RU2211843C1

RU2211843C1 - N'-{n-[3-oxo-20[29]lupen-28-oyl]-9-aminononanoyl}-3-amino-3-phenylpropionic acid eliciting immuno-stimulating and antiviral activity

Info

Publication number: RU2211843C1
Application number: RU2002102338A
Authority: RU
Inventors: Г.А. Толстиков; Н.И. Петренко; Н.В. Еланцева; Э.Э. Шульц; О.А. Плясунова; Т.Н. Ильичева; О.А. Борисова; Т.Р. Проняева; А.Г. Покровский
Original assignee: Новосибирский институт органической химии им. Н.Н.Ворожцова СО РАН; Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор"
Priority date: 2002-01-25
Filing date: 2002-01-25
Publication date: 2003-09-10

Abstract

FIELD: organic chemistry, medicine. SUBSTANCE: invention relates to a novel chemical substance, namely to biologically active compound eliciting immunostimulating and antiviral activity (anti-HIV and antiherpetic activities, namely to compound N'-{N-[3-oxo-20[29]-lupen-28-oyl]-9-aminononanoyl} -3-amino-3-phenylpropionic acid of the formula (I) given in the invention description. This compound is not toxic, can be prepared from available raw and shows broad spectrum of an antiviral activity. Additionally, this compounds shows the expressed immuno- stimulating effect. EFFECT: valuable medicinal properties of compound. 2 cl, 5 tbl, 2 dwg, 7 ex

Description

Изобретение относится к новому химическому соединению, конкретно к тритерпеноиду лупанового ряда формулы (I),

обладающему иммуностимулирующей и противовирусной активностью.The invention relates to a new chemical compound, specifically to a triterpenoid of the lupane series of the formula (I),

possessing immunostimulating and antiviral activity.

Указанное свойство позволяет предполагать возможность использования соединения в медицине в качестве фармацевтического препарата. This property suggests the possibility of using the compound in medicine as a pharmaceutical preparation.

Синдром приобретенного иммунодефицита человека (AIDS, СПИД) является наиболее распространенной болезнью, которая до настоящего времени не поддается успешной химиотерапии. Это заболевание имеет ряд особенностей, заключающихся в том, что оно поражает систему защиты организма человека от всевозможных внешних инфекций. Кроме того, провирусный геном вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), вызывающий СПИД, интегрируется в геном лимфоцитов, поэтому зараженные лимфоциты вплоть до своей гибели способны производить новые копии вируса, инфицируя таким путем здоровые лимфоциты. Acquired Human Immunodeficiency Syndrome (AIDS, AIDS) is the most common disease that so far has not been amenable to successful chemotherapy. This disease has a number of features, namely that it affects the system of protecting the human body from all kinds of external infections. In addition, the proviral genome of the human immunodeficiency virus (HIV), which causes AIDS, is integrated into the genome of lymphocytes, so infected lymphocytes, up to their death, are able to produce new copies of the virus, thus infecting healthy lymphocytes.

Известны 2 группы ингибиторов ОТ. 1-ая группа - нуклеозидные ингибиторы, служащие конкурентными ингибиторами по отношению к субстратам и блокирующие синтез цепи ДНК. Наиболее широко используемым препаратом этой группы является азидотимидин, который, несмотря на высокую ингибирующую активность, обладает рядом негативных качеств: высокая токсичность и быстрое возникновение устойчивых к действию препарата мутантов вируса. 2 groups of RT inhibitors are known. Group 1 - nucleoside inhibitors, which serve as competitive inhibitors with respect to substrates and block DNA chain synthesis. The most widely used drug of this group is azidothymidine, which, despite its high inhibitory activity, has a number of negative qualities: high toxicity and rapid emergence of virus-resistant mutants of the drug.

Ненуклеозидные соединения составляют многочисленный класс потенциальных ингибиторов репликации ВИЧ. Эти соединения могут ингибировать различные стадии вирусной репродукции, включая этап обратной транскрипции вирусной нуклеиновой кислоты. Как правило, ненуклеозидные препараты менее токсичны для клеток организма, чем нуклеозидные ингибиторы из-за отсутствия ингибирующего эффекта на клеточные ДНК полимеразы [De Clercq E.//Meclical virology, 1996, v. 6, р. 97-117].

Non-nucleoside compounds comprise a large class of potential HIV replication inhibitors. These compounds can inhibit various stages of viral reproduction, including the step of reverse transcription of viral nucleic acid. As a rule, non-nucleoside preparations are less toxic to body cells than nucleoside inhibitors due to the lack of an inhibitory effect on cellular DNA polymerase [De Clercq E.//Meclical virology, 1996, v. 6, p. 97-117].

Высокая и разнообразная биологическая активность тритерпенов олеонанового и лупанового ряда (особенно антимикробная, противовирусная и противоопухолевая) делает эту группу соединений перспективной для поиска эффективных анти-ВИЧ агентов, а также иммуностимуляторов. The high and diverse biological activity of the triterpenes of the oleonan and lupane series (especially antimicrobial, antiviral and antitumor) makes this group of compounds promising for the search for effective anti-HIV agents, as well as immunostimulants.

Известны тритерпены олеонанового ряда в качестве ингибиторов ВИЧ в культуре клеток [Kashiwada Y., Nagao Т., Hashimoto A., Ikeshiro Y., Okabe H., Cosentino L. M. , Lee K.- H.// J. Nat. Prod., 2000, v. 63, N 12, р. 1619-1622] . Описан синтез большого ряда производных бетулиновой кислоты и фармакологических композиций на их основе для изучения в качестве анти-ВИЧ и иммуномодулирующих агентов, однако количественные данные по активности соединений отсутствуют [US Patent N 5468888, 1995]. В работе [Y. Kashiwada, F. Hashimoto, L. M. Cosentino, C-H. Chen, P.E. Garrett, K.-H. Lee // J. Med. Chem. , 1996, v. 39, N 5, p. 1016-1017] приведены данные по анти-ВИЧ активности сукцинатов бетулина, а также производного бетулиновой кислоты (II), однако данные по иммуностимулирующей активности указанных соединений отсутствуют. Oleonane series triterpenes are known as HIV inhibitors in cell culture [Kashiwada Y., Nagao T., Hashimoto A., Ikeshiro Y., Okabe H., Cosentino L. M., Lee K.- H. // J. Nat. Prod., 2000, v. 63, N 12, p. 1619-1622]. The synthesis of a large number of derivatives of betulinic acid and pharmacological compositions based on them for studying as anti-HIV and immunomodulating agents is described, however, quantitative data on the activity of the compounds are not available [US Patent N 5468888, 1995]. In [Y. Kashiwada, F. Hashimoto, L. M. Cosentino, C-H. Chen, P.E. Garrett, K.-H. Lee // J. Med. Chem. 1996, v. 39, N 5, p. 1016-1017] shows data on the anti-HIV activity of betulin succinates, as well as a derivative of betulinic acid (II), however, data on the immunostimulating activity of these compounds are not available.

Среди тритерпенов найдены также высокоэффективные иммуностимуляторы, вошедшие в состав ISCOMs - иммуностимулирующих комплексов, состоящих из антигена, холестерина, фосфолипидов и сапонинов южноамериканского дерева Quillaia saponaria [Villacres-Eriksson M., Behboudi S., Morgan A.J, Trinchieri G, Morein B. // Cytokine, 1997, v. 9, p. 73-82]. Фракция сапонинов, активирующая иммунный ответ - QuilA - представляет собой смесь тритерпеновых гликозидов [Chavali S., Francis Т., Campbell J. // Int. J. Immunopharmacol., 1987, v. 9, р. 675-679]. Известна иммуностимулирующая активность циклоартрановых гликозидов - куркулигосапонинов С и F из Curculigo orchioides [Xu J. -P. , Xu R., Li X.-Y. // Phytochemistry, 1992, v. 31, N 1, p. 233-236]. Недостатком указанных препаратов является недоступность растительного сырья, проявление указанными препаратами иммуносупрессорных свойств при использовании в больших дозах, а также низкая эффективность при оральном введении.

