RU2214274C2

RU2214274C2 - Immunogenic composition containing chimeric hiv polypeptide, polypeptides and test-system for detection of antibodies raised to hiv

Info

Publication number: RU2214274C2
Application number: RU2001122896A
Authority: RU
Inventors: И.Г. Сидорович; И.А. Николаева; А.Ф. Шевалье; Г.А. Игнатьева; С.В. Коробова; Т.А. Алексеев; Р.В. Петров; Р.М. Хаитов
Priority date: 2001-08-16
Filing date: 2001-08-16
Publication date: 2003-10-20

Abstract

FIELD: medicine, biotechnology. SUBSTANCE: invention relates to immunogenic composition containing chimeric HIV polypeptide, method for induction of immune response to HIV 1 and HIV 1/2, chimeric polypeptide HIV 1 and HIV 1/2, DNA molecule encoding chimeric polypeptide, plasmid vector for expression of chimeric polypeptide, polyclonal antibodies raised to HIV 1 or HIV 1/2 and diagnostic test-system for detection of antibodies raised to HIV 1 and HIV 2. Invention involves immunogenic composition based on chimeric polypeptides HIV 1 or HIV 1/2 representing full-sized protein p24 fused with immunodominant fragment gp 41 of site 575-616 or taken among them (rec 24-41) or fused with immunodominant fragment gp 36 of the same site or taken among them (rec 24-36). Indicated composition is able to induce the strong immune response to HIV 1 or HIV 2. Invention involves also the gene construction able to expression of indicated chimeric polypeptides in E. coli cells and diagnostic test-system for detection of antibodies raised to HIV 1 and HIV 2. The advantage of invention involves the development of gene construction allowing expression the chimeric recombinant protein that contains a full-sized polypeptide as a component of a single polypeptide chain and related by its conformation to viral protein p24 and immunogenic protein fragment of HIV 1 or HIV 2 envelope. Indicated recombinant proteins are able to induce strong immune response to HIV 1 or HIV 1/2 that allows using these chimeric polypeptides both for creation of diagnostic test-systems and for their recommendation for development of vaccine preparations. EFFECT: valuable properties of composition. 18 cl, 3 tbl, 5 dwg, 10 ex

Description

Изобретение относится к медицине и биотехнологии и касается иммуногенной композиции, содержащей химерный полипептид ВИЧ, способа индукции иммунного ответа к ВИЧ1 или к ВИЧ1/2, химерного полипептида ВИЧ1 и ВИЧ1/2, полученного рекомбинантным методом, молекулы ДНК, кодирующей химерный полипептид, плазмидного вектора для экспрессии химерного полипептида, поликлональных антител к ВИЧ1 или ВИЧ1/2 и тест-системы для обнаружения антител к ВИЧ1 и ВИЧ2. The invention relates to medicine and biotechnology and relates to an immunogenic composition containing a chimeric HIV polypeptide, a method for inducing an immune response to HIV1 or HIV1 / 2, a chimeric HIV1 and HIV1 / 2 polypeptide obtained by the recombinant method, a DNA molecule encoding a chimeric polypeptide, a plasmid vector for expression of a chimeric polypeptide, polyclonal antibodies to HIV1 or HIV1 / 2 and a test system for detecting antibodies to HIV1 and HIV2.

Известно, что антитела к белкам, кодируемым геном GAG, являются ранним маркером инфекции ВИЧ, при этом антитела к белку р24 первыми появляются в сыворотке крови в процессе сероконверсии [1], а их уровень коррелирует с состоянием инфицированного человека (падает при появлении симптомов заболевания СПИД) [2, 3] и поэтому является прогностическим маркером инфекции ВИЧ. С другой стороны, именно GAG-белки довольно консервативны и, следовательно, позволяют выявлять антитела против различных субтипов ВИЧ. Поэтому белок р24 представляет особенный интерес при разработке вакцинных и диагностических препаратов. Antibodies to the proteins encoded by the GAG gene are known to be an early marker of HIV infection, while antibodies to the p24 protein are the first to appear in the blood serum during seroconversion [1], and their level correlates with the condition of an infected person (decreases with the onset of symptoms of AIDS ) [2, 3] and therefore is a prognostic marker of HIV infection. On the other hand, it is GAG proteins that are rather conservative and, therefore, can detect antibodies against various subtypes of HIV. Therefore, p24 protein is of particular interest in the development of vaccine and diagnostic products.

Антигены, кодируемые геном ENV-gp41 ВИЧ1 и gp36 ВИЧ2, являются вирусными трансмембранными гликопротеинами. Для белков, кодируемых геном ENV, известна короткая иммунодоминантная последовательность (около 40 аминокислот), способная обеспечить распознавание более 90% ВИЧ-положительных образцов (содержащих антитела к ВИЧ). Наоборот, олигопептиды, воспроизводящие короткие последовательности белков, кодируемых геном GAG, узнают не более 50% позитивных сывороток [4] . Приемлемую иммунореактивность проявляют только протяженные белки [5]. Antigens encoded by the HIV1 and HIV2 gp36 ENV-gp41 gene are viral transmembrane glycoproteins. For proteins encoded by the ENV gene, a short immunodominant sequence (about 40 amino acids) is known that can recognize more than 90% of HIV-positive samples (containing antibodies to HIV). Conversely, oligopeptides that reproduce short sequences of proteins encoded by the GAG gene recognize no more than 50% of positive sera [4]. Acceptable immunoreactivity is shown only by extended proteins [5].

Методы генной инженерии позволяют получать промышленные количества этих белков. Однако белки, экспрессируемые в системе Е. coli, не подвергаются посттрансляционной модификации, которая присуща белкам ВИЧ, образующимся в ходе инфекции, и, таким образом, иммунологические характеристики рекомбинантных белков могут несколько отличаться от свойств вирусных белков. Genetic engineering methods allow the production of industrial quantities of these proteins. However, the proteins expressed in the E. coli system do not undergo post-translational modification, which is inherent in HIV proteins generated during infection, and thus, the immunological characteristics of recombinant proteins may slightly differ from the properties of viral proteins.

Известны тест-системы на основе рекомбинантных белков, в которых в составе одной тест-системы используется смесь антигенов, куда входят как протяженные антигены, слитые с белком-носителем (например, с бета-галактозидазой, глутатионтрансферазой и т.д. [6]), так и короткие фрагменты, слитые с белком-носителем. Однако белки, входящие в состав смеси, различаются по физико-химическим свойствам, что осложняет этапы экспрессии и очистки и ведет к удорожанию этих продуктов. Еще более важно то, что различие физико-химических свойств антигенов ведет к их неравномерной сорбции на твердую фазу из смеси белков, что вызывает снижение чувствительности и специфичности теста. Вышеуказанные недостатки можно преодолеть с помощью химерных структур, куда входит набор актуальных антигенных детерминант. Known test systems based on recombinant proteins in which a single test system uses a mixture of antigens that include extended antigens fused with a carrier protein (for example, beta-galactosidase, glutathione transferase, etc. [6]) as well as short fragments fused to a carrier protein. However, the proteins that make up the mixture differ in physicochemical properties, which complicates the stages of expression and purification and leads to an increase in the cost of these products. Even more important, the difference in the physicochemical properties of antigens leads to their uneven sorption on the solid phase from a mixture of proteins, which causes a decrease in the sensitivity and specificity of the test. The above disadvantages can be overcome with the help of chimeric structures, which includes a set of topical antigenic determinants.

Первые конструкции без белка-носителя, кодирующие фрагменты р24 и иммунодоминантный участок gp41, были описаны в патентах США 5204259 и 5470720 и представлены химерньм рекомбинантным полипептидом, растворимым в водных растворах. На основе различных вариантов этих конструкций описаны диагностические системы для ИФА. В первом патенте описан ДНК-сегмент, кодирующий рекомбинантный ВИЧ р24 белок и ВИЧ p24-gp41 слитый белок, причем молекула ДНК способна экспрессировать оба этих белка. Описаны также клетки, трансформированные рекомбинантной ДНК, и метод получения слитого белка, а также диагностические системы с использованием слитого белка. В описании представлены аминокислотные последовательности, кодируемые этим сегментом ДНК, при этом слитый белок применяется для обнаружения антител против р24 или против gp41 ВИЧ1, преимущественно в ИФА. Во втором патенте описаны 4 разных химерных полипептида. При этом белок р24 разорван на длинную N-концевую часть (1-225 по нумерации авторов) и короткую С-концевую часть из 7 аминокислот, а между этими частями вставлен иммунореактивный фрагмент из gp41 и/или gp36 длиной от 15 до 20 аминокислот, но не более 35. Схема строения описанного химерного белка может быть представлена следующим образом: 1) (фрагмент р24 - фрагмент gp41 - фрагмент р24), 2) (фрагмент р24 - фрагмент gp36 - фрагмент р24), 3) (фрагмент р24 - фрагмент gp41 - фрагмент gp36 - фрагмент gp41 - фрагмент - gp41 - фрагмент р24), 4) (фрагмент р24 - фрагмент gp41 - фрагмент gp36 - фрагмент р24). В патенте также представлена структура ДНК-сегмента, кодирующего химерные полипептиды, а также рекомбинантная молекула ДНК, способная экспрессировать химерный полипептид в клетках Е. coli. Также описана ИФА диагностическая тест-система на основе химерных полипептидов, сорбированных на твердой подложке. The first protein-free constructs encoding the p24 fragments and the gp41 immunodominant region were described in US Pat. Nos. 5,204,259 and 5,470,720 and are represented by the chimeric recombinant polypeptide soluble in aqueous solutions. Based on various variants of these designs, diagnostic systems for ELISA are described. The first patent describes a DNA segment encoding a recombinant HIV p24 protein and an HIV p24-gp41 fusion protein, the DNA molecule being able to express both of these proteins. Also described are cells transformed with recombinant DNA, and a method for producing a fusion protein, as well as diagnostic systems using a fused protein. The description provides the amino acid sequences encoded by this DNA segment, and the fusion protein is used to detect antibodies against p24 or against gp41 HIV1, mainly in ELISA. The second patent describes 4 different chimeric polypeptides. In this case, p24 protein is torn into a long N-terminal part (1-225 according to the numbering of the authors) and a short C-terminal part of 7 amino acids, and an immunoreactive fragment of gp41 and / or gp36 from 15 to 20 amino acids in length is inserted between these parts, but no more than 35. The structure diagram of the described chimeric protein can be represented as follows: 1) (p24 fragment - gp41 fragment - p24 fragment), 2) (p24 fragment - gp36 fragment - p24 fragment), 3) (p24 fragment - gp41 fragment - fragment gp36 - fragment gp41 - fragment - gp41 - fragment p24), 4) (fragment p24 - fragment gp41 - fragment gp36 - fragment p24). The patent also provides the structure of a DNA segment encoding chimeric polypeptides, as well as a recombinant DNA molecule capable of expressing a chimeric polypeptide in E. coli cells. An ELISA diagnostic test system based on chimeric polypeptides sorbed on a solid substrate is also described.

