RU2218414C2 - Method for integration of multiple polymerase reactions of amplification with following analysis of amplified sequences on biochip directly - Google Patents
Method for integration of multiple polymerase reactions of amplification with following analysis of amplified sequences on biochip directly Download PDFInfo
- Publication number
- RU2218414C2 RU2218414C2 RU2001112429A RU2001112429A RU2218414C2 RU 2218414 C2 RU2218414 C2 RU 2218414C2 RU 2001112429 A RU2001112429 A RU 2001112429A RU 2001112429 A RU2001112429 A RU 2001112429A RU 2218414 C2 RU2218414 C2 RU 2218414C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- primers
- immobilized
- primer
- biochip
- sequence
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к молекулярной биологии, биоорганической химии, генетике, геномике и описывает новый подход к анализу нуклеотидных последовательностей в экспериментальном образце с использованием описанного ранее устройства-микрочипа с иммобилизованными на его поверхности в гелевых ячейках олигонуклеотидами.FIELD OF THE INVENTION
The invention relates to molecular biology, bioorganic chemistry, genetics, genomics, and describes a new approach to the analysis of nucleotide sequences in an experimental sample using the microchip device described above with oligonucleotides immobilized on its surface in gel cells.
Уровень техники
Гибридизация ДНК с олигонуклеотидными биочипами - эффективный подход для параллельного анализа большого числа специфических последовательностей (1, 2). Обычно исследуемые последовательности должны быть амплифицированы (размножены) перед гибридизацией путем проведения множественных полимеразных цепных реакций (ПЦР) во многих раздельных пробирках или лунках. Эта процедура довольно дорогая и требует много времени в случае исследования вариаций последовательностей в масштабах геномной ДНК. Например, тысячи независимых ПЦР должны быть проведены в случае исследования полиморфизма в ДНК генома человека. Популярный сегодня метод проведения ПЦР для нескольких различных последовательностей параллельно в одной пробирке ограничен вследствие проблем, возникающих из-за трудно контролируемых взаимодействий между олигонуклеотидами, используемыми в качестве затравки (праймеров) для размножения различных последовательностей путем проведения ПЦР. Осуществление привлекательной идеи проведения ПЦР или иной реакции амплификации (размножения) ДНК прямо на биочипе, интегрирование этой реакции с анализом амплифицируемых последовательностей могло бы быть качественным продвижением и существенным упрощением анализа нуклеотидных последовательностей с использованием биочипов. Недавно был описан метод амплификации па биочипе, в котором оба необходимых для индивидуального ПЦР олигонуклеотида (праймера) были постоянно иммобилизованы в определенном месте (ячейке) биочипа. Этот метод, или "Мост ПЦР" (3), существенно менее эффективен, чем обычный ПЦР в растворе, из-за физических проблем, возникающих при образовании двухцепочечных молекул ДНК, прикрепленных к поверхности биочипа на обоих концах. Высвобождение амплифицированного фрагмента ДНК и одного (или двух) праймера(ов) могло бы существенно повысить эффективность ПЦР.State of the art
DNA hybridization with oligonucleotide biochips is an effective approach for the parallel analysis of a large number of specific sequences (1, 2). Typically, test sequences should be amplified (multiplied) before hybridization by performing multiple polymerase chain reactions (PCR) in many separate tubes or wells. This procedure is quite expensive and requires a lot of time in the case of studies of sequence variations on the scale of genomic DNA. For example, thousands of independent PCRs should be performed if polymorphisms in the DNA of the human genome are examined. Today's popular PCR method for several different sequences in parallel in the same tube is limited due to problems arising from difficult to control interactions between oligonucleotides used as primers for multiplication of different sequences by PCR. Implementation of the attractive idea of conducting PCR or another DNA amplification (multiplication) reaction directly on the biochip, integrating this reaction with the analysis of amplified sequences could be a qualitative advance and a significant simplification of the analysis of nucleotide sequences using biochips. The method of amplification on a biochip has recently been described, in which both oligonucleotides (primers) necessary for individual PCR were constantly immobilized in a specific place (cell) of the biochip. This method, or "PCR Bridge" (3), is significantly less effective than conventional PCR in solution, due to physical problems that arise when double-stranded DNA molecules are attached to the surface of the biochip at both ends. The release of the amplified DNA fragment and one (or two) primer (s) could significantly increase the effectiveness of PCR.
Другой недавно описанный метод амплификации на биочипе был основан на альтернативной реакции амплификации, "амплификации путем вытеснения цепи" (4). Этот метод амплификации был соединен с технологией микроэлектронного биочипа путем иммобилизации праймеров в определенных местах биочипа, усиленной электрическим полем гибридизации исследуемых молекул ДНК и проведением амплификации на биочипе. Полное замещение цепи одноцепочечного амплифицированного продукта происходило при каждом цикле репликации. Однако, из-за того, что эти одноцепочечные продукты могут диффундировать к другим местам биочипа, специфичность и чувствительность данного метода ограничены. Another recently described biochip amplification method was based on an alternative amplification reaction, “chain displacement amplification” (4). This amplification method was combined with the microelectronic biochip technology by immobilizing primers in certain places of the biochip, amplified by the electric field of hybridization of the studied DNA molecules and amplification on the biochip. Complete substitution of the single-chain amplified product chain occurred at each replication cycle. However, due to the fact that these single-chain products can diffuse to other places in the biochip, the specificity and sensitivity of this method are limited.
Недавно был разработан метод прямой ПЦР-амплификации на биочипе, в гибридизационной микрокамере над биочипом и внутри гелевых элементов, интегрированной с аллелеспецифичным удлинением иммобилизованных праймеров (5). Лишь малое число разных последовательностей могут быть взяты одновременно для амплификации и анализа этим способом, так как диффузия амплифицированных ДНК по всей поверхности биочипа и фоновые взаимодействия различных праймеров (в растворе и в геле) между собой и ДНК очевидно ограничивают возможности метода. Recently, a direct PCR amplification method was developed on a biochip, in a hybridization microchamber over a biochip and inside gel elements, integrated with allele-specific extension of immobilized primers (5). Only a small number of different sequences can be taken simultaneously for amplification and analysis by this method, since the diffusion of amplified DNA over the entire surface of the biochip and the background interactions of different primers (in solution and in gel) between themselves and DNA obviously limit the possibilities of the method.
Сущность изобретения
Сущность предложенного изобретения состоит в совокупности приемов, позволяющих существенно модифицировать метод амплификации на биочипе, описанный ранее (5). Специально модифицированные олигонуклеотиды, ряд последовательных энзиматических реакций и процедур были использованы для создания нового эффективного метода параллельной амплификации (ПЦР) многих (в перспективе - тысяч) нуклеотидных последовательностей прямо внутри разделенных элементов биочипа и последующего параллельного нуклеотидного анализа амплицифированных последовательностей внутри тех же элементов биочипа.SUMMARY OF THE INVENTION
The essence of the proposed invention consists in a combination of techniques that can significantly modify the method of amplification on a biochip, described earlier (5). Specially modified oligonucleotides, a series of sequential enzymatic reactions and procedures were used to create a new effective method of parallel amplification (PCR) of many (in the future - thousands) nucleotide sequences directly inside the separated biochip elements and subsequent parallel nucleotide analysis of the amplified sequences inside the same biochip elements.
Используемый биочип (подробно описан ранее - см. ссылку 5) состоит из массива гелевых (модифицированный полиакриламидный гель) ячеек объемом порядка 0,4 нанолитра. Каждая ячейка содержит уникальный специфический набор иммобилизованных праймеров, которые будут последовательно использованы сначала для размножения специфического для данной ячейки фрагмента ДНК, а затем для анализа последовательности этого фрагмента. The biochip used (described in detail earlier - see link 5) consists of an array of gel (modified polyacrylamide gel) cells with a volume of about 0.4 nanoliters. Each cell contains a unique specific set of immobilized primers, which will be used sequentially first to propagate a specific DNA fragment for a given cell, and then to analyze the sequence of this fragment.