Among the triterpenes, highly effective immunostimulants have also been found that are part of ISCOMs - immunostimulatory complexes consisting of the antigen, cholesterol, phospholipids and saponins of the South American tree Quillaia saponaria [Villacres-Eriksson M., Behboudi S., Morgan AJ, Trinchier B., Morinier J., Trinchier Cytokine 1997, v. 9, p. 73-82]. The saponin fraction that activates the immune response — QuilA — is a mixture of triterpene glycosides [Chavali S., Francis T., Campbell J. // Int. J. Immunopharmacol., 1987, v. 9, p. 675-679]. Known immunostimulatory activity of cycloarthran glycosides - curculigosaponins C and F from Curculigo orchioides [Xu J. -P. , Xu R., Li X.-Y. // Phytochemistry, 1992, v. 31, N 1, p. 233-236]. The disadvantage of these drugs is the inaccessibility of plant materials, the manifestation of the indicated drugs immunosuppressive properties when used in high doses, as well as low efficiency when administered orally.

Анализ литературных данных показывает, что синтез и биологические испытания индивидуальных соединений тритерпенового ряда, отличающихся от существующих меньшей общей токсичностью и большей эффективностью специфического действия, а также расширенным спектром антивирусного действия, является актуальным. An analysis of the literature data shows that the synthesis and biological testing of individual compounds of the triterpene series, which differ from the existing ones by a lower general toxicity and greater efficiency of a specific action, as well as an expanded spectrum of antiviral action, is relevant.

Аналогом по структуре и свойствам соединения (I) является глицирризиновая кислота (ГК) формулы (III). Описан выраженный противовирусный эффект ГК и некоторых ее производных. Так, моноаммониевая соль ГК полностью ингибирует in vitro репродукцию многих ДНК и РНК-содержащих вирусов (Herpes simplex, Varicella zoster, ВИЧ) [Плясунова О.А., Егоричева И.Н., Федюк Н.В., Покровский А.Г., Балтина Л.А, Муринов Ю.И., Толстиков Г.А.// Вопросы вирусологии, 1992, 5-6, с. 235-238]. В малых дозах ГК и ее соли являются сильными иммуностимуляторами. Они увеличивают продукцию интерферона, интерлейкина-2 и усиливают экспрессию рецепторов к ИЛ-2 на поверхности Т-лимфоцитов, стимулируют пролиферацию Т- и В-лимфоцитов в культуре клеток селезенки мышей, стимулируют выработку AT, усиливают фагоцитарную функцию макрофагов, усиливают цитотоксичность естественных киллеров [Толстиков Г.А., Балтина Л.А., Шульц Э. Э. , Покровский А.Г.// Биоорганическая химия, 1997, т. 23, 9, с. 691-709. ] . Основным недостатком ГК в плане ее широкого применения является минералокортикоидное действие [Armanini D., Wehling M., Weber P.C.//J. Endocrinol. Invest., 1989, v. 12, р. 303-306.]. An analog in the structure and properties of compound (I) is glycyrrhizic acid (HA) of the formula (III). The expressed antiviral effect of HA and some of its derivatives is described. Thus, monoammonium salt of HA completely inhibits the in vitro reproduction of many DNA and RNA-containing viruses (Herpes simplex, Varicella zoster, HIV) [Plyasunova OA, Egoricheva IN, Fedyuk NV, Pokrovsky AG , Baltina L.A., Murinov Yu.I., Tolstikov G.A. // Issues of Virology, 1992, 5-6, p. 235-238]. In small doses, HA and its salts are strong immunostimulants. They increase the production of interferon, interleukin-2 and enhance the expression of IL-2 receptors on the surface of T-lymphocytes, stimulate the proliferation of T- and B-lymphocytes in mouse spleen cell culture, stimulate AT production, enhance macrophage phagocytic function, enhance the cytotoxicity of natural killers [ Tolstikov G.A., Baltina L.A., Schulz E.E., Pokrovsky A.G. // Bioorganic chemistry, 1997, v. 23, 9, p. 691-709. ]. The main disadvantage of HA in terms of its widespread use is the mineralocorticoid effect [Armanini D., Wehling M., Weber P.C.//J. Endocrinol. Invest., 1989, v. 12, p. 303-306.].

Задачей изобретения является расширение ассортимента средств, проявляющих иммуностимулирующую и противовирусную активность и обладающих преимуществом перед известными структурными аналогами подобного действия.

The objective of the invention is to expand the assortment of agents exhibiting immunostimulating and antiviral activity and having an advantage over the known structural analogues of such an action.

Поставленная задача достигается новым химическим соединением указанной формулы (I), обладающим выраженной иммуностимулирующей активностью и проявляющим противовирусное действие в отношении ВИЧ-1 и вируса простого герпеса 1 типа (ВПГ-1). The problem is achieved by a new chemical compound of the indicated formula (I), which has a pronounced immunostimulating activity and exhibits antiviral activity against HIV-1 and herpes simplex virus type 1 (HSV-1).

Синтез заявляемого соединения (I) проводили по приведенной в конце описания схеме. Исходным соединением для получения (I) является легко выделяемый из коры березы бетулин (содержание в коре достигает 25%). Бетулин по известному способу окисляли в бетулоновую кислоту (IV) [Kim Darrick S.H.L., Chen Z. , Nguyen V.T., Pezzuto J., Qiu S., Lu Z.-Z. // Synth. Commun, 1997, v. 27, p. 1607-1611]. Обработка бетулоновой кислоты оксалилхлоридом в хлористом метилене дает хлорангидрид (V), конденсацией которого с силиловым эфиром 9-аминопеларгоновой кислоты [Петренко Н.И., Петухова В.З., Шакиров М. М. , Шульц Э.Э., Толстиков Г.А. // Журнал орган. химии, 2000, т. 36, вып. 7, с. 1013-1026] в присутствии триэтиламина получают соответствующий амид (VI). Реакция (VI) с β-фенил-β-аланином в присутствии N,N-дициклогексилкарбодиимида, 1-гидроксибензотриазола и триэтиламина в хлористом метилене и последующий гидролиз приводит к соединению (I) с общим выходом 44% на исходную бетулоновую кислоту. The synthesis of the claimed compound (I) was carried out as shown at the end of the description of the scheme. The initial compound for obtaining (I) is betulin, which is easily isolated from the birch bark (the content in the bark reaches 25%). Betulin was oxidized to betulonic acid (IV) by a known method [Kim Darrick S.H. L., Chen Z., Nguyen V.T., Pezzuto J., Qiu S., Lu Z.-Z. // Synth. Commun, 1997, v. 27, p. 1607-1611]. Treatment of betulonic acid with oxalyl chloride in methylene chloride gives acid chloride (V), the condensation of which with 9-aminopelarboxylic acid silyl ether [Petrenko NI, Petukhova VZ, Shakirov MM, Shults E.E., Tolstikov G. A. // Journal organ. Chemistry, 2000, v. 36, no. 7, p. 1013-1026] in the presence of triethylamine, the corresponding amide (VI) is obtained. Reaction (VI) with β-phenyl-β-alanine in the presence of N, N-dicyclohexylcarbodiimide, 1-hydroxybenzotriazole and triethylamine in methylene chloride and subsequent hydrolysis leads to compound (I) with a total yield of 44% of the initial betulonic acid.

Биологическая активность соединения формулы (I) изучалась путем определения иммуностимулирующего действия (при иммунизации сильным и слабым антигенами), исследования цитотоксичности в культурах клеток МТ-4, острой токсичности на мышах, а также исследования противовирусной активности в отношении ВИЧ и ВПГ-1. Дополнительно определяли также острую токсичность на белых беспородных мышах обоего пола при внутрибрюшинном введении. LD₅₀ соединения составила > 2,0 г/кг. Заявляемое соединение относится к 3-му классу умеренно опасных веществ.The biological activity of the compounds of formula (I) was studied by determining the immunostimulating effect (when immunizing with strong and weak antigens), studying cytotoxicity in MT-4 cell cultures, acute toxicity in mice, and also studying antiviral activity against HIV and HSV-1. In addition, acute toxicity was also determined on outbred white mice of both sexes with intraperitoneal administration. The LD _{50 of the} compound was> 2.0 g / kg. The inventive compound belongs to the 3rd class of moderately hazardous substances.

Иммуностимулирующие свойства патентуемого соединения изучали на белых беспородных мышах массой 18-20 г. Влияние соединения (I) на стимуляцию Т-клеточного иммунитета при введении сильного антигена эритроцитов барана (ЭБ) исследовали методом розеток [Фримель X. Иммунологические методы. / Пер. с нем., под ред. М.А. Фроловой. - М.: Мир, 1979, 518 с.]. Препаратом сравнения служил неполный адъювант Фрейнда (НАФ), а также ГК. Результаты приведены в табл. 1. The immunostimulatory properties of the patented compound were studied on white outbred mice weighing 18-20 g. The effect of compound (I) on the stimulation of T-cell immunity with the introduction of the strong sheep erythrocyte (EB) antigen was studied by the method of rosettes [Frimel X. Immunological methods. / Per. with him., ed. M.A. Frolova. - M .: Mir, 1979, 518 p.]. Comparison preparation was Freund's incomplete adjuvant (NAF), as well as HA. The results are shown in table. 1.

