повышенной емкостью по иммобилизованному ферменту, увеличенной пористостью и термостабильностью, а также повышение универсальности способа получения биокатализатора в отношении исходного фазового состояния иммобилизуемого фермента.The objective of the invention is the creation of an effective biocatalyst with increased capacity for the immobilized enzyme, increased porosity and thermal stability, as well as increasing the versatility of the method for producing the biocatalyst in relation to the initial phase state of the immobilized enzyme.
Поставленная задача решается тем, что заявляемый биокатализатор является нерастворимым препаратом фермента или ферментов, включенным в матрицу геля на основе поливиниловою спирта, при этом нерастворимый препарат фермента или ферментов представляет собой или сшитый гель, или сшитый коагулят, или сшитые белковые кристаллы, или частицы, состоящие из ферментативно-неактивного материала, к которым фермент или ферменты пришиты ковалентно, а матрица полимерного геля представляет собой криогель поливинилового спирта, причем соотношение компонентов составляет, мас.%:The problem is solved in that the inventive biocatalyst is an insoluble preparation of the enzyme or enzymes included in the gel matrix based on polyvinyl alcohol, while the insoluble preparation of the enzyme or enzymes is either a crosslinked gel, or a crosslinked coagulum, or crosslinked protein crystals, or particles consisting of from an enzymatically inactive material to which the enzyme or enzymes are covalently attached, and the polymer gel matrix is a polyvinyl alcohol cryogel, and the ratio onentov amounts, wt.%:
Нерастворимый препарат фермента 1-20Insoluble enzyme preparation 1-20
Поливиниловый спирт 8-16Polyvinyl alcohol 8-16
Вода До 100Water Up to 100
Способ получения заявляемого биокатализатора заключается в диспергировании указанного нерастворимого препарата фермента или ферментов в водном растворе поливиниловою спирта с последующим замораживанием полученной дисперсии при -5...-40°С в течение 4-48 ч и дальнейшим размораживанием со скоростью 0,001-0,2°С/мин.A method of obtaining the inventive biocatalyst is to disperse the specified insoluble preparation of the enzyme or enzymes in an aqueous solution of polyvinyl alcohol, followed by freezing the resulting dispersion at -5 ...- 40 ° C for 4-48 hours and further thawing at a speed of 0.001-0.2 ° C / min
Существенным отличием заявляемого изобретения является то, что биокатализатор представляет собой криогель поливинилового спирта (ПВС), в матрицу которого включен нерастворимый препарат фермента или смеси ферментов. При этом изобретение предусматривает следующие варианты нерастворимого препарата фермента, включаемого в матрицу криогеля:A significant difference of the claimed invention is that the biocatalyst is a polyvinyl alcohol (PVA) cryogel, in the matrix of which an insoluble enzyme preparation or enzyme mixture is included. The invention provides the following options for an insoluble enzyme preparation included in the cryogel matrix:
- нерастворимый препарат фермента или ферментов в виде химически сшитого геля, получаемого как ковалентным сшиванием самого фермента или ферментов в растворе (пример №4), так и сшиванием фермента или ферментов в присутствии энзиматически-инертного вспомогательного растворимого полимера (примеры №1-3);- an insoluble preparation of the enzyme or enzymes in the form of a chemically crosslinked gel, obtained both by covalent crosslinking of the enzyme or enzymes in solution (example No. 4) and by crosslinking of the enzyme or enzymes in the presence of an enzymatically inert auxiliary soluble polymer (examples No. 1-3);
- нерастворимый препарат фермента в виде сшитого коагулята, получаемого введением осадителя(ей) в раствор фермента или ферментов с одновременным или последующим действием химического сшивателя (примеры №7, 8);- insoluble preparation of the enzyme in the form of a crosslinked coagulate obtained by introducing the precipitant (s) into the solution of the enzyme or enzymes with the simultaneous or subsequent action of a chemical crosslinker (examples No. 7, 8);
- нерастворимый препарат фермента в виде сшитых ферментных кристаллов (пример №6);- insoluble preparation of the enzyme in the form of crosslinked enzyme crystals (example No. 6);
- нерастворимый препарат фермента или ферментов в виде частиц правильной или неправильной формы, состоящих из ферментативно-неактивного материала, к которым фермент или ферменты пришиты ковалентно (примеры №5, 9, 10).- insoluble preparation of the enzyme or enzymes in the form of particles of regular or irregular shape, consisting of enzymatically-inactive material, to which the enzyme or enzymes are sewn covalently (examples No. 5, 9, 10).
Самому же биокатализатору может быть придана любая желаемая форма: сферических частиц, дисков, блоков, трубок, частиц неправильной формы и др.The biocatalyst itself can be given any desired shape: spherical particles, disks, blocks, tubes, irregularly shaped particles, etc.
В качестве фермента или их смеси заявляемое изобретение предусматривает использование любых ферментов или их препаратов совершенно разнородных по природе и типу энзиматической активности ферментов, например гликозидаз (примеры №1, 2, 8), протеаз (примеры №3, 4, 6, 7), липаз (пример №9), лиаз (пример №5), оксидоредуктаз (пример №10) и др.As an enzyme or mixtures thereof, the claimed invention provides for the use of any enzymes or their preparations completely heterogeneous in nature and type of enzymatic activity of enzymes, for example glycosidases (examples No. 1, 2, 8), proteases (examples No. 3, 4, 6, 7), lipases (example No. 9), lyases (example No. 5), oxidoreductases (example No. 10), etc.
Реализация заявляемого способа включает стадии диспергирования нерастворимого препарата фермента или ферментов в водном растворе ПВC (осуществляется обычным перемешиваем при положительных температурах), замораживание полученной дисперсии при -5...-40°С в течение 4-48 ч (для чего используются соответствующие морозильные камеры или бани с известными хладоагентами) и дальнейшее размораживание со скоростью 0,001-0,2°С/мин (эта последняя стадия обычно осуществляется с помощью программируемых криостатов, позволяющих проводит контролируемый нагрев замороженных объектов).Implementation of the proposed method includes the steps of dispersing an insoluble preparation of an enzyme or enzymes in an aqueous solution of PVA (carried out by normal mixing at positive temperatures), freezing the resulting dispersion at -5 ...- 40 ° C for 4-48 hours (for which appropriate freezers are used or baths with known refrigerants) and further thawing at a rate of 0.001-0.2 ° C / min (this last stage is usually carried out using programmable cryostats that allow for controlled heating in frozen objects).
