RU2208633C1 - Strain bacillus subtilis p-1 as producer of protease - Google Patents
Strain bacillus subtilis p-1 as producer of protease Download PDFInfo
- Publication number
- RU2208633C1 RU2208633C1 RU2001130859A RU2001130859A RU2208633C1 RU 2208633 C1 RU2208633 C1 RU 2208633C1 RU 2001130859 A RU2001130859 A RU 2001130859A RU 2001130859 A RU2001130859 A RU 2001130859A RU 2208633 C1 RU2208633 C1 RU 2208633C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strain
- protease
- bacillus subtilis
- producer
- strain bacillus
- Prior art date
Links
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 title claims abstract description 24
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 title claims abstract description 21
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 title claims abstract description 20
- 239000004365 Protease Substances 0.000 title claims abstract description 20
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 title claims abstract description 20
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 abstract description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 9
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 abstract description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 abstract 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract 1
- 230000004899 motility Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 7
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 3
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 3
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N Indole Chemical compound C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 2
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen sulfide Chemical compound S RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- 108010040201 Polymyxins Proteins 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 1
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000012041 food component Nutrition 0.000 description 1
- 239000005428 food component Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229910000037 hydrogen sulfide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000010985 leather Substances 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002823 nitrates Chemical class 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- UWYHMGVUTGAWSP-JKIFEVAISA-N oxacillin Chemical compound N([C@@H]1C(N2[C@H](C(C)(C)S[C@@H]21)C(O)=O)=O)C(=O)C1=C(C)ON=C1C1=CC=CC=C1 UWYHMGVUTGAWSP-JKIFEVAISA-N 0.000 description 1
- 229960001019 oxacillin Drugs 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к созданию нового штамма, используемого для получения фермента - протеазы. Протеолитические ферменты широко используются в медицине, в пищевой, сельскохозяйственной, кожевенной промышленности и других отраслях народного хозяйства. Протеолитические ферменты получают в качестве продуктов биосинтетической деятельности из грибов или бактерий. Однако бактерии использовать предпочтительнее, т.к. они имеют более быстрый цикл развития и синтеза протеазы по сравнению с грибами. В связи с этим селекция новых бактериальных штаммов для получения протеаз актуальна и в настоящее время. The invention relates to biotechnology, in particular to the creation of a new strain used to obtain the enzyme - protease. Proteolytic enzymes are widely used in medicine, in the food, agricultural, leather and other industries. Proteolytic enzymes are obtained as products of biosynthetic activity from fungi or bacteria. However, bacteria are preferable to use, because they have a faster cycle of protease development and synthesis compared to fungi. In this regard, the selection of new bacterial strains for proteases is still relevant.
Наиболее близким к заявляемому объекту является штамм Bacillus subtilis ФУ-79, регистрационный ЦМПМВ-1989 (1), один из наиболее сильных продуцентов протеазы. Известный штамм может продуцировать протеазу в количестве 14,7-30 ПЕ/мл, в зависимости от питательной среды, за 38 часов биосинтеза. Closest to the claimed object is a strain of Bacillus subtilis FU-79, registration TsMPMV-1989 (1), one of the most powerful producers of protease. A known strain can produce a protease in an amount of 14.7-30 PE / ml, depending on the nutrient medium, for 38 hours of biosynthesis.
Недостатком этого штамма является длительность процесса культивирования - 38 часов, а также необходимость его выращивания на средах, в которые входят нестандартные пищевые компоненты - кукурузный экстракт, осахаренный крахмал, которые повышают стоимость питательных сред, делают их менее стандартными, а также снижают удельную активность фермента протеазы в культуральной жидкости, поскольку с ними вносится дополнительный белок. The disadvantage of this strain is the duration of the cultivation process - 38 hours, as well as the need for its cultivation on environments that include non-standard food components - corn extract, saccharified starch, which increase the cost of nutrient media, make them less standard, and also reduce the specific activity of the protease enzyme in the culture fluid, as additional protein is introduced with them.
Задачей изобретения является создание нового штамма Bacillus subtilis, способного продуцировать протеазу в промышленных объемах на синтетической питательной среде. The objective of the invention is the creation of a new strain of Bacillus subtilis, capable of producing protease in industrial volumes on a synthetic nutrient medium.