Как видно из табл.1, соединение (I) стимулирует образование розеток, его индекс стимуляции соответствует индексу стимуляции ГК. As can be seen from table 1, compound (I) stimulates the formation of rosettes, its stimulation index corresponds to the stimulation index of HA.

Влияние соединения (I) на стимуляцию В-клеточного ответа определяли по увеличению титра специфических антител после иммунизации слабым антигеном - бычьим сывороточным антигеном (БСА). Препаратом сравнения служил препарат гидроокиси алюминия, применяемый в вакцинах в качестве адъюванта. Результаты представлены в табл. 2. The effect of compound (I) on the stimulation of the B-cell response was determined by increasing the titer of specific antibodies after immunization with a weak antigen - bovine serum antigen (BSA). The reference preparation was an aluminum hydroxide preparation used as an adjuvant in vaccines. The results are presented in table. 2.

Как видно из приведенных данных, при иммунизации слабым антигеном соединение (I) проявляет выраженную иммуностимулирующую активность: титр специфических антител при иммунизации БСА совместно с исследуемым соединением увеличился в 256 раз по сравнению с контролем и оказался более чем в 10 раз выше, чем при использовании ГК в качестве иммуностимулятора. As can be seen from the above data, when immunizing with a weak antigen, compound (I) exhibits a pronounced immunostimulating activity: the titer of specific antibodies during immunization with BSA together with the test compound increased by 256 times compared with the control and was more than 10 times higher than when using HA as an immunostimulant.

Анти-ВИЧ активность оценивали по двум схемам, отличающихся временем внесения соединений в суспензию клеток: а) после адсорбции вируса, б) одновременно с вирусом. Препаратом сравнения служил высоко эффективный и широко применяемый в медицинской практике анти-ВИЧ препарат нуклеозидного типа азидотимидин (АЗТ). Результаты исследования приведены в табл. 3 и 4 и на фиг. 1. Anti-HIV activity was evaluated according to two schemes differing in the time the compounds were added to the cell suspension: a) after the adsorption of the virus, b) simultaneously with the virus. The comparison drug was a highly effective and widely used in medical practice anti-HIV drug of the nucleoside type azidothymidine (AZT). The results of the study are given in table. 3 and 4 and in FIG. 1.

Как видно из табл. 3, соединение (I) оказалось активным в отношении ВИЧ-1, хотя терапевтический индекс невысок (14). Кроме того, это соединение защищает клетки от вирус-индуцированного цитопатического действия (PD₅₀ = 0,4 мкМ; IS=14). Дозозависимая кривая, иллюстрирующая этот эффект, приведена на фиг.1.As can be seen from the table. 3, compound (I) was active against HIV-1, although the therapeutic index is low (14). In addition, this compound protects cells from virus-induced cytopathic effects (PD ₅₀ = 0.4 μM; IS = 14). A dose-dependent curve illustrating this effect is shown in FIG.

Учитывая данные о том, что амиды бетулиновой кислоты ингибируют ранние стадии вирусной репродукции (именно такой механизм действия установлен для структурного аналога (II)) [Mayaux J.-F, Bousseau A, Pauwels R., Huet Т., Henin Y., Dereu N., Evers M, Soler F., Poujade C., De Clercq E., Le Pecq J. -B. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1994, v. 91, p.3564-3566], было проведено исследование анти-ВИЧ активности заявляемого соединения при одновременном добавлении с вирусом к клеткам МТ-4 по схеме (б). Экспериментальные данные этого исследования приведены в табл. 4. Given the evidence that betulinic amides inhibit the early stages of viral reproduction (this is the mechanism of action established for structural analogue (II)) [Mayaux J.-F, Bousseau A, Pauwels R., Huet T., Henin Y., Dereu N., Evers M, Soler F., Poujade C., De Clercq E., Le Pecq J. -B. Proc. Natl. Acad Sci., USA, 1994, v. 91, p.3564-3566], a study was carried out of the anti-HIV activity of the claimed compound while adding virus to MT-4 cells according to scheme (b). The experimental data of this study are given in table. 4.

Из табл. 4 видно, что при одновременном внесении с вирусом, соединение (I) обеспечивает 50%-ное ингибирование репродукции вируса при концентрации 0,0026 мкМ с индексом селективности 2135. Следует заметить, что важной характеристикой противовирусной активности соединения служат концентрации, которые вызывают 50 и 90% ингибирование накопления вируса. Сравнение этих характеристик позволяет более детально оценить эффективность соединений. Из приведенных данных видно, что концентрация (I), обеспечивающая 90% ингибирование вируса составляет ~0.2 мкМ (на порядок ниже, чем у азидотимидина). Кроме того, заявляемое соединение эффективно защищает клетки от вирус-индуцированного цитопатического действия (PD₅₀ = 0,029 мкМ; IS=191), что хорошо видно на фиг.1. Эти данные позволяют предположить, что основное анти-ВИЧ действие заявляемого соединения связано с влиянием на ранние этапы цикла репродукции вируса, следующие сразу за связыванием вируса с клеткой. Другое объяснение значительного повышения эффективности действия агента при его раннем добавлении может быть связано с особенностями проникновения соединения в клетки. В случае медленной скорости проникновения соединения его эффективность будет существенно возрастать при предварительном добавлении препарата к клеткам.From the table. Figure 4 shows that, when administered simultaneously with the virus, compound (I) provides 50% inhibition of virus reproduction at a concentration of 0.0026 μM with a selectivity index of 2135. It should be noted that concentrations that cause 50 and 90 are an important characteristic of the antiviral activity of the compound. % inhibition of virus accumulation. A comparison of these characteristics allows a more detailed assessment of the effectiveness of the compounds. The above data show that the concentration (I), which provides 90% inhibition of the virus, is ~ 0.2 μM (an order of magnitude lower than that of azidothymidine). In addition, the claimed compound effectively protects cells from virus-induced cytopathic effects (PD ₅₀ = 0.029 μM; IS = 191), which is clearly seen in figure 1. These data suggest that the main anti-HIV effect of the claimed compound is associated with the effect on the early stages of the virus reproduction cycle, immediately following the binding of the virus to the cell. Another explanation for a significant increase in the effectiveness of the agent during its early addition may be due to the peculiarities of the penetration of the compound into cells. In the case of a slow penetration rate of the compound, its effectiveness will increase significantly with the preliminary addition of the drug to the cells.

По сравнению со структурным аналогом (II), ID₅₀ для которого в культуре клеток МТ-4 в отношении разных штаммов ВИЧ-1 составляет 0,045-0,75 мкМ [Y. Kashiwada, F. Hashimoto, L.M. Cosentino, C-H. Chen, P.E. Garrett, K.-H. Lee, J. Med. Chem. , 1996, v. 39, N 5, p. 1016-1017], анти-ВИЧ индекс селективности для соединения (I) превышает таковой для (II) как минимум на порядок. В качестве несомненного достоинства изобретения, следует отметить, что низкие ингибирующие концентрации (в 1000-10000 раз меньшие по сравнению с ГК) делают заявляемое соединение перспективным для перорального применения при терапии ВИЧ-инфекции. Это важно, так как одним из недостатков терапии вирусных инфекций ГК, а также других тритерпенов, является необходимость внутривенного введения препарата для достижения высоких концентраций в крови, необходимых для проявления противовирусной активности.Compared with the structural analogue (II), ID ₅₀ for which in the culture of MT-4 cells in relation to different strains of HIV-1 is 0.045-0.75 μM [Y. Kashiwada, F. Hashimoto, LM Cosentino, CH. Chen, PE Garrett, K.-H. Lee, J. Med. Chem. 1996, v. 39, N 5, p. 1016-1017], the anti-HIV selectivity index for compound (I) is at least an order of magnitude higher than that for (II). As an undoubted advantage of the invention, it should be noted that low inhibitory concentrations (1000-10000 times lower compared with HA) make the claimed compound promising for oral use in the treatment of HIV infection. This is important, since one of the drawbacks in the treatment of viral infections of HA, as well as other triterpenes, is the need for intravenous administration of the drug to achieve high blood concentrations necessary for the manifestation of antiviral activity.