Конкретные варианты реализации заявляемого технического решения иллюстрируются примерами.Specific options for the implementation of the proposed technical solution are illustrated by examples.
Пример 1. Биокатализатор на основе смеси амилолитических ферментовExample 1. Biocatalyst based on a mixture of amylolytic enzymes
К 10 г сухого препарата смеси амилолитических ферментов Амилосубтилин ГЗх (Омутнинский з-д ОАО "Восток", Россия), обладающего суммарной α-амилазной и β-глюканазной активностями, прибавляют 85 г 5%-ного водного раствора овальбумина, перемешивают до полного растворения сухого вещества, с помощью 1 N NaOH доводят рН раствора до 8,2-8,3 и вносят 5 мл 2,5%-ного водного раствора глутарового альдегида. После 6-часовой выдержки при 15-18°С получается сшитый гель, который измельчают до частиц неправильной формы размером 40-250 мкм. Далее эти частицы диспергируют в 400 мл 16%-ного (мас.%) водного раствора ПВС, перемешивают до получения равномерной суспензии, а затем подвергают криогенной обработке (замораживанию-оттаиванию) при -10°С в течение 12 ч с последующим размораживанием со скоростью 0,2°С/мин. Получают блок композитного криогеля ПВС, содержащего включенные частицы нерастворимого препарата фермента. Этот блок измельчают до частиц неправильной формы размером 2-4 мм. В результате получают биокатализатор с содержанием амилолитических ферментов 2 мас.% (по белку) и ПВС - 12,8 мас.%. Амилолитическая активность полученного биокатализатора (измерена в 0,1 М Na-цитратном буфере, рН 6,0; 45°С) составляет 85% от активности исходного препарата Амилосубтилин ГЗх в расчете на 1 мг белка.To 10 g of a dry preparation of a mixture of amylolytic enzymes Amilosubtilin GZh (Omutninsky plant of Vostok OJSC, Russia), which has a total α-amylase and β-glucanase activity, 85 g of a 5% aqueous solution of ovalbumin are added, mixed until the dry solution is completely dissolved substances, using 1 N NaOH, the pH of the solution is adjusted to 8.2-8.3 and 5 ml of a 2.5% aqueous solution of glutaraldehyde are added. After 6 hours at 15-18 ° C, a cross-linked gel is obtained, which is crushed to particles of irregular shape with a size of 40-250 microns. Further, these particles are dispersed in 400 ml of a 16% (wt.%) Aqueous solution of PVA, stirred until a uniform suspension is obtained, and then subjected to cryogenic treatment (freezing-thawing) at -10 ° C for 12 hours, followed by thawing at a speed 0.2 ° C / min. Get a block of composite PVA cryogel containing the included particles of an insoluble enzyme preparation. This block is crushed to particles of irregular shape with a size of 2-4 mm. The result is a biocatalyst with a content of amylolytic enzymes of 2 wt.% (Protein) and PVA - 12.8 wt.%. The amylolytic activity of the obtained biocatalyst (measured in 0.1 M Na-citrate buffer, pH 6.0; 45 ° C) is 85% of the activity of the starting drug Amilosubtilin GZh per 1 mg of protein.
Пример 2. Биокатализатор на основе глюкоамилазыExample 2. Glucoamylase-Based Biocatalyst
К 2,5 мл жидкого препарата Глюкаваморин Гх (Омутнинский з-д ОАО "Восток", Россия), обладающего α-глюкоамилазной активностью, прибавляют 1,5 мл нагретого до 40°С 14%-ного водного раствора желатина и быстро вносят 1 мл 0,5%-ного водного раствора глиоксаля. Выдерживают раствор 30 мин при 40°С и затем 18 ч при комнатной температуре. В результате получают сшитый гель, который измельчают до частиц неправильной формы размером 50-150 мкм. Далее эти частицы диспергируют в 6 мл 18%-ного водного раствора ПВС (мас.%), перемешивают до получения равномерной суспензии, которую помещают в цилиндрическую форму с кольцевым зазором шириной 5 мм, а затем подвергают криогенной обработке при -24°С в течение 24 ч с последующим размораживанием со скоростью 0,02°С/мин. Получают композитный криогель ПВС в виде трубки с толщиной стенок 5 мм, содержащей включенные частицы нерастворимого препарата фермента. После промывки изделия в ванне с проточной водой получают биокатализатор с содержанием глюкоамилазы 3,2 мас.% (по белку) и ПВС - 9,7 мас.%. Глюкоамилазная активность полученного биокатализатора (измерена в 0,1 М Na-цитратном буфере, рН 4,5; 60°С) составляет 64% от активности исходного препарата Глюкаваморин Гх в расчете на 1 мг белка.To 2.5 ml of the liquid preparation Glukavamorin Gh (Omutninsky plant of Vostok OJSC, Russia) with α-glucoamylase activity, 1.5 ml of a 14% aqueous gelatin solution heated to 40 ° C are added and 1 ml is rapidly added 0.5% aqueous glyoxal solution. The solution is kept for 30 minutes at 40 ° C and then 18 hours at room temperature. The result is a cross-linked gel, which is crushed to particles of irregular shape with a size of 50-150 microns. Further, these particles are dispersed in 6 ml of an 18% aqueous solution of PVA (wt.%), Mixed until a uniform suspension is obtained, which is placed in a cylindrical shape with an annular gap of 5 mm wide, and then subjected to cryogenic treatment at -24 ° C for 24 hours followed by thawing at a rate of 0.02 ° C / min. A composite PVA cryogel is obtained in the form of a tube with a wall thickness of 5 mm containing the included particles of an insoluble enzyme preparation. After washing the product in a bath with running water, a biocatalyst is obtained with a content of glucoamylase of 3.2 wt.% (Protein) and PVA of 9.7 wt.%. The glucoamylase activity of the obtained biocatalyst (measured in 0.1 M Na-citrate buffer, pH 4.5; 60 ° C) is 64% of the activity of the initial drug Glucavamorin Gx per 1 mg of protein.
