RU2225002C1

RU2225002C1 - Method of revealing light-weight fraction of erythrocytes

Info

Publication number: RU2225002C1
Application number: RU2002117329/15A
Authority: RU
Inventors: кова М.В. Пресн; М.В. Преснякова; В.Г. Сидоркин; А.Н. Сидоркина
Original assignee: Нижегородский государственный научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии
Priority date: 2002-06-28
Filing date: 2002-06-28
Publication date: 2004-02-27
Also published as: RU2002117329A

Abstract

FIELD: biochemical analysis. SUBSTANCE: method, which can be used for diagnosing anemic syndromes and hemostasis system disorders, resides in the following. Venous blood is taken from a patient, citrate blood sample is prepared in a known way, hematocrit capillary is half filled with citrate blood and the other half of capillary is filled with aqueous solution of verografin having density 1.1315 g/cu.cm. Capillary on its verografin side is sealed and centrifuged during 9-10 min in hematocrit centrifuge at 10000-155000 g. Appearance of a small rose-colored cloud over dense red cell sediment is estimated as presence of light-weight fraction of erythrocytes, that is positive test, and absence of that (transparent supernatant) is regarded as negative test. EFFECT: simplified procedure, increased reproducibility of assay, reduced time and material consumption. 4 ex

Description

Изобретение относится к медицине, а конкретно к лабораторной технике выявления легкой фракции эритроцитов, что может быть использовано врачами-лаборантами клинико-диагностических, гематологических и гемостазиологических лабораторий для диагностики анемических синдромов и расстройства системы гемостаза (синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания - ДВС-синдрома). The invention relates to medicine, and in particular to a laboratory technique for detecting a light fraction of red blood cells, which can be used by laboratory assistants of clinical diagnostic, hematological and hemostatic laboratories for the diagnosis of anemic syndromes and disorders of the hemostasis system (disseminated intravascular coagulation syndrome - DIC).

Известен способ определения легкой фракции эритроцитов, основанный на разделении пула эритроцитов путем центрифугирования образцов крови в градиенте плотности раствора фиколверографина заданной удельной плотности (Баркаган З.С., Тамарин И.В. Оценка степени повреждения эритроцитов при диссеминированном внутрисосудистом свертывании крови./ Лаб. дело. -1988. - 4. - С. 35-39). Однако метод имеет существенные недостатки. Он относится к категории макрометодов, и для его выполнения требуется значительное количество реагентов, а также большой объем анализируемой крови (2 мл). Кроме того, процедура определения легкой фракции эритроцитов по этому методу занимает много времени и является достаточно трудоемкой. A known method of determining the light fraction of red blood cells, based on the separation of the red blood cell pool by centrifuging blood samples in the density gradient of a solution of ficolverographin of a given specific density (Barkagan Z.S., Tamarin I.V. Assessment of the degree of damage to red blood cells during disseminated intravascular coagulation. / Lab. . -1988. - 4. - S. 35-39). However, the method has significant drawbacks. It belongs to the category of macro methods, and its implementation requires a significant amount of reagents, as well as a large volume of blood sample (2 ml). In addition, the procedure for determining the light fraction of red blood cells by this method takes a lot of time and is quite time-consuming.

Наиболее близким к предлагаемому техническому решению является микрометод обнаружения легкой фракции эритроцитов, предложенный А.М. Лившицем (Лившиц А. М. Экспресс-метод определения степени повреждения эритроцитов//Лаб. дело. - 1992. - С.25-27). При выполнении способа-прототипа требуется капиллярная кровь, которую получают при проколе пальца. Кровь по одной капле помещают в 4 лунки планшета, в которые последовательно вносят по 0,25 мл раствора верографина 4-х заданных концентраций - 1,115, 1,1170, 1,1225 и 1,1280 г/см³. Содержимое каждой лунки перемешивают. Четыре капилляра заполняют полученными смесями. Каждый из капилляров с одного из торцов герметизируют и центрифугируют 10 минут при 15 000 об./мин, после чего оценивают результаты теста.Closest to the proposed technical solution is a micromethod for detecting a light fraction of red blood cells, proposed by A.M. Livshitsem (Livshits A.M. Express method for determining the degree of damage to red blood cells // Lab. Business. - 1992. - S.25-27). When performing the prototype method requires capillary blood, which is obtained by puncture of the finger. One drop of blood is placed in 4 wells of a tablet into which 0.25 ml of a solution of verographin of 4 predetermined concentrations - 1.115, 1.1170, 1.1225 and 1.1280 g / cm ³ are successively added. The contents of each well are mixed. Four capillaries are filled with the resulting mixtures. Each of the capillaries from one of the ends is sealed and centrifuged for 10 minutes at 15,000 rpm./min, after which the test results are evaluated.

