RU2220614C2

RU2220614C2 - Viburnum extract eliciting antiradical activity

Info

Publication number: RU2220614C2
Application number: RU2001125775/13A
Authority: RU
Inventors: В.Г. Спрыгин; Н.Ф. Кушнерова
Original assignee: Спрыгин Владимир Геннадьевич
Priority date: 2001-09-20
Filing date: 2001-09-20
Publication date: 2004-01-10

Abstract

FIELD: chemical-pharmaceutical industry, medicinal plants. SUBSTANCE: viburnum (Viburnum) waste processing extract from kernels and/or husks and/or oil cake contains complex of oligomeric procyanidines that is prepared by extraction of viburnum kernels and/or husks and/or oil cake with water or an aqueous-ethanol mixture with alcohol content 70 wt.-%, not above. Invention can be used in chemical, biological or chemical- pharmaceutical industry for preparing complex of oligomeric procyanidines eliciting high antiradical activity. Invention provides expanding assortment of vegetable extracts comprising complex of oligomeric procyanidines and eliciting the enhanced antiradical activity. EFFECT: improved preparing method, valuable biological properties of extract. 1 tbl

Description

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается экстракта отходов переработки калины, содержащего комплекс олигомерных процианидинов, обладающих антирадикальнной активностью и использующихся в качестве биологически активной пищевой добавки. The invention relates to the pharmaceutical industry and relates to an extract of waste products of processing of viburnum containing a complex of oligomeric procyanidins with antiradical activity and used as a biologically active food supplement.

Интенсивное воздействие химически и структурно разнообразных факторов загрязнения окружающей среды, включая пестициды, токсические химические отходы, прямой и вторичный сигаретный дым, выхлопные газы, озона, радиации, а также разнообразных видов стресса вызывают сходные токсические эффекты на человеческое здоровье. В многочисленных исследованиях было показано, что эти вредные факторы способствуют образованию огромного количества свободных радикалов, приводящих к оксидативному разрушению липидов, белков и ДНК, активизации прокарциногенеза, ингибированию клеточной и антиоксидантной систем защиты, истощению сульфгидрильных групп, обеспечивающих активность ферментов, изменению гомеостаза кальция, изменению экспрессии генов и индукции аномальных белков, что вносит существенный вклад в патофизиологию заболеваний человека (Florence Т.М. "The role of free radicals in disease." Aust N Z J Ophthalmol 23(1):3-7). The intense effects of chemically and structurally diverse environmental pollution factors, including pesticides, toxic chemical waste, direct and secondary cigarette smoke, exhaust fumes, ozone, radiation, and various types of stress cause similar toxic effects on human health. Numerous studies have shown that these harmful factors contribute to the formation of a huge number of free radicals, leading to oxidative destruction of lipids, proteins and DNA, activation of procarcinogenesis, inhibition of cellular and antioxidant defense systems, depletion of sulfhydryl groups that provide enzyme activity, a change in calcium homeostasis, a change gene expression and induction of abnormal proteins, which makes a significant contribution to the pathophysiology of human diseases (Florence T.M. "The role of free radicals i n disease. "Aust N Z J Ophthalmol 23 (1): 3-7).

В то же время антиоксиданты - ловушки свободных радикалов - являются ингибиторами как стадии инициирования образования свободных радикалов, так и всех дальнейших стадий развития свободнорадикальных процессов, трансформации биомолекул, развития вторичных новообразований и защищают клетки от оксидативного повреждения на всех уровнях (Halliwell В., М. A. Murcia, et al. "Free-Radicals and Antioxidants in Food and in-Vivo - What They Do and How They Work." Crit Rev Food Sci Nutr - 1995, 35(1-2): 7-20). At the same time, antioxidants - free radical traps - are inhibitors of both the initiation stage of free radical formation and all further stages of the development of free radical processes, the transformation of biomolecules, the development of secondary neoplasms and protect cells from oxidative damage at all levels (Halliwell B., M. A. Murcia, et al. "Free-Radicals and Antioxidants in Food and in-Vivo - What They Do and How They Work." Crit Rev Food Sci Nutr - 1995, 35 (1-2): 7-20).