Пример 3. Биокатализатор с наполнителем на основе трипсина, сшитого в присутствии синтетического полимераExample 3. Biocatalyst with a trypsin-based filler crosslinked in the presence of a synthetic polymer
Трипсин (препарат фирмы Spofa, Чехия) в количестве 0,15 г и чередующийся сополимер N-винилпирролидона с виниламином в количестве 0,4 г растворяют в 3 мл 0,01 N НСl, а затем доводят рН полученного раствора до 7,2 с помощью 1 N NaOH. Далее раствор охлаждают в ледяной бане, вносят 0,01 г водорастворимого карбодиимида, перемешивают и инкубируют при 4-6°С в течение 15 ч. К полученному клейстерообразному препарату прибавляют 3 мл 22%-ного (мас.%) раствора ПВС в 0,1 М NaSCN и гомогенизируют полученную смесь в измельчителе биологических тканей. Затем помещают гомогенат в кольцевидную форму и подвергают криогенной обработке при -15°С в течение 48 ч с последующим размораживанием со скоростью 0,1°С/мин. Получают композитный криогель ПВС, содержащий включенный нерастворимый препарат фермента; композит имеет форму кольца с внешним диаметром 32 мм и внутренним диаметром 22 мм. Полученный биокатализатор содержит 2,5 мас.% трипсина и 11 мас.% ПВС. Ферментативная активность полученного биокатализатора при гидролизе п-нитроанилида Nα-бeнзoил-DL-apгининa (измерена в 0,3 М Na-фосфатном буфере, рН 8,0; 25°С) составляет 81% от активности исходного препарата трипсина в расчете на 1 мг белка.Trypsin (a preparation from Spofa, Czech Republic) in an amount of 0.15 g and an alternating copolymer of N-vinylpyrrolidone with vinylamine in an amount of 0.4 g are dissolved in 3 ml of 0.01 N Hcl, and then the pH of the resulting solution is adjusted to 7.2 with 1 N NaOH. Next, the solution is cooled in an ice bath, 0.01 g of water-soluble carbodiimide is added, stirred and incubated at 4-6 ° C for 15 hours. 3 ml of a 22% (wt.%) PVA solution are added to the resulting paste-like preparation. 1 M NaSCN and homogenize the resulting mixture in a biological tissue grinder. The homogenate is then placed in a ring-shaped form and subjected to cryogenic treatment at -15 ° C for 48 hours, followed by thawing at a rate of 0.1 ° C / min. Get PVA composite cryogel containing the included insoluble enzyme preparation; the composite has a ring shape with an outer diameter of 32 mm and an inner diameter of 22 mm. The resulting biocatalyst contains 2.5 wt.% Trypsin and 11 wt.% PVA. The enzymatic activity of the obtained biocatalyst during the hydrolysis of p-nitroanilide Nα-benzoyl-DL-apginine (measured in 0.3 M Na-phosphate buffer, pH 8.0; 25 ° С) is 81% of the activity of the initial trypsin preparation per 1 mg squirrel.
Пример 4. Биокатализатор с наполнителем на основе частиц сшитого трипсинаExample 4. Biocatalyst with a filler based on particles of cross-linked trypsin
Трипсин (препарат фирмы Fluka, Швейцария) в количестве 0,15 г растворяют в 4 мл 0,01 N НСl, затем доводят рН полученного раствора до 7,2 с помощью 1 N NaOH и добавляют воды до общего объема 4,5 мл. Раствор охлаждают в ледяной бане и при интенсивном перемешивании вносят 0,5 мл 0,05%-ного водного раствора глутарового альдегида. Перемешивание на холоде продолжают в течение 5 ч, в результате чего получается суспензия гелевых частиц сшитого трипсина. Частицы имеют неправильную форму и размеры от 0,1 до примерно 1,5 мм (определено с помощью световой микроскопии). Нерастворимый продукт отделяют фильтрованием, промывают на фильтре водой до отсутствия запаха глутарового альдегида. Этот материал диспергируют в воде и измельчают в гомогенезаторе Поттера до частиц размером не более 50 мкм. После отделения воды центрифугированием при 4000 об/мин в течение 20 мин 2 г полученного влажного препарата сшитого трипсина (содержание белка в препарате 0,7 г/г) смешивают с 8 мл 17%-ного (мас.%) водного раствора ПВС. Тщательно перемешивают смесь до получения равномерной суспензии, из которой затем известным методом монодисперсного гранулирования [Пат. РФ №2036095 (1992). Устройство для формирования сферических гранул из материала на основе водных систем] формируют гранулы композитного криогеля ПВО диаметром 2-3 мм. Замораживание проводят при -40°С в течение 4 ч, гранулы оттаивают со скоростью 0,03°С/мин. В результате получают гранулированный биокатализатор с содержанием трипсина 14 мас.% и ПВС-13,6 мас.%. Ферментативная активность полученного биокатализатора при гидролизе п-нитроанилида Nα-бензоил-DL-аргинина (измерена в 0,3 М Na-фосфатном буфере, рН 8,0; 25°С) составляет 75% от активности исходного препарата трипсина в расчете на 1 мг белка.Trypsin (a drug from Fluka, Switzerland) in an amount of 0.15 g was dissolved in 4 ml of 0.01 N Hcl, then the pH of the resulting solution was adjusted to 7.2 with 1 N NaOH and water was added to a total volume of 4.5 ml. The solution was cooled in an ice bath and 0.5 ml of a 0.05% aqueous solution of glutaraldehyde was added with vigorous stirring. Stirring in the cold is continued for 5 hours, resulting in a suspension of gel particles of cross-linked trypsin. Particles have an irregular shape and sizes from 0.1 to about 1.5 mm (determined using light microscopy). The insoluble product is separated by filtration, washed on the filter with water until there is no smell of glutaraldehyde. This material is dispersed in water and ground in a Potter homogenizer to particles no larger than 50 microns. After separation of water by centrifugation at 4000 rpm for 20 minutes, 2 g of the obtained crosslinked trypsin wet preparation (protein content in the preparation of 0.7 g / g) was mixed with 8 ml of a 17% (wt.%) Aqueous PVA solution. Thoroughly mix the mixture until a uniform suspension is obtained, from which it is then known by the method of monodisperse granulation [US Pat. RF №2036095 (1992). Device for forming spherical granules from a material based on aqueous systems] form granules of a composite air defense cryogel with a diameter of 2-3 mm Freezing is carried out at -40 ° C for 4 hours, the granules are thawed at a rate of 0.03 ° C / min. The result is a granular biocatalyst with a trypsin content of 14 wt.% And PVA-13.6 wt.%. The enzymatic activity of the obtained biocatalyst during the hydrolysis of p-nitroanilide Nα-benzoyl-DL-arginine (measured in 0.3 M Na-phosphate buffer, pH 8.0; 25 ° С) is 75% of the activity of the initial trypsin preparation per 1 mg squirrel.