В патенте ЕР 0307149 описан твердофазный иммуноферментный анализ для определения антител против р24 и антител против gp41 ВИЧ1, основанный на использовании химерного белка, состоящего из аминокислотной последовательности GAG 121-356 и ENV последовательности, соответствующей аминокислотным остаткам 542-674 (нумерация по [7]). Химерный белок состоит из 379 аминокислот, процесс экспрессии рекомбинантного белка включает трансформацию хозяйских клеток, предпочтительно Е. coli, вектором, который включает ген, кодирующий указанный белок, и который в хозяйских клетках экспрессирует указанный белок, культивирование клеток и выделение белка. Однако ни в одном из указанных патентов химерные белки не использовались и не обсуждались для использования в вакцинных препаратах. EP 0 307 149 describes an enzyme-linked immunosorbent assay for determining anti-p24 antibodies and anti-HIV gp41 antibodies based on the use of a chimeric protein consisting of the amino acid sequence GAG 121-356 and the ENV sequence corresponding to amino acid residues 542-674 (numbering according to [7]) . A chimeric protein consists of 379 amino acids, the process of expression of a recombinant protein involves transformation of host cells, preferably E. coli, with a vector that includes a gene encoding the specified protein, and which expresses the specified protein in host cells, cell cultivation and protein isolation. However, in none of these patents did chimeric proteins be used or discussed for use in vaccine preparations.

Описана [5] диагностическая система на основе рекомбинантных антигенов, копирующих ВИЧ1-специфические последовательности gp41 (аминокислоты 584-615, по нумерации авторов) и р24 (аминокислоты 78-437, по нумерации авторов) и ВИЧ2-специфическую последовательность gp36. Однако белок, описанный авторами статьи как рекомбинантный р24, фактически представляет собой длинный фрагмент предшественника ядерных (core) белков ВИЧ1-р55, куда входят фрагмент р17, полный р24 и фрагмент р15, и используется в составе смеси с рекомбинантным gp41, а не в виде химерного белка, а последовательность gp36 не приведена. A diagnostic system based on recombinant antigens copying HIV1-specific sequences of gp41 (amino acids 584-615, according to the numbering of the authors) and p24 (amino acids 78-437, according to the numbering of the authors) and the HIV2-specific sequence of gp36 are described [5]. However, the protein described by the authors of the article as recombinant p24, in fact, is a long fragment of the precursor of the nuclear (core) HIV1-p55 proteins, which includes the p17 fragment, full p24 and p15 fragment, and is used as part of a mixture with recombinant gp41, and not in the form of a chimeric protein, and the sequence of gp36 is not shown.

Описанные работы касаются слитых белков р24 с gp41, которые эффективно применяются в диагностических тест-системах. Использование слитых белков в качестве вакцинных препаратов не описано. The described works relate to p24 fusion proteins with gp41, which are effectively used in diagnostic test systems. The use of fusion proteins as vaccines has not been described.

Описан новый иммуноген ВИЧ1, представляющий собой рекомбинантный водорастворимый химерный полипептид, содержащий фрагменты структурных белков ВИЧ1. Генная конструкция кодирует весь внутренний белок р24 и иммуногенный фрагмент gp41. Экспрессируемый химерный белок, очищенный до 99,99% гомогенности, дает сильный иммунный ответ на р24 ВИЧ1 с титром более 100 000 в ИФА [8, 9]. Авторы предлагают использовать указанный белок в качестве кандидатной вакцины. Однако в указанных материалах не приводится строение химерного полипептида. A new HIV1 immunogen is described, which is a recombinant water-soluble chimeric polypeptide containing fragments of structural proteins of HIV1. The gene construct encodes the entire internal p24 protein and immunogenic fragment of gp41. The expressed chimeric protein, purified to 99.99% homogeneity, gives a strong immune response to p24 HIV1 with a titer of more than 100,000 in ELISA [8, 9]. The authors propose using the indicated protein as a candidate vaccine. However, the structure of the chimeric polypeptide is not given in these materials.

В связи с вышеизложенным, целью данного изобретения является создание таких химерных белков p24-gp41 и p24-gp36, которые успешно могут применяться не только для диагностики, но и в качестве вакцинного препарата. In connection with the foregoing, the aim of the present invention is to provide such chimeric proteins p24-gp41 and p24-gp36, which can be successfully used not only for diagnosis, but also as a vaccine preparation.

Задача данного изобретения заключается в разработке генной конструкции, экспрессирующей в клетках прокариот химерный рекомбинантный белок, содержащий в составе одной полипептидной цепи полноразмерный полипептид, конформационно близкий к вирусному белку р24, и иммунодоминантный фрагмент белка оболочки ВИЧ1 или ВИЧ2, и представляющий собой слитый белок, содержащий на N-конце полноразмерный р24, а на С-конце - иммунодоминантный фрагмент gp41 или gp36, и создание на базе полученных белков иммуногенной композиции, способной индуцировать сильный иммунный ответ у млекопитающих, а также высокоэффективной диагностической тест-системы для определения антител против ВИЧ1 и/или ВИЧ2. The objective of this invention is to develop a gene construct that expresses in a prokaryotic cell a chimeric recombinant protein containing in one polypeptide chain a full-sized polypeptide conformationally close to the p24 viral protein and an immunodominant fragment of the HIV1 or HIV2 envelope protein, and which is a fusion protein containing At the N-terminus, full-size p24, and at the C-terminus, an immunodominant fragment of gp41 or gp36, and the creation of an immunogenic composition based on the obtained proteins that can induce strong and mammalian response in mammals, as well as a highly effective diagnostic test system for determining antibodies against HIV1 and / or HIV2.

Сущность данного изобретения включает: иммуногенную композицию, содержащую химерный полипептид ВИЧ, способ индукции иммунного ответа к ВИЧ1 или к ВИЧ1/2, молекулу ДНК, кодирующую химерный полипептид ВИЧ1 или ВИЧ1/2, плазмидный вектор для экспрессии в клетках прокариот химербного полипептида ВИЧ1 или ВИЧ 1/2, поликлональные антитела к ВИЧ1 или к ВИЧ 1/2, тест-систему для обнаружения антител к ВИЧ1 и ВИЧ2. The essence of this invention includes: an immunogenic composition comprising a chimeric HIV polypeptide, a method for inducing an immune response to HIV1 or HIV1 / 2, a DNA molecule encoding a chimeric HIV1 or HIV1 / 2 polypeptide, a plasmid vector for expression in the cells of the prokaryotic HIV1 or HIV chimeric polypeptide 1 / 2, polyclonal antibodies to HIV1 or to HIV 1/2, a test system for the detection of antibodies to HIV1 and HIV2.

Данное изобретение включает группу изобретений, объединенных общим изобретательским замыслом. This invention includes a group of inventions united by a common inventive concept.

Иммуногенная композиция, содержащая химерный полипептид ВИЧ, характеризующаяся тем, что она представляет собой полноразмерный белок р24, слитый с иммунодоминантным фрагментом gp41, содержащим аминокислоты участка 575-616 (здесь и далее нумерация по [7] и [10]), или выбранные из него (rec 24-41) (фиг. 1а), или слитый с иммунодоминантным фрагментом gp36, содержащим аминокислоты участка 575-616 или выбранные из него (rec 24-36) (фиг.1б), и фармакологически пригодный носитель и/или разбавитель. An immunogenic composition containing a chimeric HIV polypeptide, characterized in that it is a full-sized p24 protein fused to an immunodominant gp41 fragment containing amino acids of the 575-616 region (hereinafter, numbering according to [7] and [10]), or selected from it (rec 24-41) (Fig. 1a), or fused to an immunodominant gp36 fragment containing or selected from the amino acids of region 575-616 (rec 24-36) (Fig. 1b) and a pharmacologically acceptable carrier and / or diluent.