Способ-прототип также имеет недостатки: для его реализации требуется значительное количество исходного (ампульного) раствора верографина на этапе приготовления верографина 4-х заданных концентраций, процедура подготовительных мероприятий при выполнении метода в 4-х капиллярах с растворам верографина различной удельной плотности является достаточно трудоемкой. Для выполнения теста требуется капиллярная кровь, которую получают путем прокола мякоти фаланги пальца, то есть необходима дополнительная процедура, когда у больного исследуется полный комплекс показателей системы гемостаза и кровь при этом забирают из локтевой вены для приготовления плазмы. Кроме того, как показали наши исследования, воспроизводимость этой методики оказалась неудовлетворительной. The prototype method also has drawbacks: its implementation requires a significant amount of the initial (ampoule) solution of verographin at the stage of preparing verographin of 4 predetermined concentrations, the preparatory procedure for performing the method in 4 capillaries with solutions of verographin of different specific gravity is quite laborious. To perform the test, capillary blood is required, which is obtained by puncturing the pulp of the phalanx of the finger, that is, an additional procedure is required when the patient is examined for a full set of indicators of the hemostatic system and blood is taken from the ulnar vein for plasma preparation. In addition, as our studies have shown, the reproducibility of this technique has been unsatisfactory.

Задачей настоящего изобретения является упрощение процедуры выявления легкой фракции эритроцитов, повышение воспроизводимости способа и снижение затрат времени и средств на его выполнение. The objective of the present invention is to simplify the procedure for detecting a light fraction of red blood cells, increasing the reproducibility of the method and reducing the time and cost of its implementation.

Поставленная задача решается за счет того, что у больного из вены забирают кровь, готовят цитратный образец крови известным методом, гематокритный капилляр наполовину заполняют цитратной кровью, а вторую половину капилляра - водным раствором верографина с удельной плотностью 1,1315 г/см³, капилляр со стороны раствора верографина герметизируют и центрифугируют в течение 9-10 мин в гематокритной центрифуге при ускорении 15000-15500 g. При этом после окончания процедуры центрифугирования образца появление розового облачка над плотным седиментом эритроцитов оценивают как наличие в крови легкой фракции эритроцитов (тест положительный), а отсутствие такового (над седиментом эритроцитов надосадочный слой прозрачен) - как отрицательный.The problem is solved due to the fact that blood is taken from a patient from a vein, a citrate blood sample is prepared by a known method, the hematocrit capillary is half filled with citrate blood, and the second half of the capillary is filled with an aqueous solution of verographin with a specific gravity of 1.1315 g / cm ³ , the capillary is the sides of the verographin solution are sealed and centrifuged for 9-10 minutes in a hematocrit centrifuge with an acceleration of 15000-15500 g. In this case, after the end of the centrifugation of the sample, the appearance of a pink cloud over a dense erythrocyte sediment is assessed as the presence of a light fraction of red blood cells in the blood (a positive test), and the absence thereof (above the erythrocyte sediment, the supernatant is transparent) as negative.