Пример 5. Биокатализа тор на основе L-тирозин-декарбоксилазыExample 5. Biocatalyst based on L-tyrosine decarboxylase
20 г обезжиренной овечьей шерсти (очес - отходы производства шерстяной пряжи) помещают на 30 мин в жидкий азот, а затем измельчают до фрагментов длиной не более 1-2 мм. Далее 2 г полученного материала диспергируют в 20 мл 0,01 N NaOH, вносят 0,1 мл дивинилсульфона и перешивают 2 ч при комнатной температуре. Нерастворимый продукт промывают дистиллированной водой и диспергируют в 10 мл раствора (3 мг белка в 1 мл 0,05 М Na-фосфатного буфере, рН 6,8) L-тирозин-декарбоксилазы (Sigma, США). Суспензию перемешивают 18 ч при 4-6°С (при этом происходит ковалентное присоединение фермента к волокнам шерсти, модифицированной дивинилсульфоном), а затем отделяют нерастворимый материал центрифугированием при 2000 об/мин в течение 20 мин. Получают 4,2 г влажного нерастворимого препарата фермента, который диспергируют в 8 мл 17%-го (мас.%) водного раствора ПВС. После тщательного перемешивания полученную суспензию помещают в плоскую четырехугольную металлическую форму (поддон) размером 10×4×0,3 см и подвергают криогенной обработке при -30°С в течение 8 ч с последующим размораживанием со скоростью 0,01°С/мин. Получают композитный криогель ПВС в виде листа, содержащего включенные частицы нерастворимого препарата фермента. Этот лист разрезают на квадраты размером 1×1 см, которые используют в биодатчике для определения L-тирозина. Полученный биокатализатор содержит L-тирозин-декарбоксилазу в количестве 2,2 мас.% (по белку) и ПВС - 16 мас.%. Декарбокислазная активность биокатализатора (измерена в 0,01 мМ растворе НС1, рН 5,5; 37°С) составляет 72% от активности исходной L-тирозин-декарбоксилазы в расчете на 1 мг белка.20 g of fat-free sheep wool (tow - waste from the production of wool yarn) is placed in liquid nitrogen for 30 minutes, and then crushed to fragments no more than 1-2 mm long. Next, 2 g of the obtained material is dispersed in 20 ml of 0.01 N NaOH, 0.1 ml of divinyl sulfone are added and the mixture is stirred for 2 hours at room temperature. The insoluble product is washed with distilled water and dispersed in 10 ml of a solution (3 mg of protein in 1 ml of 0.05 M Na-phosphate buffer, pH 6.8) L-tyrosine decarboxylase (Sigma, USA). The suspension is stirred for 18 hours at 4-6 ° C (this causes the enzyme to covalently attach to the fibers of the wool modified with divinyl sulfone), and then insoluble material is separated by centrifugation at 2000 rpm for 20 minutes. Obtain 4.2 g of a wet insoluble preparation of the enzyme, which is dispersed in 8 ml of a 17% (wt.%) Aqueous solution of PVA. After thorough mixing, the resulting suspension is placed in a flat quadrangular metal mold (pan) of 10 × 4 × 0.3 cm in size and subjected to cryogenic treatment at -30 ° C for 8 hours, followed by thawing at a rate of 0.01 ° C / min. A composite PVA cryogel is obtained in the form of a sheet containing incorporated particles of an insoluble enzyme preparation. This sheet is cut into 1 × 1 cm squares, which are used in the biosensor to determine L-tyrosine. The resulting biocatalyst contains L-tyrosine decarboxylase in an amount of 2.2 wt.% (Protein) and PVA - 16 wt.%. The decarbic acid activity of the biocatalyst (measured in a 0.01 mM HC1 solution, pH 5.5; 37 ° C) is 72% of the activity of the initial L-tyrosine decarboxylase per 1 mg of protein.
Пример 6. Биокатализатор на основе субтилизинаExample 6. The biocatalyst based on subtilisin
К 50 г 10%-ного (мас.%) водного раствора ПВС прибавляют 5 г сухого препарата сшитых кристаллов субтилизина Карлсберга (коммерческий препарат ChiroCLEC-BL - продукт фирмы Altus Biologics, США; размер частиц 5-10 мкм). Тщательно перемешивают смесь до получения равномерной суспензии, из которой затем известным методом (см. пример 4) сформируют гранулы композитного криогеля ПВС диаметром 1,0-1,2 мм. Замораживание проводят при -18°С в течение 18 ч, гранулы оттаивают со скоростью 0,08°С/мин. В результате получают гранулированный биокатализатор с содержанием фермента (субтилизин Карлсберга) 9,1 мас.% и ПВС - 10 мас.%. Энзиматическая активность полученного биокатализатора в реакции гидролиза п-нитроаналида N-пироглутарил-аланил-аланил-лейцина (0,05М Трис/НСl буфер, содержащий 1,5 мМ CaCl2, pH 8,3; 20°С) составляет 92% от активности исходного препарата ChiroCLEC-BL в расчете на 1 мг белка.To 50 g of a 10% (wt.%) Aqueous solution of PVA is added 5 g of a dry preparation of cross-linked Carlsberg subtilisin crystals (commercial preparation ChiroCLEC-BL is a product of Altus Biologics, USA; particle size 5-10 μm). The mixture is thoroughly mixed until a uniform suspension is obtained, from which granules of a composite PVA cryogel with a diameter of 1.0-1.2 mm are then formed by a known method (see example 4). Freezing is carried out at -18 ° C for 18 hours, the granules are thawed at a rate of 0.08 ° C / min. The result is a granular biocatalyst with an enzyme content (Carlsberg subtilisin) of 9.1 wt.% And PVA - 10 wt.%. The enzymatic activity of the obtained biocatalyst in the hydrolysis of p-nitroanalide N-pyroglutaryl-alanyl-alanyl-leucine (0.05 M Tris / Hcl buffer containing 1.5 mm CaCl 2 , pH 8.3; 20 ° C) is 92% of the activity the original preparation ChiroCLEC-BL per 1 mg of protein.