Сущностью данного изобретения является способ одновременного, пространственно разделенного, параллельного проведения зависящих от используемой температуры энзиматических или химических реакций, а также комбинации этих реакций в единой многостадийной процедуре, в частности ПЦР-амплификация, для многих различных нуклеотидных последовательностей внутри трехмерных, разделенных с помощью гидрофобной жидкости, элементов биочипа. The essence of this invention is a method for the simultaneous, spatially separated, parallel implementation of the temperature-dependent enzymatic or chemical reactions, as well as a combination of these reactions in a single multi-stage procedure, in particular PCR amplification, for many different nucleotide sequences inside three-dimensional, separated by a hydrophobic liquid biochip elements.
Можно выделить три ключевые особенности метода:
1. ДНК, которая должна быть амплифицирована, обогащается в соответствующих гелевых элементах биочипа путем ее гибридизации с комплементарными иммобилизованными олигонуклеотидами.Three key features of the method can be distinguished:
1. The DNA to be amplified is enriched in the corresponding gel elements of the biochip by hybridizing it with complementary immobilized oligonucleotides.
2. Различные наборы специфических праймеров иммобилизованы внутри различных гелевых ячеек. Амплификационные праймеры непосредственно перед проведением ПЦР энзиматически отделяются от геля и способны свободно перемещаться внутри гелевого элемента во время ПЦР. Гелевый элемент может содержать также дополнительный временно неактивный молчащий праймер, который должен быть активирован, чтобы вести аллелеспецифическую реакцию удлинения праймера для детекции мутации или полиморфного участка в амплифицированной ДНК. 2. Different sets of specific primers are immobilized inside different gel cells. Amplification primers immediately before PCR are enzymatically separated from the gel and are able to move freely inside the gel element during PCR. The gel element may also contain an additional temporarily inactive silent primer, which must be activated in order to conduct an allele-specific primer extension reaction to detect a mutation or polymorphic region in amplified DNA.
3. Множество параллельных ПЦР (а, возможно, и иных энзиматических реакций) проводятся в ограниченном объеме гелевых ячеек, покрытых и отделенных друг от друга минеральным маслом. 3. Many parallel PCR (and, possibly, other enzymatic reactions) are carried out in a limited volume of gel cells coated and separated from each other by mineral oil.
Заключительный анализ локализации специфически удлиненных иммобилизованных праймеров обычно включал их гибридизацию с флуоресцентно мечеными олигонуклеотидными пробами. A final analysis of the localization of specifically elongated immobilized primers typically included their hybridization with fluorescently labeled oligonucleotide probes.
Предложено использование помимо стандартного постоянно иммобилизованного праймера (тип 1) иммобилизованных праймеров трех новых типов:
1) молчащий или активируемый, временно неактивный (тип 2),
2) высвобождаемый или выщепляемый (тип 3),
3) инактивируемый, временно активный (тип 4).In addition to the standard permanently immobilized primer (type 1), three new types of immobilized primers are proposed:
1) silent or activated, temporarily inactive (type 2),
2) released or cleaved (type 3),
3) inactivated, temporarily active (type 4).
Праймер типа 2, например, может иметь на 3'-конце фосфат вместо гидроксила, что блокирует участие данного олигонуклеотида в затравке полимеразной реакции. Блокирующая группа может быть удалена обработкой щелочной фосфатазой. После такой обработки праймер активируется, то есть становится активным в качестве затравки в полимеразной реакции в составе совершенного дуплекса с комплементарной цепью ДНК, результатом чего является специфическое удлинение данного праймера. A
Праймер типа 3, например, может иметь рибонуклеотидный район (--rU-rU-rU- или другой структуры), локализующийся между прикрепленным к гелю 5'-концом и началом специфической последовательности олигонуклеотида (см. табл. 1). Этот район может быть расщеплен при обработке РНКазой А, что ведет к высвобождению олигонуклеотида. Другим примером может служить введение углерод-углеродных -С-С-связей с вицинальными гидроксильными группами (как в случае гликолей) в 5'-область (в состав линкера), высвобождаемого праймера, которая может быть затем в достаточно мягких условиях специфически расщеплена периодатом натрия (реакция Малапрада) (12). Высвобождаемые праймеры позволяют максимально повысить эффективность ПЦР в пористом гелевом элементе. Минеральное масло надежно отделяет места амплификаций различных последовательностей, а также предохраняет реакционные растворы в набухших гелевых элементах от высушивания при высоких температурах ПЦР. A
Активируемые праймеры (тип 2) позволяют полностью разделить стадию амплификации ДНК и стадию анализа нуклеотидной последовательности, что способствует увеличению специфичности реакции дискриминации (определению отличий в нуклеотидной последовательности между мутантной ДНК и ДНК дикого типа). Activated primers (type 2) make it possible to completely separate the stage of DNA amplification and the stage of analysis of the nucleotide sequence, which increases the specificity of the discrimination reaction (determination of differences in the nucleotide sequence between mutant DNA and wild-type DNA).
Частным случаем инактивируемого, временно активного праймера (тип 4) может быть как выщепляемый праймер, который вымывают из геля сразу после высвобождения, так и стандартный праймер, который в ходе эксперимента будет инактивирован наподобие временно неактивного праймера путем энзиматического фосфорилирования его 3'-конца. Инактивируемый праймер также может содержать внутреннюю модификацию, например, углерод-углеродную -С-С- связь с вицинальными гидроксильными группами (как в случае α-гликолей) в середине фосфоруглеводной цепи олигонуклеотида. При обработке периодатом натрия (12) такой праймер будет расщеплен пополам и уже не сможет участвовать в ПЦР. A special case of an inactivated, temporarily active primer (type 4) can be either a cleaved primer that is washed out of the gel immediately after release, or a standard primer that will be inactivated during the experiment like a temporarily inactive primer by enzymatic phosphorylation of its 3'-end. The inactivable primer may also contain an internal modification, for example, a carbon-carbon — C — C— bond with vicinal hydroxyl groups (as in the case of α-glycols) in the middle of the phosphorocarbon chain of the oligonucleotide. When treated with sodium periodate (12), such a primer will be split in half and will no longer be able to participate in PCR.
Наборы олигонуклеотидов обоих типов могут быть нанесены с помощью робота и иммобилизованы одновременно в специфических местах на биочипе, и сухие биочипы могут храниться длительное время. Это позволяет стандартизировать процедуру и изготовлять биочипы впрок на длительный срок. Весь последующий анализ проводится полностью прямо на биочипе и состоит из ряда последовательных энзиматических реакций. Каждый гелевый элемент биочипа представляет собой как бы независимую пробирку, где происходит амплификация уникального фрагмента ДНК и затем его идентификация или анализ: выявление точечной мутации или идентификация нуклеотида в определенном положении (полиморфном участке). Sets of oligonucleotides of both types can be applied using a robot and immobilized simultaneously in specific places on the biochip, and dry biochips can be stored for a long time. This allows you to standardize the procedure and produce biochips for future use for a long time. All subsequent analysis is carried out completely directly on the biochip and consists of a series of sequential enzymatic reactions. Each gel element of the biochip is an independent tube, as it were, where the amplification of a unique DNA fragment takes place and then its identification or analysis: identification of a point mutation or identification of a nucleotide at a specific position (polymorphic region).
Максимально возможное количество различных исследуемых фрагментов или максимальное число исследуемых в ходе одного эксперимента разных полиморфных нуклеотидных участков будет ограничиваться числом отдельных гелевых элементов биочипа. При проведении эксперимента использовался биочип с 676 гелевыми ячейками на 1 квадратном сантиметре стеклянной подложки. Такой биочип в принципе может позволить проводить параллельно до 676 различных ПЦР-анализов. Описываемый способ позволяет модифицировать конкретную последовательность стадий анализа, исходя из конкретной поставленной задачи, путем комбинирования разных стадий (гибридизацию, энзиматические реакции, химические обработки) с активацией, инактивацией или высвобождением специфических праймеров внутри каждой из экспериментальных ячеек биочипа. Все требующиеся праймеры выбирают таким образом, чтобы они могли эффективно работать при одних и тех же реакционных условиях, что необходимо для проведения параллельных независимых анализов ДНК во всех ячейках биочипа с одинаково высокой эффективностью. The maximum possible number of different studied fragments or the maximum number of different polymorphic nucleotide sites studied during one experiment will be limited by the number of individual gel elements of the biochip. During the experiment, a biochip with 676 gel cells per 1 square centimeter of a glass substrate was used. Such a biochip, in principle, can allow up to 676 different PCR analyzes to be performed in parallel. The described method allows you to modify a specific sequence of stages of analysis, based on a specific task, by combining different stages (hybridization, enzymatic reactions, chemical treatments) with activation, inactivation or release of specific primers inside each of the experimental cells of the biochip. All the required primers are selected so that they can work efficiently under the same reaction conditions, which is necessary for conducting parallel independent DNA analyzes in all biochip cells with equally high efficiency.