Противовирусную активность заявляемого соединения в отношении вируса простого герпеса 1 типа (ВГП-1) определяли на штамме L, полученном из Аmеrican Tissue Culture Collection (ATCC) с использованием клеток Нер-2 (перевиваемся эпителиальная культура клеток человека) и Vero (перевиваемая культура клеток почки зеленой мартышки). Активность определяли при добавлении к клеточному монослою одновременно с вирусом. Препаратом сравнения служил широко применяемый в медицинской практике антигерпетический препарат ацикловир. Результаты представлены в табл. 5 и на фиг. 2. The antiviral activity of the claimed compounds against herpes simplex virus type 1 (HHP-1) was determined on strain L obtained from American Tissue Culture Collection (ATCC) using Hep-2 cells (transplantable human cell epithelial culture) and Vero (transplantable kidney cell culture green monkey). Activity was determined by adding to the cell monolayer simultaneously with the virus. The reference drug was the antiherpetic drug acyclovir widely used in medical practice. The results are presented in table. 5 and in FIG. 2.

Соединение (I), по-видимому, из-за токсичности не достигает ID₅₀ на клетках Vero, поэтому IS не определяется, тогда как на клетках Нер-2 эффективная доза для соединения (I) равна 0,5 мкг/мл, что в 20 раз ниже, чем для ГК, и находится на уровне ацикловира. ГК в культуре Vero оказывала выраженное противовирусное действие (ID₅₀ 1,0 мкг/мл), в то время как на Нер-2 требовалась значительно более высокая доза препарата для того же эффекта (ID₅₀ 10 мкг/мл). Как видно из табл. 5 и фиг. 2, значения по защите клеток заявляемым агентом на культурах Vero и Нер-2 различны, что не противоречит данным для широко применяемых препаратов. Так, значения ID₅₀ при изучении противовирусного действия на культурах Vero и HEL существенно различались для ацикловира (1,06 и 0,0061 мкг/мл соответственно), ганцикловира (5,32 и 0,067 мкг/мл соответственно) и пенцикловира (6,67 и 0.14 мкг/мл соответственно) [Neyts J. , Andrei G., De Clercq E. // Antimicrobal agents and chemoterapy, 1998, v. 42, p. 216-222]. Следует также подчеркнуть, что противовирусная активность для структурного аналога (II) неизвестна.Compound (I), apparently, due to toxicity, does not reach ID ₅₀ on Vero cells; therefore, IS is not determined, whereas on Hep-2 cells, the effective dose for compound (I) is 0.5 μg / ml, which 20 times lower than for HA, and is at the level of acyclovir. HA in Vero culture had a pronounced antiviral effect (ID ₅₀ 1.0 μg / ml), while Hep-2 required a significantly higher dose for the same effect (ID ₅₀ 10 μg / ml). As can be seen from the table. 5 and FIG. 2, the cell protection values of the claimed agent on the Vero and Hep-2 cultures are different, which does not contradict the data for widely used preparations. Thus, the values of ID ₅₀ when studying the antiviral effect on Vero and HEL cultures were significantly different for acyclovir (1.06 and 0.0061 μg / ml, respectively), ganciclovir (5.32 and 0.067 μg / ml, respectively) and penciclovir (6.67 and 0.14 μg / ml, respectively) [Neyts J., Andrei G., De Clercq E. // Antimicrobal agents and chemoterapy, 1998, v. 42, p. 216-222]. It should also be emphasized that the antiviral activity for the structural analogue (II) is unknown.

Таким образом, новое химическое соединение - N'-{N-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оил] -9-аминононаноил} -3-амино-3-фенилпропионовая кислота - не токсично, обладает широким спектром антивирусной активности в сочетании с иммуностимулирующей активностью. Заявляемое соединение получается с высоким выходом из доступного отечественного сырья бетулина (содержание в коре березы достигает 25%). Thus, the new chemical compound - N '- {N- [3-oxo-20 (29) -lupen-28-oyl] -9-aminononanoyl} -3-amino-3-phenylpropionic acid - is non-toxic, has a wide spectrum antiviral activity in combination with immunostimulating activity. The inventive compound is obtained with a high yield of available domestic raw materials betulin (the content in the bark of the birch reaches 25%).

Данное изобретение иллюстрируется примерами. The invention is illustrated by examples.

Пример 1. Синтез N'-{N-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оил]-9-аминононаноил}-3-амино-3-фенилпропионовой кислоты (I). Example 1. Synthesis of N '- {N- [3-oxo-20 (29) -lupen-28-oyl] -9-aminononanoyl} -3-amino-3-phenylpropionic acid (I).

К соединению (IV) (2.82 г, 6.2 ммоль) в 70 мл безводного хлористого метилена в атмосфере аргона прибавляли 1.1 мл (12.6 ммоль) хлористого оксалила, реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре 6 ч и затем упаривали на роторном испарителе при температуре не более 30^oС. К остатку добавляли безводный хлористый метилен и снова упаривали, эту процедуру повторяли несколько раз, затем остаток промывали безводным серным эфиром. Получили 2.60 г (89%) хлорангидрида 3-оксо-20(29)-лупен-28-овой кислоты (V), т. пл. 209-212^oС.To compound (IV) (2.82 g, 6.2 mmol) in 70 ml of anhydrous methylene chloride in an argon atmosphere was added 1.1 ml (12.6 mmol) of oxalyl chloride, the reaction mixture was stirred at room temperature for 6 h and then evaporated on a rotary evaporator at a temperature of no more than 30 ^o C. Anhydrous methylene chloride was added to the residue and evaporated again, this procedure was repeated several times, then the residue was washed with anhydrous sulfuric ether. Received 2.60 g (89%) of 3-oxo-20 (29) -lupen-28-oic acid acid chloride (V), mp 209-212 ^o C.

Масс-спектрометрически найдено: мол. масса 472.31425. С₃₀Н₄₅O₂Сl. Вычислено: мол. масса 472.31079.Mass spectrometrically found: mol. mass 472.31425. C ₃₀ H ₄₅ O ₂ Cl. Calculated: mol. mass 472.31079.

ИК-спектр (ν, см^-1): 1705 (С=O), 1804 (СOСl).IR spectrum (ν, cm ^-1 ): 1705 (С = O), 1804 (СОСl).

Спектр ЯМР ¹Н (δ, м.д.): 4.67 с и 4.57 с (2Н, =CH₂), 1.62 с (3Н, Me), 1.02 с (3Н, Me), 0.98 с (3Н, Me), 0.94 с (6Н, 2 Me), 0.89 с (3Н, Me). ¹ H NMR spectrum (δ, ppm): 4.67 s and 4.57 s (2H, = CH ₂ ), 1.62 s (3H, Me), 1.02 s (3H, Me), 0.98 s (3H, Me), 0.94 s (6H, 2 Me), 0.89 s (3H, Me).

Спектр ЯМР ¹³С (δ, м.д.): 14.54 к, 15.56 к, 15.79 к, 19.19 к, 19.45 т, 20.86 к, 21.19 т, 25.22 т, 26.44 к, 29.41 т, 29.69 т, 32.02 т, 33.44 т, 33.92 т, 35.99 т, 36.77 с, 37.66 д, 39.49 т. 40.52 с, 42.35 с, 45.81 д, 47.15 с, 49.49 д, 49.80 д, 54.86 д, 67.61 с, 110.18 т, 149.04 с, 177.17 с, 217.73 с. ¹³ C NMR spectrum (δ, ppm): 14.54 k, 15.56 k, 15.79 k, 19.19 k, 19.45 t, 20.86 k, 21.19 t, 25.22 t, 26.44 k, 29.41 t, 29.69 t, 32.02 t, 33.44 t, 33.92 t, 35.99 t, 36.77 s, 37.66 d, 39.49 t. 40.52 s, 42.35 s, 45.81 d, 47.15 s, 49.49 d, 49.80 d, 54.86 d, 67.61 s, 110.18 t, 149.04 s, 177.17 s, 217.73 s.