Способ выявления легкой фракции эритроцитов осуществляют следующим образом. У больного из вены забирают кровь, готовят цитратный образец путем смешивания цельной крови с 3,8% водным раствором цитрата натрия в соотношении 9: 1, гематокритный капилляр наполовину заполняют цитратной кровью (приблизительно 50 мкл), а вторую половину капилляра - водным раствором верографина (приблизительно 50 мкл) с удельной плотностью 1,1315 г/см³ (рабочий раствор верографина). При этом используют методику подготовки раствора верографина согласно патенту на изобретение 2134421 (Преснякова М.В., Сидоркин В. Г. , Сидоркина А.Н. Способ подготовки раствора верографина для обнаружения легкой фракции эритроцитов). Для приготовления раствора верографина заданной плотности применяют микрометод - смешиваемые жидкости отмеривают с помощью цифрового электронного или механического пипеточного дозатора, а объем добавляемого к воде исходного (ампульного) верографина рассчитывает по формуле
(1+X)•Y=(1•0,998)+Z•X,
где 1 - объем воды в мл (1 мл);
Х - объем исходного (ампульного) верографина, добавляемого к воде (в мл);
Y - заданная плотность смеси воды с ампульным верографином (г/см³);
0,998 - удельная плотность воды при 20^oС (г/см³);
Z - удельная плотность исходного (ампульного) верографина (г/см³).A method for detecting a light fraction of red blood cells is as follows. Blood is taken from a patient from a vein, a citrate sample is prepared by mixing whole blood with a 3.8% aqueous solution of sodium citrate in a ratio of 9: 1, the hematocrit capillary is half filled with citrate blood (approximately 50 μl), and the other half of the capillary is filled with an aqueous solution of verographin ( approximately 50 μl) with a specific gravity of 1.1315 g / cm ³ (working solution of verographin). In this case, a technique is used to prepare a solution of verographin according to the patent for invention 2134421 (Presnyakova M.V., Sidorkin V.G., Sidorkina A.N. A method of preparing a solution of verographin to detect a light fraction of red blood cells). To prepare a solution of verographin of a given density, a micromethod is used - the mixed liquids are measured using a digital electronic or mechanical pipette dispenser, and the volume of the original (ampoule) verographin added to the water is calculated by the formula
(1 + X) • Y = (1 • 0.998) + Z • X,
where 1 is the volume of water in ml (1 ml);
X is the volume of the original (ampoule) verographin added to water (in ml);
Y is the given density of the mixture of water with ampoule verographin (g / cm ³ );
0.998 - specific gravity of water at 20 ^o C (g / cm ³ );
Z is the specific gravity of the initial (ampoule) verographin (g / cm ³ ).

Смысл уравнения заключается в следующем: масса объема смеси (1 мл воды+Х мл ампульного верографина) с запланированной удельной плотностью смеси (Y) в левой части уравнения равна массе 1 мл воды+массе добавленного (X мл) ампупьного верографина исходной удельной плотности (Z). После преобразования уравнения находят X. The meaning of the equation is as follows: the mass of the volume of the mixture (1 ml of water + X ml of ampoule verographin) with the planned specific gravity of the mixture (Y) on the left side of the equation is equal to the mass of 1 ml of water + the mass of the added (X ml) ampoule verographin of the original specific gravity (Z ) After the conversion, the equations find X.

Для приготовления рабочего раствора верографина с удельной плотностью 1,1315 г/см³ по формуле рассчитывает количество матричного (ампульного) раствора верографина, которое следует добавить к 1 мл дистиллированной воды. Уравнение приобретает следующий вид:
(1+X)•1,1315=(1•0,9982)+(1,3594•X).To prepare a working solution of verographin with a specific gravity of 1.1315 g / cm ³ , the amount of the matrix (ampoule) solution of verographin, which should be added to 1 ml of distilled water, is calculated by the formula. The equation takes the following form:
(1 + X) • 1.1315 = (1 • 0.9982) + (1.3594 • X).

Преобразуют уравнение
1,1315+1,1315X=0,9982+1,3594Х;
1,1315-0,9982=1,3594Х-1,1315Х;
0,1333=0,2279Х;
X=0,1333:0,2279=0,585.Transform the equation
1.1315 + 1.1315X = 0.9982 + 1.3594X;
1.1315-0.9982 = 1.3594X-1.1315X;
0.1333 = 0.2279X;
X = 0.1333: 0.2279 = 0.585.