Еще одним из аспектов изобретения является способ индукции иммунного ответа к ВИЧ1 или ВИЧ 1/2 у млекопитающих, характеризующийся тем, что млекопитающим вводят иммуногенную композицию по п.1, при этом для индукции иммунного ответа к ВИЧ1 млекопитающим вводят иммуногенную композицию, представляющую собой полноразмерный белок р24, слитый с иммунодоминантным фрагментом gp41, содержащим аминокислоты участка 575-616, или выбранные из него (rec 24-41), а для индукции иммунного ответа к ВИЧ 1/2 млекопитающим вводят иммуногенную композицию, представляющую собой полноразмерный белок р24, слитый с иммунодоминантным фрагментом gp36, содержащим аминокислоты участка 575-616, или выбранные из него (rec 24-36). Another aspect of the invention is a method of inducing an immune response to HIV1 or HIV 1/2 in mammals, characterized in that mammals are administered the immunogenic composition according to claim 1, while to induce an immune response to HIV1 mammals are administered an immunogenic composition, which is a full-sized protein p24 fused to an immunodominant gp41 fragment containing amino acids of region 575-616 or selected from it (rec 24-41), and to induce an immune response to HIV 1/2, an immunogenic composition representing oh full length p24 protein, fused to immunodominant fragment of gp36, amino acids 575-616 containing portion, or selected therefrom (rec 24-36).

Для создания иммуногенной композиции разработан химерный полипептид ВИЧ, характеризующийся тем, что в случае ВИЧ1 он представляет собой полноразмерный белок р24, слитый с иммунодоминантным фрагментом gp41, содержащим аминокислоты участка 575-616, или выбранные из него (rec 24-41) (фиг.1a), а в случае ВИЧ1/2 он представляет собой полноразмерный белок р24, слитый с иммунодоминантным фрагментом gp36, содержащим аминокислоты участка 575-616 или выбранные из него (rec 24-36) (фиг.1б). To create an immunogenic composition, a chimeric HIV polypeptide has been developed, characterized in that in the case of HIV1 it is a full-sized p24 protein fused to or selected from the amino acids of the gp41 fragment of amino acids 575-616 (rec 24-41) (Fig. 1a ), and in the case of HIV1 / 2, it is a full-sized p24 protein fused to the immunodominant gp36 fragment containing amino acids of the 575-616 region or selected from it (rec 24-36) (Fig. 1b).

При этом иммунодоминантный фрагмент gp41 имеет следующие аминокислотные последовательности:
SEQ ID NО:1 575-616
L Q A R V T N I E K Y L Q D Q A R L N S W G C A F R Q V C H T T V P W P N D T L K P
SEQ ID NO:2 578-609
R V T N I E K Y L Q D Q A R L N S W G C A F R Q V C H T T V P W
SEQ ID NO:3 595-607
W G C A F R Q V C H T T V
а иммунодоминантный фрагмент gp36 имеет следующие аминокислотные последовательности:
SEQ ID NO:4 575-616
L Q A R V T N I E K Y L Q D Q A R L N S W G C A F R Q V C H T T V P W P N D T L K P
SEQ ID NO:5 578-609
R V T N I E K Y L Q D Q A R L N S W G C A F R Q V C H T T V P W
SEQ ID NO:6 595-607
W G C A F R Q V C H T T V
Молекула ДНК, кодирующая химерный полипептид ВИЧ, представляет собой последовательность оснований
SEQ ID NO:7 для химерного полипептида ВИЧ1 (rec 24-41) и
SEQ ID NO:8 для химерного полипептида ВИЧ1/2 (rec 24-36).In this case, the immunodominant gp41 fragment has the following amino acid sequences:
SEQ ID NO: 1 575-616
LQARVTNIEKYLQDQARLNSW GCAFRQVCHTTVPWPNDTLKP
SEQ ID NO: 2 578-609
RVTNIEKYLQDQARLNSWGCA FRQVCHTTVPW
SEQ ID NO: 3 595-607
WGCAFRQVCHTTV
and the immunodominant gp36 fragment has the following amino acid sequences:
SEQ ID NO: 4 575-616
LQARVTNIEKYLQDQARLNSW GCAFRQVCHTTVPWPNDTLKP
SEQ ID NO: 5 578-609
RVTNIEKYLQDQARLNSWGCA FRQVCHTTVPW
SEQ ID NO: 6 595-607
WGCAFRQVCHTTV
A DNA molecule encoding a chimeric HIV polypeptide is a base sequence
SEQ ID NO: 7 for the chimeric HIV1 polypeptide (rec 24-41) and
SEQ ID NO: 8 for the chimeric HIV1 / 2 polypeptide (rec 24-36).

Плазмидный вектор, применяемый для экспрессии химерного полипептида ВИЧ, представляет собой вектор, пригодный для экспрессии в клетках Е.coli и содержащий молекулу ДНК SEQ ID NO:7 для химерного полипептида ВИЧ1 (rec 24-41) или SEQ ID NO:8 для химерного полипептида ВИЧ1/2 (rec 24-36). The plasmid vector used to express the chimeric HIV polypeptide is a vector suitable for expression in E. coli cells and contains the DNA molecule SEQ ID NO: 7 for the HIV1 chimeric polypeptide (rec 24-41) or SEQ ID NO: 8 for the chimeric polypeptide HIV 1/2 (rec 24-36).

Кроме того, предложен плазмидный вектор для экспрессии химерного полипептида ВИЧ1 (rec 24-41), представляющий собой плазмиду рЕТ15b, в которую вставлены по сайту рестрикции Bam HI фрагмент ДНК SEQ ID NO:7, а по сайтам рестрикции Hind III-Eco R1 вставлен par-локус. In addition, a plasmid vector for expression of the HIV1 chimeric polypeptide (rec 24-41) is proposed, which is a plasmid pET15b into which the DNA fragment SEQ ID NO: 7 is inserted at the Bam HI restriction site, and par is inserted at the Hind III-Eco R1 restriction sites locus.

Кроме того, плазмидный вектор для экспрессии химерного полипептида ВИЧ1/2 (rec 24-36) представляет собой плазмиду рЕТ15b, в которую вставлены по сайту рестрикции Bam HI фрагмент ДНК SEQ ID NO: 8, а по сайтам рестрикции Hind III-Eco R1 вставлен par-локус. In addition, the plasmid vector for expression of the chimeric HIV1 / 2 polypeptide (rec 24-36) is a plasmid pET15b, into which the DNA fragment SEQ ID NO: 8 was inserted at the Bam HI restriction site, and par was inserted at the Hind III-Eco R1 restriction sites locus.

Изобретение также касается поликлональных антител к ВИЧ1 или ВИЧ1/2, которые представляют собой иммуноглобулины класса IgG 2a, полученные при иммунизации млекопитающих химерным полипептидом, с титром не менее 30 000 к фрагменту gp41 и gp36 и не менее 200 000 к р24 в непрямом ИФА. The invention also relates to polyclonal antibodies to HIV1 or HIV1 / 2, which are IgG 2a class immunoglobulins obtained by immunizing mammals with a chimeric polypeptide with a titer of at least 30,000 to the gp41 and gp36 fragment and at least 200,000 to p24 in indirect ELISA.

Изобретение также включает тест-систему для обнаружения антител к ВИЧ, содержащую сорбированные на твердой подложке антигены ВИЧ, представленные химерными полипептидами, и детектирующий реагент, при этом антиген ВИЧ1 представляет собой полноразмерный белок р24, слитый с иммунодоминантным фрагментом gp41, содержащим аминокислоты участка 575-616 или выбранные из него (rec 24-41), а антиген ВИЧ 1/2 представляет собой полноразмерный белок р24, слитый с иммунодоминантным фрагментом gp36, содержащим аминокислоты участка 575-616 или выбранные из него (rec 24-36). The invention also includes a test system for detecting antibodies to HIV, containing HIV antigens adsorbed on a solid support, represented by chimeric polypeptides, and a detecting reagent, wherein HIV1 antigen is a full-size p24 protein fused to the immunodominant fragment of gp41 containing amino acids of region 575-616 or selected from it (rec 24-41), and the HIV 1/2 antigen is a full-sized p24 protein fused to an immunodominant gp36 fragment containing amino acids of the 575-616 region or selected from it (rec 24-36).

Вышеупомянутая тест-система в качестве детектирующего реагента может содержать конъюгат антивидовых антител с пероксидазой хрена. The aforementioned test system as a detecting reagent may contain a conjugate of antispecies antibodies with horseradish peroxidase.

Тест-система может также в качестве детектирующего реагента содержать конъюгат антивидовых антител со щелочной фосфатазой. The test system may also contain a conjugate of antispecies antibodies with alkaline phosphatase as a detecting reagent.

Тест-система может также содержать в качестве детектирующего реагента - конъюгат А-белка St. aureus с пероксидазой хрена. The test system may also contain St. A conjugate protein as a detecting reagent. aureus with horseradish peroxidase.

Еще одним вариантом может быть тест-система, в качестве детектирующего реагента содержащая конъюгат антивидовых антител с коллоидным углеродом. Another option may be a test system containing a conjugate of antispecies antibodies with colloidal carbon as a detecting reagent.

Тест-система может также содержать в качестве детектирующего реагента конъюгат А-белка St.aureus с коллоидным углеродом. The test system may also contain a colloidal carbon conjugate of St.aureus A protein as a detecting reagent.

Еще один вариант тест-системы может содержать в качестве детектирующего реагента химерные полипептиды, конъюгированные с пероксидазой хрена. Another variant of the test system may contain chimeric polypeptides conjugated to horseradish peroxidase as a detecting reagent.