Смесь 2.2 ммоль (0.46 г) гидрохлорида 9-аминононановой кислоты, 4.4 ммоль (0.56 мл) свежеперегнанного триметилхлорсилана и 2.2 ммоль (0.31 мл) перегнанного триэтиламина в 100 мл безводного хлористого метилена кипятили 4 ч в атмосфере аргона, затем охлаждали до 0-5^oС и добавляли 2 ммоль (0.95г) хлорангидрида (V) и 3.2 ммоль (0.45 мл) перегнанного триэтиламина. Реакционную смесь выдерживали с периодическим перемешиванием при комнатной температуре в течение суток, затем разбавляли хлористым метиленом, промывали 10%-ным раствором соляной кислоты, водой, 5%-ным раствором бикарбоната натрия, водой, сушили MgSO₄ и упаривали. Остаток хроматографировали на силикагеле (элюент - раствор, содержащий 5% ацетонитрила в хлороформе) и высушивали при 60^oС над Р₂O₅. Получили 0.75 г N-(3-оксо-20(29)-лупен-28-оил)-9-аминононановой кислоты (VI) (61%), т.пл. 96-98^oC, [α] +27^o (с 4.16, хлороформ).A mixture of 2.2 mmol (0.46 g) of 9-aminononanoic acid hydrochloride, 4.4 mmol (0.56 ml) of freshly distilled trimethylchlorosilane and 2.2 mmol (0.31 ml) of distilled triethylamine in 100 ml of anhydrous methylene chloride was boiled for 4 hours under argon atmosphere, then cooled to 0-5 ^o C and 2 mmol (0.95 g) of acid chloride (V) and 3.2 mmol (0.45 ml) of distilled triethylamine were added. The reaction mixture was kept with periodic stirring at room temperature for one day, then it was diluted with methylene chloride, washed with 10% hydrochloric acid solution, water, 5% sodium bicarbonate solution, water, dried with MgSO ₄ and evaporated. The residue was chromatographed on silica gel (eluent — a solution containing 5% acetonitrile in chloroform) and dried at 60 ^{° C.} over P ₂ O ₅ . Obtained 0.75 g of N- (3-oxo-20 (29) -lupen-28-oyl) -9-aminononanoic acid (VI) (61%), so pl. 96-98 ^o C, [α] +27 ^o (s 4.16, chloroform).

Масс-спектрометрически найдено: мол. масса 609.47507. С₃₉Н₆₃NO₄. Вычислено: мол. масса 609.47568.Mass spectrometrically found: mol. weight 609.47507. C ₃₉ H ₆₃ NO ₄ . Calculated: mol. mass 609.47568.

Спектр ЯМР ¹Н (δ, м.д.): 9.49 уш.с (1Н, СООН), 5.80 т (1Н, NH, J=5.3 Гц ), 4.65 с и 4.50 с (2Н, = СН₂), 3.22 м (1Н,

), 3.05 м (2Н, 1Н,

), 2.35 т (2Н,

, J=8.0 Гц), 1.59 с (3Н, Me), 0.98 с (3Н, Me), 0.93 с (3Н, Me), 0.89 с (6Н, 2 Me), 0.84 с (3Н, Me). Спектр ЯМР ¹³С (δ, м. д. ): 14.29 к, 15.69 к (2С), 19.24 к, 19.38 т, 20.75 к. 21.23 т, 24.43 т, 25.38 т, 26.36 к, 26.64 т, 28.70 т, 28.79 т, 28.88 т, 29.14 т, 29.50 т, 30.60 т, 33.46 т (2С), 33.81 т, 33.87 т, 36.65 с, 37.50 д, 38.20 т, 38.98 т, 39.38 т, 40.44 с, 42.26 с, 46.41 д, 47.07 с, 49.74 д, 49.83 д, 54.74 д, 55.32 с, 109.10 т. 150.63 с, 176.00 с, 178.75 с, 218.28 с. ¹ H NMR spectrum (δ, ppm): 9.49 br s (1H, COOH), 5.80 t (1H, NH, J = 5.3 Hz), 4.65 s and 4.50 s (2H, = CH ₂ ), 3.22 m (1H,

), 3.05 m (2H, 1H,

), 2.35 t (2H,

, J = 8.0 Hz), 1.59 s (3H, Me), 0.98 s (3H, Me), 0.93 s (3H, Me), 0.89 s (6H, 2 Me), 0.84 s (3H, Me). ¹³ C NMR spectrum (δ, ppm): 14.29 k, 15.69 k (2C), 19.24 k, 19.38 t, 20.75 k, 21.23 t, 24.43 t, 25.38 t, 26.36 k, 26.64 t, 28.70 t, 28.79 t, 28.88 t, 29.14 t, 29.50 t, 30.60 t, 33.46 t (2C), 33.81 t, 33.87 t, 36.65 s, 37.50 d, 38.20 t, 38.98 t, 39.38 t, 40.44 s, 42.26 s, 46.41 d, 47.07 s, 49.74 d, 49.83 d, 54.74 d, 55.32 s, 109.10 t. 150.63 s, 176.00 s, 178.75 s, 218.28 s.

К раствору 0.97 г (1.6 ммоль) соединения (VI) в 150 мл безводного хлористого метилена при 0^oС в атмосфере аргона прибавляли при перемешивании 0.23 г (2 ммоль) 1-гидроксибензотриазола и 0.41 г (2 ммоль) N,N-дициклогексилкарбодиимида, реакционную смесь перемешивали 0.5 ч при 0^oС и 5 ч при комнатной температуре, затем охлаждали до 0^oС и прибавляли 0.45 г (2.1 ммоль) гидрохлорида метилового эфира β-фенил-β-аланина и 0.3 мл (2.1 ммоль) перегнанного триэтиламина. Реакционную смесь выдерживали, периодически перемешивая, при комнатной температуре в течение суток, затем охлаждали до 0^oС, осадок дициклогексилмочевины отфильтровывали и промывали охлажденным хлористым метиленом. Объединенные фильтраты промывали 10%-ным раствором соляной кислоты, водой, 5%-ным раствором бикарбоната натрия, водой, сушили MgSO₄ и упаривали. Остаток растворяли в небольшом количестве хлористого метилена (~ 5 мл), раствор охлаждали до -10^oС, выпавший осадок отфильтровали, промывали охлажденным хлористым метиленом и фильтрат упаривали. Эту процедуру повторяли 2-3 раза, остаток высушивали в вакууме. К раствору 1.04 г полученного вещества в смеси 7 мл МеОН и 14 мл ТГФ прибавляли 1.4 мл 4 М раствора NaOH и реакционную смесь выдерживали при комнатной температуре в течение суток, затем выливали на смесь льда с разбавленной соляной кислотой. Выпавший осадок отфильтровывали, промывали водой и сушили в вакуум-эксикаторе над P₂O₅. Получили 0.97 г (81%) соединения (I), т.пл. 146-148^o, [α] +21^o (с 3.83, хлороформ).To a solution of 0.97 g (1.6 mmol) of compound (VI) in 150 ml of anhydrous methylene chloride at 0 ^° C in an argon atmosphere was added with stirring 0.23 g (2 mmol) of 1-hydroxybenzotriazole and 0.41 g (2 mmol) of N, N-dicyclohexylcarbodiimide, the reaction mixture was stirred for 0.5 h at 0 ^° С and 5 h at room temperature, then it was cooled to 0 ^° С and 0.45 g (2.1 mmol) of β-phenyl-β-alanine methyl ester hydrochloride and 0.3 ml (2.1 mmol) of distilled triethylamine were added. The reaction mixture was kept, periodically stirring, at room temperature for one day, then cooled to 0 ^{° C.} , the precipitate of dicyclohexylurea was filtered off and washed with chilled methylene chloride. The combined filtrates were washed with 10% hydrochloric acid, water, 5% sodium bicarbonate, water, dried with MgSO ₄ and evaporated. The residue was dissolved in a small amount of methylene chloride (~ 5 ml), the solution was cooled to -10 ^° C, the precipitate was filtered off, washed with chilled methylene chloride and the filtrate was evaporated. This procedure was repeated 2-3 times, the residue was dried in vacuum. To a solution of 1.04 g of the obtained substance in a mixture of 7 ml of MeOH and 14 ml of THF was added 1.4 ml of a 4 M NaOH solution and the reaction mixture was kept at room temperature for 24 hours, then it was poured onto a mixture of ice with dilute hydrochloric acid. The precipitate was filtered off, washed with water and dried in a vacuum desiccator over P ₂ O ₅ . Received 0.97 g (81%) of compound (I), so pl. 146-148 ^° , [α] +21 ^° (c 3.83, chloroform).

Масс-спектрометрически найдено: мол. масса 756. C₄₈H₇₂N₂O₅. Вычислено: мол. масса 756.Mass spectrometrically found: mol. weight 756. C ₄₈ H ₇₂ N ₂ O ₅ . Calculated: mol. mass 756.