Технический результат, получаемый от использования нового штамма, заключается в получении фермента - протеазы с высокой общей и удельной активностью в культуральной жидкости при сокращении длительности процесса культивирования. The technical result obtained from the use of the new strain is to obtain an enzyme, a protease with high total and specific activity in the culture fluid while reducing the duration of the cultivation process.
Задача решается созданием нового штамма путем селекции из известного штамма Bacillus subtilis 534, регистрационный ВКМВ-1666Д (2), способного к быстрому росту на простых по составу питательных средах. The problem is solved by creating a new strain by selection from the known strain of Bacillus subtilis 534, registration VKMV-1666D (2), capable of rapid growth on simple compositional nutrient media.
Штамм Bacillus subtilis 534 многократно пересевали через питательную среду, содержащую возрастающие концентрации антибиотика. Полученную популяцию антибиотикоустойчивого варианта штамма высевали моноспоровым рассевом на агаризованную среду с казеином для выделения колоний, обладающих высокой продукцией протеазы. В результате селекции выделен штамм Bacillus subtilis P1, обладающий высокой продукцией протеазы на простых по составу синтетических питательных средах. Strain Bacillus subtilis 534 was repeatedly passaged through a nutrient medium containing increasing concentrations of the antibiotic. The resulting population of the antibiotic-resistant variant of the strain was seeded with monospore sieving on an agar medium with casein to isolate colonies with high protease production. As a result of selection, a strain of Bacillus subtilis P1 was isolated, which has high protease production on simple compositional nutrient media.
Для подтверждения генетических различий исходного штамма Bacillus subtilis 534 и селекционированного штамма Bacillus subtilis P1 произведен анализ геномного полиморфизма штаммов Bacillus subtilis 534 и P1 методом концевого мечения рестриктазных фрагментов радиоактивной меткой [а-32Р]ДАТФ с последующим разделением высоковольтным секвенирующим электрофорезом в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (чертеж). На радиоафтографе, представленном на чертеже, можно видеть большое количество общих для штаммов полос. Вместе с тем можно отметить присутствие целого ряда полос, позволяющих выявить имеющиеся различия между исследуемыми штаммами.To confirm the genetic differences between the original Bacillus subtilis 534 strain and the selected Bacillus subtilis P1 strain, the genomic polymorphism of the Bacillus subtilis 534 and P1 strains was analyzed by end-labeling of restriction enzyme fragments with a radioactive label [a- 32 P] DATP followed by separation by high-voltage sequencing genomerizing electrophoresis conditions (drawing). On the radiograph presented in the drawing, you can see a large number of bands common to the strains. At the same time, it is possible to note the presence of a number of bands, allowing to reveal the existing differences between the studied strains.
Для выявления различий между штаммами в уровне продукции протеазы исследовали зоны гидролиза голодного агара с казеином отдельных колоний популяции исходного штамма 534 и нового штамма Р1. Данные сравнительного анализа представлены в табл.1. Изучали также уровни продукции протеазы в культуральной жидкости, полученной путем выращивания штаммов в жидкой питательной среде с аэрацией и перемешиванием. Протеолитическую активность культуральной жидкости определяли по методу Ansona в модификации Петровой И.С. - Винцюкайте М. М. (3). Сравнительные показатели уровней протеолитических активностей культуральной жидкости штаммов Bacillus subtilis 534 и P1 в сравнении с прототипом представлены в табл.1. To identify differences between the strains in the level of protease production, we studied the hydrolysis zones of hungry agar with casein of individual colonies of the population of the
Таким образом, в результате селекции получен новый штамм Bacillus subtilis P1, обладающий высоким уровнем синтеза протеазы и сокращенной длительностью процесса культивирования, что позволяет повысить технологичность процесса получения фермента при использовании штамма Bacillus subtilis P1. Thus, as a result of selection, a new strain of Bacillus subtilis P1 was obtained, which has a high level of protease synthesis and a shorter duration of the cultivation process, which makes it possible to increase the manufacturability of the enzyme production process using the Bacillus subtilis P1 strain.
Штамм хранится в виде лиофильно высушенной культуры в вакуумных ампулах в научной лаборатории государственного унитарного предприятия "Иммунопрепарат" г. Уфы. The strain is stored in the form of freeze-dried culture in vacuum ampoules in the scientific laboratory of the state unitary enterprise "Immunopreparat" in Ufa.