Тест-система может также использовать в качестве детектирующего реагента химерные полипептиды, конъюгированные с коллоидным углеродом. The test system can also use colloidal carbon conjugated chimeric polypeptides as a detection reagent.

Изобретение иллюстрируется следующим примером. The invention is illustrated by the following example.

Химерную конструкцию, отвечающую целому белку gp24 и фрагменту gp41, собирают в промежуточной плазмиде, например pBS. Синтезируют праймеры, соответствующие 131-136 и 365-370 аминокислотной последовательности полноразмерной кДНК плазмиды рВН10 для р24 и соответственно 584-589 и 610-615 для фрагмента gp41. PCR-фрагменты поочередно клонируют в pBS. В качестве экспрессирующего вектора используют любую систему, пригодную для экспрессии в прокариотических клетках, например в Е. coli. Таким вектором может служить рЕТ15 или любой другой подходящий для этой цели, например pQE31 (Qiagen). Результатом экспрессии является химерный белок rec 24-41. Клетки обрабатывают 8М мочевиной и ультразвуком. Осветленный лизат сульфитируют и чистят на аффинной колонке с Ni2+ -агарозой, а затем на колонке с Q-сефарозой (Pharmacia). Чистоту продукта проверяют электрофорезом в PAAG. Белки используют для иммунизации, конъюгации с ферментом и иммуноферментного анализа (ИФА) и т.д. The chimeric construct corresponding to the whole gp24 protein and the gp41 fragment is assembled in an intermediate plasmid, for example pBS. Primers are synthesized corresponding to 131-136 and 365-370 amino acid sequence of the full-length cDNA of plasmid pBH10 for p24 and, respectively, 584-589 and 610-615 for the gp41 fragment. PCR fragments are alternately cloned into pBS. As the expression vector, any system suitable for expression in prokaryotic cells, for example, E. coli, is used. Such a vector may be pET15 or any other suitable for this purpose, for example pQE31 (Qiagen). The expression result is a chimeric protein rec 24-41. Cells are treated with 8M urea and ultrasound. The clarified lysate is sulfonated and purified on an affinity column with Ni2 + agarose, and then on a Q-Sepharose column (Pharmacia). The purity of the product is checked by electrophoresis in PAAG. Proteins are used for immunization, conjugation with an enzyme and enzyme immunoassay (ELISA), etc.

Способность белков индуцировать иммуный ответ (иммуногенность препарата) проверяют на лабораторных животных. Кроликов весом 2 кг иммунизируют белком rec 24-41 или rec 24-36. Повторную иммунизацию проводят через 4 недели после первой. Кровь собирают из ушной вены и получают сыворотку обычным способом. Мышей иммунизируют внутрибрюшинно белком rec 24-41 или rec 24-36. Вторую иммунизацию проводят через 2 месяца после первой. Кровь собирают из шейной артерии через 7 дней после иммунизации и получают сыворотку как обычно. The ability of proteins to induce an immune response (immunogenicity of the drug) is tested in laboratory animals. Rabbits weighing 2 kg are immunized with protein rec 24-41 or rec 24-36. Re-immunization is carried out 4 weeks after the first. Blood is collected from the ear vein and serum is obtained in the usual manner. Mice are immunized intraperitoneally with protein rec 24-41 or rec 24-36. The second immunization is carried out 2 months after the first. Blood is collected from the cervical artery 7 days after immunization and serum is obtained as usual.

В иммуногенных композициях в качестве физиологически пригодного носителя используется гидроокись алюминия, а в качестве фармакологически пригодного разбавителя любые подходящие растворы для парентерального применения. In immunogenic compositions, aluminum hydroxide is used as a physiologically acceptable carrier, and any suitable solutions for parenteral use are used as a pharmacologically suitable diluent.

Способность химерных полипептидов распознавать и выявлять антитела к ВИЧ проверяют следующим образом. Химерные полипептиды rec 24-41 и rec 24-36 сорбируют на твердой фазе, например в лунках полистиролового планшета, добавляют образцы сывороток крови инфицированных и неинфицированных ВИЧ людей в приемлемом разведении и проводят иммуноферментный анализ обычным способом, применяя один из детектирующих реагентов и колориметрический индикатор. The ability of chimeric polypeptides to recognize and detect antibodies to HIV is tested as follows. Chimeric polypeptides rec 24-41 and rec 24-36 are adsorbed on the solid phase, for example, in the wells of a polystyrene plate, blood samples of infected and uninfected HIV people are added in an acceptable dilution, and enzyme immunoassay is carried out in the usual way using one of the detection reagents and a colorimetric indicator.

Примеры конкретного осуществления изобретения. Examples of specific embodiments of the invention.

Пример 1. Получение плазмиды pET15par. Example 1. Obtaining the plasmid pET15par.

рЕТ 15b гидролизуют рестриктазой Hind III, достраивают липкие концы ДНК-полимеразой Т4, плазмиду выделяют набором Quiagen и лигируют с par-локусом, полученным по [11]. Полученной лигазной смесью трансформируют клетки Е. coli штамм Nova-Blue (Novagen) по обычной методике [12]. Трансформированные клетки высевают на чашки с LB агаром, содержащим 25 мкг/мл канамицина. Выросшие колонии проверяют на наличие рекомбинантных плазмид. Для этого бактериальные клетки лизируют и выделяют плазмидную ДНК. Выделенную плазмидную ДНК обрабатывают рестриктазами Pst I и Hind III и гидролизат исследуют электорофорезом в 1%-ной агарозе. Гидролизат плазмидной ДНК рЕТ15-par имеет на электрофореграмме полосу ДНК размером 2270 пар оснований. pET 15b is hydrolyzed with Hind III restriction enzyme, the sticky ends are completed with T4 DNA polymerase, the plasmid is isolated with Quiagen kit and ligated with the par locus obtained according to [11]. The obtained ligase mixture transform cells of E. coli strain Nova-Blue (Novagen) by the usual method [12]. Transformed cells are plated on LB agar plates containing 25 μg / ml kanamycin. The grown colonies are checked for the presence of recombinant plasmids. For this, bacterial cells lyse and secrete plasmid DNA. The isolated plasmid DNA is treated with restriction enzymes Pst I and Hind III and the hydrolyzate is examined by electrophoresis in 1% agarose. The pET15-par plasmid DNA hydrolyzate has a 2270 base pair DNA band on the electrophoregram.

Пример 2. Получение плазмиды рЕТ15par(24-41). Example 2. Obtaining plasmids pET15par (24-41).

Олигонуклеотиды для получения gp41 кинируют с помощью ДНК-киназы обычным способом [12], смешивают в эквимолярном соотношении, инкубируют при 95^oС 30 мин и отжигают до 15^oС в течение 2 часов в термостате, добавляют ДНК-лигазу и инкубируют ночь при 15^oС. Целевой фрагмент ДНК rес gp41 выделяют с помощью набора для выделения ДНК фирмы Qiagen.Oligonucleotides for gp41 production are kinetized using DNA kinase in the usual way [12], mixed in an equimolar ratio, incubated at 95 ^° C for 30 minutes and annealed to 15 ^° C for 2 hours in a thermostat, DNA ligase is added and incubated overnight at 15 ^o C. The target res gp41 DNA fragment is isolated using a Qiagen DNA isolation kit.

Структура олигонуклеотидов для получения синтетической фрагмента gp41. The structure of oligonucleotides to obtain a synthetic fragment of gp41.

5' GAT CTG GGT ACC GAC GAC GAC GAC AAG AAG GCC ATG GCG ATA TCG GAT CTG CAG CGT GTT CTG GCT GTT GAA CGT TAC CTG AAA GAC CAG CAG CTG CTG GGT ATC TGG GGT TGC TCT GGT AAA CTG ATC TGC ACC ACC GCT GTT CCG TGG TAA TAA G 3'
5' GA TCC TTA TTA CCA CGG AAC AGC GGT GGT GCA GAT CAG TTT ACC AGA GCA ACC CCA GAT ACC CAG CAG CTG CTG GTC TTT CAG GTA ACG TTC AAC AGC CAG AAC ACG CTG CAG ATC CGA TAT CGC CAT GGC CTT CTT GTC GTC GTC GTC GGT ACC CA 3'
Для получения фрагмента rec р24 плазмиду рВН-10, содержащую полноразмерный геном ВИЧ1 [7], амплифицируют с помощью праймеров N1 и N2. Фрагмент ДНК выделяют с помощью набора для выделения ДНК фирмы Qiagen, гидролизуют рестриктазой BamH1 и очищают электрофорезом в 1%-ной агарозе.5 'GAT CTG GGT ACC GAC GAC GAC GAC AAG AAG GCC ATG GCG ATA TCG GAT CTG CAG CGT GTT CTG GCT GTT GAA CGT TAC CTG AAA GAC CAG CAG CTG CTG GGT ATC TGG GGT TGC TCT GGT AAA CTG ATC GTC ATC CCG TGG TAA TAA G 3 '
5 'GA TCC TTA TTA CCA CGG AAC AGC GGT GGT GCA GAT CAG TTT ACC AGA GCA ACC CCA GAT ACC CAG CAG CTG CTG GTC TTT CAG GTA ACG TTC AAC AGC CAG AAC ACG CTG CAG ATC CGA TAT CGC CAT GGC CTT CTT GTC GTC GTC GGT ACC CA 3 '
To obtain the rec p24 fragment, the plasmid pBH-10 containing the full-length HIV1 genome [7] is amplified using primers N1 and N2. The DNA fragment was isolated using a Qiagen DNA isolation kit, digested with BamH1 restriction enzyme and purified by electrophoresis in 1% agarose.