Пример 7. Биокатализатор на основе щелочных микробных протеазExample 7. Biocatalyst based on alkaline microbial proteases
100 мл жидкого ферментного препарата на основе щелочных микробных протеаз из Bacillus licheniformis (фирменное название Deterzyme L-600; ENDE Industrial Inc., США) помещают в мешок из целлофана и диализуют при комнатной температуре против деионизованной воды до отсутствия сульфата аммония в диализате. В результате белковые компоненты, содержащие целевую энзиматическую активность, выпадают в осадок (коагулят), который отделяют центрифугированием при 4000 об/мин в течение 15 мин. Получают 12 г влажного уплотненного коагулята, который диспергируют в 50 мл 0,01 М растворе NaHCO3, а затем прибавляют 2 мл 0,2% водного раствора янтарного альдегида и перемешивают 18 ч при 20°С. Нерастворимый продукт отделяют центрифугированием при 4000 об/мин в течение 15 мин, промывают 100 мл дистиллированной воды и вновь отделяют центрифугированием в тех же режимах. Полученный нерастворимый препарат фермента диспергируют в 12%-ном (мас.%) водном растворе ПВС при соотношении указанных компонентов 1:3 по массе. Полученную суспензию разливают в дисковые формы диаметром 15 мм и высотой 2 мм, а затем подвергают криогенной обработке при -20°С в течение 36 ч с последующим размораживанием со скоростью 0,06°С/мин. В результате получают биокатализатор в виде дисков с содержанием фермента 20 мас.% и ПВС - 8 мас.%. Казеинолитическая активность полученного биокатализатора (измерена в 0,1 М Na-карбонатном буфере, рН 10,3; 50°С) составляет 74% от активности исходного препарата Deterzyme L-600 в расчете на 1 мг белка.100 ml of an alkaline microbial protease enzyme preparation from Bacillus licheniformis (brand name Deterzyme L-600; ENDE Industrial Inc., USA) is placed in a cellophane bag and dialyzed at room temperature against deionized water until there is no ammonium sulfate in the dialysate. As a result, protein components containing the target enzymatic activity precipitate (coagulate), which is separated by centrifugation at 4000 rpm for 15 minutes. Obtain 12 g of a wet compacted coagulum, which is dispersed in 50 ml of a 0.01 M solution of NaHCO 3 , and then 2 ml of a 0.2% aqueous solution of succinic aldehyde are added and stirred for 18 hours at 20 ° C. The insoluble product is separated by centrifugation at 4000 rpm for 15 minutes, washed with 100 ml of distilled water and again separated by centrifugation in the same modes. The resulting insoluble preparation of the enzyme is dispersed in a 12% (wt.%) Aqueous solution of PVA with a ratio of these components of 1: 3 by weight. The resulting suspension is poured into disk forms with a diameter of 15 mm and a height of 2 mm, and then subjected to cryogenic treatment at -20 ° C for 36 hours, followed by thawing at a rate of 0.06 ° C / min. The result is a biocatalyst in the form of disks with an enzyme content of 20 wt.% And PVA - 8 wt.%. The caseinolytic activity of the obtained biocatalyst (measured in 0.1 M Na-carbonate buffer, pH 10.3; 50 ° C) is 74% of the activity of the original Deterzyme L-600 preparation per 1 mg of protein.
Пример 8. Биокатализатор на основе лизоцимаExample 8. Biocatalyst based on lysozyme
Готовят 100 мл 2%-ного раствора лизоцима куриных яиц (Merck, Германия) в 0,2 М Na-бикарбонатном буфере (рН 8,7). куда при постоянном перемешивании небольшими порциями прибавляют 40%-ный водный раствор полиэтиленоксида с молекулярной массой 1200 до образования мелкодисперсного коагулята белка. Далее дисперсию охлаждают на ледяной бане, вносят 0,1 г трихлортриазина и перемешивают на холоде 20 ч. Осадок отделяют центрифугированием при 6000 об/мин в течение 15 мин и трижды промывают водой центрифугированием при тех же режимах. Получают 5,1 г влажного сшитого белкового коагулята с содержанием белка 0,37 г на 1 г препарата. Этот нерастворимый препарат фермента диспергируют в 6 мл 20%-ного раствора ПВС. Полученную суспензию помещают в дисковые формы и подвергают криогенной обработке при -8°С в течение 15 ч с последующим размораживанием со скоростью 0,005°С/мин. В результате получают биокатализатор в виде дисков с содержанием фермента 17,2 мас.% и ПВС - 10,9 мас.%. Энзиматическая активность биокатализатора при расщеплении п-нитрофенильного производного β-D-N,N’,N’’-триацетил-хитотриозы (измерена в 0,1 М трис-глициновом буфере, рН 6,5 при 25°С) составляет 59% от активности исходного препарата лизоцима в расчете на 1 мг белка.Prepare 100 ml of a 2% solution of chicken egg lysozyme (Merck, Germany) in 0.2 M Na-bicarbonate buffer (pH 8.7). where, with constant stirring, a 40% aqueous solution of polyethylene oxide with a molecular weight of 1200 is added in small portions until a finely divided protein coagulate is formed. Next, the dispersion is cooled in an ice bath, 0.1 g of trichlorotriazine is added and stirred in the cold for 20 hours. The precipitate is separated by centrifugation at 6000 rpm for 15 minutes and washed three times with water by centrifugation under the same conditions. Obtain 5.1 g of wet cross-linked protein coagulate with a protein content of 0.37 g per 1 g of the drug. This insoluble enzyme preparation is dispersed in 6 ml of a 20% PVA solution. The resulting suspension is placed in disk forms and subjected to cryogenic treatment at -8 ° C for 15 hours, followed by thawing at a rate of 0.005 ° C / min. The result is a biocatalyst in the form of disks with an enzyme content of 17.2 wt.% And PVA - 10.9 wt.%. The enzymatic activity of the biocatalyst in the cleavage of the p-nitrophenyl derivative of β-DN, N ', N' '- triacetyl-chitotrioses (measured in 0.1 M Tris-glycine buffer, pH 6.5 at 25 ° C) is 59% of the activity of the initial lysozyme preparation per 1 mg of protein.
