RU2207369C2

RU2207369C2 - Method for preparing cultures of unicellular microorganism cells

Info

Publication number: RU2207369C2
Application number: RU2000100866A
Authority: RU
Inventors: Л.Г. Вячеславов; Э.Н. Казбеков
Original assignee: Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова РАН; Вячеславов Лев Георгиевич; Казбеков Эмбек Николаевич
Priority date: 2000-01-11
Filing date: 2000-01-11
Publication date: 2003-06-27

Abstract

FIELD: microbiology, biotechnology. SUBSTANCE: invention involves culturing cells of unicellular microorganisms in liquid or solid nutrient medium. Preliminary the package containing parallel oriented microfibers made of glass or other water- -wetting material is placed into medium. Method provides preparing cultures of uniformly oriented cells of unicellular microorganisms. EFFECT: improved preparing method. 2 dwg

Description

Настоящее изобретение относится к микробиологии, точнее к способам выращивания культур микроорганизмов. The present invention relates to microbiology, more specifically to methods of growing cultures of microorganisms.

Известен способ выращивания клеток микроорганизмов в жидкой питательной среде [1] при стационарном культивировании в заданном незаменяемом объеме питательной среды или при проточном культивировании (в хемостате), когда в хемостат подается чистая питательная среда и в то же время из него отводится такой же объем питательной среды с размножившимися микроорганизмами, в результате чего устанавливается динамическое равновесие, и непрерывный отбор биомассы микроорганизмов компенсируется ее приростом. Очевидно, что в жидкой питательной среде, где непрерывно происходят свободное конвекционное перемешивание слоев питательной среды и диффузионное перемещение отдельных клеток, последние всегда ориентированы относительно друг друга случайным образом, эта ориентация непрерывно меняется и взаимная однородная ориентация клеток микроорганизмов отсутствует. A known method of growing cells of microorganisms in a liquid nutrient medium [1] during stationary cultivation in a given irreplaceable volume of nutrient medium or during continuous cultivation (in a chemostat), when a clean nutrient medium is supplied to the chemostat and at the same time the same volume of nutrient medium is removed from it with multiplied microorganisms, as a result of which a dynamic equilibrium is established, and the continuous selection of the biomass of microorganisms is compensated by its growth. Obviously, in a liquid nutrient medium, where free convection mixing of the layers of the nutrient medium and diffusion movement of individual cells continuously occur, the latter are always randomly oriented relative to each other, this orientation is constantly changing, and there is no mutual homogeneous orientation of microorganism cells.

Известен способ выращивания клеток на поверхности твердых питательных сред, когда клетки помещают для размножения на поверхность среды и питательные вещества поступают к высеянным на поверхность среды клеткам за счет диффузии из толщин твердой среды. В этом случае клеточная биомасса представляет собой пласт или отдельные колонии со слоистой структурой, состоящей из отдельных неподвижных клеток, которые в слабой степени могут быть ориентированы относительно ближайших соседей (ближний порядок) и ориентированы совершенно случайным образом относительно большинства остальных клеток (дальний порядок) [2]. A known method of growing cells on the surface of solid nutrient media, when the cells are placed for propagation on the surface of the medium and nutrients enter the cells sown on the surface of the medium due to diffusion from the thickness of the solid medium. In this case, the cell biomass is a layer or separate colonies with a layered structure consisting of separate motionless cells, which can be weakly oriented relative to the nearest neighbors (short-range order) and randomly oriented with respect to most other cells (long-range order) [2 ].

Известен также способ выращивания некоторых одноклеточных микроорганизмов (и культур дедифференцированных клеток многоклеточных организмов) в жидких питательных средах на помещенных в эти среды твердых сферических гранулах - стеклянных или сформированных из синтетических или природных полимеров (например, декстрана). При этом происходит адгезия клеток из жидкой питательной среды и их рост на поверхности гранул [3]. В этом случае клетки на поверхности каждой гранулы остаются неподвижными относительно поверхности гранулы, однако при этом они располагаются на поверхности гранулы случайным образом, и какая-либо однородная ориентация клеток относительно друг друга на поверхности каждой гранулы отсутствует. Более того, все гранулы произвольным образом перемещаются и вращаются относительно друг друга в жидкой питательной среде. Таким образом, и при этом способе культивирования нет однородной ориентации клеток относительно друг друга. There is also known a method of growing certain unicellular microorganisms (and cultures of dedifferentiated cells of multicellular organisms) in liquid nutrient media on solid spherical granules placed in these media - glass granules or formed from synthetic or natural polymers (for example, dextran). In this case, the cells adhere from the liquid nutrient medium and grow on the surface of the granules [3]. In this case, the cells on the surface of each granule remain stationary relative to the surface of the granule, however, they are randomly located on the surface of the granule, and there is no uniform orientation of the cells relative to each other on the surface of each granule. Moreover, all granules arbitrarily move and rotate relative to each other in a liquid nutrient medium. Thus, and with this method of cultivation there is no uniform orientation of the cells relative to each other.