Структура олигонуклеотидов для получения ПЦР-фрагмента р24 и ПЦР-фрагмента 24-41. The structure of oligonucleotides to obtain a PCR fragment of p24 and a PCR fragment of 24-41.

N1 GGGG GAT ССТ САА ААТ ТАС ССТ АТА GTG
N2 GGGG GG АТС САА TAG TTG GCT CAT TGC TTC
N3 GGGGG GAT ССТ TAT ТАС САС GCA AC
T7 ААТ ACG ACT CAC TAT AG
Для получения полноразмерного фрагмента ДНК, кодирующего белок rec 24-41, в пробирке 0,5 мл смешивают оба фрагмента ДНК (р24 и gp41) и проводят ПЦР с использованием праймеров N1 и N3. Целевой фрагмент выделяют, как описано выше, гидролизуют рестриктазой BamH1 и лигируют с вектором рЕТ15-par, гидролизованным той же рестриктазой. Полученной лигазной смесью трансформируют клетки Е.coli штамм Nova-Blue (Novagen) по обычной методике [12]. Трансформированные клетки высевают на чашки с LB агаром, содержащим 25 мкг/мл канамицина. Выросшие колонии проверяют на наличие рекомбинантных плазмид. Для этого бактериальные клоны выращивают и выделяют плазмидную ДНК. Выделенную плазмидную ДНК анализируют ПЦР с использованием праймеров N3 и Т7. Структуру ДНК фрагмента подтверждают секвенированием по методу Сэнгера с использованием праймеров Т7 и N3 [12]. Структура ДНК фрагмента показана на фиг.1а, схема конструкции экспрессирующего вектора приведена на фиг.2а.N1 GGGG GAT SST CAA AAT TAS SST ATA GTG
N2 GGGG GG PBX CAA TAG TTG GCT CAT TGC TTC
N3 GGGGG GAT CCT TAT TAC CAC GCA AC
T7 AAT ACG ACT CAC TAT AG
To obtain a full-sized DNA fragment encoding the rec 24-41 protein, both DNA fragments (p24 and gp41) are mixed in a 0.5 ml tube and PCR is performed using primers N1 and N3. The target fragment is isolated as described above, hydrolyzed with BamH1 restriction enzyme and ligated with the pET15-par vector hydrolyzed with the same restriction enzyme. The obtained ligase mixture transform cells of E. coli strain Nova-Blue (Novagen) by the usual method [12]. Transformed cells are plated on LB agar plates containing 25 μg / ml kanamycin. The grown colonies are checked for the presence of recombinant plasmids. For this, bacterial clones are grown and plasmid DNA is isolated. Isolated plasmid DNA was analyzed by PCR using primers N3 and T7. The structure of the DNA fragment is confirmed by Sanger sequencing using T7 and N3 primers [12]. The structure of the DNA fragment is shown in figa, the design scheme of the expression vector is shown in figa.

Пример 3. Получение плазмиды рЕТ15раг(24-36). Example 3. Obtaining plasmids pET15rag (24-36).

Структура олигонуклеотидов для получения синтетической фрагмента gp36. The structure of oligonucleotides to obtain a synthetic fragment of gp36.

5' GAT CTG GGT ACC GAC GAC GAC GAC AAG AAG GCC ATG GCG ATA TCG GAT CTG CAG GAG CGT GTT ACC GCT ATC GAA AAA TAC CTG CAG GAC CAG GCT CGT CTG AAC AGC TGG GGT TGC GCT TTC CGT CAG GTT TGC CAC ACC ACT GTT CCG TGG TAA TAA G 3'
5' A TCC TTA TTA CCA CGG AAC AGT GGT GTG GCA AAC CTG ACG GAA AGC GCA ACC CCA GCT GTT CAG ACG AGC CTG GCC CTG CAG GTA TTT TTC GAT AGC GGT AAC ACG CTC CTG CAG ATC CGA TAT CGC CAT GGC CTT CTT GTC GTC GTC GTC GGT ACC CA 3'
Фрагмент ДНК, кодирующий белок rec 24-36, получают так же, как описано в примере 1. Структура ДНК фрагмента показана на фиг. 1б, схема конструкции экспрессирующего вектора приведена на фиг. 2б.5 'GAT CTG GGT ACC GAC GAC GAC GAC AAG AAG GCC ATG GCG ATA TCG GAT CTG CAG GAG CGT GTT ACC GCT ATC GAA AAA TAC CTG CAG GAC CAG GCT CGT CTG AAC AGC TGG GGT TGC GCT TTC CG ACT GTT CCG TGG TAA TAA G 3 '
5 'A TCC TTA TTA CCA CGG AAC AGT GGT GTG GCA AAC CTG ACG GAA AGC GCA ACC CCA GCT GTT CAG ACG AGC CTG GCC CTG CAG GTA TTT TTC GAT AGC GGT AAC ACG CTC CTG CAG ATC CGA TAT CGC CAT GGC CTT GTC GTC GTC GGT ACC CA 3 '
The DNA fragment encoding the rec 24-36 protein is obtained as described in Example 1. The structure of the DNA fragment is shown in FIG. 1b, a design diagram of an expression vector is shown in FIG. 2b.

Пример 4. Экспрессия, выделение и очистка rec 24-41 ВИЧ1. Example 4. Expression, isolation and purification of rec 24-41 HIV1.

Штамм Е.coli BL21 (DE3), содержащий плазмиду рЕТ15par(24-41), выращивают в 1 литре среды LB, содержащей 25 мг/л канамицина, при 37^oС до плотности 0,5 ОЕ (при 600 нм), добавляют ИПТГ (изопропилтиоглюкопиранозид) до концентрации 1 мМ, инкубируют еще в течение 4 часов и собирают клетки центрифугированием при 4000g. Клетки суспендируют в 50 мл 6 М мочевины, обрабатывают ультразвуком, к осветленному лизату добавляют тетратионат калия и сульфит натрия до концентрации 25 мМ и 100 мМ соответственно, инкубируют 16 ч и смесь хроматографируют на аффинной колонке с Ni2+ - агарозой (Qiagen) по прописи фирмы-производителя. Рехроматографию проводят на колонке с Q-сефарозой в 6 М мочевине и линейном градиенте NaCl (0-0,2 М). Чистоту продукта оценивают по электрофорезу в PAAG (фиг.3).The E. coli strain BL21 (DE3) containing the plasmid pET15par (24-41) is grown in 1 liter of LB medium containing 25 mg / l kanamycin at 37 ^° C to a density of 0.5 OE (at 600 nm), IPTG is added (isopropylthioglucopyranoside) to a concentration of 1 mM, incubated for another 4 hours and cells were collected by centrifugation at 4000g. Cells are suspended in 50 ml of 6 M urea, sonicated, potassium tetrathionate and sodium sulfite are added to the clarified lysate to a concentration of 25 mM and 100 mM, respectively, incubated for 16 hours and the mixture is chromatographed on an affinity column with Ni2 + agarose (Qiagen) according to the company manufacturer. Rechromatography was performed on a Q-Sepharose column in 6 M urea and a linear NaCl gradient (0-0.2 M). The purity of the product is evaluated by electrophoresis in PAAG (figure 3).

Для проведения рефолдинга к раствору белка добавляют цистеин до конечной концентрации 10 мМ, инкубируют 72 ч при 4^oС и диализуют ступенчато против 6 М-1 М мочевины, а затем против 10 мМ NaHCO₃ и белок лиофилизуют. Аминокислотная последовательность гибридного полипептида, определенная на основании нуклеотидной последовательности, приведена на фиг.1а. Структура подтверждена масс-спектром MALDI-TOF и результатами триптического гидролиза.For refolding, cysteine is added to the protein solution to a final concentration of 10 mM, incubated for 72 hours at 4 ^° C and dialyzed stepwise against 6 M-1 M urea, and then against 10 mM NaHCO ₃ and the protein is lyophilized. The amino acid sequence of the hybrid polypeptide, determined based on the nucleotide sequence, is shown in figa. The structure is confirmed by the MALDI-TOF mass spectrum and the results of tryptic hydrolysis.

Пример 5. Экспрессия, выделение и очистка rec 24-36 ВИЧ2. Example 5. Expression, isolation and purification of rec 24-36 HIV2.

Для получения белка используют штамм Е.coli BL21 (DE3), содержащий плазмиду рЕТ15par (24-36). Экспрессию, выделение и очистку белка проводят, как описано в примере 4. Аминокислотная последовательность гибридного полипептида, определенная на основании нуклеотидной последовательности, приведена на фиг. 1б. To obtain protein using E. coli strain BL21 (DE3) containing the plasmid pET15par (24-36). The expression, isolation and purification of the protein is carried out as described in Example 4. The amino acid sequence of the hybrid polypeptide, determined on the basis of the nucleotide sequence, is shown in FIG. 1b.

Белки используют для иммунизации, конъюгации с ферментом и коллоидным углеродом иммуноферментного анализа (ИФА) и дот-анализа. Proteins are used for immunization, conjugation with an enzyme and colloidal carbon enzyme immunoassay (ELISA) and dot analysis.