Одним из наиболее широко применяемых видов антиоксидантов, считающихся одной из самых важных пищевых добавок десятилетия, является комплекс олигомерных процианидинов (ОПЦ), получаемый из растительного сырья. В основе данного комплекса лежат две мономерные единицы - катехин и (-)-эпикатехин и их производные. Благодаря способности этих соединений образовывать полимерные структуры, состоящие из 2 и более субъединиц, и образуются комплексы ОПЦ. Важность ОПЦ для здоровья человека настолько велика и применение ОПЦ в различных пищевых продуктах так широко распространено, что для регулирования качества поставляемых на рынок ОПЦ был создан специальный комитет по стандартизации экстрактов из виноградных косточек, из которых комплекс впервые был выделен и которые на сегодня являются основным промышленным источником их получения. Вполне очевидно, что в мире постоянно ведется поиск новых источников промышленного получения ОПЦ. One of the most widely used types of antioxidants, considered one of the most important food additives of the decade, is a complex of oligomeric procyanidins (OPC), obtained from plant materials. This complex is based on two monomer units - catechin and (-) - epicatechin and their derivatives. Due to the ability of these compounds to form polymer structures consisting of 2 or more subunits, OPC complexes are formed. The importance of OPC for human health is so great and the use of OPC in various food products is so widespread that in order to regulate the quality of the OPC delivered to the market, a special committee was created to standardize grape seed extracts, of which the complex was first isolated and which today are the main industrial source of their receipt. It is quite obvious that the world is constantly searching for new sources of industrial production of OPC.

Известен экстракт остаточных фракций винограда после выжимки, состоящий в основном из катехина, эпикатехина и галловой кислоты, обладающий защитным действием против ионизирующего или неионизирующего электромагнитного излучения, полученный экстракцией органическими растворителями остаточных фракций винограда после выжимки (п. РФ 2162703)
Известен сухой экстракт кустарника леспедецы двухцветной, обладающий антиоксидантной активностью, полученный путем трехкратной экстракции органическим растворителем одеревеневших побегов и/или коры дальневосточного кустарника леспедецы двухцветной с последующим упариванием и высушиванием в вакууме полученного экстракта (п. РФ 2133621).Known extract of residual grape fractions after squeezing, consisting mainly of catechin, epicatechin and gallic acid, which has a protective effect against ionizing or non-ionizing electromagnetic radiation, obtained by extraction with organic solvents of residual grape fractions after squeezing (p. RF 2162703)
Known for dry extract of the bush of the birch birch bark, possessing antioxidant activity, obtained by triple extraction with an organic solvent of woody shoots and / or the bark of the Far Eastern birch bush birch bark with subsequent evaporation and drying in vacuum of the obtained extract (paragraph RF 2133621).

Известен сухой экстракт комплекса ОПЦ из земляных орехов, полученный экстракцией водным раствором хлорида натрия, отделением экстракта от примесей, обработкой водного раствора экстракта этилацетатом, затем избытком хлороформа до выделения осадка, содержащего ОПЦ, и последующей очисткой комплекса осаждением его из этилацетатного раствора хлороформом (п. США 3436707). A dry extract of the OPC complex from peanuts is known, obtained by extraction with an aqueous solution of sodium chloride, separating the extract from impurities, treating the aqueous solution of the extract with ethyl acetate, then with excess chloroform until the precipitate containing OPC is isolated, and then purifying the complex by precipitation of it from the ethyl acetate solution with chloroform (p. U.S. 3436707).

Известен сухой экстракт комплекса ОПЦ из зеленых листьев "гинго билоба" путем экстракции измельченных листьев водным ацетоном при нагревании, концентрирования полученного раствора, фильтрации, подщелачивания для осаждения ОПЦ, отделения осадка ОПЦ, подкисления фильтрата, экстракции кетоном в присутствии сульфата аммония и последующей сушкой кетоновой фазы, что позволяет получить выход ОПЦ до 35%. A dry extract of the OPC complex from green leaves of “gingo biloba” is known by extracting the crushed leaves with aqueous acetone while heating, concentrating the resulting solution, filtering, alkalizing to precipitate the OPC, separating the OPC precipitate, acidifying the filtrate, extracting with ketone in the presence of ammonium sulfate and then drying the ketone phase that allows you to get the output of the OPC to 35%.

Известен сухой экстракт листьев Аронии черноплодной, содержащий ОПЦ и обладающий антиоксидантной активностью, полученный экстракцией криопорошка листьев Аронии черноплодной, собранных перед началом и в период цветения, кипящим водным спиртом с последующим отделением водно-спиртовых извлечений, концентрированием их до водного раствора, фильтрацией, очисткой фильтрата петролейным или диэтиловым эфиром, экстракцией водного остатка смесью диэтилацетата и спирта и последующим получением сухого остатка (п. РФ 2171111). A dry extract of Aronia chokeberry leaves is known, containing OPC and possessing antioxidant activity, obtained by extraction of cryopowder of Aronia chokeberry leaves, collected before and during flowering, with boiling aqueous alcohol, followed by separation of water-alcohol extracts, their concentration to an aqueous solution, filtration, and filtrate purification petroleum or diethyl ether, extraction of the aqueous residue with a mixture of diethyl acetate and alcohol and the subsequent receipt of a dry residue (paragraph RF 2171111).