Перечень фигур чертежей и иных материалов
Схема 1
Типы олигонуклеотидов (праймеров), используемых в нижеприведенных демонстрационных экспериментах.List of figures of drawings and other materials
Types of oligonucleotides (primers) used in the following demonstration experiments.
Схема 2
Различные варианты иммобилизации праймеров внутри одной гелевой ячейки для проведения ПЦР-амплификации под маслом.
Various options for immobilization of primers within a single gel cell for PCR amplification under oil.
Фиг. 1 - демонстрация значительного повышения эффективности ПЦР-амплификации внутри гелевой ячейки под маслом в результате введения высвобождаемого праймера. FIG. 1 is a demonstration of a significant increase in the efficiency of PCR amplification inside a gel cell under oil as a result of administration of a released primer.
(А) Схема ПЦР-эксперимента на биочипе
1. Высвобождаемый прямой праймер Fd и постоянно иммобилизованный обратный праймер R были иммобилизованы в гелевом элементе I, в то время как в гелевом элементе II были иммобилизованы оба постоянно иммобилизованные прямой F и обратный R праймеры. Пустые гелевые элементы "а" и "b" использовались как внутренние контроли. Фрагментированную денатурированную геномную ДНК М. tuberculosis гибридизовали с иммобилизованными на биочипе праймерами.(A) Scheme of a PCR experiment on a biochip
1. The released forward primer F d and the continuously immobilized reverse primer R were immobilized in gel element I, while both permanently immobilized direct F and reverse R primers were immobilized in gel element II. The empty gel elements "a" and "b" were used as internal controls. The fragmented denatured genomic DNA of M. tuberculosis was hybridized with primers immobilized on a biochip.
2. Высвобождение праймера Fd внутри гелевого элемента I проводили путем обработки с РНКазой А. Эта реакция, как и последующая ПЦР-амплификация, проводилась в индивидуальных элементах (ячейках) биочипа, покрытого минеральным маслом.2. The release of primer F d inside the gel element I was carried out by treatment with RNase A. This reaction, as well as subsequent PCR amplification, was carried out in individual elements (cells) of the biochip coated with mineral oil.
3. Амплифицированную ДНК денатурировали и биочип промывали для того, чтобы удалить неприкрепленную ДНК и высвободившиеся праймеры F. Анализ биочипа проводили с помощью последовательных гибридизаций с флуоресцентно мечеными олигонуклеотидными пробами P1, P2 и Р3, комплементарными соответственно праймерам R, F и внутреннему району амплифицированной ДНК. 3. The amplified DNA was denatured and the biochip was washed to remove loose DNA and freed primers F. The biochip was analyzed by sequential hybridization with fluorescently labeled oligonucleotide probes P1, P2, and P3, complementary to the primers R, F, and the internal amplification DNA, respectively.
(B) Три флуоресцентных изображения биочипа после последовательных гибридизаций с флуоресцентно мечеными олигонуклеотидными пробами P1, P2 и Р3. (B) Three fluorescence images of the biochip after successive hybridizations with fluorescently labeled oligonucleotide probes P1, P2 and P3.
(C) Интенсивности флуоресценции (в условных единицах) ячеек биочипа. (C) Fluorescence intensities (in arbitrary units) of the biochip cells.
Фиг. 2 - демонстрация одновременной и независимой множественной ПЦР-амплификации на биочипе и последующего параллельного анализа 6 различных мутаций в трех различных генах M.tuberculosis. FIG. 2 - demonstration of simultaneous and independent multiple PCR amplification on a biochip and subsequent parallel analysis of 6 different mutations in three different M. tuberculosis genes.
(А) Схема эксперимента
I - Наборы из трех праймеров были иммобилизованы в каждом из 6 пар гелевых ячеек биочипа. Каждый набор праймеров включает два высвобождаемых праймера, прямой (Fd) и обратный (Rd), и внутренний "спящий" праймер (Di). 3'-концевой нуклеотид специфического временно неактивного "спящего" праймера (Di) в каждой паре гелевых ячеек соответствует или дикому типу "а", или мутантной "b" последовательности ДНК. Фрагментированную денатурированную геномную ДНК М. tuberculosis гибридизовали с иммобилизованными на биочипе праймерами.(A) Experiment design
I - Sets of three primers were immobilized in each of the 6 pairs of gel cells of the biochip. Each set of primers includes two released primers, forward (F d ) and reverse (R d ), and an internal "sleeping" primer (D i ). The 3'-terminal nucleotide of a specific temporarily inactive “sleeping” primer (D i ) in each pair of gel cells corresponds to either wild type “a” or mutant “b” DNA sequence. The fragmented denatured genomic DNA of M. tuberculosis was hybridized with primers immobilized on a biochip.
II - биочип покрывали минеральным маслом и два праймера, Fd и Rd, высвобождали с помощью РНКазы А. Затем проводили ПЦР-амплификацию.II - the biochip was covered with mineral oil and two primers, F d and R d , were released using RNase A. Then, PCR amplification was performed.
III - Амплифицированную ДНК денатурировали и затем гибридизовали с постоянно иммобилизованным внутренним "спящим" праймером (Di). Высвобожденные праймеры и несгибридизовавшуюся ДНК отмывали. "Спящие" праймеры активировали дефосфорилированием и затем проводили второй раунд ПЦР (или реакцию полимеразного удлинения праймера). Праймер D эффективно участвовал в реакции только в том случае, когда его 3'-конец был полностью комплементарен последовательности сгибридизованной с ним ДНК.III - Amplified DNA was denatured and then hybridized with a permanently immobilized internal "sleeping" primer (D i ). The released primers and non-hybridized DNA were washed. Dormant primers were activated by dephosphorylation and then a second round of PCR (or primer extension polymerase reaction) was performed. Primer D effectively participated in the reaction only if its 3'-end was completely complementary to the sequence of DNA hybridized with it.
IV - Финальный анализ биочипа проводили путем гибридизации удлиненых праймеров D с флуоресцентно мечеными регион-специфичными пробами РМ. IV - The final analysis of the biochip was carried out by hybridization of the elongated primers D with fluorescently labeled region-specific samples of PM.
(B) Результаты гибридизации для двух разных ДНК образцов, анализируемых на двух биочипах. (B) Hybridization results for two different DNA samples analyzed on two biochips.
(C) Количественные измерения интенсивностей флуоресценции в гелевых ячейках биочипа. (C) Quantitative measurements of fluorescence intensities in the gel cells of the biochip.
Фиг. 3 - демонстрация отщепления иммобилизованного олигонуклеотида, содержащего (dU)4-последовательность вблизи места прикрепления к гелевому матриксу (5'-конец) и техасский красный (на 3'-конце), в результате обработки урацил-гликозилазой и последующей инкубации при 95oС в ПЦР-буфере.FIG. 3 - demonstration of cleavage of an immobilized oligonucleotide containing (dU) 4 sequence near the attachment site to the gel matrix (5'-end) and Texas red (at the 3'-end), as a result of treatment with uracil-glycosylase and subsequent incubation at 95 o C in the PCR buffer.
Фиг. 4 - демонстрация значительного повышения эффективности ПЦР-амплификации под маслом внутри гелевой ячейки с тремя праймерами в результате использования двух краевых высвобождаемых праймеров и одного внутреннего постоянно иммобилизованного праймера. FIG. 4 - demonstration of a significant increase in the efficiency of PCR amplification under oil inside a gel cell with three primers as a result of using two edge-released primers and one internal permanently immobilized primer.
В табл. 1 даны последовательности олигонуклеотидов, используемых для ПЦР-амплификации и детекции мутаций. In the table. Figure 1 shows the sequences of oligonucleotides used for PCR amplification and detection of mutations.