Пример 9. Биокатализатор на основе панкреатической липазыExample 9. Pancreatic Lipase Based Biocatalyst
К 45 г 3-аминопропилированного силикагеля (Silasorb A, Chemapol, Чехия; размер частиц 5 мкм) прибавляют 80 мл 2,5%-ного водного раствора терефталевого альдегида и энергично перемешивают на лабораторной качалке в течение 2 ч при комнатной температуре. Модифицированный таким образом силикагель, содержащий привитые альдегидные группы, отфильтровывают, промывают на фильтре водой до отсутствия альдегида в промывках и диспергируют в 60 мл 0,5%-ного раствора панкреатической липазы (Fluka, Швейцария) в 0,1 М Na-фосфатном буфере (рН 7,4). Суспензию перемешивают в течение 4 ч при комнатной температуре, затем отфильтровывают твердую фазу, промывают ее последовательно тем же буфером (3×50 мл) и дистиллированной водой до отрицательной реакции на белок в промывках. Получают нерастворимый препарат липазы, присоединенной ковалентно к силикагелю. Содержание фермента в этом препарате составляет по данным аминокислотного анализа 20,9 мг белка на 1 г сухого препарата. К 80 мл 9,5%-ного (мас.%) водного раствора ПВС прибавляют 40 г полученного нерастворимого ферментного препарата и перемешивают систему до получения равномерной суспензии, из которой затем известным методом (см. пример 4) формируют гранулы композитного криогеля ПВС диаметром 0,7-0,9 мм. Замораживание проводят в течение 20 ч при -22°С с последующим оттаиванием гранул со скоростью 0,15°С/мин. В результате получают биокатализатор в гранулированном виде с содержанием фермента 1 мас.% и ПВС - 9,3 мас.% (без учета массы силикагеля). Энзиматическая активность полученного биокатализатора в отношении гидролиза п-нитрофенилпропионата (измерена в 0,2 М Na-фосфатном буфере (рН 7,9) при 37°С) в расчете на 1 мг белка составляет 98% от активности нерастворимого препарата липазы после ее присоединения к силикагелю.To 45 g of 3-aminopropylated silica gel (Silasorb A, Chemapol, Czech Republic; particle size 5 μm), 80 ml of a 2.5% aqueous solution of terephthalic aldehyde are added and the mixture is vigorously stirred for 2 hours at room temperature. Silica gel modified in this way containing grafted aldehyde groups is filtered off, washed on the filter with water until the aldehyde is not washed and dispersed in 60 ml of a 0.5% solution of pancreatic lipase (Fluka, Switzerland) in 0.1 M Na-phosphate buffer ( pH 7.4). The suspension is stirred for 4 hours at room temperature, then the solid phase is filtered off, washed successively with the same buffer (3 × 50 ml) and distilled water until the protein is negatively washed. An insoluble lipase preparation covalently attached to silica gel is obtained. According to the amino acid analysis, the enzyme content in this preparation is 20.9 mg of protein per 1 g of dry preparation. 40 g of the obtained insoluble enzyme preparation are added to 80 ml of a 9.5% (wt.%) Aqueous solution of PVA and the system is stirred until a uniform suspension is obtained, from which granules of PVA composite cryogel with a diameter of 0 are then formed using the known method (see example 4) , 7-0.9 mm. Freezing is carried out for 20 hours at -22 ° C, followed by thawing of the granules at a rate of 0.15 ° C / min. The result is a biocatalyst in granular form with an enzyme content of 1 wt.% And PVA - 9.3 wt.% (Excluding the mass of silica gel). The enzymatic activity of the obtained biocatalyst with respect to the hydrolysis of p-nitrophenylpropionate (measured in 0.2 M Na-phosphate buffer (pH 7.9) at 37 ° C) per 1 mg of protein is 98% of the activity of the insoluble lipase preparation after it is attached to silica gel.