Таким образом, экстракты, содержащие комплекс ОПЦ, получают, как правило, из такого растительного сырья, которое либо не имеет широкого распространения на территории России, либо совсем не встречается либо требует специального выращивания, особой обработки и глубокой очистки, что приводит к получению сухого экстракта. Thus, extracts containing the OPC complex are obtained, as a rule, from such plant materials that either are not widely distributed in Russia, or are not found at all, or require special cultivation, special processing and deep purification, which leads to a dry extract .

Наиболее близким к заявляемому является экстракт стандартизованного ОПЦ комплекса из коры сосны (Pinus maritima) с торговым названием "Пикногенол" производства компании Stryka Botanicals (USA), получаемый путем водного извлечения размолотой в порошок коры сосны с последующим доэкстрагированием этилацетатом. Затем водный экстракт подвергают лиофилизации, а этилацетатный экстракт упаривают при пониженной температуре и полученные сухие остатки объединяют. Согласно литературным данным это единственный ОПЦ комплекс на рынке, который имеет стабильный состав и высокую биологическую активность (Packer L., G. Rimbach, et al. "Antioxidant activity and biologic properties of a procyanidin-rich extract from pine (Pinus maritima) bark, pycnogenol." Free Radic Biol Med - 1999, 27 (5-6): р 704-724). Однако используемая для получения экстракта ОПЦ сосна произрастает в основном в Канаде и плохо приживается в других районах мира, что в какой-то степени ограничивает использование полученного экстракта. Closest to the claimed is an extract of a standardized OPC complex from pine bark (Pinus maritima) under the trade name "Pycnogenol" manufactured by Stryka Botanicals (USA), obtained by aqueous extraction of milled pine bark into powder, followed by further extraction with ethyl acetate. Then, the aqueous extract is lyophilized, and the ethyl acetate extract is evaporated at a reduced temperature and the resulting dry residues are combined. According to published data, this is the only OPC complex on the market that has a stable composition and high biological activity (Packer L., G. Rimbach, et al. "Antioxidant activity and biologic properties of a procyanidin-rich extract from pine (Pinus maritima) bark, pycnogenol. "Free Radic Biol Med - 1999, 27 (5-6): p 704-724). However, the pine used to obtain the OPC extract grows mainly in Canada and does not take root well in other parts of the world, which to some extent limits the use of the obtained extract.

Технической задачей изобретения является расширение ассортимента экстрактов растительного происхождения, содержащих комплекс ОПЦ и обладающих повышенной антирадикальной активностью, из более доступных сырьевых источников. An object of the invention is to expand the range of plant extracts containing a complex of OPC and having increased antiradical activity from more available raw materials.

Поставленная задача решается экстрактом калины, обладающим антирадикальной активностью, полученным экстракцией косточек, и/или отжима, и/или жмыха калины (Viburnum) водой или водно-этанольной смесью с содержанием спирта не более 70 мас.%. The problem is solved by a viburnum extract having anti-radical activity obtained by extracting seeds, and / or squeezing, and / or cake viburnum (Viburnum) with water or an aqueous-ethanol mixture with an alcohol content of not more than 70 wt.%.

Калина (Viburnum) представляет собой крупный ветвистый древовидный кустарник или деревце семейства жимолостных. Распространена на всей европейской территории, в Сибири, горных районах Кавказа и Крыма, в Восточном Казахстане. Viburnum (Viburnum) is a large branchy tree-like shrub or tree of the family honeysuckle. Distributed throughout the European territory, in Siberia, the mountainous regions of the Caucasus and Crimea, in East Kazakhstan.

Плоды калины (Fructus Viburni) обладают противоспазматическим действием, понижают кровяное давление и повышают диурез. Известно использование плодов калины для приготовления настоев и отваров, которые используют при простуде, осипшем голосе, кашле. Плоды входят в состав различных лекарственных сборов (ГФ XI изд., ст.40, М.: Медицина, 1989 г.). The fruits of viburnum (Fructus Viburni) have an antispasmodic effect, lower blood pressure and increase diuresis. It is known to use the fruits of viburnum for the preparation of infusions and decoctions, which are used for colds, hoarse voices, and coughs. The fruits are part of various medicinal fees (GF XI ed., Article 40, M .: Medicine, 1989).