Спектр ЯМР ¹Н (δ, м.д.): 9.80 уш.с (1Н, СООН), 7.30-7.13 м (5Н, Ph), 7.05 д (1Н, NH, J=8.6 Гц), 5.85 т (1Н, NH, J=5.2 Гц), 5.36 м (1Н,

), 4.66 с и 4.53 с (2Н, =СН₂), 3.16-3.01 м (3Н,

, Н¹⁹), 2.80 м (2Н, СН₂

), 2.15 т (2Н,

, J=8.0 Гц), 1.62 с (3Н, Me), 1.00 с (3Н, Me), 0.95 с (3Н, Me), 0.91 с (6Н, 2Ме), 0.85с (3Н, Me). ¹ H NMR spectrum (δ, ppm): 9.80 br.s (1H, COOH), 7.30-7.13 m (5H, Ph), 7.05 d (1H, NH, J = 8.6 Hz), 5.85 t (1H , NH, J = 5.2 Hz), 5.36 m (1H,

), 4.66 s and 4.53 s (2Н, = СН ₂ ), 3.16-3.01 m (3Н,

, H ¹⁹ ), 2.80 m (2H, CH ₂

), 2.15 t (2H,

, J = 8.0 Hz), 1.62 s (3H, Me), 1.00 s (3H, Me), 0.95 s (3H, Me), 0.91 s (6H, 2Me), 0.85 s (3H, Me).

Спектр ЯМР ¹³С (δ, м.д.): 14.31 к, 15.69 к (2С), 19.24 к, 19.43 т, 20.77 к, 21.26 т, 25.32 т, 25.42 т, 26.41 к, 26.50 т, 28.68 т (2С), 28.80 т, 29.16 т, 29.43 т, 30.63 т, 33.47 т (2С), 33.87 т, 36.34 т, 36.68 с, 37.54 д, 38.24 т, 38.99 т, 39.41 т (2С), 40.48 с, 42.29 с, 46.45 д, 47.07 с, 49.11 д, 49.77 д, 49.85 д, 54.77 д, 55.36 с, 109.15 т, 126.09 д (2С), 127.16 д, 128.32 д (2С), 140.65 с, 150.61 с, 172.76 с, 173.40 с, 176.20 с, 218.17 с. ¹³ C NMR spectrum (δ, ppm): 14.31 k, 15.69 k (2C), 19.24 k, 19.43 t, 20.77 k, 21.26 t, 25.32 t, 25.42 t, 26.41 k, 26.50 t, 28.68 t (2C ), 28.80 t, 29.16 t, 29.43 t, 30.63 t, 33.47 t (2C), 33.87 t, 36.34 t, 36.68 s, 37.54 d, 38.24 t, 38.99 t, 39.41 t (2C), 40.48 s, 42.29 s, 46.45 d, 47.07 s, 49.11 d, 49.77 d, 49.85 d, 54.77 d, 55.36 s, 109.15 t, 126.09 d (2C), 127.16 d, 128.32 d (2C), 140.65 s, 150.61 s, 172.76 s, 173.40 s , 176.20 s, 218.17 s.

Пример 2. Влияние соединения (I) на Т-клеточный иммунитет при иммунизации сильным антигеном. Example 2. The effect of compound (I) on T-cell immunity when immunized with a strong antigen.

В работе использовали нелинейных мышей, самцов массой 20-22 г. Животным вводили подкожно взвесь ЭБ (10⁷ клеток на мышь) с 200 мкг (10 мг/кг) исследуемого соединения в 0,5 мл физиологического раствора. Контрольным животным вводили ЭБ без соединения (I) (отрицательный контроль) или ЭБ с НАФ (положительный контроль); еще одна контрольная группа - неиммунные мыши. На 6 день после иммунизации готовили суспензию спленоцитов с концентрацией 10 живых клеток в 1 миллилитре. 0,9 мл суспензии спленоцитов и 0,1 мл суспензии эритроцитов (10⁹ клеток в миллилитре) помещали в пенфлаконы, перемешивали и инкубировали 16 ч при 4^oС. После инкубации в пенфлаконы вносили по 4 мл холодной среды, осторожно перемешивали; пипеткой с широким носиком отбирали 100 мкл суспензии клеток, окрашивали трипановым синим 0,4% и считали количество розеток в камере Горяева [Фримель X. Иммунологические методы. / Пер. с нем., под ред. М.А.Фроловой.- М.: Мир, 1979, 518 с.]. Результаты представляют как число розеток на 10 клеток. Индекс стимуляции рассчитывали как соотношение числа розеток в эксперименте (иммунизация ЭБ в смеси с исследуемым соединением) и числа розеток в контроле (иммунизация только ЭБ). Данные представлены в табл. 1.Nonlinear mice, males weighing 20-22 g, were used in the work. Animals were injected subcutaneously with an EB suspension (10 ⁷ cells per mouse) with 200 μg (10 mg / kg) of the test compound in 0.5 ml of physiological saline. Control animals were given EB without compound (I) (negative control) or EB with NAF (positive control); another control group is non-immune mice. On the 6th day after immunization, a suspension of splenocytes was prepared with a concentration of 10 living cells in 1 milliliter. 0.9 ml of a suspension of splenocytes and 0.1 ml of a suspension of red blood cells (10 ⁹ cells per milliliter) were placed in pen bottles, mixed and incubated for 16 hours at 4 ^° C. After incubation, 4 ml of cold medium was added to the pen bottles, carefully mixed; 100 μl of a cell suspension was taken with a wide-nose pipette, stained with trypan blue 0.4% and the number of sockets in the Goryaev chamber was counted [Frimel X. Immunological methods. / Per. with him., ed. M.A. Frolova.- M .: Mir, 1979, 518 p.]. The results are presented as the number of outlets per 10 cells. The stimulation index was calculated as the ratio of the number of sockets in the experiment (immunization of EBs mixed with the test compound) and the number of sockets in the control (immunization of EBs only). The data are presented in table. 1.

Пример 3. Влияние соединения (I) на В-клеточный ответ при иммунизации слабым антигеном. Животным вводили подкожно 400 мкг БСА в 0,5 мл 0,9% NaCl. Исследуемые соединения вводили подкожно в дозе 200 мк/кг. В работе использовали 3 группы контрольных животных. Одну группу иммунизировали БСА с НПФ (1: 1 по объему), вторую - БСА с 1%-ным Аl(ОН)₃, третью - БСА без препарата. Контроль - неиммунные мыши. На 21 день аналогично проводили вторую иммунизацию (инъекционный раствор содержал 100 мкг БСА и 200 мкг исследуемого соединения). На 10-й день после второй иммунизации получали сыворотки крови. Титр антител определяли методом иммуноферментного анализа по методике [Иммуноферментный анализ // Под ред. Т-Т. Иго, Г.Ленхоффа. - М: Мир, 1988]. Количественные данные приведены в табл. 2.Example 3. The effect of compound (I) on the b-cell response during immunization with a weak antigen. Animals were injected subcutaneously with 400 μg BSA in 0.5 ml of 0.9% NaCl. The test compounds were administered subcutaneously at a dose of 200 mc / kg. We used 3 groups of control animals. One group was immunized with BSA with NPF (1: 1 by volume), the second with BSA with 1% Al (OH) ₃ , and the third with BSA without drug. Control - non-immune mice. On day 21, the second immunization was carried out similarly (the injection solution contained 100 μg BSA and 200 μg of the test compound). On the 10th day after the second immunization, serum was obtained. The antibody titer was determined by enzyme-linked immunosorbent assay according to the method of [Immunoassay analysis // Ed. TT. Igo, G. Lenhoff. - M: Mir, 1988]. Quantitative data are given in table. 2.

Пример 4. Оценка цитотоксичности соединения (I) на клетках МТ-4. Example 4. Assessment of the cytotoxicity of compound (I) on MT-4 cells.