Пример 6. Непрямой иммуноферментный анализ (ИФА). Example 6. Indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

Антигены адсорбируют на поверхности лунок планшетов для ИФА (Greiner, 756071). Для этого растворы, содержащие смесь антигенов, являющихся предметом настоящего изобретения - ВИЧ1 rec 24-41 и ВИЧ1/2 rec 24-36 с концентрациями 8 мкг/мл каждого в 0,05 М карбонатно-бикарбонатном буфере, рН 9,5, вносят в лунки планшетов и выдерживают 40 час при комнатной температуре. Затем растворы удаляют и планшеты высушивают в течение 2 час при комнатной температуре. Для постановки ИФА в лунки вносят сыворотки ВИЧ-инфицированных пациентов или нормальные сыворотки не инфицированных ВИЧ людей, разведенные в PBSAT (фосфатный солевой буфер с альбумином и твином-20), и выдержают в течение 1 часа при 37^oС. Далее лунки промывают 4 раза PBST (фосфатным солевым буфером с твином-20). Затем в лунки внесли конъюгат пероксидазы хрена с антителами против IgG человека (Sigma, no A 0170) в рабочем разведении на PBSAT и выдерживают в течение одного часа при 37^oС. Затем лунки промывают 4 раза PBST. Далее в лунки добавляют субстрат пероксидазы (о-фенилендиамин дигидрохлорид 1,6 мг/мл, в цитратно-фосфатном буфере, рН 5,5, с 0,006% Н₂O₂) и выдерживают при комнатной температуре в темноте в течение 15 мин. Ферментативную реакцию останавливают добавлением 1N раствора серной кислоты, и оптическую плотность раствора в лунках определяют с помощью спектрофотометра-ридера МСС 340 при 492 нм. Результаты показаны в табл. 1.Antigens are adsorbed on the surface of the wells of ELISA plates (Greiner, 756071). For this, solutions containing a mixture of antigens that are the subject of the present invention - HIV1 rec 24-41 and HIV1 / 2 rec 24-36 with concentrations of 8 μg / ml each in 0.05 M carbonate-bicarbonate buffer, pH 9.5, make in well plates and incubated for 40 hours at room temperature. Then the solutions are removed and the tablets are dried for 2 hours at room temperature. For ELISA, the sera of HIV-infected patients or normal sera of non-HIV infected people diluted in PBSAT (phosphate buffered saline with albumin and tween-20) are added to the wells and incubated for 1 hour at 37 ^° C. Then the wells are washed 4 times PBST (Tween-20 phosphate buffered saline). Then, the horseradish peroxidase conjugate with anti-human IgG antibodies (Sigma, no A 0170) was added to the wells in working dilution with PBSAT and incubated for one hour at 37 ^° C. Then the wells were washed 4 times with PBST. Then, a peroxidase substrate (o-phenylenediamine dihydrochloride 1.6 mg / ml, in citrate-phosphate buffer, pH 5.5, with 0.006% H ₂ O ₂ ) is added to the wells and kept at room temperature in the dark for 15 minutes. The enzymatic reaction is stopped by the addition of a 1N sulfuric acid solution, and the optical density of the solution in the wells is determined using an MCC 340 spectrophotometer reader at 492 nm. The results are shown in table. 1.

Таким образом, непрямой вариант ИФА на основе рекомбинантных белков, являющихся предметом данного изобретения, обеспечивает распознавание 100% ВИЧ-положительных сывороток (477 из 477) при специфичности 100% (1032 отрицательных результата на 1032 отрицательных образца или ни одного положительного результата на 1032 отрицательных образца). Thus, an indirect variant of ELISA based on recombinant proteins that are the subject of this invention provides recognition of 100% HIV-positive sera (477 of 477) with a specificity of 100% (1032 negative results for 1032 negative samples or no positive result for 1032 negative samples )

Подобным образом проводится постановка иммуноферментного анализа с применением в качестве проявляющего реагента щелочной фосфатазы, конъюгированной с антивидовыми антителами, но в этом случае из растворов для разведения образцов и конъюгата и промывающего раствора исключаются фосфаты, взамен которых используется трис, и применяется субстрат для фосфатазы, например паранитрофенилфосфат. An enzyme-linked immunosorbent assay is performed in a similar manner using alkaline phosphatase conjugated with antivirus antibodies as the developing reagent, but in this case phosphates are excluded from the solutions for diluting the samples and the conjugate and the washing solution, and a phosphatase substrate is used, for example, paranitrophenyl phosphate .

Иммуноферментный анализ также выполняют так, как описано в примере 6, с той разницей, что в качестве детектирующего реагента используется конъюгат А-белка St. aureus с пероксидазой хрена. An enzyme-linked immunosorbent assay is also performed as described in Example 6, with the difference that St. A conjugate protein is used as the detection reagent. aureus with horseradish peroxidase.

Пример 7. Иммуноферментный анализ с применением меченых антигенов. Example 7. Enzyme-linked immunosorbent assay using labeled antigens.

Антигены адсорбируют на поверхности лунок планшетов для ИФА (Greiner, 756071). Для этого растворы, содержащие смесь очищенных антигенов, являющихся предметом настоящего изобретения - ВИЧ1 rec 24-41 и ВИЧ1/2 rec 24-36 - в концентрации 8 мкг/мл каждого в 0,05 М карбонатно-бикарбонатном буфере, рН 9,5, вносят в лунки планшетов и выдерживают 40 час при комнатной температуре. Затем растворы удаляют и планшеты высушивают в течение 2 час при комнатной температуре. Для получения индикаторных реагентов готовят (по [13]) конъюгаты с пероксидазой антигенов, являющихся предметом настоящего изобретения - ВИЧ1 rec 24-41 и ВИЧ1/2 rec 24-36. Для постановки ИФА в лунки вносят сыворотки ВИЧ-инфицированных пациентов или нормальные сыворотки не инфицированных ВИЧ людей, разведенные в PBSAT, и выдерживают в течение 1 часа при 37^oС. Далее лунки промывают 4 раза PBST. Затем в лунки вносят конъюгат пероксидазы хрена с антигенами, являющимися предметом настоящего изобретения, в рабочем разведении на PBSAT и выдерживают в течение одного часа при 37^oС. Затем лунки промывают 4 раза PBST. Далее в лунки добавляют субстрат пероксидазы (о-фенилендиамин дигидрохлорид 1,6 мг/мл, в цитратно-фосфатном буфере, рН 5,5, с 0,006% H₂O₂) и выдерживают при комнатной температуре в темноте в течение 30 мин. Ферментативную реакцию останавливают добавлением 1N раствора серной кислоты, и оптическую плотность раствора в лунках определяют с помощью спектрофотометра-ридера МСС 340 при 492 нм. Результаты показаны в табл.2.Antigens are adsorbed on the surface of the wells of ELISA plates (Greiner, 756071). For this, solutions containing a mixture of purified antigens that are the subject of the present invention - HIV1 rec 24-41 and HIV1 / 2 rec 24-36 - at a concentration of 8 μg / ml each in 0.05 M carbonate-bicarbonate buffer, pH 9.5, contribute to the wells of the plates and incubated for 40 hours at room temperature. Then the solutions are removed and the tablets are dried for 2 hours at room temperature. To obtain indicator reagents, conjugates with peroxidase antigens of the present invention, HIV1 rec 24-41 and HIV1 / 2 rec 24-36, are prepared (according to [13]). For ELISA, the sera of HIV-infected patients or normal sera of non-HIV infected people diluted in PBSAT are added to the wells and incubated for 1 hour at 37 ^° C. Then the wells are washed 4 times with PBST. Then, the horseradish peroxidase conjugate with the antigens of the present invention is added to the wells in working dilution on PBSAT and incubated for one hour at 37 ^° C. Then the wells are washed 4 times with PBST. Then, a peroxidase substrate (o-phenylenediamine dihydrochloride 1.6 mg / ml, in citrate-phosphate buffer, pH 5.5, with 0.006% H ₂ O ₂ ) is added to the wells and kept at room temperature in the dark for 30 minutes. The enzymatic reaction is stopped by the addition of a 1N sulfuric acid solution, and the optical density of the solution in the wells is determined using an MCC 340 spectrophotometer reader at 492 nm. The results are shown in table 2.

Таким образом, иммунометрический вариант ИФА на основе рекомбинантных белков, являющихся предметом данного изобретения, обеспечивает распознавание 36 из 36 (100%) ВИЧ1 положительных сывороток при специфичности 100% (420 отрицательных результатов на 420 отрицательных образца или ни одного положительного результата на 420 ВИЧ-отрицательных образцов). Thus, the immunometric variant of the ELISA based on the recombinant proteins of the invention provides recognition of 36 of 36 (100%) HIV1 positive sera with a specificity of 100% (420 negative results for 420 negative samples or no positive results for 420 HIV negative samples).

Пример 8. Дот-анализ (непрямой вариант, рекомбинантные белки, являющиеся предметом данного изобретения, сорбированы на твердой фазе - нитроцеллюлозной мембране, индикаторным реагентом является А-белок St. aureus, конъюгированный с коллоидным углеродом). Example 8. Dot analysis (indirect option, the recombinant proteins that are the subject of this invention are adsorbed on the solid phase — nitrocellulose membrane, indicator reagent is St. aureus A protein conjugated to colloidal carbon).