Последовательности вариабельных районов генов proB (2336-2472 bp), katG (2873-3002bp) и rpsL (83-192bp) были взяты из файлов Gene Bank с номерами соответственно L27989, X68081 и Х70995. The sequences of the variable regions of the proB (2336-2472 bp), katG (2873-3002bp) and rpsL (83-192bp) genes were taken from Gene Bank files with numbers L27989, X68081, and X70995, respectively.
F, R, Di - прямой, обратный и молчащий (активируемый) праймеры; P - гибридизационная проба; Fd, Rd - отщепляемые праймеры.F, R, D i - direct, reverse and silent (activated) primers; P - hybridization test; F d , R d are cleavable primers.
5'-NH2-(С6)-аминолинкер (Glen Research Inc., Eugene, OR); p - фосфат.5'-NH 2 - (C6) -aminolinker (Glen Research Inc., Eugene, OR); p is phosphate.
aФлуоресцентно меченые одноцепочечные продукты асимметричной ПЦР. a Fluorescently labeled single chain asymmetric PCR products.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Далее сущность изобретения раскрывается на отдельных примерах, которые не должны рассматриваться экспертом как ограничивающие притязания патента. Эксперименты проводились на биочипах (MAGIC ChipТМ) с иммобилизованными в гелевых элементах олигонуклеотидами (5-10). Технология создания и использования этих биочипов разрабатывается начиная с конца 80-х годов. Эта технология в силу своих уникальных свойств хорошо подошла для демонстрации возможности осуществления изобретения. Трехмерные гелевые элементы, образуемые на гидрофобной силиконизированной стеклянной поверхности, легко могут быть как одновременно инкубированы в общем растворе (в специальной микрокамере, образуемой на поверхности биочипа при использовании прокладки и покровного стекла, как описано ранее (5) и ниже), так и легко и быстро разделены друг от друга в любой момент даже без предварительного подсушивания. Для этого мы предлагаем использовать гидрофобную жидкость, в демонстрируемых экспериментах мы использовали минеральное масло. Далее, как уже неоднократно указывалось ранее, иммобилизация олигонуклеотидов внутри гелевых пористых трехмерных структур помещает олигонуклеотид в более благоприятные для проведения гибридизации и энзиматических реакций условия, чем иммобилизация на поверхности (6-10). Ниже будут приведены демонстрационные примеры, подтверждающие и раскрывающие возможности применения описываемого изобретения. Специальный раздел (см. ниже) посвящен материалам и методам. Следует отметить, что эксперименты на биочипе проводились с использованием специальной микрокамеры, описанной ранее (5). Простейший вариант ныне используемой нами микрокамеры устроен следующим образом. Овальная двусторонне клейкая прокладка толщиной около 100 мкм помещается на поверхность биочипа таким образом, что она окружает, не касаясь, зону биочипа, где локализуются гелевые элементы. Далее поверх этой прокладки помещается кварцевое стекло толщиной 2-3 мм и размером, несколько превышающим крайние размеры прокладки. Прижиманием и прогреванием при 95oС в течение 10 мин прокладка плотно приклеивается как к поверхности стекла биочипа, так и к покровному стеклу. Объем образующейся полости между двумя стеклянными поверхностями и краями прокладки зависит от толщины прокладки и от размера ограничиваемой ею площади, обычно этот объем порядка 20 микролитров. В покровном кварцевом стекле, как правило, имеются два отверстия диаметром 1-2 мм, расположенные с противоположных краев таким образом, чтобы они были еще внутри площади, окруженной прокладкой, но вне зоны расположения гелевых ячеек (с двух противоположных краев этой зоны). Через эти два отверстия осуществляется добавление и замещение растворов, а также промывка гелевых элементов. Для поддержания определенного температурного режима мы использовали или Master Cycler с in situ ПЦР-насадкой фирмы Eppendorf, или Т-Gradient с in situ ПЦР-блоком фирмы Biometra, или базирующийся на элементе Пелтье термостолик (5).Information confirming the possibility of carrying out the invention
Further, the invention is disclosed in separate examples, which should not be considered by an expert as limiting the claims of a patent. The experiments were carried out on biochips (MAGIC Chip ТМ ) with oligonucleotides immobilized in gel elements (5-10). The technology for creating and using these biochips has been developed since the end of the 80s. This technology, due to its unique properties, is well suited to demonstrate the feasibility of the invention. Three-dimensional gel elements formed on a hydrophobic siliconized glass surface can be easily incubated simultaneously in a common solution (in a special microchamber formed on the surface of a biochip using a gasket and coverslip, as described earlier (5) and below), and easily and quickly separated from each other at any time, even without prior drying. For this, we propose the use of a hydrophobic liquid, in the demonstrated experiments we used mineral oil. Further, as has been repeatedly mentioned earlier, immobilization of oligonucleotides inside gel porous three-dimensional structures places the oligonucleotide in more favorable conditions for hybridization and enzymatic reactions than immobilization on the surface (6-10). The following are demonstration examples that confirm and disclose the possibilities of using the described invention. A special section (see below) is devoted to materials and methods. It should be noted that experiments on the biochip were carried out using a special microchamber described earlier (5). The simplest version of the microcamera currently used by us is arranged as follows. An oval double-sided adhesive pad with a thickness of about 100 μm is placed on the surface of the biochip in such a way that it surrounds, without touching, the zone of the biochip where gel elements are localized. Next, quartz glass 2-3 mm thick and a size slightly larger than the extreme dimensions of the gasket is placed on top of this gasket. By pressing and heating at 95 o C for 10 min, the gasket adheres tightly to both the surface of the biochip glass and the coverslip. The volume of the cavity formed between the two glass surfaces and the edges of the gasket depends on the thickness of the gasket and the size of the area limited by it, usually this volume is about 20 microliters. As a rule, there are two holes with a diameter of 1-2 mm in the quartz cover glass, located from opposite edges so that they are still inside the area surrounded by the gasket, but outside the gel cell location area (from two opposite edges of this zone). Through these two openings, solutions are added and replaced, as well as gel elements are washed. To maintain a certain temperature regime, we used either Master Cycler with an in situ PCR attachment from Eppendorf, or a T-Gradient with an in situ PCR block from Biometra, or a thermostatic based on a Peltier element (5).