Сок калины входит в состав киселей, компотов, желе, мармелада, а из плодов калины получают жирорастворимые витамины, содержащиеся в косточках (п. РФ 2075953). Viburnum juice is a part of jelly, stewed fruit, jelly, marmalade, and fat-soluble vitamins contained in seeds are obtained from viburnum fruits (Section RF 2075953).

Отжим и жмых калины являются отходом и об их свойствах и практическом применении сведений не обнаружено. Press and cake viburnum are waste and no information was found on their properties and practical application.

Проведенные нами исследования показали, что водный или водно-этанольный экстракты косточек, и/или отжима, и/или жмыха калины содержат комплекс ОПЦ, обладающий высокой антирадикальной активностью за счет повышенного содержания в них высокобиодоступной водорастворимой фракции. Our studies have shown that aqueous or water-ethanol extracts of seeds, and / or squeeze, and / or cake of viburnum contain a complex of OPC, which has a high antiradical activity due to the increased content of a highly bioavailable water-soluble fraction in them.

Основным источником комплекса ОПЦ, отвечающего за антирадикальную активность экстракта, служат косточки калины, которые являются и основным компонентом как отжима, так и жмыха калины. Однако отделение косточек от отжима или жмыха, которые являются отходом и далее не используется, - операция трудоемкая и не обязательная, поскольку последние, состоящие дополнительно, как правило, из кистей без ягод и/или кожицы, также содержат другие биологически активные полифенолы и не только не мешают, но и несколько увеличивают выход биологически активных веществ. Таким образом, косточки, отжим и жмых калины являются взаимозаменяемым источником для получения экстракта, содержащего комплекс ОПЦ. The main source of the OPC complex, which is responsible for the anti-radical activity of the extract, are viburnum bones, which are the main component of both squeezing and cake of viburnum. However, the separation of the seeds from the squeeze or cake, which is a waste and is not further used, is a laborious and not necessary operation, since the latter, consisting additionally, as a rule, of brushes without berries and / or skin, also contain other biologically active polyphenols and not only they do not interfere, but they also slightly increase the yield of biologically active substances. Thus, the seeds, squeeze and cake of viburnum are an interchangeable source for obtaining an extract containing a complex of OPC.

Экстракт получают следующим образом. The extract is prepared as follows.

Сырье - косточки, и/или отжим, и/или жмых калины (Viburnum) - помещают в емкость, заливают экстрагентом - водой или водно-этанольной смесью и проводят экстракцию. Raw materials - seeds, and / or squeezing, and / or viburnum cake (Viburnum) - are placed in a container, filled with extractant - water or water-ethanol mixture and carry out the extraction.

Экстракцию можно осуществить и любым другим известным приемом, например методом реперколяции. Как правило, используют водно-спиртовую смесь с концентрацией спирта не выше 70 мас.%, так как при повышении концентрации спирта в экстракте повышается содержание высокомолекулярных процианидинов и уменьшается количество высокобиодоступной фракции низкомолекулярных водорастворимых ОПЦ, что приводит к снижению антирадикальной активности экстракта. Extraction can be carried out by any other known technique, for example, by repercolation. As a rule, a water-alcohol mixture with an alcohol concentration of not higher than 70 wt.% Is used, since with an increase in the alcohol concentration in the extract, the content of high molecular weight procyanidins increases and the amount of the highly bioavailable fraction of low molecular weight water-soluble OPC decreases, which leads to a decrease in the antiradical activity of the extract.

Выход экстракта составляет 1 литр на 1 кг исходного сырья, при этом 1 г экстракта содержит 250 мг сухих веществ, из которых 103 мг являются полифенольными соединениями, обладающими биологической активностью. При этом водорастворимая фракция, являющаяся наиболее биодоступной, составляет в полученном экстракте около 30 мг, что превышает ее содержание в "Пигногеноле". В состав полученного экстракта по данным хроматографического анализа входят феноловые кислоты, мономерные катехины, низкомолекулярные олигомерные процианидины со степенью полимеризации от 2 до 4 и высокомолекулярные процианидины со степенью полимеризации от 5 и выше. The yield of the extract is 1 liter per 1 kg of feedstock, while 1 g of the extract contains 250 mg of solids, of which 103 mg are polyphenolic compounds with biological activity. In this case, the water-soluble fraction, which is the most bioavailable, is about 30 mg in the obtained extract, which exceeds its content in Pygnogenol. The composition of the extract according to chromatographic analysis includes phenolic acids, monomeric catechins, low molecular weight oligomeric procyanidins with a degree of polymerization from 2 to 4 and high molecular weight procyanidins with a degree of polymerization from 5 and above.