Штамм Bacillus subtilis P1 характеризуется следующими свойствами. The strain of Bacillus subtilis P1 is characterized by the following properties.
Культурально-морфологические свойства. Cultural and morphological properties.
Вегетативные клетки-палочки овоидной формы с размерами (7-1,3)х((0,5) мкм, расположены отдельно или небольшими цепочками. Образуют внутренние центральные споры овальной формы. В популяции жгутики лофотрихиальные и перитрихиальные. Колонии на мясопептонном агаре плоские, слегка блестящие, белого цвета с ровными краями. На мясопептонном бульоне при температуре 37oС через 18-24 ч наблюдается равномерное помутнение бульона. Аэроб, грамположительный, обладает подвижностью, оптимальные условия роста при температуре 37oС и рН 6,0-7,5.Vegetative stick cells of an ovoid shape with sizes of (7-1.3) x ((0.5) microns, located separately or in small chains. Form internal central spores of an oval shape. In the population of flagella, lofotrichial and peritrichous. Colonies on meat and peptone agar are flat, slightly shiny, white in color with smooth edges. On the meat and peptone broth at a temperature of 37 o C after 18-24 hours there is a uniform clouding of the broth. Aerob, gram-positive, has mobility, optimal growth conditions at a temperature of 37 o C and pH 6.0-7, 5.
Биохимические свойства. Biochemical properties.
Не растет в анаэробных условиях, гидролизует мочевину и крахмал, разжижает желатину. Дает положительную реакцию Фогес-Проскауэра. Ферментирует глюкозу, сахарозу, мальтозу, маннит, лактозу. Редуцирует нитраты. Продуцирует каталазу, протеазу. Не обладает лецитиназной активностью. Образует аммиак и сероводород, не образует индол. It does not grow under anaerobic conditions, hydrolyzes urea and starch, liquefies gelatin. Gives a positive reaction of Voges-Proskauer. Ferments glucose, sucrose, maltose, mannitol, lactose. Reduces nitrates. Produces catalase, a protease. It does not have lecithinase activity. Forms ammonia and hydrogen sulfide, does not form indole.
Антибиотикоустойчивость
Определение чувствительности штамма к антибиотикам изучали диско-диффузионным методом, используя стандартные диски, пропитанные антибиотиками. Штамм высевали на агаризованную питательную среду и раскладывали диски с антибиотиками, по 5 на чашку Петри. Посевы инкубировали при температуре 37oС в течение 24 ч. Устойчивыми считали штамм при отсутствии задержки роста антибиотиком.Antibiotic resistance
The determination of the sensitivity of the strain to antibiotics was studied by the disk diffusion method using standard disks impregnated with antibiotics. The strain was plated on an agar medium and 5 antibiotic discs were placed on a Petri dish. Crops were incubated at a temperature of 37 o C for 24 hours. Stable was considered a strain in the absence of growth inhibition by antibiotic.
Штамм обладает устойчивостью к пенициллину, карбенициллину, ампициллину, оксациллину, полимиксину. The strain is resistant to penicillin, carbenicillin, ampicillin, oxacillin, polymyxin.
Вирулентность
Культура штамма В. subtilis P1 была проверена на вирулентность. Для исследования вирулентности штамм выращивали на мясо-пептонном агаре в течение 24 ч при температуре 37oС. Выросшую биомассу смывали 0,9%-ным раствором натрия хлорида и готовили бактериальные суспензии с концентрацией клеток от 0,5 до 5,0 млрд/ в мл. Полученные суспензии вводили белым беспородным мышам массой (16±1) г двумя способами: однократно внутрибрюшинно и пятикратно перорально (по одной дозе ежедневно в течение 5 дней). Результаты испытаний представлены в табл.2.Virulence
The culture of B. subtilis P1 strain was tested for virulence. To study virulence, the strain was grown on meat-peptone agar for 24 hours at a temperature of 37 o C. The grown biomass was washed with 0.9% sodium chloride solution and bacterial suspensions were prepared with cell concentrations from 0.5 to 5.0 billion / v ml The resulting suspensions were administered to white mongrel mice weighing (16 ± 1) g in two ways: once intraperitoneally and five times orally (one dose daily for 5 days). The test results are presented in table.2.