Фиг. 1 содержит схему, результат и количественный анализ данных эксперимента, в котором демонстрируется возможность и существенное улучшение эффективности ПЦР-амплификации в гелевом элементе под маслом в случае двух исходно иммобилизованных праймеров, когда один из праймеров Fd - высвобождаемый непосредственно перед проведением ПЦР и при этом остающийся в пределах пространства набухшего гелевого элемента, покрытого маслом. Прямой высвобождаемый праймер Fd в гелевом элементе I был исходно ковалентно прикреплен к гелю за 5'-конец. Район праймера между участком прикрепления и началом специфической нуклеотидной последовательности содержал дополнительную тририбонуклеотидную rUrUrC-группу (таблица 1). Расщепление этой группы при обработке рибонуклеазой А приводит к высвобождению праймера в окружающий гелевый матрикс раствор. Прямой праймер F в гелевом элементе II и обратный праймер R в обоих элементах I и II были постоянно прикреплены к гелю. На первом этапе эксперимента образец геномной ДНК был химически фрагментирован до молекул длиной 200-300 нуклеотидов. Денатурированная дробленая ДНК диффундировала в гибридизационном буфере внутрь гелевых элементов и гибридизовалась с иммобилизированными праймерами. После гибридизации несгибридизовавшуюся ДНК отмывали в 0,1-0,3М растворе хлорида натрия. В результате происходило специфическое обогащение комплементарными последовательностями ДНК тех элементов (ячеек) биочипа, где были иммобилизованы соответствующие этим ДНК олигонуклеотиды. Метод применения олигонуклеотидного биочипа для такого гибридизационного обогащения специфическими последовательностями был описан ранее (6). После гибридизации и отмывки биочип инкубировали в ПЦР-растворе (см. материалы и методы) для того, чтобы все необходимые реакционные компоненты, включая температуроустойчивую ДНК полимеразу и дезоксинуклеотидтрифосфаты, продиффундировали внутрь гелевых ячеек биочипа. Затем в течение нескольких секунд биочип инкубировали в том же растворе, дополнительно содержащем рибонуклеазу А (0,2 мг/мл), после чего быстро замещали водный раствор, окружающий и покрывающий гелевые элементы биочипа, минеральным маслом. Минеральное масло при этом окружает каждый гелевый элемент биочипа, предохраняя его водное содержимое (реакционную смесь) от высыхания и от контакта с реакционными смесями других гелевых элементов.FIG. 1 contains a diagram, a result and a quantitative analysis of experimental data, which demonstrates the possibility and significant improvement in the efficiency of PCR amplification in a gel element under oil in the case of two initially immobilized primers, when one of the primers F d is released immediately before PCR and at the same time remains within the space of a swollen gel element coated with oil. The direct releasable primer F d in gel element I was initially covalently attached to the gel at the 5'-end. The primer region between the attachment site and the start of the specific nucleotide sequence contained an additional tribribonucleotide rUrUrC group (table 1). The cleavage of this group upon treatment with ribonuclease A leads to the release of the primer into the surrounding gel matrix solution. The forward primer F in gel element II and the reverse primer R in both elements I and II were permanently attached to the gel. At the first stage of the experiment, a sample of genomic DNA was chemically fragmented into molecules with a length of 200-300 nucleotides. The denatured crushed DNA diffused in a hybridization buffer into the gel elements and hybridized with immobilized primers. After hybridization, the non-hybridized DNA was washed in a 0.1-0.3 M sodium chloride solution. As a result, there was a specific enrichment with complementary DNA sequences of those elements (cells) of the biochip where the corresponding oligonucleotides were immobilized. The method of using the oligonucleotide biochip for such hybridization enrichment with specific sequences has been described previously (6). After hybridization and washing, the biochip was incubated in a PCR solution (see materials and methods) so that all necessary reaction components, including temperature-resistant DNA polymerase and deoxynucleotide triphosphates, were diffused into the gel cells of the biochip. Then, for several seconds, the biochip was incubated in the same solution, additionally containing ribonuclease A (0.2 mg / ml), after which the aqueous solution surrounding and covering the gel elements of the biochip was quickly replaced with mineral oil. At the same time, mineral oil surrounds each gel element of the biochip, protecting its aqueous contents (reaction mixture) from drying out and from contact with other gel elements from reaction mixtures.
Биочип инкубировали при 37oС для того, чтобы рибонуклеаза переварила олигорибонуклеотидный участок отщепляемого олигонуклеотида (Fd), в результате чего этот олигонуклеотид будет откреплен от геля и будет свободно диффундировать в пределах данного окруженного маслом гелевого элемента. Инкубационную температуру поднимали до 72oС на 2 мин и затем проводили 30 циклов ПЦР (см. материалы и методы). После ПЦР минеральное масло отмывали хлороформом и затем 0,1-0,3М раствором хлорида натрия, денатурировали дуплексы ДНК, повышая температуру до 95oС, тщательно отмывали всю не прикрепленную к гелю ДНК и высвобожденные олигонуклеотиды. Наконец, оставшиеся на биочипе удлиненные и неудлиненные олигонуклеотиды последовательно (с тщательной отмывкой биочипа перед гибридизацией с новой пробой) гибридизовались с тремя олигонуклеотидными пробами, флуоресцентно меченными по 5'-концу техасским красным. Эти пробы - P1, P2 и Р3 (таблица 1) - были соответственно комплементарны праймерам R, F и внутреннему району амплифицированной ДНК. На фиг. 1Б и 1В показано распределение и количественное измерение (с помощью флуоресцентного микроскопа) интенсивностей флуоресценции на биочипе, полученных в результате проведения описанного эксперимента. Гибридизация биочипа с пробой Р1, комплементарной постоянно иммобилизованному обратному праймеру R, дала, как ожидалось, одинаково сильные гибридизационные сигналы в случае обоих рассматриваемых гелевых элементов I и II. Гибридизация с пробой P2, комплементарной праймеру F, дала сильный сигнал в случае гелевого элемента II (в которой этот праймер постоянно иммобилизован) и пренебрежимо малый сигнал в случае гелевого элемента I (где этот праймер был высвобожден в результате РНКазной обработки и затем при финальной отмывке биочипа удален). Этот результат свидетельствует о высокой эффективности высвобождения праймера Fd (более 90%) в результате использованного метода, включающего введение в 5'-концевой район иммобилизуемого олигонуклеотида тририбонуклеотидной последовательности, расщепляемой при обработке рибонуклеазой. Гибридизация с пробой Р3, выявляющей внутренний район новосинтезированного фрагмента ДНК, дала сильный гибридизационный сигнал в случае гелевого элемента I и весьма слабый сигнал в случае элемента II. Соотношение интенсивностей флуоресценции в этих гелевых элементах (I/II) было около 10:1, если вычесть фоновую флуоресценцию контрольных пустых гелевых элементов "а" и "b". Это соотношение указывает на то, что амплификация с использованием обоих постоянно иммобилизованных праймеров, так называемая "bridge PCR amplification" (3), примерно в 10 раз менее эффективна в рассматриваемом случае, чем ПЦР в случае, когда один из праймеров высвобожден в раствор. Эти данные хорошо согласуются с более ранними результатами, указывающими на сравнительно низкую эффективность ПЦР с использованием двух постоянно иммобилизованных праймеров (3, 5). Кривые плавления дуплексов, образованных при гибридизации пробы Р3 с удлиненной (в результате полимеразной реакции) частью иммобилизованного праймера R, анализировались с помощью флуоресцентного микроскопа (5, 9). Характерная для совершенного дуплекса форма кривой плавления и соответствующая для данной нуклеотидной последовательности температура плавления гибрида подтвердили правильность ПЦР реакции.The biochip was incubated at 37 ° C so that the ribonuclease digested the oligoribonucleotide region of the cleaved oligonucleotide (F d ), as a result of which this oligonucleotide would be detached from the gel and would freely diffuse within the given gel-surrounded cell. The incubation temperature was raised to 72 ° C. for 2 minutes and then 30 PCR cycles were performed (see materials and methods). After PCR, the mineral oil was washed with chloroform and then with a 0.1-0.3 M sodium chloride solution, DNA duplexes were denatured, raising the temperature to 95 o C, all non-gel attached DNA and the released oligonucleotides were thoroughly washed. Finally, the elongated and elongated oligonucleotides remaining on the biochip sequentially (with thorough washing of the biochip before hybridization with a new probe) were hybridized with three oligonucleotide probes fluorescently labeled at the 5'end of Texas red. These samples - P1, P2 and P3 (table 1) - were respectively complementary to primers R, F and the inner region of amplified DNA. In FIG. 1B and 1C show the distribution and quantitative measurement (using a fluorescence microscope) of the bio-chip fluorescence intensities obtained as a result of the described experiment. Hybridization of the biochip with the P1 sample complementary to the constantly immobilized reverse primer R gave, as expected, equally strong hybridization signals in the case of both gel elements I and II under consideration. Hybridization with sample P2 complementary to primer F gave a strong signal in the case of gel element II (in which this primer is constantly immobilized) and a negligible signal in the case of gel element I (where this primer was released as a result of RNase treatment and then during the final washing of the biochip deleted). This result indicates a high efficiency of the release of primer F d (more than 90%) as a result of the method used, including the introduction of a tribonucleotide sequence cleaved by ribonuclease treatment into the 5'-terminal region of the immobilized oligonucleotide. Hybridization with a P3 probe, revealing the inner region of the newly synthesized DNA fragment, gave a strong hybridization signal in the case of gel element I and a very weak signal in the case of element II. The ratio of the fluorescence intensities in these gel elements (I / II) was about 10: 1, if we subtract the background fluorescence of the control empty gel elements "a" and "b". This ratio indicates that amplification using both permanently immobilized primers, the so-called "bridge PCR amplification" (3), is about 10 times less effective in this case than PCR in the case when one of the primers is released into solution. These data are in good agreement with earlier results indicating a relatively low PCR efficiency using two permanently immobilized primers (3, 5). The melting curves of duplexes formed upon hybridization of the P3 sample with the elongated (as a result of the polymerase reaction) part of the immobilized primer R were analyzed using a fluorescence microscope (5, 9). The shape of the melting curve, characteristic of a perfect duplex, and the melting point of a hybrid corresponding to a given nucleotide sequence confirmed the correctness of the PCR reaction.