Поскольку известно, что именно водорастворимая фракция ОПЦ комплекса обладает наибольшей биодоступностью, ее выделяют из экстракта и анализируют. Since it is known that it is the water-soluble fraction of the OPC complex that has the highest bioavailability, it is isolated from the extract and analyzed.

Выделение водорастворимой фракции осуществляют следующим способом. Исходный экстракт упаривают на роторном испарителе до 1/2 объема для удаления спирта, выпавший осадок удаляют центрифугированием, а оставшийся раствор доводят дистиллированной водой до первоначального объема. The selection of a water-soluble fraction is carried out in the following way. The initial extract was evaporated on a rotary evaporator to 1/2 volume to remove alcohol, the precipitated precipitate was removed by centrifugation, and the remaining solution was brought to the original volume with distilled water.

В качестве препарата сравнения антирадикальной активности нами был использован "Пикногенол" - экстракт комплекса ОПЦ, полученный из коры сосны-прототип. Для сравнительного анализа приготовили водный раствор Пикногенола со средним для растительных извлечений содержанием сухих веществ - 7 мг/мл. As a drug for comparing antiradical activity, we used Pycnogenol, an extract of the OPC complex, obtained from prototype pine bark. For comparative analysis, an aqueous solution of Pycnogenol was prepared with an average dry matter content of 7 mg / ml for plant extracts.

Для количественного определения содержания полифенолов, к классу которых относятся феноловые кислоты, катехины и проантоцианидины, используют колориметрический метод с реактивом Фолина-Чикалтео, являющийся официальным методом, принятым в ISO. Метод основан на способности полифенольных соединений, содержащих гидроксильные группы, взаимодействуя с реагентом, образовывать синий хромофор, интенсивность которого напрямую связана с количеством полифенольных соединений. Данный метод позволяет определять в смеси веществ количественно ту часть, которая обладает способностью выступать в качестве восстановителя-антиоксиданта, т.е. определять комплексы ОПЦ. To quantify the content of polyphenols, which include phenolic acids, catechins and proanthocyanidins, use the colorimetric method with the Folin-Cicalteo reagent, which is the official method adopted in ISO. The method is based on the ability of polyphenolic compounds containing hydroxyl groups, interacting with the reagent, to form a blue chromophore, the intensity of which is directly related to the number of polyphenolic compounds. This method allows you to quantify in a mixture of substances that part that has the ability to act as an antioxidant reducing agent, i.e. determine the complexes of the OPC.

Известно, что феноловые кислоты и мономерные катехины в значительном количестве присутствуют в других растениях, употребляемых в пищу, ягодах и фруктах, и поэтому основная ценность полученного из косточек, или отжима, или жмыха калины экстракта состоит в содержании олигомерных процианидинов, которыми по определению комитета по стандартизации экстрактов из виноградных косточек от 13 марта, 1999 являются процианидины состоящие из двух или более мономеров (С. Santos-Buelga and A. Scalbert "Proanthocyanidins and tannin-like compounds - nature, occurrence, dietary intake and effects on nutrition and health". Journal of Agricultural and Food Chemistry - 2000, 80(7): 1094-1117). В связи с этим для оценки качества препаратов с комплексом ОПЦ, полученных из косточек, или отжима, или жмыха калины и из прототипа - "Пигногенола", из суммарного экстракта отделяют феноловые кислоты и мономерные катехины путем фракционирования. It is known that phenolic acids and monomeric catechins are present in significant quantities in other plants used in food, berries and fruits, and therefore the main value of the extract obtained from the seeds, or squeezed, or oil cake is the content of oligomeric procyanidins, which, by definition, standardization of grape seed extracts dated March 13, 1999 are procyanidins consisting of two or more monomers (C. Santos-Buelga and A. Scalbert "Proanthocyanidins and tannin-like compounds - nature, occurrence, dietary intake and effects on nutrition and health". Journ al of Agricultural and Food Chemistry - 2000, 80 (7): 1094-1117). In this regard, to assess the quality of drugs with a complex of OPC obtained from the seeds, or squeeze, or cake of viburnum and from the prototype “Pygnogenol”, phenolic acids and monomeric catechins are separated from the total extract by fractionation.