Для сорбции готовят раствор, содержащий смесь рекомбинантных белков, являющихся предметом настоящего изобретения - ВИЧ1 rec 24-41 и ВИЧ 1/2 rec 24-36 - с конечной концентрацией 200 мкг/мл каждого (т.е. всего 400 мкг/мл) в карбонатно-бикарбонатном буфере 0,05 М, рН 9,6. Этот раствор наносят на нитроцеллюлозную мембрану (Millipore, 5 мкм), предварительно размеченную на квадраты со стороной 1 см, по 1 мкл (т.е. по 0,4 мкг смеси антигенов) на точку, в центр каждого квадрата, и сушат на воздухе при комнатной температуре в течение 1 часа. Мембрану замачивают в блокирующем растворе (2% БСА на ФСБ-0,05% Tween-20) на 2-20 часов, затем извлекают из блокирующего раствора, помещают на фильтровальную бумагу и сушат на воздухе 4 часа. В качестве проявляющего реагента используют конъюгат А-белка с коллоидным углеродом. Результат реакции читают визуально. Позитивный результат проявляется в виде черного пятна (фиг.4). For sorption, a solution is prepared containing a mixture of recombinant proteins that are the subject of the present invention - HIV1 rec 24-41 and HIV 1/2 rec 24-36 - with a final concentration of 200 μg / ml each (i.e., only 400 μg / ml) in carbonate-bicarbonate buffer 0.05 M, pH 9.6. This solution is applied onto a nitrocellulose membrane (Millipore, 5 μm), previously labeled with 1 cm side, 1 μl (i.e., 0.4 μg antigen mixture) per point, in the center of each square, and air-dried at room temperature for 1 hour. The membrane is soaked in a blocking solution (2% BSA on FSB-0.05% Tween-20) for 2-20 hours, then removed from the blocking solution, placed on filter paper and dried in air for 4 hours. As a developing reagent, an A protein conjugate with colloidal carbon is used. The reaction result is read visually. A positive result is manifested in the form of a black spot (figure 4).

Подобным образом выполняют постановку дот-анализа с использованием в качестве детектирующего реагента конъюгата антивидовых антител с коллоидным углеродом. In a similar way, a dot analysis is performed using a conjugate of antispecies antibodies with colloidal carbon as a detecting reagent.

Аналогичным образом проводят дот-анализ в иммунометрическом варианте, когда химерные полипептиды, являющиеся предметом данного изобретения, сорбированы на твердой фазе - нитроцеллюлозной мембране, а в качестве детектирующего реагента используются химерные полипептиды, конъюгированные с коллоидньм углеродом. Dot analysis is carried out in an immunometric manner in the same way, when the chimeric polypeptides that are the subject of this invention are adsorbed on the solid phase — the nitrocellulose membrane, and colloidal carbon conjugated chimeric polypeptides are used as the detection reagent.

Пример 9. Иммуногенные свойства водорастворимого рекомбинантного химерного белка ВИЧ1 rec 24-41. Example 9. Immunogenic properties of water-soluble recombinant chimeric protein HIV1 rec 24-41.

Иммуногенность препарата проверяют на лабораторных животных. Кроликов породы "Шиншилла" весом 2 кг иммунизируют являющимся предметом данного изобретения белком ВИЧ1 rec 24-41 в физиологическом растворе, 1 мг на животное. Повторную иммунизацию проводят через 4 недели после первой. Кровь собирают из ушной вены и получают сыворотку обычным способом. Мышей линии (СВА х С57 В1/6) F1, самок, весом 16-18 г иммунизируют внутрибрюшинно являющимся предметом данного изобретения белком ВИЧ1 rec 24-41, 100 мкг в 0,5 мл физиологического раствора на животное. Вторую иммунизацию проводят через 2 месяца после первой. Кровь собирают из шейной артерии через 7 дней после иммунизации и получают сыворотку как обычно. The immunogenicity of the drug is tested in laboratory animals. Chinchilla rabbits weighing 2 kg are immunized with the subject protein of the present invention, HIV1 rec 24-41 in saline, 1 mg per animal. Re-immunization is carried out 4 weeks after the first. Blood is collected from the ear vein and serum is obtained in the usual manner. Mice of the line (CBA x C57 B1 / 6) F1, females, weighing 16-18 g, are immunized with the HIV1 rec 24-41 protein, 100 μg in 0.5 ml of physiological saline per animal, by the intraperitoneal route of the invention. The second immunization is carried out 2 months after the first. Blood is collected from the cervical artery 7 days after immunization and serum is obtained as usual.

Иммунный ответ определяют с помощью ИФА. Для проведения ИФА антигены сорбируют на полистироловых планшетах Greiner 756071. Титр антител определяют в непрямом ИФА и в сэндвич-варианте. В непрямом ИФА проявляющим реагентом при анализе сывороток мышей служит конъюгат пероксидазы хрена с антителами козы против IgG мыши (Sigma, A 3673), а при анализе сывороток кролика - конъюгат А-белка St. aureus с пероксидазой (по [13]). Для сэндвич-варианта готовят конъюгаты рекомбинантных антигенов с пероксидазой (по [13]). Субстратом для колориметрической реакции служит (о-фенилендиамин дигидрохлорид 1,6 мг/мл, в цитратно-фосфатном буфере, рН 5,5, с 0,006% H₂O₂). Результаты регистрируют при 492 нм с помощью спектрофотометра МСС 340. Для каждого разведения сыворотки выполняют три параллельных определения и рассчитывают среднее значение А₄₉₂

За титр принимают такое разведение сыворотки, при котором

на 25% превышает уровень среза. Поскольку препарат представляет собой химерный полипептид, содержащий полноразмерный белок р24 ВИЧ1 и слитый с ним фрагмент gp41 ВИЧ1, исследуют иммунный ответ на оба этих фрагмента. В таблице 3 приведены результаты исследования сывороток иммунизированных животных в ИФА с использованием сорбированных на планшете (на твердой фазе) рекомбинантных белков: ВИЧ1 gp41, содержащего только один ВИЧ-специфический фрагмент - участок gp41, ВИЧ1 р24, содержащего только один ВИЧ-специфический фрагмент - полноразмерный р24, и ВИЧ1 rec24-41, содержащего оба ВИЧ-специфических фрагмента - участок gp41 и полноразмерный р24, т.е. тот же антиген, который был использован для иммунизации.The immune response is determined by ELISA. For ELISA, antigens are sorbed on Greiner 756071 polystyrene plates. The antibody titer is determined in indirect ELISA and in a sandwich version. In indirect ELISA, a horseradish peroxidase conjugate with goat anti-mouse IgG antibodies (Sigma, A 3673) serves as a developing reagent in the analysis of mouse sera, and St. A conjugate is used in the analysis of rabbit sera. aureus with peroxidase (according to [13]). For the sandwich variant, conjugates of recombinant antigens with peroxidase are prepared (according to [13]). The substrate for the colorimetric reaction is (o-phenylenediamine dihydrochloride 1.6 mg / ml, in citrate-phosphate buffer, pH 5.5, with 0.006% H ₂ O ₂ ). The results are recorded at 492 nm using an MCC 340 spectrophotometer. For each dilution of the serum, three parallel determinations are performed and the average value A _{492 is} calculated

The titer is a dilution of serum in which

25% higher cut level. Since the drug is a chimeric polypeptide containing the full-length HIV24 p24 protein and the HIV1 gp41 fragment fused to it, the immune response to both of these fragments is examined. Table 3 shows the results of a study of the sera of immunized animals in ELISA using sorbed on a tablet (solid phase) recombinant proteins: HIV1 gp41, containing only one HIV-specific fragment - plot gp41, HIV1 p24, containing only one HIV-specific fragment - full-sized p24, and HIV1 rec24-41, containing both HIV-specific fragments — the gp41 region and the full-sized p24, i.e. the same antigen that was used for immunization.

Из таблицы 3 видно, что в ответ на введение химерного полипептида развивается сильный иммунный ответ как на gp41, так и на р24. Различие титров, определенных непрямым и сэндвич ИФА, объясняется разными условиями представления антигена на твердой фазе и связанной с этим разной доступностью детерминант. From table 3 it is seen that in response to the introduction of the chimeric polypeptide, a strong immune response develops on both gp41 and p24. The difference in the titers defined by indirect and the ELISA sandwich is explained by different conditions for the presentation of antigen on the solid phase and the different determinants associated with it.

Пример 10. Функциональная активность антител против химерного водорастворимого рекомбинантного антигена ВИЧ1 rec 24-41. Example 10. The functional activity of antibodies against the chimeric water-soluble recombinant HIV1 antigen rec 24-41.

Оценку сходства химерного рекомбинантного антигена ВИЧ1 rec 24-41 с вирусным прототипом и способности антител, возникших у животных (мышей и кроликов, пример 9) при иммунизации указанным антигеном, узнавать белки культурального вируса проводят с помощью иммуноблота. Для этого используют полоски нитроцеллюлозы из коммерческого набора LavBlot (Sanofi Pasteur, Франция), на которые, после разделения в SDS-PAAG, перенесены белки культурального ВИЧ1. Полоски обрабатывают разведенными в PBSAT сыворотками животных, иммунизированных рекомбинантным антигеном ВИЧ1 rec 24-41, являющимся предметом данного изобретения, затем отмывают 3 раза PBST и обрабатывают индикаторными реагентами. В качестве индикаторных реагентов служат конъюгат пероксидазы с антителами козы против IgG мыши (Sigma, A 3673) (при детекции специфичности мышиных антител) и конъюгат пероксидазы с А-белком (при детекции специфичности кроличьих антител). Антитела, индуцированные у животных в ответ на иммунизацию рекомбинантным белком, узнают gp41 и р24 культурального вируса, а также предшественник белка р24-р55 (фиг.5). Следовательно, антитела, индуцированные рекомбинантным белком, специфически распознают естественный вирусный белок, что указывает на функциональную активность антител и на сходство строения рекомбинаного белка и вирусного прототипа. The similarity of the chimeric recombinant HIV1 rec 24-41 antigen with the viral prototype and the ability of antibodies produced in animals (mice and rabbits, Example 9) to immunize with the indicated antigen to evaluate the proteins of the culture virus are assessed using an immunoblot. To do this, use strips of nitrocellulose from the commercial LavBlot kit (Sanofi Pasteur, France), onto which, after separation in SDS-PAAG, the cultural HIV1 proteins were transferred. The strips are treated with PBSAT diluted animal sera immunized with the recombinant HIV1 rec 24-41 antigen of the invention, then washed 3 times with PBST and treated with indicator reagents. The peroxidase conjugate with goat antibodies against mouse IgG (Sigma, A 3673) (for detecting the specificity of murine antibodies) and the peroxidase conjugate with A protein (for detecting the specificity of rabbit antibodies) are used as indicator reagents. Antibodies induced in animals in response to immunization with a recombinant protein recognize gp41 and p24 of the culture virus, as well as the p24-p55 protein precursor (FIG. 5). Therefore, antibodies induced by a recombinant protein specifically recognize the natural viral protein, which indicates the functional activity of the antibodies and the similarity of the structure of the recombinant protein and the viral prototype.