Наблюдения за животными проводили на протяжении 5 суток после окончания курса инъекций или перорального введения. В этот период все животные оставались активными, хорошо поедали пищевые рационы, прибавляли в весе, физиологические отправления и поведенческие реакции у них не изменялись. Полученные данные свидетельствуют о безопасности штамма Bacillus subtilis P1. Observations of animals were carried out for 5 days after the end of the course of injections or oral administration. During this period, all animals remained active, ate well-fed diets, gained weight, physiological functions and behavioral reactions did not change. The data obtained indicate the safety of the strain Bacillus subtilis P1.
Штамм Bacillus subtilis P1 использовали для получения протеолитического фермента. The strain Bacillus subtilis P1 was used to obtain a proteolytic enzyme.
Изобретение характеризуется следующими примерами. The invention is characterized by the following examples.
Пример 1. Штамм выращивали путем периодического гомогенного глубинного культивирования в ферментере АК-10 с объемом питательной среды - 8 л. Для выращивания штамма Bacillus subtilis P1, с целью получения протеазы используют синтетическую питательную среду, содержащую минеральные соли, в качестве источника азота - мочевину, в качестве источника углерода - мальтозу. Example 1. The strain was grown by periodic homogeneous deep cultivation in an AK-10 fermenter with a volume of nutrient medium - 8 l. To grow a strain of Bacillus subtilis P1, in order to obtain a protease, a synthetic nutrient medium containing mineral salts is used, urea as a nitrogen source, and maltose as a carbon source.
Посевной материал получали выращиванием штамма Bacillus subtilis P1 во флаконах при температуре 37oС в течение 16-18 ч в жидкой питательной среде того же состава, что и для культивирования. Полученный посевной материал, вносят в объеме 1% от объема питательной среды в ферментере. Ферментацию ведут при температуре 37oС с аэрацией в течение 24 ч. В результате культивирования получено 6 л ферментсодержащей культуральной жидкости с активностью протеазы 28-32 ПЕ/мл и удельной активностью (20,0±2,0) ПЕ/мг белка.Inoculum was obtained by growing a strain of Bacillus subtilis P1 in vials at a temperature of 37 o C for 16-18 hours in a liquid nutrient medium of the same composition as for cultivation. The resulting seed, contribute in the amount of 1% of the volume of the nutrient medium in the fermenter. Fermentation is carried out at a temperature of 37 o With aeration for 24 hours. As a result of cultivation, 6 l of enzyme-containing culture fluid with a protease activity of 28-32 PE / ml and specific activity (20.0 ± 2.0) PE / mg of protein were obtained.
Пример 2. Штамм выращивали путем периодического гомогенного глубинного культивирования в реакторе Биор-100 с объемом питательной среды - 70 л. Питательная среда и подготовка маточного штамма, как в примере 1. Example 2. The strain was grown by periodic homogeneous deep cultivation in a Bior-100 reactor with a volume of nutrient medium - 70 l. Culture medium and preparation of the uterine strain, as in example 1.
Полученный посевной материал, вносят в объеме 1% от объема питательной среды в реакторе "Биор - 100". Ферментацию ведут при температуре 37oС с аэрацией в течение 24 ч. В результате культивирования получено 60 л ферментсодержащей культуральной жидкости с активностью протеазы 30±2 ПЕ/мл удельной активностью (20,0±2,0) ПЕ/мг белка.The resulting seed, contribute in the amount of 1% of the volume of the nutrient medium in the reactor "Bior - 100". Fermentation is carried out at a temperature of 37 ° C. with aeration for 24 hours. As a result of cultivation, 60 l of an enzyme-containing culture fluid with a protease activity of 30 ± 2 PE / ml specific activity (20.0 ± 2.0) PE / mg protein were obtained.
Источники литературы
1. А.с. 885253, кл. МКИ3 С 12 N 9/28, 30.11.81.Sources of literature
1. A.S. 885253, cl. MKI 3 C 12 N 9/28, 11/30/81.
2. Никитенко В.И. Бактериальный препарат для профилактики и лечения воспалительных процессов и аллергических заболеваний// Международная заявка. N 89/09607, WO, 19.10.1989. 2. Nikitenko V.I. Bacterial drug for the prevention and treatment of inflammatory processes and allergic diseases // International application. N 89/09607, WO, 10.19.1989.