Пример 10. Биокатализатор на основе алкогольдегидрогеназыExample 10. Alcohol dehydrogenase-based biocatalyst
Порошок микрокристаллической целлюлозы (размер частиц 10-20×0,3-0,5 мкм), содержащей привитые фенилглицидильные группировки (~40 мкмоль/г), в количестве 1 г диспергируют в 5 мл 0,2%-ного раствора дрожжевой алкогольдегидрогеназы (Worthington Biochemical Corp., США) в 0,05 М Na-пирофосфатном буфере (рН 8,8) и перешивают в центрифужной пробирке при комнатной температуре 8 ч (при этом происходит адсорбция фермента на производном целлюлозы). Фазы разделяют центрифугированием при 4000 об/мин в течение 20 мин, супернатант сливают, а осадок при охлаждении в ледяной бане суспендируют в 5 мл 0,1%-ного раствора глиоксаля в таком же буфере и перемешивают на холоде 30 мин, что приводит к сшиванию адсорбированного фермента. Фазы разделяют фильтрованием, осадок промывают буфером до отсутствия глиоксаля в промывках. Получают нерастворимый препарат фермента с содержанием белка 35 мг на 1 г сухой целлюлозы. К 0,5 г (в расчете на сухой вес) этого препарата прибавляют 1 г 14%-ного (мас.%) раствора ПВС, тщательно перешивают ишредиенты, помещают полученную суспензию в лоток с полуцилиндрическими желобками (диаметр 6 мм) и затем подвергают криогенной обработке при -5°С в течение 12 ч с последующим размораживанием со скоростью 0,001°С/мин. В результате получают биокатализатор в виде полуцилиндров с содержанием фермента 1,7 мас.% и ПВС - 13,7 мас.% (без учета массы целлюлозы). Энзиматическая активность полученного биокатализатора в отношении окисления этанола (измерена при 25°С с помощью стандартного набора реагентов фирмы Worthington Biochemical Corp., США; содержит раствор этанола, НАД и желатина в 0,05 М Na-пирофосфатном буфере (рН 8,8)) в расчете на 1 мг белка составляет 83% от активности исходной алкогольдегидрогеназы.Microcrystalline cellulose powder (particle size 10-20 × 0.3-0.5 μm) containing grafted phenyl glycidyl groups (~ 40 μmol / g) is dispersed in an amount of 1 g in 5 ml of a 0.2% solution of yeast alcohol dehydrogenase ( Worthington Biochemical Corp., USA) in a 0.05 M Na-pyrophosphate buffer (pH 8.8) and inoculated in a centrifuge tube at room temperature for 8 hours (the enzyme is adsorbed on a cellulose derivative). The phases are separated by centrifugation at 4000 rpm for 20 minutes, the supernatant is drained, and the precipitate is cooled in an ice bath and suspended in 5 ml of a 0.1% glyoxal solution in the same buffer and stirred in the cold for 30 minutes, which leads to crosslinking. adsorbed enzyme. The phases are separated by filtration, the precipitate is washed with buffer until there is no glyoxal in the washes. An insoluble enzyme preparation is obtained with a protein content of 35 mg per 1 g of dry cellulose. To 0.5 g (calculated on dry weight) of this preparation, 1 g of a 14% (wt.%) PVA solution is added, the ingredients are thoroughly alter, the resulting suspension is placed in a tray with half-cylindrical grooves (diameter 6 mm) and then subjected to cryogenic processing at -5 ° C for 12 hours, followed by thawing at a rate of 0.001 ° C / min. The result is a biocatalyst in the form of half cylinders with an enzyme content of 1.7 wt.% And PVA - 13.7 wt.% (Excluding cellulose mass). The enzymatic activity of the obtained biocatalyst in relation to the oxidation of ethanol (measured at 25 ° C using a standard set of reagents from Worthington Biochemical Corp., USA; contains a solution of ethanol, NAD and gelatin in 0.05 M Na-pyrophosphate buffer (pH 8.8)) per 1 mg of protein is 83% of the activity of the initial alcohol dehydrogenase.
Оказалось, что такой ранее неизвестный состав и неизвестное сочетание технологических операций, т.е. приготовление нерастворимого препарата фермента с последующим его включением в матрицу криогеля ПВС, приводит к получению биокатализатора, имеющего следующие преимущества по сравнению с аналогами и прототипом:It turned out that such a previously unknown composition and an unknown combination of technological operations, i.e. the preparation of an insoluble enzyme preparation with its subsequent inclusion in the PVA cryogel matrix results in a biocatalyst having the following advantages compared to analogues and prototype:
1. Заявляемое изобретение позволяет получать биокатализаторы, содержащие значительно большее по сравнению с аналогами и прототипом (до 680 раз) количества иммобилизованного фермента или ферментов, эффективных при работе как с низкомолекулярными (примеры №2-6, 8-10), так высокомолекулярными (примеры №1, 7) субстратами.1. The claimed invention allows to obtain biocatalysts containing significantly larger compared with analogues and prototype (up to 680 times) the number of immobilized enzyme or enzymes effective when working with both low molecular weight (examples No. 2-6, 8-10), and high molecular weight (examples No. 1, 7) substrates.
2. Включение фермента или ферментов в матрицу криогеля в виде нерастворимого препарата, находящегося в одном из перечисленных физических состояний: сшитый гель, сшитый коагулят, сшитые белковые кристаллы, частицы правильной или неправильной формы, состоящие из энзиматически неактивного материала, к которым фермент или ферменты пришиты ковалентно, существенно повышает универсальность заявляемого технического решения по сравнению с аналогами и прототипом, каждый из которых предусматривает только одно из физических состояний иммобилизуемого фермента.2. The inclusion of the enzyme or enzymes in the cryogel matrix in the form of an insoluble preparation in one of the following physical conditions: crosslinked gel, crosslinked coagulum, crosslinked protein crystals, particles of regular or irregular shape, consisting of enzymatically inactive material, to which the enzyme or enzymes are sewn covalently, significantly increases the versatility of the claimed technical solution in comparison with analogues and prototype, each of which provides only one of the physical conditions of immobilization of enzyme.
3. Заявляемое техническое решение обладает широкой универсальностью также в отношении классов иммобилизуемых ферментов, в частности, примеры иллюстрируют приготовление биокатализаторов на основе совершенно разнородных по природе и типу энзиматической активности ферментов: гликозидаз (примеры №1, 2, 8), протеаз (примеры №3, 4, 6, 7), липазы (пример №9), лиазы (пример №5), оксидоредуктазы (пример №10).3. The claimed technical solution has wide versatility also with respect to classes of immobilized enzymes, in particular, the examples illustrate the preparation of biocatalysts based on completely heterogeneous in nature and type of enzymatic activity of enzymes: glycosidases (examples No. 1, 2, 8), proteases (examples No. 3 , 4, 6, 7), lipases (example No. 9), lyases (example No. 5), oxidoreductases (example No. 10).
4. Кроме того, заявляемое техническое решение обладает универсальностью в отношении того, в каком виде нерастворимый препарат фермента или ферментов включается в матрицу гелевого носителя: как индивидуальный фермент (примеры №3-6, 8-10) или их смесь (примеры №1, 2, 7), что позволяет получать широкий набор биокатализаторов.4. In addition, the claimed technical solution has universality with respect to the form in which the insoluble preparation of the enzyme or enzymes is included in the matrix of the gel carrier: as an individual enzyme (examples No. 3-6, 8-10) or a mixture thereof (examples No. 1, 2, 7), which allows to obtain a wide range of biocatalysts.
5. Биокатализатор обладает не только необходимой энзиматической активностью, но при этом обеспечивается и надежное удерживание фермента или ферментов в пределах частиц носителя.5. The biocatalyst has not only the necessary enzymatic activity, but it also provides reliable retention of the enzyme or enzymes within the particles of the carrier.