Цитотоксичность соединения (I) оценивали на культуре клеток перевиваемых Т-лимфоцитов человека (линия МТ-4). Навеску агента (I) растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) до концентрации 10 мг/мл и готовили последовательные разведения в ростовой среде, затем вносили аликвоты соответствующих разведений в лунки 96-луночных планшетов (по три на каждое разведение) при рассеве клеток до конечных концентраций от 0,1 до 100 мкг/мл. Посевная концентрация составляла 0,5х10⁶ клеток/мл. Экспериментальные (с препаратом) и контрольные (без препарата) клетки культивировали в 96-луночных планшетах для культур клеток фирмы "Costar" (США) на ростовой питательной среде RPMI-1640, содержащей 10% сыворотки плода коровы фирмы "ICN" (США), 0,06% L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина и 60 мкг/мл линкомицина, и 5% СО₂ в течение 4 суток при 37^oС. По окончании инкубации подсчитывали долю жизнеспособных клеток в камере Горяева после окрашивания 0,4%-ным раствором трипанового синего. Строили дозозависимую кривую, из которой определяли цитотоксическую дозу (CD₅₀) концентрацию соединения, на 50% снижающую долю жизнеспособных клеток по сравнению с контролем. CD₅₀ для соединения (I) составляет 5,6 мкМ (табл.3).The cytotoxicity of compound (I) was evaluated on a cell culture of transplantable human T-lymphocytes (MT-4 line). A portion of agent (I) was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) to a concentration of 10 mg / ml and serial dilutions were prepared in growth medium, then aliquots of the corresponding dilutions were added to the wells of 96-well plates (three for each dilution) when the cells were sieved to final concentrations from 0.1 to 100 μg / ml. The inoculum concentration was 0.5 x 10 ⁶ cells / ml. Experimental (with the drug) and control (without the drug) cells were cultured in 96-well plates for cell cultures of Costar company (USA) on RPMI-1640 growth medium containing 10% ICN cow serum (USA), 0.06% L-glutamine, 100 μg / ml gentamicin and 60 μg / ml lincomycin, and 5% CO ₂ for 4 days at 37 ^° C. After incubation, the proportion of viable cells in the Goryaev chamber after staining with 0.4% was calculated trypan blue solution. A dose-dependent curve was constructed from which the cytotoxic dose (CD ₅₀ ) concentration of the compound was determined, which reduces the proportion of viable cells by 50% compared to the control. The CD ₅₀ for compound (I) is 5.6 μM (Table 3).

Пример 5. Оценка анти-ВИЧ активности соединения (I) при внесении препарата после адсорбции вируса. Example 5. Evaluation of the anti-HIV activity of compound (I) upon application of the drug after virus adsorption.

Анти-ВИЧ-1 активность соединения (I) изучали на высоко чувствительной к ВИЧ культуре клеток МТ-4. Клетки МТ-4 заражали стоком вируса (штамм ВИЧ-1/ЭВК [Карамов Э.В., Богомолов Б.П., Жданов В.М. // Обзор центров, сотрудничающих с ВОЗ по вирусным инфекциям, 1986, 4 с.]) с множественностью заражения 0,2-0,5 инфекционных единиц на клетку и инкубировали при 37^oС в течение 1 ч (адсорбция вируса). Суспензию инфицированных клеток разводили ростовой питательной средой RPMI-1640, содержащей 10% сыворотки плода коровы фирмы "ICN" (США), 0,06% L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина и 60 мкг/мл линкомицина до посевной концентрации 0,5х10⁶ клеток/мл и вносили в лунки 96-луночного культурального планшета. Затем вносили в лунки аликвоты последовательных разведений соединения (I) в ДМСО до конечных концентраций от 0,1 нг/мл до 1 мкг/мл (по три лунки на каждую концентрацию). Экспериментальные (с препаратом) и контрольные (без препарата) инфицированные клетки и контрольные неинфицированные клетки (без препарата) культивировали при 37^oС и 5% СO₂ в течение 4 суток. По окончании инкубации подсчитывали долю жизнеспособных клеток в камере Горяева после окрашивания 0,4%-ным раствором трипанового синего и контролировали уровень накопления вирусспецифического белка р24 иммуноферментным методом, как описано [Федюк Н.В., Коновалов Е.Е., Локтев В.Б., Урываев Л.В., Куляндин С.А., Покровский А.Г. // Вопросы Вирусологии, 1992, т. 3, с. 135]. На основе полученных в эксперименте количественных данных строили дозозависимую кривую, из которой определяли ингибирующую дозу (ID₅₀) - концентрацию соединения, на 50% снижающую накопление вирусного антигена р24 по сравнению с контролем, которая для соединения (I) составляет 0,4 мкМ. Терапевтический индекс или индекс селективности (IS), рассчитываемый как отношение цитотоксической дозы к эффективной (CD₅₀/ID₅₀), составляет для соединения (I) 14. Количественные данные ингибирования репродукции вируса представлены в табл.3.The anti-HIV-1 activity of compound (I) was studied in a highly sensitive to HIV MT-4 cell culture. MT-4 cells were infected with a virus stock (strain HIV-1 / EVK [Karamov EV, Bogomolov BP, Zhdanov VM // Review of centers collaborating with WHO on viral infections, 1986, 4 pp.] ) with a multiplicity of infection of 0.2-0.5 infectious units per cell and incubated at 37 ^o C for 1 h (virus adsorption). The suspension of infected cells was diluted with RPMI-1640 growth medium containing 10% ICN cow serum (USA), 0.06% L-glutamine, 100 μg / ml gentamicin and 60 μg / ml lincomycin to a seed concentration of 0.5x10 ⁶ cells / ml and added to the wells of a 96-well culture plate. Then aliquots of successive dilutions of compound (I) were added to the wells in DMSO to final concentrations from 0.1 ng / ml to 1 μg / ml (three wells per concentration). Experimental (with the drug) and control (without the drug) infected cells and control uninfected cells (without the drug) were cultured at 37 ^° C and 5% CO ₂ for 4 days. At the end of the incubation, the fraction of viable cells in the Goryaev chamber was counted after staining with a 0.4% trypan blue solution and the accumulation level of the virus-specific p24 protein was checked by the enzyme immunoassay as described [Fedyuk N.V., Konovalov E.E., Loktev V.B. ., Uryvaev L.V., Kulyandin S.A., Pokrovsky A.G. // Questions of Virology, 1992, v. 3, p. 135]. Based on the quantitative data obtained in the experiment, a dose-dependent curve was constructed from which the inhibitory dose (ID ₅₀ ) was determined — the concentration of the compound, which reduces the accumulation of the p24 viral antigen by 50% compared to the control, which was 0.4 μM for compound (I). The therapeutic index or selectivity index (IS), calculated as the ratio of cytotoxic dose to effective (CD ₅₀ / ID ₅₀ ), is for compound (I) 14. Quantitative data on the inhibition of virus reproduction are presented in table 3.

Пример 6. Оценка анти-ВИЧ активности соединения (I) при внесении препарата одновременно с вирусом. Анти-ВИЧ-1 активность соединения (I) изучали на культуре клеток МТ-4. Example 6. Evaluation of the anti-HIV activity of compound (I) when making the drug simultaneously with the virus. The anti-HIV-1 activity of compound (I) was studied on a MT-4 cell culture.