Предыдущие описания и примеры приведены в качестве иллюстрации и не исчерпывают возможностей данного изобретения (последовательности приведены в конце описания). The previous descriptions and examples are given by way of illustration and do not exhaust the possibilities of this invention (the sequences are given at the end of the description).

Литература
1. Allain J. P., Laurian Y., Paul D.A., et al., Lancet, 1986, v.2, pp. 1233-1236.Literature
1. Allain JP, Laurian Y., Paul DA, et al., Lancet, 1986, v. 2, pp. 1233-1236.

2. Salk J., Nature, 1987, v.327, pp.473-476. 2. Salk J., Nature, 1987, v. 337, pp. 473-476.

3. Хаитов P. M. , Трубченинова Л.П., Ефремова Е.В. и др., Иммунология, 1992, 5, стр.1-14. 3. Khaitov P. M., Trubcheninova L.P., Efremova E.V. and others, Immunology, 1992, 5, pp. 1-14.

4. Petrov R.V., Khaitov R.M., Sidorovich I.G., et al., Biomedical Science, 1990, v. 1, pp.239-244. 4. Petrov R.V., Khaitov R.M., Sidorovich I.G., et al., Biomedical Science, 1990, v. 1, pp. 239-244.

5. Сидорович И.Г., Шевалье А.Ф., Алексеев Т.А. и др.. Аллергия, астма и клиническая иммунология, 1999, 9, стр.139-141, М., Новости науки и техники, ВИНИТИ, РААКИ, Серия МЕДИЦИНА. 5. Sidorovich I.G., Chevalier A.F., Alekseev T.A. et al. Allergy, asthma and clinical immunology, 1999, 9, pp. 139-141, M., News of science and technology, VINITI, RAAKI, MEDICINE series.

6. Debouck С. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, v. 84, pp. ++++8903-8906. 6. Debouck C. et al. , Proc. Natl. Acad Sci. USA, 1987, v. 84, pp. ++++ 8903-8906.

7. Mousing P. et al., Nature, 1985, v. 313, pp.450-458. 7. Mousing P. et al., Nature, 1985, v. 313, pp. 450-458.

8. Sidorovich I.G., Chevalier A.F., Ignatjeva G.A. et al., Abstracts of 20^th Congress EAACI, Berlin, 9-13 May 2001, Allergy, suppl., 68, v. 56, p. 141, abstract no 427.8. Sidorovich IG, Chevalier AF, Ignatjeva GA et al., Abstracts of 20 ^th Congress EAACI, Berlin, 9-13 May 2001, Allergy, suppl., 68, v. 56, p. 141, abstract no 427.

9. Nikolaeva I.A., Chevalier A.F., Ignatjeva G.A. et al., Abstracts of 11^th International Congress of Immunology, Stockholm, 22-27 July 2001, A8. Thu.5.19/1182, p.116, abstract 1182.9. Nikolaeva IA, Chevalier AF, Ignatjeva GA et al., Abstracts of 11 ^th International Congress of Immunology, Stockholm, July 22-27, 2001, A8. Thu. 5.19 / 1182, p. 116, abstract 1182.

10. HIV sequence database, Los Alamos, 1989. 10. HIV sequence database, Los Alamos, 1989.

11. Meacock P.A., Cohen, S.N., Cell, 1980, v. 20, pp.529-542. 11. Meacock P.A., Cohen, S.N., Cell, 1980, v. 20, pp. 529-542.

12. Маниатис Т., Фриг Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование, Москва, Мир, 1984. 12. Maniatis T., Frig E., Sambrook J. Molecular Cloning, Moscow, Mir, 1984.

13. Nakane P. K. , Kawaoi A., J. Histochem. Cytochem.,1974, v. 22, pp. 1084-1090. 13. Nakane P. K., Kawaoi A., J. Histochem. Cytochem., 1974, v. 22, pp. 1084-1090.

Claims

1. An immunogenic composition comprising a chimeric HIV polypeptide, characterized in that it is a full-sized p24 protein fused to or selected from the immunodominant fragment of gp41, amino acids of the 575-616 region (hes 24-41), or fused to the gp36 immunodominant fragment containing amino acids of the site 575-616 or selected from it (he 24-36), and a pharmacologically acceptable carrier and / or diluent.

2. A method of inducing an immune response to HIV1 or HIV1 / 2 in mammals, characterized in that the mammal is administered the immunogenic composition according to claim 1, wherein to induce an immune response to HIV1, the immunogenic composition is introduced to mammals, which is a full-sized p24 protein fused to an immunodominant fragment gp41 containing amino acids of the plot 575-616 or selected from it (he 24-41), and to induce an immune response to HIV1 / 2, an immunogenic composition is introduced to mammals, which is a full-sized p24 protein fused to the dominant fragment of gp36 containing amino acids of the plot 575-616 or selected from it (he 24-36).

3. HIV chimeric polypeptide, characterized in that in the case of HIV1 it is a full-sized p24 protein fused to the immunodominant gp41 fragment containing amino acids of the 575-616 region or selected from it (hes 24-41), and in the case of HIV1 / 2 it is a full-sized p24 protein fused to an immunodominant gp36 fragment containing amino acids of the 575-616 region or selected from it (hess 24-36).

4. The chimeric HIV polypeptide according to claim 3, characterized in that the immunodominant gp41 fragment has the following amino acid sequences: SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3.

5. The chimeric HIV polypeptide according to claim 3, characterized in that the immunodominant gp36 fragment has the following amino acid sequences: SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; SEQIDNO: 6.

6. The DNA molecule encoding the HIV chimeric polypeptide according to claim 3, which is the base sequence of SEQ ID NO: 7 for the HIV1 chimeric polypeptide (Hess 24-41) and SEQ ID NO: 8 for the HIV1 / 2 chimeric polypeptide (Hes 24-36 )

7. A plasmid vector suitable for expression in E. coli cells and containing the DNA molecule according to claim 6.

8. The plasmid vector according to claim 7, characterized in that for the expression of the chimeric HIV1 polypeptide (ges 24-41) it is a plasmid pET15b into which the DNA fragment SEQ ID NO: 7 is inserted at the Barn H1 restriction site, and at the restriction sites Hind III - Eco R1 inserted par-locus.

9. The plasmid vector according to claim 7, characterized in that for the expression of the chimeric HIV1 / 2 polypeptide (cess 24-36) it is a plasmid pET15b into which the DNA fragment SEQ ID NO: 8 is inserted at the Bam H1 restriction site, and The Hind III-Eco R1 restriction sites have a par locus inserted.

10. Polyclonal antibodies to HIV1 or HIV1 / 2, which are IgG 2a class immunoglobulins, obtained by immunization with the chimeric polypeptide according to claim 3 with a titer of at least 30,000 to the gp41 and gp36 fragment and a titer of at least 200,000 to p24 in indirect ELISA.

11. A test system for detecting antibodies to HIV1 and HIV2, including HIV antigens adsorbed on a solid support, and a detection reagent, characterized in that it contains chimeric polypeptides as claimed in claim 3, wherein the HIV1 antigen is a full-sized protein p24 fused to the immunodominant gp41 fragment containing amino acids of the 575-616 region or selected from it (he 24-41), and the HIV1 / 2 antigen is a full-length p24 protein fused to the gp36 immunodominant fragment containing the amino acids of the 575-616 region or you scolded from him (hess 24-36).

12. The test system according to claim 11, characterized in that as a detecting reagent, a conjugate of antispecies antibodies with horseradish peroxidase is used.

13. The test system according to claim 11, characterized in that the conjugate of antispecies antibodies with alkaline phosphatase is used as a detecting reagent.

14. The test system according to claim 11, characterized in that the conjugate of St.aureus A protein with horseradish peroxidase is used as the detecting reagent.

15. The test system according to claim 11, characterized in that a conjugate of antispecies antibodies with colloidal carbon is used as a detecting reagent.

16. The test system according to claim 11, characterized in that the conjugate of St.aureus A protein with colloidal carbon is used as the detection reagent.

17. The test system according to claim 11, characterized in that the chimeric polypeptides according to claim 3 conjugated to horseradish peroxidase are used as the detection reagent.

18. The test system according to claim 11, characterized in that the chimeric polypeptides according to claim 3 conjugated to colloidal carbon are used as a detecting reagent.