Следовательно, для получения рабочего раствора верографина с удельной плотностью 1,1315 г/см³ к 1 мл воды следует добавить с помощью цифрового пипеточного микродозатора 0,585 мл (585 мкл) ампульного верографина с исходной плотностью 1,3594 г/см³. Общий объем смеси составляет 1,585 мл.Therefore, to obtain a working solution of verographin with a specific gravity of 1.1315 g / cm ^3, 0.585 ml (585 μl) of ampoule verographin with an initial density of 1.3594 g / cm ³ should be added to 1 ml of water using a digital pipette microdoser. The total volume of the mixture is 1.585 ml.

При этом смесь верографина с водой готовится по мере необходимости для использования раствора в течение одного рабочего дня. Так как общий объем приготовленной смеси составляет около 1,5 мл, то этого достаточно, чтобы выполнить 20-25 анализов. Следует заметить, что плотность исходного (ампульного) раствора верографина (Z) из партии приобретенного препарата определяют заранее один раз с помощью пикнометра на аналитических весах известным методом. Полученную величину используют всякий раз при подготовке рабочего раствора верографина. In this case, a mixture of verographin with water is prepared as necessary for using the solution within one working day. Since the total volume of the prepared mixture is about 1.5 ml, this is enough to perform 20-25 analyzes. It should be noted that the density of the initial (ampoule) solution of verographin (Z) from the batch of the purchased preparation is determined in advance once using a pycnometer on an analytical balance by a known method. The resulting value is used every time when preparing a working solution of verographin.

Процедуру заполнения гематокритного капилляра образцом крови и рабочим раствором верографина выполняют следующим образом. Пробирку с цитратной кровью наклоняют под углом 45^o, нижней открытой частью гематокритного капилляра аккуратно касаются поверхности крови. При этом кровь поднимается по капилляру и постепенно его заполняет. Когда капилляр приблизительно наполовину заполнится анализируемым образцом, капилляр извлекают из пробирки и аналогично тем же открытые концом касаются поверхности приготовленного водного раствора верографина заданной удельной плотности. Верографин поднимается по капилляру вверх, продвигая вперед столбик крови. По завершении процедуры заполнения капилляра открытый торец гематокритного капилляра со стороны раствора верографина герметизируют, например пластилином, и осторожно, не встряхивая, помещают в гематокритную центрифугу.The procedure for filling the hematocrit capillary with a blood sample and a working solution of verographin is performed as follows. The tube with citrated blood is tilted at an angle of 45 ^o , the lower open part of the hematocrit capillary gently touch the surface of the blood. In this case, the blood rises along the capillary and gradually fills it. When the capillary is approximately half filled with the analyzed sample, the capillary is removed from the test tube and, similarly, with the same open end, touch the surface of the prepared aqueous solution of verographin of a given specific density. Verographin rises up the capillary, moving forward a column of blood. Upon completion of the capillary filling procedure, the open end face of the hematocrit capillary from the side of the verographine solution is sealed, for example with plasticine, and carefully, without shaking, placed in a hematocrit centrifuge.

Капилляр с образцом крови центрифугируют в течение 9-10 мин в гематокритной центрифуге при ускорении 15000-15500 g. В варианте конкретного выполнения методики использована гематокритная центрифуга "Jouan A-13" (Франция), имеющая скорость вращения ротора 12 000 об./мин и ускорение 15290 g. При использовании иной центрифуги с близкими рабочими параметрами оптимальные результаты получают несколько варьируя длительность процедуры центрифугирования в пределах от 9 до 10 мин. A capillary with a blood sample is centrifuged for 9-10 minutes in a hematocrit centrifuge with an acceleration of 15000-15500 g. In a particular embodiment of the technique, a Jouan A-13 hematocrit centrifuge (France) was used, having a rotor speed of 12,000 rpm and an acceleration of 15,290 g. When using a different centrifuge with close operating parameters, optimal results are obtained by slightly varying the duration of the centrifugation procedure in the range from 9 to 10 minutes.

После окончания процедуры центрифугирования образца появление розового облачка над плотным седиментом эритроцитов оценивают как наличие в крови легкой фракции эритроцитов (тест положительный), а отсутствие такового (над седиментом эритроцитов надосадочный слой прозрачен) - как отрицательный. After the centrifugation of the sample is completed, the appearance of a pink cloud over a dense erythrocyte sediment is assessed as the presence of a light fraction of red blood cells (a positive test), and the absence of it (a supernatant above the erythrocyte sediment is transparent) as negative.