Фракционирование ОПЦ проводят по методу, описанному в работе Sun. В. с соавторами (Sun В. S. , С. Leandro, et al. "Separation of grape and wine proanthocyanidins according to their degree of polymerization." Journal of Agricultural and Food Chemistry - 1998, 46(4):1390-1396). Для этого 7 мг соответствующего ОПЦ (прототип и по заявляемому способу) растворяют в 5 мл дистиллированной воды и доводят рН раствора до 7 титрованием 0,1 Н едким натром. Затем образец пропускают через два предварительно подготовленных и соединенных для увеличения экстракционной емкости патрона Sep Pak C₁₈ (500 mg сорбента в каждом) (Waters, USA). Экстракционную колонку после нанесения образца элюируют 10 мл воды (рН 7) для удаления феноловых кислот и объединяют с образцом, собранным после нанесения (Фракция I). После просушивания экстракционных патронов в токе азота патроны элюируют сначала 20 мл этилацетата для элюирования мономерных катехинов, низкомолекулярных процианидинов (n<5) и других небольших фенольных молекул (Фракции II+III), а затем 10 мл метанола для элюирования полимерных проциандинов (n≥5) (Фракция IV). Далее для разделения мономерных катехинов и олигомерных процианидинов Фракцию II+III упаривают досуха в ваккуме при температуре ниже 25^oС, диспергируют в 10 мл дистиллированной воды и наносят на те же экстракционные патроны, предварительно промытые дистиллированной водой. После высушивания патронов в токе азота разделение мономерных катехинов и олигомерных процианидинов проводят последовательным элюированием 20 мл диэтилового эфира (мономерные катехины Фракция - II) и 10 мл метанола (Олигомерные процианидины - Фракция III).Fractionation of the OPC is carried out according to the method described in the work of Sun. B. et al. (Sun B. S., S. Leandro, et al. "Separation of grape and wine proanthocyanidins according to their degree of polymerization." Journal of Agricultural and Food Chemistry - 1998, 46 (4): 1390-1396 ) To do this, 7 mg of the corresponding OPC (prototype and by the present method) is dissolved in 5 ml of distilled water and the pH of the solution is adjusted to 7 by titration with 0.1 N sodium hydroxide. Then the sample is passed through two previously prepared and connected to increase the extraction capacity of the Sep Pak C ₁₈ cartridge (500 mg of sorbent in each) (Waters, USA). After applying the sample, the extraction column was eluted with 10 ml of water (pH 7) to remove phenolic acids and combined with the sample collected after application (Fraction I). After drying the extraction cartridges in a nitrogen stream, the cartridges first elute with 20 ml of ethyl acetate to elute the monomeric catechins, low molecular weight procyanidins (n <5) and other small phenolic molecules (Fractions II + III), and then 10 ml of methanol to elute the polymer procyandines (n≥5 ) (Fraction IV). Further, to separate monomeric catechins and oligomeric procyanidins, the fraction II + III is evaporated to dryness in vacuo at a temperature below 25 ^o C, dispersed in 10 ml of distilled water and applied to the same extraction cartridges, previously washed with distilled water. After drying the cartridges in a stream of nitrogen, the separation of monomeric catechins and oligomeric procyanidins is carried out by successive elution of 20 ml of diethyl ether (monomeric catechins Fraction II) and 10 ml of methanol (Oligomeric procyanidins Fraction III).