6. Использование в качестве матрицы носителя вязкоупругого нехрупкого материала - криогеля ПВС, практически не подвергаемого абразивному износу, позволяет применять соответствующие биокатализаторы не только в колоночных реакторах со стационарным слоем насадки, но и в реакторах с интенсивным перемешиванием, что существенно ускоряет скорость массообменных биокаталитических процессов.6. The use of a viscoelastic non-brittle material, the PVA cryogel, which is practically not subjected to abrasive wear, as a carrier matrix, allows the use of appropriate biocatalysts not only in column reactors with a stationary packing layer, but also in intensive mixing reactors, which significantly accelerates the rate of mass transfer biocatalytic processes.
5. Благодаря более высокой, по сравнению с прототипом, термостабильности матрицы носителя, т.е. криогеля ПВС в противовес пленочному гелю ПВС, появляется возможность получать заявляемым методом биокатализаторы не только на основе “обычных” ферментов, функционирующих при физиологических температурах (примеры №3-6, 8-10), но и на основе термостабильных ферментов, работающих при повышенных температурах (примеры №1, 2, 7).5. Due to the higher, compared with the prototype, thermal stability of the carrier matrix, ie PVA cryogel as opposed to PVA film gel, it becomes possible to obtain biocatalysts by the claimed method, not only on the basis of “ordinary” enzymes functioning at physiological temperatures (examples No. 3-6, 8-10), but also on the basis of thermostable enzymes working at elevated temperatures (examples No. 1, 2, 7).
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2002122032/13A RU2233327C2 (en) | 2002-08-20 | 2002-08-20 | Biocatalyst and method for its preparing |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2002122032/13A RU2233327C2 (en) | 2002-08-20 | 2002-08-20 | Biocatalyst and method for its preparing |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2233327C2 true RU2233327C2 (en) | 2004-07-27 |
| RU2002122032A RU2002122032A (en) | 2004-09-10 |
Family
ID=33412794
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2002122032/13A RU2233327C2 (en) | 2002-08-20 | 2002-08-20 | Biocatalyst and method for its preparing |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2233327C2 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2461625C2 (en) * | 2010-12-30 | 2012-09-20 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Тульский государственный университет" (ТулГУ) | Composition for producing polymer film for microorganism immobilisation in biosensor analysers |
| RU2528778C2 (en) * | 2011-11-11 | 2014-09-20 | Российская Федерация, От Имени Которой Выступает Министерство Промышленности И Торговли Российской Федерации | Biocatalyst for re-esterification of fats and method for production thereof |
| RU2636041C2 (en) * | 2016-12-20 | 2017-11-17 | Елена Николаевна Ефременко | Immobilized bioacatalyst for bacterial cellulose production |
-
2002
- 2002-08-20 RU RU2002122032/13A patent/RU2233327C2/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| В.И.ЛОЗИНСКИЙ. Криотропное гелеобразование растворов поливинилового спирта. Успехи химии. 67(7), 1998, с.641-655. * |
| Н.GROEGER. Asymmetric synthesis of an (R)-cyanohydrin using enzymes entrapped in lens-shaped gels. Organic Letters. 3(13), 2001, p.1969-1972. * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2461625C2 (en) * | 2010-12-30 | 2012-09-20 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Тульский государственный университет" (ТулГУ) | Composition for producing polymer film for microorganism immobilisation in biosensor analysers |
| RU2528778C2 (en) * | 2011-11-11 | 2014-09-20 | Российская Федерация, От Имени Которой Выступает Министерство Промышленности И Торговли Российской Федерации | Biocatalyst for re-esterification of fats and method for production thereof |
| RU2636041C2 (en) * | 2016-12-20 | 2017-11-17 | Елена Николаевна Ефременко | Immobilized bioacatalyst for bacterial cellulose production |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kokufuta | Functional immobilized biocatalysts | |
| US4148689A (en) | Immobilization of microorganisms in a hydrophilic complex gel | |
| US4478976A (en) | Water-insoluble protein material, its preparation and its use | |
| US4004979A (en) | Preparation of active proteins cross-linked to inactive proteins | |
| Nilsson et al. | The use of bead polymerization of acrylic monomers for immobilization of enzymes | |
| US4464468A (en) | Immobilization of active protein by cross-linking to inactive protein | |
| Chui et al. | Prolonged retention of cross-linked trypsin in calcium alginate microspheres | |
| KR920009499B1 (en) | Process for preparation of porous matters containing an enzyme immobilized by means of pva-gel | |
| JPH01503677A (en) | Immobilization method | |
| Arica et al. | Reversible immobilization of lipase on phenylalanine containing hydrogel membranes | |
| Alloue et al. | Comparison of Yarrowia lipolytica lipase immobilization yield of entrapment, adsorption, and covalent bond techniques | |
| US4276381A (en) | Preparation of immobilized enzymes of microorganisms | |
| Asaduzzaman et al. | Enzyme immobilization: polymer–solvent–enzyme compatibility | |
| Poonsin et al. | Optimal immobilization of trypsin from the spleen of albacore tuna (Thunnus alalunga) and its characterization | |
| RU2233327C2 (en) | Biocatalyst and method for its preparing | |
| Pedersen et al. | Immobilized biocatalysts | |
| US4764467A (en) | Preparation of an insoluble biocatalyst | |
| Baran et al. | Comparison of β‐galactosidase immobilization by entrapment in and adsorption on poly (2‐hydroxyethylmethacrylate) membranes | |
| Lee et al. | Immobilization of aminoacylase by encapsulation in poly‐l‐lysine‐stabilized calcium alginate beads | |
| JPH02212523A (en) | Hydrated spherical polyvinyl alcohol gel and its production | |
| Lozinsky | What new opportunities the use of diverse polymeric cryogels opens for the immobilization of molecules and cells | |
| Lee et al. | Studies of l‐phenylalanine production by immobilised aminoacylase in stabilized calcium alginate beads | |
| JPH0325159B2 (en) | ||
| El-Bendary et al. | Efficient immobilization of Milk clotting enzyme produced by Bacillus sphaericus | |
| JPS6017512B2 (en) | Method for producing insoluble enzymes |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20080821 |