Удельная плотность раствора верографина в дистиллированной воде 1,1315 г/см³ найдена экспериментальным путем при исследовании образцов крови здоровых людей и пациентов, находившихся на лечении в Российском ожоговом центре на базе Нижегородского НИИ травматологии и ортопедии по поводу тяжелой термической травмы. При этом у пострадавших, у которых по данным анализа совокупности различных показателей, характеризующих различные звенья состояния системы гемостаза, был диагностирован ДВС-синдром, тест на наличие в крови легких (поврежденных) эритроцитов был положительным.The specific gravity of a solution of verographin in distilled water 1.1315 g / cm ^{3 was} found experimentally in the study of blood samples of healthy people and patients who were treated in the Russian Burn Center at the Nizhny Novgorod Research Institute of Traumatology and Orthopedics for severe thermal injury. At the same time, in patients who, according to an analysis of a combination of different indicators characterizing various links in the state of the hemostatic system, DIC was diagnosed, a test for the presence of red (damaged) red blood cells in the blood was positive.

Как показали результаты обследования пациентов с термической травмой (свыше 1000 человек) и здоровых людей (более 400 человек), предложенный способ позволял адекватно оценить наличие или отсутствие в образцах крови легкой фракции эритроцитов. Позитивные результаты теста всегда положительно коррелировали с другими данными лабораторного обследования состояния системы гемостаза больных, свидетельствующими о развитии у пострадавших синдрома ДВС. As shown by the results of examination of patients with thermal injury (over 1000 people) and healthy people (more than 400 people), the proposed method allowed us to adequately assess the presence or absence of a light fraction of red blood cells in blood samples. Positive test results have always been positively correlated with other data from a laboratory examination of the state of the hemostatic system of patients, indicating the development of an ICE syndrome in patients.

Вышеизложенное иллюстрируется примерами. The foregoing is illustrated by examples.

Пример 1. Example 1

Больная П-ва А.А. 26 лет ( ист. б-ни 181147) поступила в Нижегородский НИИ травматологии и ортопедии по поводу ожога пламенем II-IIIАБ степени на площади 20% поверхности тела. Индекс тяжести поражения - 22 ЕД. Тест повреждения эритроцитов отрицательный. Прочие показатели состояния системы гемостаза в пределах нормы. Выписалась из института на 43-и сутки после термической травмы в удовлетворительном состоянии. Patient Peninsula A.A. 26 years old (source b-ni 181147) was admitted to the Nizhny Novgorod Research Institute of Traumatology and Orthopedics for a burn with a flame of the II-IIIAB degree on an area of 20% of the body surface. The severity index of the lesion is 22 units. The red blood cell damage test is negative. Other indicators of the state of the hemostatic system are within normal limits. Discharged from the institute on the 43rd day after thermal injury in satisfactory condition.

Пример 2. Пациентка М-ва А.П. 59 лет ( ист. б-ни 186454) поступила в ННИИТО с ожогом паром I-II-IIIA степени на площади 20% поверхности тела. Индекс тяжести поражения - 20 ЕД. Тест-повреждения эритроцитов отрицательный. Другие показатели развернутой коагулограммы в норме, на 17-е сутки после ожога выписалась в удовлетворительном состоянии. Example 2. Patient M-va A.P. 59 years old (source B-NI 186454) was admitted to the NNIITO with a steam burn of I-II-IIIA degree on an area of 20% of the body surface. The severity index of the lesion is 20 units. Red blood cell damage test is negative. Other indicators of the expanded coagulogram are normal; on the 17th day after the burn, it was discharged in satisfactory condition.