Полноту разделения контролируют по содержанию мономерных катехинов во Фракциях I, II, III методом ВЭЖХ (Ding М., Н. Yang, et al. "Rapid, direct determination of polyphenols in tea by reversed-phase column liquid chromatography. " J Chromatogr A - 1999, 849(2): p. 637-640). В работе используют хроматограф LKB (Bromma, Sweden), состоящий из ВЭЖХ насоса LKB 2150, быстрого спектрального детектора LKB 2140, оснащенного диодной регистрирующей решеткой в диапазоне 190-370 нм и станцией для обработки данных Wallac 1224 с установленным пакетом прикладных программ Wavescan Software (Sweden) и Nelson Chromatography Software, вер. 2,60 для получения и обработки данных с быстрого спектрального детектора. Регистрацию ведут в диапазоне 270-280 нм. Хроматографию проводят на колонке 5 мкм Lichrosorb RP18 (250•4 мм) (LKB, Sweden), которую элюируют в изократном режиме системой растворителей метанол:вода:уксусная кислота (30:70:01) об/об, скорость элюирования 0,6 мл/мин. The completeness of the separation is monitored by the content of monomeric catechins in Fractions I, II, III by HPLC (Ding M., N. Yang, et al. "Rapid, direct determination of polyphenols in tea by reversed-phase column liquid chromatography." J Chromatogr A - 1999, 849 (2): p. 637-640). We use an LKB chromatograph (Bromma, Sweden), consisting of an LKB 2150 HPLC pump, an LKB 2140 fast spectral detector equipped with a diode detection array in the 190-370 nm range and a Wallac 1224 data processing station with the installed Wavescan Software application package (Sweden ) and Nelson Chromatography Software, ver. 2.60 for receiving and processing data from a fast spectral detector. Registration is carried out in the range of 270-280 nm. Chromatography was performed on a 5 μm Lichrosorb RP18 column (250 * 4 mm) (LKB, Sweden), which was eluted in isocratic mode with a solvent system methanol: water: acetic acid (30:70:01) v / v, elution rate 0.6 ml / min

Суммарное содержание полифенольных соединений, к классу которых относятся и вещества, входящие в комплекс ОПЦ, во фракциях определяют с помощью метода Фолина-Чикалтео, описанного в работе V.L. Singleton, R.Orthofer, R.M. Lamuela-Raventos "Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu reagent" in Meth. Enzymol, Academic Press Inc. , San-Diego, Vol. 299, 152-178, 1999. Суммарное количество полифенолов выражают в мг-экв галловой кислоты (ГК), которое определяют по калибровочной кривой в диапазоне 0,7-20 мкг галловой кислоты на пробу. Для определения в аликвоту из фракции объемом 200 мкл добавляют 100 мкл реактива Фолина (кислотный эквивалент соответствовал 1 Н) и 400 мкл 20% раствора карбоната натрия и объем пробы доводят до 2 мл дистиллированной водой. Реакционную смесь инкубируют при 70^oС в течение 10 мин и после охлаждения и центрифугирования для удаления образовавшейся взвеси замеряют абсорбцию при 700 нм (Ultraspek II спектрофотометр, LKB, Sweden) против бланка, содержащего реагенты и воду вместо образца. В случае, если полученная величина абсорбции выходит за пределы калибровочного графика, образец разводят и измерение повторяют. Все измерения проводят не менее 3 раз. В нашем случае 1 мг ОПЦ был равен 0,95±0,013 мг ГК.The total content of polyphenolic compounds, to the class of which the substances included in the OPC complex are also classified, in fractions is determined using the Folin-Cicalteo method described in VL Singleton, R. Orthofer, RM Lamuela-Raventos "Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu reagent "in Meth. Enzymol, Academic Press Inc. , San-Diego, Vol. 299, 152-178, 1999. The total amount of polyphenols is expressed in mEq gallic acid (HA), which is determined by the calibration curve in the range of 0.7-20 μg gallic acid per sample. To determine an aliquot from a fraction of 200 μl, add 100 μl of Folin's reagent (acid equivalent to 1 N) and 400 μl of a 20% sodium carbonate solution and the sample volume is adjusted to 2 ml with distilled water. The reaction mixture was incubated at 70 ^{° C.} for 10 minutes and after cooling and centrifugation to remove the suspension, the absorbance was measured at 700 nm (Ultraspek II spectrophotometer, LKB, Sweden) against a blank containing reagents and water instead of the sample. If the obtained absorption value is outside the calibration graph, the sample is diluted and the measurement is repeated. All measurements are carried out at least 3 times. In our case, 1 mg of OPC was equal to 0.95 ± 0.013 mg of HA.

В результате фракционирования получают фракции, содержащие:
A) Фенольные кислоты;
Б) Мономерные катехины;
B) Низкомолекулярные олигомеры, включающие процианидины В1-В4, тримеры, тетрамеры;
Г) Высокомолекулярные олигомеры (n≥5) и полимеры.As a result of fractionation, fractions are obtained containing:
A) Phenolic acids;
B) Monomeric catechins;
B) Low molecular weight oligomers including procyanidins B1-B4, trimers, tetramers;
D) High molecular weight oligomers (n≥5) and polymers.