3. Петрова И.С., Винцюнайте М.М. Определение протеолитической активности ферментных препаратов микробиологического происхождения //Прикладная биохимия и микробиология. - 1966. - N 2. -С. 322-327. 3. Petrova I.S., Vintsiunaite M.M. Determination of the proteolytic activity of enzyme preparations of microbiological origin // Applied Biochemistry and Microbiology. - 1966. - N 2. -C. 322-327.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2001130859A RU2208633C1 (en) | 2001-11-14 | 2001-11-14 | Strain bacillus subtilis p-1 as producer of protease |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2001130859A RU2208633C1 (en) | 2001-11-14 | 2001-11-14 | Strain bacillus subtilis p-1 as producer of protease |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2001130859A RU2001130859A (en) | 2003-06-20 |
| RU2208633C1 true RU2208633C1 (en) | 2003-07-20 |
Family
ID=29210895
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2001130859A RU2208633C1 (en) | 2001-11-14 | 2001-11-14 | Strain bacillus subtilis p-1 as producer of protease |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2208633C1 (en) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2285038C2 (en) * | 2004-10-26 | 2006-10-10 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Научно-производственное объединение по медицинским иммунобиологическим препаратам "Микроген" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for preparing proteolytic enzyme preparation and proteolytic enzyme preparation |
| RU2298032C2 (en) * | 2005-04-19 | 2007-04-27 | Государственное учреждение Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова Российской академии медицинских наук (ГУ НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН) | Bacillus subtilis 1719 BACTERIUM STRAIN AS PRODUCER OF ANTAGONISTICALLY ACTIVE BIOMASS IN RELATES TO PATHOGENIC MICROORGANISMS, AS WELL AS PROTEOLYTIC, AMYLOLYTIC, AND LIPOLYTIC ENZYMES |
| RU2315096C1 (en) * | 2006-07-04 | 2008-01-20 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт пищевой биотехнологии Российской академии сельскохозяйственных наук | FUNGUS STRAIN ASPERGILLUS ORYZAE AS PRODUCER OF COMPLEX OF PEPTIDASES, β-GLUCANASE, α-AMYLASE AND XYLANASE |
| RU2315097C1 (en) * | 2006-07-04 | 2008-01-20 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт пищевой биотехнологии Российской академии сельскохозяйственных наук | Fungus strain aspergillus oryzae as producer of acid proteases and xylanase |
| RU2315098C1 (en) * | 2006-07-04 | 2008-01-20 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт пищевой биотехнологии Российской академии сельскохозяйственных наук | Fungus strain aspergillus oryzae as producer of acid and subacid proteases |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1723116A1 (en) * | 1988-04-15 | 1992-03-30 | Оренбургский Государственный Медицинский Институт | Strain of bacteria bacillus subtilis, used for producing of preparation for prophylaxis and treatment of inflammatory process and allergic diseases |
| RU2112035C1 (en) * | 1997-01-23 | 1998-05-27 | Государственное предприятие Научно-Производственное Объединение "Иммунопрепарат" | Method of preparing proteolytic enzymes from bacteria of genus bacillus |
-
2001
- 2001-11-14 RU RU2001130859A patent/RU2208633C1/en active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1723116A1 (en) * | 1988-04-15 | 1992-03-30 | Оренбургский Государственный Медицинский Институт | Strain of bacteria bacillus subtilis, used for producing of preparation for prophylaxis and treatment of inflammatory process and allergic diseases |
| RU2112035C1 (en) * | 1997-01-23 | 1998-05-27 | Государственное предприятие Научно-Производственное Объединение "Иммунопрепарат" | Method of preparing proteolytic enzymes from bacteria of genus bacillus |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Биосинтез микроорганизмами нуклеаз и протеаз. - М.: Наука, 1979, с.217-221. * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2285038C2 (en) * | 2004-10-26 | 2006-10-10 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Научно-производственное объединение по медицинским иммунобиологическим препаратам "Микроген" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for preparing proteolytic enzyme preparation and proteolytic enzyme preparation |