Пример 3. Example 3

Пострадавший Л-ин С.М. 57 лет ( ист. б-ни 184247) поступил в институт с ожогами IIIАБ-IV степени на площади 45% поверхности тела. Индекс тяжести поражения - 70 ЕД. Тест повреждения эритроцитов положительный, низкая активность антитромбина III (54%), по данным ортофенатролинового теста - в крови высокое содержание растворимых фибрин-мономерных комплексов - 100 мг/л, положительный этаноловый тест (тест на наличие растворимых фибрин-мономерных комплексов и продуктов деградации фибрина и фибриногена), резко заторможен XIIa-зависимый фибринолиз (120 мин). По данным лабораторного анализа у больного острый ДВС-синдром. Пациент скончался на 6-е сутки после травмы. The injured L-in S.M. 57 years old (source no. 184247) entered the institute with burns of IIIAB-IV degree on an area of 45% of the body surface. The severity index of the lesion is 70 units. The erythrocyte damage test is positive, low antithrombin III activity (54%), according to the orthophenatrolin test, the blood contains a high content of soluble fibrin-monomer complexes - 100 mg / l, a positive ethanol test (test for the presence of soluble fibrin-monomer complexes and fibrin degradation products and fibrinogen), XIIa-dependent fibrinolysis is sharply inhibited (120 min). According to laboratory analysis, the patient has acute DIC. The patient died on the 6th day after the injury.

Пример 4. Example 4

Больной Г-ин В. Р. 61 года ( ист. б-ни 179902) доставлен в Российский ожоговый центр с ожогами пламенем II-IIIAB-IV степени на площади 35% поверхности тела. Индекс тяжести поражения - 95 ЕД. Тест повреждения эритроцитов положительный. Результаты прочих анализов также свидетельствовали о наличии у пострадавшего синдрома ДВС - в крови низкое значение активности антитромбина III (56%), по данным ортофенантролинового теста - высокое содержание растворимых фибрин-мономерных комплексов (160 мг/л), положительный этаноловый тест. XIIа-зависимый фибринолиз заторможен (63 мин). Больной скончался на 30-е сутки после ожога. Patient Mr. V.R. 61 years old (source: no 179902) was delivered to the Russian Burn Center with II-IIIAB-IV degree burns on an area of 35% of the body surface. The severity index of the lesion is 95 units. The red blood cell damage test is positive. The results of other analyzes also indicated the presence of an ICE syndrome in the victim - low antithrombin III activity in the blood (56%), according to the orthophenanthroline test - a high content of soluble fibrin-monomer complexes (160 mg / l), a positive ethanol test. XIIa-dependent fibrinolysis is inhibited (63 min). The patient died on the 30th day after the burn.

Предложенный тест относится к категории микрометодов, отличается высокой воспроизводимостью получаемых результатов, требует для выполнения ничтожно малого количества верографина, характеризуется простотой процедуры проведения теста и минимальной затратой времени для его реализации. The proposed test belongs to the category of micromethods, it is characterized by high reproducibility of the results obtained, it requires a negligible amount of verographin to perform, it is characterized by the simplicity of the test procedure and the minimum time required for its implementation.

Способ обнаружения легкой фракции эритроцитов в образце крови может быть эффективно использован в гемостазиологических лабораториях для диагностики диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови (ДВС-синдрома) в клиниках, где это грозное осложнение встречается наиболее часто (травматология и общая хирургия, комбустиология, акушерство и гинекология), а также быть полезным в гематологических клиниках для обнаружения атипично легких эритроцитов при диагностике предлейкозных анемических синдромов, аутоиммунной гемолитической анемии, гипопластической анемии. The method for detecting a light fraction of red blood cells in a blood sample can be effectively used in hemostasiological laboratories for the diagnosis of disseminated intravascular coagulation (DIC) in clinics where this formidable complication is most common (traumatology and general surgery, combustiology, obstetrics and gynecology), and also be useful in hematological clinics for the detection of atypically light red blood cells in the diagnosis of pre-leukemic anemic syndromes, autoimmune hemolytic anemia, aplastic anemia.

Claims

A method for detecting a light fraction of red blood cells, including blood sampling and centrifugation of a blood sample with a verographin solution, characterized in that the blood for analysis is obtained from a vein, a citrated blood sample is prepared, the capillary is half filled with citrate blood, and the other half is filled with an aqueous solution of verographin with a specific gravity of 1 , 1,315 g / cm ^3, by capillary verografin solution is sealed, centrifuged for 9-10 minutes with an acceleration of 15000-15500 g and the appearance of pink cloud above the dense sediment erythrocytes - light fraction red blood cell test is considered positive, and absence at it - negative.