Клетки МТ-4 вносили в лунки 96-луночного культурального планшета, заражали стоком вируса (штамм ВИЧ-1/ЭВК) с множественностью заражения 0,2-0,5 инфекционных единиц на клетку, затем вносили исследуемые вещества в суспензию клеток одновременно с вирусом до конечной концентрации от 0,00001 до 1 мкг/мл (по три лунки на каждую концентрацию) и инкубировали при 37^oС в течение 1 ч (адсорбция вируса). По окончании инкубации суспензию инфицированных клеток разводили полной ростовой средой со всеми добавками, как описано выше, содержащей препараты в тех же концентрациях, до посевной концентрации 0,5х10⁶ клеток/мл. Экспериментальные (с препаратом) и контрольные (без препарата) инфицированные клетки и контрольные неинфицированные клетки (без препарата) культивировали при 37^oС и 5% CO₂ в течение 4 суток. По окончании инкубации подсчитывали долю жизнеспособных клеток в камере Горяева после окрашивания 0,4%-ным раствором трипанового синего и контролируют уровень накопления вирусспецифического белка р24 иммуноферментным методом, как описано [Федюк Н.В., Коновалов Е.Е., Локтев В.Б., Урываев Л.В., Куляндин С.А., Покровский А. Г. // Вопросы Вирусологии, 1992, т. 3, с.135]. На основе полученных в эксперименте количественных данных строили дозозависимую кривую, из которой определяли ингибирующую дозу (ID₅₀) - концентрацию соединения, на 50% снижающую накопление вирусного антигена р24 по сравнению с контролем, которая для соединения (I) составляет 0,0026 мкМ. Терапевтический индекс или индекс селективности (IS), рассчитываемый как отношение цитотоксической дозы к эффективной (CD₅₀/ID₅₀), составляет для соединения (I) 2135. Кроме того, определяли ID₉₀ - концентрацию соединения, подавляющую продукцию вируса на 90%, которая для соединения (I) составляет 0,198 мкМ, а также PD₅₀ - концентрацию соединения, на 50% защищающую инфицированные клетки от вирус-индуцированного цитопатического действия, рассчитанную, как описано нами ранее [Svinarchuk P.P., Konevetz D.A., Pliasunova O.A., Pokrovsky A.G,. Vlassov V. V.// Biochimie, 1993, Bd. 75, S. 243], которая для соединения (I) составляет 0,029 мкМ; IS - индекс селективности - отношение токсичной дозы соединения CD₅₀ к его защищающей дозе PD₅₀, который для соединения (I) составляет 191. Количественные данные ингибирования репродукции вируса представлены в табл.4 и на фиг. 1.MT-4 cells were introduced into the wells of a 96-well culture plate, infected with a virus stock (strain HIV-1 / EVK) with a multiplicity of infection of 0.2-0.5 infectious units per cell, then the test substances were introduced into the cell suspension simultaneously with the virus until final concentration from 0.00001 to 1 μg / ml (three wells per concentration) and incubated at 37 ^o C for 1 h (virus adsorption). At the end of the incubation, the suspension of infected cells was diluted with complete growth medium with all additives, as described above, containing preparations in the same concentrations, to an inoculum concentration of 0.5x10 ⁶ cells / ml. Experimental (with the drug) and control (without the drug) infected cells and control uninfected cells (without the drug) were cultured at 37 ^° C and 5% CO ₂ for 4 days. At the end of the incubation, the fraction of viable cells in the Goryaev chamber was counted after staining with a 0.4% trypan blue solution and the level of accumulation of the virus-specific protein p24 by the enzyme immunoassay was controlled as described [Fedyuk N.V., Konovalov E.E., Loktev V.B. ., Uryvaev L.V., Kulyandin S.A., Pokrovsky A.G. // Questions of Virology, 1992, v. 3, p.135]. Based on the quantitative data obtained in the experiment, a dose-dependent curve was constructed from which the inhibitory dose (ID ₅₀ ) was determined — the concentration of the compound, which reduces the accumulation of p24 viral antigen by 50% compared to the control, which for compound (I) was 0.0026 μM. The therapeutic index or selectivity index (IS), calculated as the ratio of cytotoxic dose to effective (CD ₅₀ / ID ₅₀ ), is 2135 for compound (I). In addition, ID ₉₀ , the concentration of the compound that suppresses virus production by 90%, was determined, which for compound (I) is 0.198 μM, and also PD ₅₀ is the concentration of the compound, which protects infected cells from virus-induced cytopathic effects by 50%, calculated as described previously [Svinarchuk PP, Konevetz DA, Pliasunova OA, Pokrovsky AG ,. Vlassov VV // Biochimie, 1993, Bd. 75, S. 243], which for compound (I) is 0.029 μM; IS is the selectivity index is the ratio of the toxic dose of the compound CD ₅₀ to its protective dose PD ₅₀ , which for compound (I) is 191. Quantitative data on the inhibition of virus reproduction are presented in Table 4 and in FIG. 1.

Пример 7. Оценка противовирусной активности соединения (1) в отношении ВПГ-1. Example 7. Evaluation of the antiviral activity of compound (1) against HSV-1.

Антигерпетическую активность соединения (I) изучали на чувствительных к вирусу простого герпеса культурах клеток Нер-2 и Vero с использованием ростовой питательной среды RPMI-1640, содержащей 5% сыворотки плода коровы фирмы "ICN" (США), 0,06% L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина и 60 мкг/мл линкомицина. Клетки Нер-2 и Vero вносят в лунки 96-луночного культурального планшета, инкубировали при 37^oС в атмосфере 5% CO₂ - 95% воздух до формирования монослоя, заражали стоком вируса (ВПГ-1 штамм L) с множественностью заражения 0,2-0,5 инфекционных единиц на клетку, вносили соединения в лунки планшета сразу после внесения вируса до конечной концентрации от 0,1 до 100 мкг/мл (по три лунки на каждую концентрацию) и инкубировали при 37^oС в течение 1,5 ч в атмосфере 5% СО₂ - 95% воздух (адсорбция вируса). По окончании инкубации в лунки планшета вносили полную ростовую среду со всеми добавками, содержащую исследуемые соединения в тех же концентрациях, что и при адсорбции вируса. Экспериментальные (с препаратом) и контрольные (без препарата) инфицированные клетки и контрольные неинфицированные клетки (без препарата) культивировали при 37^oС в 5% CO₂ в течение 4 суток. По окончании инкубации подсчитывали долю жизнеспособных клеток путем окрашивания раствором генциан-виолета (1,3 г красителя растворяли в 50 мл 96% спирта, доводили дистиллированной водой до 700 мл и смешивали с 300 мл 40% формалина). Для этого в лунки планшета вносили по 30 мкл раствора красителя и оставляли при комнатной температуре на 1,5-2 ч. Затем трижды отмывали дистиллированной водой, планшеты высушивали, затем определяли оптическую плотность при длине волны 570 нм. На основе полученных количественных данных строили дозозависимую кривую (фиг. 2), из которой определяли эффективную дозу (ID₅₀) - концентрацию соединения, на 50% защищающую клетки от цитопатического действия вируса, которая для соединения (I) составляет 0,5 мкг/мл на клетках Нер-2. Терапевтический индекс или индекс селективности (IS), рассчитываемый как отношение цитотоксической дозы к эффективной (CD₅₀/ID₅₀), составляет для соединения (I) 40. Количественные данные противовирусной активности соединения (I) в отношении ВПГ-1 представлены в табл.5.The antiherpetic activity of compound (I) was studied on herpes simplex virus cultures of Hep-2 and Vero cells using RPMI-1640 growth medium containing 5% of fetal bovine serum from ICN company (USA), 0.06% L-glutamine , 100 μg / ml gentamicin and 60 μg / ml lincomycin. Hep-2 and Vero cells were added to the wells of a 96-well culture plate, incubated at 37 ^° C in an atmosphere of 5% CO ₂ - 95% air until a monolayer was formed, infected with a virus stock (HSV-1 strain L) with a multiplicity of infection of 0.2 -0.5 infectious units per cell, the compounds were added to the wells of the tablet immediately after the virus was introduced to a final concentration of 0.1 to 100 μg / ml (three wells per concentration) and incubated at 37 ^° C for 1.5 hours in an atmosphere of 5% CO ₂ - 95% air (virus adsorption). At the end of the incubation, a complete growth medium with all additives containing the studied compounds in the same concentrations as during the adsorption of the virus was added to the wells of the plate. Experimental (with the drug) and control (without the drug) infected cells and control uninfected cells (without the drug) were cultured at 37 ^{° C.} in 5% CO ₂ for 4 days. At the end of the incubation, the proportion of viable cells was counted by staining with a gentian violet solution (1.3 g of the dye was dissolved in 50 ml of 96% alcohol, adjusted to 700 ml with distilled water and mixed with 300 ml of 40% formalin). For this, 30 μl of the dye solution was added to the wells of the tablet and left at room temperature for 1.5-2 hours. Then it was washed three times with distilled water, the tablets were dried, and then the optical density was determined at a wavelength of 570 nm. Based on the obtained quantitative data, a dose-dependent curve was constructed (Fig. 2), from which the effective dose (ID ₅₀ ) was determined — the concentration of the compound that 50% protects cells from the cytopathic effect of the virus, which for compound (I) is 0.5 μg / ml on Ner-2 cells. The therapeutic index or selectivity index (IS), calculated as the ratio of cytotoxic dose to effective (CD ₅₀ / ID ₅₀ ), is 40 for compound (I). The antiviral activity of compound (I) for HSV-1 is shown in Table 5. .

Таким образом, новое соединение -N'-{N-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оил]-9-аминононаноил} -3-амино-3-фенилпропионовая кислота - имеет фармакологические преимущества перед известными иммуностимулирующими и противовирусными препаратами тритерпенового ряда. Выраженное иммуностимулирующее действие сочетается с анти-ВИЧ активностью, характеризующейся высоким терапевтическим индексом (2135), а также с активностью соединения в отношении вируса герпеса 1 типа. Кроме того, соединение получают достаточно простым технологичным способом из доступного отечественного сырья - коры березы. Thus, the new compound —N ′ - {N- [3-oxo-20 (29) -lupen-28-oyl] -9-aminononanoyl} -3-amino-3-phenylpropionic acid - has pharmacological advantages over the known immunostimulating and antiviral drugs triterpene series. The pronounced immunostimulating effect is combined with anti-HIV activity, characterized by a high therapeutic index (2135), as well as with the activity of the compound against type 1 herpes virus. In addition, the connection is obtained in a fairly simple technological way from available domestic raw materials - birch bark.

Claims

N '- {N- [3-oxo-20 (29) -lupen-28-oyl] -9-aminononanoyl} -3-amino-3-phenylpropionic acid of the formula (I)

possessing immunostimulating and antiviral activity.