Более усложненная, но вместе с тем и более универсальная, схема эксперимента рассмотрена ниже. ПЦР-амплификация с двумя высвобождаемыми праймерами и введением дополнительного временно неактивного ("спящего", Di) постоянно иммобилизованного праймера была использована для проведения одновременного анализа нескольких различных последовательностей (фиг. 2). 3'-концевой нуклеотид внутреннего праймера Di фосфорилирован, что делает этот праймер неактивным во время первой амплификационной стадии. Этот спящий праймер Di активировали путем удаления 3'-концевой фосфатной группы в результате обработки щелочной фосфатазой. Аллелеспецифическое удлинение (5) активированного праймера D проводили, чтобы определить, комплементарен ли его 3'-концевой нуклеотид соответствующему нуклеотиду в амплифицированном фрагменте исследуемой ДНК. Схема всего эксперимента, включающего как стадию ПЦР-амплификации, так и стадию детекции точечной нуклеотидной замены, приведена на фиг. 2А. Эта специально разработанная процедура была использована для анализа 6 точечных мутаций в трех генах, rpoB, katG and rpsL, ответственных за резистентность М. tuberculosis соответственно к рифампицину, изониазиду и стрептомицину (фиг. 2Б и табл. 1). На фиг. 2Б и 2В показано распределение и количественное измерение интенсивностей флуоресценции на биочипе, полученных в результате проведения двух таких экспериментов (параллельная множественная ПЦР-амплификация и последующая параллельная детекция мутаций в амплифицированных последовательностях, последовательно проводя ряд процедур на одном и том же биочипе). Соотношение интенсивностей флуоресценции (после гибридизации с новосинтезированными последовательностями аналогично предыдущему примеру) в случае аллелеспецифического удлинения полностью комплементарного праймера по сравнению с сигналом в гелевом элементе, где используемый для детекции праймер содержал 3'-концевой нуклеотид, отличный от соответствующего нуклеотида в исследуемой ДНК, было обычно около 5-10 к 1.A more complicated, but at the same time more universal, experimental design is discussed below. PCR amplification with two released primers and the introduction of an additional temporarily inactive ("sleeping", D i ) permanently immobilized primer was used to simultaneously analyze several different sequences (Fig. 2). The 3'-terminal nucleotide of the internal primer D i is phosphorylated, which makes this primer inactive during the first amplification step. This dormant primer D i was activated by removing the 3'-terminal phosphate group as a result of treatment with alkaline phosphatase. Allelespecific extension (5) of activated primer D was performed to determine if its 3'-terminal nucleotide is complementary to the corresponding nucleotide in the amplified fragment of the studied DNA. The whole experiment, including both the PCR amplification step and the detection step for the point nucleotide substitution, is shown in FIG. 2A. This specially designed procedure was used to analyze 6 point mutations in three genes, rpoB, katG and rpsL, responsible for the resistance of M. tuberculosis to rifampicin, isoniazid and streptomycin, respectively (Fig. 2B and Table 1). In FIG. 2B and 2C show the distribution and quantitative measurement of the fluorescence intensities on a biochip obtained as a result of two such experiments (parallel multiple PCR amplification and subsequent parallel detection of mutations in amplified sequences, sequentially performing a number of procedures on the same biochip). The ratio of fluorescence intensities (after hybridization with newly synthesized sequences is similar to the previous example) in the case of allele-specific elongation of a fully complementary primer compared to the signal in the gel element, where the primer used for detection contained a 3'-terminal nucleotide, different from the corresponding nucleotide in the DNA being studied, was usually about 5-10 to 1.
Визуальное и количественное сравнение интенсивностей флуоресценции для каждой пары (или группы) гелевых элементов, анализирующих одну и ту же нуклеотидную позицию и содержащих удлиняемые праймеры (D) для последовательности дикого типа или для соответствующей мутантной последовательности, позволяет однозначно определить присутствие или отсутствие мутации в данном положении исследуемой ДНК. Около 105 молекул геномной ДНК М. tuberculosis воспроизводимо анализировались этим методом, но мы предполагаем, что чувствительность этого метода может быть существенно повышена. Так, включение биотинилированных производных нуклеотидов в реакцию аллелеспецифического удлинения праймера и последующее использование авидина, конъюгированного с техасским красным, для детекции новосинтезированных последовательностей, повышало в несколько раз (по сравнению с описанной выше гибридизационной детекцией) силу специфического флуоресцентного сигнала в предварительных экспериментах.Visual and quantitative comparison of fluorescence intensities for each pair (or group) of gel elements that analyze the same nucleotide position and contain extendable primers (D) for the wild-type sequence or for the corresponding mutant sequence, allows you to uniquely determine the presence or absence of a mutation in this position test DNA. About 10 5 molecules of M. tuberculosis genomic DNA were reproducibly analyzed by this method, but we suggest that the sensitivity of this method can be significantly increased. Thus, the inclusion of biotinylated nucleotide derivatives in the allele-specific extension of the primer and the subsequent use of avidin conjugated with Texas red to detect newly synthesized sequences increased several times (compared with the hybridization detection described above) the strength of a specific fluorescent signal in preliminary experiments.
Описанная комбинированная процедура ДНК-амплификации и анализа непосредственно на биочипе позволит одновременно анализировать мутации и нуклеотидный полиморфизм для многих различных геномных районов, при этом упростит, ускорит и удешевит такой анализ. The described combined procedure of DNA amplification and analysis directly on the biochip will allow simultaneous analysis of mutations and nucleotide polymorphism for many different genomic regions, while simplifying, accelerating and cheapening such analysis.
Ниже будут коротко упомянуты другие эксперименты, демонстрирующие варианты или отдельные элементы описанной выше многостадийной процедуры. Below, other experiments will be briefly mentioned that demonstrate options or individual elements of the multistage procedure described above.
Иной механизм высвобождения исходно иммобилизованных праймеров был продемонстрирован. Вместо рибонуклеотидного звена в линкерный район праймера был введена олиго-dU последовательность. Были взяты моно-, ди- и тетрамеры (dU)n, и с удлинением этой последовательности повышалась эффективность последующего высвобождения праймера. Механизм высвобождения праймера в этом случае был двухстадийным. Сначала проводили обработку ферментом урацил-гликозилазой, в результате которой происходило отщепление урациловых оснований. Затем, уже во время первичной денатурации в ПЦР-смеси под маслом, проходил гидролиз нуклеотидной цепи в местах отщепления урацила. Иммобилизованный в этом эксперименте олигонуклеотид содержал флуоресцентную метку на 3'- конце, и за ходом реакции следили по уменьшению флуоресценции. Была продемонстрирована (фиг. 3) принципиальная возможность использования этого подхода.A different mechanism for the release of initially immobilized primers has been demonstrated. Instead of the ribonucleotide unit, an oligo-dU sequence was introduced into the linker region of the primer. Mono-, di- and tetramers (dU) n were taken, and with the extension of this sequence, the efficiency of subsequent primer release was increased. The primer release mechanism in this case was two-stage. First, the treatment with the enzyme uracil-glycosylase was carried out, as a result of which the cleavage of uracil bases occurred. Then, already during the initial denaturation in the PCR mixture under oil, the nucleotide chain was hydrolyzed at the sites of cleavage of uracil. The oligonucleotide immobilized in this experiment contained a fluorescent label at the 3'-end, and the progress of the reaction was monitored by decreasing fluorescence. The principal possibility of using this approach was demonstrated (Fig. 3).