Идентификацию соединений во фракциях проводят на основании их УФ спектров поглощения, полученных с помощью хроматографического детектора "Диодная решетка", в сравнении с истинными стандартами для катехина и (-)-эпикатехина. Идентификацию Процианидинов В1-В4, тримеров и тетрамеров осуществляют на основании их УФ спектров и масс-спектрометрии лазерной десорбцией (MFLDI-TOF), собранных при хроматографии пиков по методике, описанной в работе (Krueger С. G., N.С. Dopke, et al. "Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass-spectrometry of polygalloyl polyflavan-3-ols in grape seed extract." J Agric Food Chem - 2000, 48(5): р 1663-1667). ВЭЖХ профиль Фракции II+III, содержащий мономерные катеины и низкомолекулярные процианидины, приведен на чертеже. Compounds in fractions are identified based on their UV absorption spectra obtained using a Diode Array chromatographic detector, in comparison with the true standards for catechin and (-) - epicatechin. Identification of Procyanidins B1-B4, trimers and tetramers is carried out on the basis of their UV spectra and laser desorption mass spectrometry (MFLDI-TOF), collected by peak chromatography according to the procedure described in (Krueger C. G., N. C. Dopke, et al. "Matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass-spectrometry of polygalloyl polyflavan-3-ols in grape seed extract." J Agric Food Chem - 2000, 48 (5): p 1663-1667). The HPLC profile of Fraction II + III containing monomeric cateins and low molecular weight procyanidins is shown in the drawing.

Антирадикальную активность полученных фракций определяют по их способности восстанавливать стабильный радикал 2,2'-азинобис-(3-этилбензотиазолин-6-сульфонат (ABST^·+, которую оценивают по снижению величины абсорбции при длине волны 734 нм (Re, R., N. Pellegrini, et al. "Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay", - Free Radic Biol Med - 1999, 26(9-10): p 1231-1237). Количественно антирадикальную активность полученных фракций выражают в ТЭАС (Тролоксовый эквивалент антирадикальной способности). За одну единицу ТЭАС принимают антирадикальную активность 1 мкМ Тролокса (водорастворимого синтетического аналога витамина Е). Для расчета величин ТЭАС полученных фракций строят калибровочный график в диапазоне от 1,25 до 40 нМ (0,3125 до 10 мкг) Тролокса.The antiradical activity of the obtained fractions is determined by their ability to restore the stable radical 2,2'-azinobis- (3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonate (ABST ^{· +)} , which is evaluated by the decrease in absorbance at a wavelength of 734 nm (Re, R., N. Pellegrini, et al. "Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay", - Free Radic Biol Med - 1999, 26 (9-10): p 1231-1237). The antiradical activity of the obtained fractions is quantified in TEAC (Trolox equivalent antiradical ability). The antiradical activity of 1 μM Trolox is taken for one TEAS unit (water growth a certain synthetic analogue of vitamin E. For the calculation of TEAS values of the obtained fractions, a calibration graph is built in the range from 1.25 to 40 nM (0.3125 to 10 μg) of Trolox.

В таблице представлены результаты определения антирадикальной активности отдельных фракций экстракта из отжима калины, косточек калины и Пикногенола. Данные по косточкам калины приведены в скобках. Из результатов видно, что экстракт, полученный как из косточек калины, так и из отжима, значительно превосходит по антирадикальной активности препарат сравнения Пикногенол, причем как по относительной активности (ТЕАС/мг) суммарного препарата - 258,09 против 39,79, так и по активности отдельных фракций. The table presents the results of determining the antiradical activity of individual fractions of the extract from the squeezed squeeze extract, the seeds of viburnum and Pycnogenol. Data on the seeds of viburnum are given in parentheses. It can be seen from the results that the extract obtained from both viburnum seeds and squeeze significantly exceeds the comparison drug Pycnogenol in antiradical activity, and both in relative activity (TEAC / mg) of the total preparation - 258.09 versus 39.79, and by the activity of individual fractions.

Данные результаты свидетельствуют, что экстракт калины, полученный из отходов переработки калины (Viburnum) - косточек, отжима или жмыха, содержит легко получаемый комплекс ОПЦ, обладает высокими активностными антирадикальными характеристиками, позволяющими использовать его в качестве, например, биологически активной добавки к пище. These results indicate that the viburnum extract obtained from the waste products of viburnum (Viburnum) - seeds, squeezed or cake, contains an easily obtainable complex of OPC, has high activity antiradical characteristics, allowing it to be used as, for example, a biologically active food supplement.

Claims

Viburnum extract having anti-radical activity obtained by extraction of seeds, and / or squeezing, and / or cake of Viburnum (Viburnum) with water or water-ethanol mixture with an alcohol content of not more than 70 wt.%.