| RU2298032C2 (en) * | 2005-04-19 | 2007-04-27 | Государственное учреждение Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова Российской академии медицинских наук (ГУ НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН) | Bacillus subtilis 1719 BACTERIUM STRAIN AS PRODUCER OF ANTAGONISTICALLY ACTIVE BIOMASS IN RELATES TO PATHOGENIC MICROORGANISMS, AS WELL AS PROTEOLYTIC, AMYLOLYTIC, AND LIPOLYTIC ENZYMES |
| RU2315096C1 (en) * | 2006-07-04 | 2008-01-20 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт пищевой биотехнологии Российской академии сельскохозяйственных наук | FUNGUS STRAIN ASPERGILLUS ORYZAE AS PRODUCER OF COMPLEX OF PEPTIDASES, β-GLUCANASE, α-AMYLASE AND XYLANASE |
| RU2315097C1 (en) * | 2006-07-04 | 2008-01-20 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт пищевой биотехнологии Российской академии сельскохозяйственных наук | Fungus strain aspergillus oryzae as producer of acid proteases and xylanase |
| RU2315098C1 (en) * | 2006-07-04 | 2008-01-20 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт пищевой биотехнологии Российской академии сельскохозяйственных наук | Fungus strain aspergillus oryzae as producer of acid and subacid proteases |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hsu et al. | Conversion of shrimp heads to α-glucosidase inhibitors via co-culture of Bacillus mycoides TKU040 and Rhizobium sp. TKU041 | |
| CN116496950A (en) | Lysine production strain and application thereof, and lysine production method | |
| RU2208633C1 (en) | Strain bacillus subtilis p-1 as producer of protease | |
| Sura et al. | Isolation of Bacillus megaterium and its commercial importance | |
| Hudson et al. | Thermonema lapsum gen. nov., sp. nov., a thermophilic gliding bacterium | |
| JP4388824B2 (en) | Product | |
| RU94026123A (en) | Method of preparation probiotic preparing | |
| KR20150101789A (en) | Bacillus subtilis BK418 strain having complex enzyme productivity and antifungal activity and uses thereof | |
| CN103667107B (en) | A kind of manure enterococcin strain producing Pfansteihl | |
| RU2169767C1 (en) | Strain of bacterium bacillus subtilis showing broad spectrum of antagonistic activity and resistance to antibiotics | |
| RU2802575C1 (en) | Streptomyces baarnensis, a new daptomycin producer | |
| Ogunnusi et al. | Isolation and identification of Proteolytic and Lipolytic Bacteria in cow dung and abattoir effluent from Ekiti general abattoir, Ekiti state, Nigeria | |
| Gafforova et al. | SCREENING BACTERIAL STRAINS OF BACILLUS GENERATION BY PROTEASE ACTIVITY | |
| RU2175350C1 (en) | Strain serratia proteamaculans 94 as producer of collagenase | |
| RU2684220C1 (en) | Strain clostridium histolyticum - producer of collagenase | |
| Kurniatanty et al. | Enzymatic Activity of Protease Producing Bacteria from Tofu Waste | |
| RU2670054C1 (en) | BIFIDOBACTERIUM BIFIDUM ICIS-310 BACTERIUM STRAIN - PRODUCER OF INHIBITOR OF PRO-INFLAMMATORY CYTOKINE INF-γ | |
| RU97101201A (en) | METHOD FOR PRODUCING PROTEOLYTIC ENZYMES FROM BACILLUS BACTERIA | |
| Mukriani et al. | Production and characterization of L-Asparaginase enzyme from symbiont bacteria of red algae Eucheuma spinosum | |
| KR19980025285A (en) | Mass production method using novel Bacillus subtilis SY8-24 (KFCC-11027) and soybean meal | |
| RU2722071C1 (en) | Nutrient medium for cultivation of bacillus subtilis vkpm b-12079 | |
| RU2158302C2 (en) | Nutrient medium for bifidobacterium and lactobacterium culturing | |
| Santoyo et al. | Growth kinetics of L-aminoacylase-producing Pseudomonas sp. BA2 | |
| RU2403283C2 (en) | Staphylococcus epidermidis bvm-1987 strain - producer of staphylolytic enzymic complex | |
| Pourmolaei et al. | Isolation and Identification of L-Asparaginase Producing Bacteria and From Forest Soil of Western Mazandaran |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC43 | Official registration of the transfer of the exclusive right without contract for inventions |
Effective date: 20180328 |
|
| PD4A | Correction of name of patent owner |