Материалы и методы
Синтез олигонуклеотидов и производство биочипов были описаны ранее (5, 8). Полученные из Московского научного центра по борьбе с туберкулезом образцы, содержащие ДНК М. tuberculosis, были приготовлены из мокроты, как описано (5), и ДНК апуринизировали в 50 мкл 80% муравьиной кислоты при 20oС в течение 15 с. ДНК преципитировали 500 мкл 2% раствором LiClO4 в ацетоне, промывали ацетоном и высушивали. Апуринизированную ДНК инкубировали в 50 мкл 10% раствора пиперидина (Aldrich) при 90oС в течение 40 мин, чтобы фрагментировать ее до фрагментов длиной около 200-300 нуклеотидов, осаждали, промывали ацетоном и затем высушивали.Materials and methods
The synthesis of oligonucleotides and the production of biochips have been described previously (5, 8). Samples containing M. tuberculosis DNA obtained from the Moscow Scientific Center for Tuberculosis were prepared from sputum as described (5), and the DNA was apurized in 50 μl of 80% formic acid at 20 ° С for 15 s. DNA was precipitated with 500 μl of a 2% solution of LiClO 4 in acetone, washed with acetone and dried. Apurinized DNA was incubated in 50 μl of a 10% piperidine solution (Aldrich) at 90 ° C. for 40 minutes to fragment to fragments of about 200-300 nucleotides in length, precipitated, washed with acetone and then dried.
Все растворы были дегазированы, а минеральное масло было насыщено соответствующим буфером перед тем, как наносить их на биочип в специальной гибридизационной камере (5). Фрагментированную денатурированную ДНК наносили на биочип в 20 мкл гибридизационного буфера (0,5 М NaCl, 0,1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 7.5) и проводили гибридизацию с иммобилизованными на биочипе праймерами при 55oС в течение примерно 2 ч. Биочип промывали 0,15 М NaCl при 55oС (200 мкл•3 раза по 5 мин). Стандартный ПЦР-раствор (67 mM Tris-HCl, pH 8.6; 2,5 mM MgCl2; 16,6 mM (NH4)2SO4; 0,001% Triton X-100; 1 мг/мл BSA; 0,25 mM каждого из dATP, dCTP, dGTP и dTTP; 2.5 U Taq ДНК полимеразы на 30 мкл) использовали для последующих описанных ниже этапов процедуры. Биочип дважды промывали и затем инкубировали в ПЦР-растворе при 55oС в течение 15 мин, а затем при 72oС в течение 5 мин. Температуру понижали до 37oС. Рибонуклеазу А (концентрированный раствор - 10 мг/мл, Sigma) добавляли к свежей порции ПЦР-раствора до конечной концентрации 0,2 мг/мл. Этот ПЦР-раствор с РНКазой наносили на биочип на несколько секунд и затем быстро замещали его минеральным маслом для ПЦР (Perkin Elmer). Рибонуклеазную обработку под маслом вели в течение 15 мин при 37oС. Затем проводили 35-40 циклов ПЦР на биочипе, покрытом маслом (типичные циклы ПЦР были 40 с при 95oС, 45 с при 66oС, 30 с при 72oС). Гибридизационный анализ проводили, используя короткие флуоресцентно меченные олигонуклеотидные пробы (PI, P2 и Р3), после завершения ПЦР и отмывки неприкрепленной ДНК и высвобожденных праймеров. Гибридизацию проводили, как описано выше.All solutions were degassed, and mineral oil was saturated with an appropriate buffer before applying them to the biochip in a special hybridization chamber (5). Fragmented denatured DNA was loaded onto the biochip in 20 μl of hybridization buffer (0.5 M NaCl, 0.1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 7.5) and hybridized with primers immobilized on the biochip at 55 ° C for about 2 hours The biochip was washed with 0.15 M NaCl at 55 ° C (200 μl • 3 times for 5 minutes). Standard PCR solution (67 mM Tris-HCl, pH 8.6; 2.5 mM MgCl 2 ; 16.6 mM (NH 4 ) 2 SO 4 ; 0.001% Triton X-100; 1 mg / ml BSA; 0.25 mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP; 2.5 U Taq DNA polymerase per 30 μl) was used for the subsequent steps of the procedure described below. The biochip was washed twice and then incubated in a PCR solution at 55 ° C for 15 minutes, and then at 72 ° C for 5 minutes. The temperature was lowered to 37 ° C. Ribonuclease A (
В случае усложненной процедуры, описанной на фиг. 2, первая часть эксперимента была идентичной описанной выше. После ПЦР-амплификации ДНК денатурировали при 95oС в течение 1 мин и затем гибридизовали с праймером Di при 54oС в течение 20 мин, после чего биочип тщательно отмывали в нескольких сменах 0.15 М NaCl при 55oС. "Спящий" праймер (Di) дефосфорилировали, обрабатывая биочип раствором, содержащим 3 единицы активности щелочной фосфатазы (CIP, Amersham) в 20 мкл 2 mM MgCl2 и 20 mМ Tris-Cl, pH 9,5, в течение 1 часа при 37oС. Фосфатазу затем тщательно отмывали в 0.15 М NaCl. Второй раунд ПЦР-амплификации для аллелеспецифического удлинения иммобилизованного внутреннего праймера проводили так же, как и в первый раунд, но в качестве фермента использовали Taq DNA Polymerase Stoffel fragment (Perkin Elmer) и реакцию вели согласно протоколу компании-изготовителя с добавлением 1 мг/мл BSA. Масло смывали с биочипа хлороформом и большим объемом 0,15 М NaCl. Дуплексы ДНК денатурировали при 95oС в 0.15 М NaCl в течение 5 мин и затем отмывали несколькими сменами того же раствора. Наличие удлиненных праймеров на биочипе анализировали с помощью гибридизации с флуоресцентно меченными одноцепочечными ДНК-пробами (см. таблицу 1). Гибридизацию с длинными пробами (РМ, фиг. 2) проводили в том же буфере, что и с короткими пробами, в течение 2 ч при 65oС, и несгибридизовавшуюся ДНК отмывали при 80oС.In the case of the complicated procedure described in FIG. 2, the first part of the experiment was identical to that described above. After PCR amplification, the DNA was denatured at 95 ° C for 1 min and then hybridized with D i primer at 54 ° C for 20 min, after which the biochip was thoroughly washed in several shifts of 0.15 M NaCl at 55 ° C. Sleeping primer (D i ) were dephosphorylated by treating the biochip with a solution containing 3 units of alkaline phosphatase activity (CIP, Amersham) in 20 μl of 2 mM MgCl 2 and 20 mM Tris-Cl, pH 9.5, for 1 hour at 37 ° C. Phosphatase then washed thoroughly in 0.15 M NaCl. The second round of PCR amplification for allele-specific extension of the immobilized internal primer was carried out as in the first round, but Taq DNA Polymerase Stoffel fragment (Perkin Elmer) was used as an enzyme and the reaction was carried out according to the manufacturer's protocol with the addition of 1 mg / ml BSA . The oil was washed off with a biochip with chloroform and a large volume of 0.15 M NaCl. DNA duplexes were denatured at 95 ° C in 0.15 M NaCl for 5 min and then washed with several changes of the same solution. The presence of elongated primers on the biochip was analyzed by hybridization with fluorescently labeled single-stranded DNA samples (see table 1). Hybridization with long samples (PM, Fig. 2) was carried out in the same buffer as with short samples for 2 hours at 65 ° C, and the non-hybridized DNA was washed at 80 ° C.
Измерения флуоресценции ячеек биочипа проводили с использованием флуоресцентного микроскопа, оснащенного CCD-камерой и соответствующим программным обеспечением (5, 9). Biochip cell fluorescence measurements were carried out using a fluorescence microscope equipped with a CCD camera and appropriate software (5, 9).
Источники информации
1. Southern, E. , Mir, К. and Shchepinov, M. (1999) Molecular interactions on microarrays. Nature Genet. 21, 5-9.Sources of information
1. Southern, E., Mir, K. and Shchepinov, M. (1999) Molecular interactions on microarrays. Nature Genet. 21, 5-9.
2. Gerold, D., Rushmore, T. and Caskey, С. Т. (1999) DNA chips: promising toys have become powerful tools. Trends Biochem. Sci. 24, 168-173. 2. Gerold, D., Rushmore, T. and Caskey, S. T. (1999) DNA chips: promising toys have become powerful tools. Trends Biochem. Sci. 24, 168-173.
3. Adams, С. P. and Kron, S. J. (1997) Method for performing amplification of nucleic acid with two primers bound to a single solid support. US PTO. US 5641658. 3. Adams, C. P. and Kron, S. J. (1997) Method for performing amplification of nucleic acid with two primers bound to a single solid support. US PTO. US 5641658.
4. Westin, L., Xu, X., Miller, C., Wang, L., Edman, C. F., and Nerenberg, M. (2000) Anchored multiplex amplification on a microelectronic chip array. Nat. Biotechnol. 18, 199-204. 4. Westin, L., Xu, X., Miller, C., Wang, L., Edman, C. F., and Nerenberg, M. (2000) Anchored multiplex amplification on a microelectronic chip array. Nat. Biotechnol. 18, 199-204.
5. Strizhkov, В. N., Drobyshev, A. L., Mikhailovich, V. M. and Mirzabekov, A. D. (2000) PCR amplification on microarray of gel-immobilized oligonucleotides: detection of bacterial toxin- and drug-resistant genes and their mutations. BioTechniques, 29, 844-857. 5. Strizhkov, B. N., Drobyshev, A. L., Mikhailovich, V. M. and Mirzabekov, A. D. (2000) PCR amplification on microarray of gel-immobilized oligonucleotides: detection of bacterial toxin- and drug-resistant genes and their mutations. BioTechniques, 29, 844-857.
6. Dubiley, S., Kirillov, E., Lysov, Y. and Mirzabekov, A. (1997) Fractionation, phosphorylation and ligation on oligonucleotide microchips to enhance sequencing by hybridization. Nucleic Acids Res. 25, 2259-2265. 6. Dubiley, S., Kirillov, E., Lysov, Y. and Mirzabekov, A. (1997) Fractionation, phosphorylation and ligation on oligonucleotide microchips to enhance sequencing by hybridization. Nucleic Acids Res. 25, 2259-2265.
7. Dubiley, S. , Kirillov, E. and Mirzabekov, A. (1999) Polymorphism analysis and gene detection by minisequencing on an array of gel-immobilized primers. Nucleic Acids Res. 27, e19, i-vi. 7. Dubiley, S., Kirillov, E. and Mirzabekov, A. (1999) Polymorphism analysis and gene detection by minisequencing on an array of gel-immobilized primers. Nucleic Acids Res. 27, e19, i-vi.
8. Yershov, G., Barsky, V., Belgovskiy, A., Kirillov, E., Kreindlin, E., Ivanov, I., Parinov, S., Guschin, D., Drobyshev, A., Dubiley, S. and Mirzabekov, A. (1996) DNA analysis and diagnostics on oligonucleotide microchip. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 4913-4918. 8. Yershov, G., Barsky, V., Belgovskiy, A., Kirillov, E., Kreindlin, E., Ivanov, I., Parinov, S., Guschin, D., Drobyshev, A., Dubiley, S . and Mirzabekov, A. (1996) DNA analysis and diagnostics on oligonucleotide microchip. Proc. Natl. Acad Sci. USA 93, 4913-4918.
9. Fotin, A., Drobyshev, A., Proudnikov, D., Perov, A. and Mirzabekov, A. (1998) Parallel thermodynamic analysis of duplexes on oligonucleotide microchips. Nucleic Acids Res. 26, 1515-1521. 9. Fotin, A., Drobyshev, A., Proudnikov, D., Perov, A. and Mirzabekov, A. (1998) Parallel thermodynamic analysis of duplexes on oligonucleotide microchips. Nucleic Acids Res. 26, 1515-1521.
10. Рубина А.Ю., Паньков С.В., Чернов Б.К., Мирзабеков А.Д. Способ иммобилизации олигонуклеотидов, содержащих непредельные группы, в полимерных гидрогелях при формировании биобиочипа. Заявка на патент РФ 99127744, приоритет от 28 декабря 1999 г. 10. Rubina A.Yu., Pankov S.V., Chernov B.K., Mirzabekov A.D. The method of immobilization of oligonucleotides containing unsaturated groups in polymer hydrogels during the formation of a biochip. RF patent application 99127744, priority of December 28, 1999
10. Chakravarti, A. (1999) Population genetics-making sence out of sequence. Nat. Genet. (Suppl.) 21, 56-60. 10. Chakravarti, A. (1999) Population genetics-making sence out of sequence. Nat. Genet. (Suppl.) 21, 56-60.
11. Ramaswamy, S. and Musser, J. M. (1998) Tuber. Lung Dis. 79, 3-9. 11. Ramaswamy, S. and Musser, J. M. (1998) Tuber. Lung dis. 79, 3-9.
12. Bentley K. W. in Elucidation of Organic Structures by Physical and Chemical Methods, Pt. 2, Bentley K.W., Kirby G.W., Eds. (Wiley, New York, 2 ed., 1973) p.177-185. 12. Bentley K. W. in Elucidation of Organic Structures by Physical and Chemical Methods, Pt. 2, Bentley K.W., Kirby G.W., Eds. (Wiley, New York, 2 ed., 1973) p. 177-185.
Claims (34)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2001112429A RU2218414C2 (en) | 2001-05-04 | 2001-05-04 | Method for integration of multiple polymerase reactions of amplification with following analysis of amplified sequences on biochip directly |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2001112429A RU2218414C2 (en) | 2001-05-04 | 2001-05-04 | Method for integration of multiple polymerase reactions of amplification with following analysis of amplified sequences on biochip directly |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2001112429A RU2001112429A (en) | 2003-06-20 |
RU2218414C2 true RU2218414C2 (en) | 2003-12-10 |
Family
ID=32065340
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2001112429A RU2218414C2 (en) | 2001-05-04 | 2001-05-04 | Method for integration of multiple polymerase reactions of amplification with following analysis of amplified sequences on biochip directly |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2218414C2 (en) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US10501782B1 (en) | 2014-09-05 | 2019-12-10 | Touchlight IP Limited | Cell-free synthesis of DNA by strand displacement |
-
2001
- 2001-05-04 RU RU2001112429A patent/RU2218414C2/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
1. DUBILEY et al., Nucl. Acids Res., 1997, 25, №12, 2259-2265. 2. STRIZHKOV et al., Bio Techniques. 2000, 29, 844-857. 3. * |
7. ШАБАРОВА З.А. и др. Химические основы генетической инженерии. - М., 1994, гл. II, ч.2. 8. ВАСИЛИСКОВ В.А. и др. Молекулярная биология. 1998, 32, №5, 923-925. * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US10501782B1 (en) | 2014-09-05 | 2019-12-10 | Touchlight IP Limited | Cell-free synthesis of DNA by strand displacement |
RU2714253C2 (en) * | 2014-09-05 | 2020-02-13 | ТАЧЛАЙТ АйПи ЛИМИТЕД | Dna synthesis |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US6642000B1 (en) | PCR amplification on microarrays of gel immobilized oligonucleotides | |
EP3797170B1 (en) | Polynucleotide synthesis method, system and kit | |
US11884950B2 (en) | Methods and reagents for synthesising polynucleotide molecules | |
US6300070B1 (en) | Solid phase methods for amplifying multiple nucleic acids | |
EP2456888B1 (en) | Probes for specific analysis of nucleic acids | |
US20220177938A1 (en) | Polynucleotide synthesis method, kit and system | |
JP6716465B2 (en) | Sequencing of accumulated single cells | |
JP7393412B2 (en) | Polynucleotide synthesis methods, kits, and systems | |
US20220213537A1 (en) | Polynucleotide synthesis method, kit and system | |
US20220396818A1 (en) | Polynucleotide synthesis method, kit and system | |
RU2218414C2 (en) | Method for integration of multiple polymerase reactions of amplification with following analysis of amplified sequences on biochip directly | |
US20100204050A1 (en) | Target preparation for parallel sequencing of complex genomes | |
JP2001299346A (en) | Solid phase pcr method using immobilized primer | |
RU2001112429A (en) | A method for integrating multiple polymerase amplification reactions with subsequent analysis of amplified sequences directly on the biochip | |
CN116555406A (en) | Sequencing method capable of being repeatedly utilized |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
QB4A | License on use of patent |
Effective date: 20080909 |
|
QB4A | License on use of patent |
Effective date: 20100210 |
|
QB4A | License on use of patent |
Effective date: 20100212 |
|
QZ4A | Changes in the licence of a patent |
Effective date: 20100210 |
|
QZ41 | Official registration of changes to a registered agreement (patent) |
Effective date: 20110202 Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20100210 |
|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20130505 |