Наиболее близким техническим решением является способ культивирования на твердой питательной среде, когда отдельные клетки биомассы неподвижны относительно среды и относительно друг друга. Этим обеспечивается неизменность ориентации клеток данного образца на твердой питательной среде относительно направления внешнего ориентированного поля при заданном положении образца. Однако при этом, как указывалось выше невозможно достигнуть однородной ориентации клеток относительно друг друга и, следовательно, одинаковой ориентации всех клеток относительно направления внешнего ориентированного поля [2]. The closest technical solution is a method of cultivation on a solid nutrient medium, when individual biomass cells are stationary relative to the medium and relative to each other. This ensures the invariance of the orientation of the cells of a given sample on a solid nutrient medium relative to the direction of the external oriented field at a given position of the sample. However, in this case, as indicated above, it is impossible to achieve a uniform orientation of cells relative to each other and, therefore, the same orientation of all cells relative to the direction of an external oriented field [2].

Тем не менее, в ряде случаев, например, при изучении воздействия внешних ориентированных полей, в том числе электромагнитных, на биомембраны, требуется полностью однородная или близкая к однородной взаимная ориентация неподвижных отдельных клеток (например, бактерий и других микроорганизмов). В этом случае поворотом препарата с клетками и фиксацией его в определенном положении можно задавать различную выбранную ориентацию клеток и клеточных мембран относительно ориентации внешнего поля и изучать эффекты взаимной ориентации клеток и поля. Nevertheless, in a number of cases, for example, when studying the effect of external oriented fields, including electromagnetic ones, on biomembranes, a completely homogeneous or close to homogeneous mutual orientation of stationary individual cells (for example, bacteria and other microorganisms) is required. In this case, by turning the preparation with the cells and fixing it in a certain position, one can set various selected orientations of the cells and cell membranes with respect to the orientation of the external field and study the effects of the mutual orientation of the cells and the field.

Задачей данного изобретения является создание способа получения культур однородно ориентированных клеток одноклеточных микроорганизмов. Решение поставленной задачи достигается тем, что в известном способе получения культур клеток одноклеточных микроорганизмов, заключающемся в культивировании клеток микроорганизмов в питательной среде, новым является то, что в питательную среду вводят пакет из параллельно ориентированных микроволокон, выполненных из стекла или другого смачиваемого водой материала. На фиг. 1 представлена схема заявляемого способа, где в питательной среде (1) с внесенными в нее клетками одноклеточных микроорганизмов (3) и пакетом микроволокон (2) последние адсорбируют клетки (3) одинаковым образом, а именно с ориентацией их длинной оси вдоль оси микроволокон (2) за счет адгезии и сил поверхностного натяжения на границе раздела "волокно-жидкость" (а). При размножении клеток в этих условиях их однородная ориентация сохраняется (б). The objective of the invention is to provide a method for producing cultures of uniformly oriented cells of unicellular microorganisms. The solution to this problem is achieved by the fact that in the known method for producing cell cultures of unicellular microorganisms, which consists in cultivating microorganism cells in a nutrient medium, it is new that a packet of parallel oriented microfibers made of glass or other material wetted with water is introduced into the nutrient medium. In FIG. 1 shows a diagram of the proposed method, where in a nutrient medium (1) with introduced cells of unicellular microorganisms (3) and a packet of microfibers (2), the latter adsorb cells (3) in the same way, namely with the orientation of their long axis along the axis of microfibers (2 ) due to adhesion and surface tension forces at the fiber-liquid interface (a). When cells multiply under these conditions, their uniform orientation is preserved (b).

Предлагаемый способ позволяет получить однородно ориентированные клетки одноклеточных микроорганизмов. Применение микроволокон для решения вышеуказанной задачи не известно. Ранее для решения подобной задачи использовались ткани многоклеточных организмов, состоящие из естественно однородно ориентированных клеток, например клеток хориоидного сплетения мозга млекопитающих [4]. The proposed method allows to obtain uniformly oriented cells of unicellular microorganisms. The use of microfibers to solve the above problem is not known. Earlier, to solve this problem, tissues of multicellular organisms were used, consisting of naturally uniformly oriented cells, for example, mammalian brain choroid plexus cells [4].

В заявляемом способе клетки одноклеточных микроорганизмов культивируют в жидкой или твердой питательной среде, причем эта питательная среда (1) с внесенными в нее клетками одноклеточных микроорганизмов пропитывает пакет (2) из параллельно ориентированных микроволокон, выполненных из стекла или другого смачиваемого водой материала и имеющих сечение любой формы, преимущественно круглое. За счет адгезии на поверхности волокон и сил поверхностного натяжения на границе раздела "волокно-жидкость" клетки (3) прикрепляются к поверхности волоки параллельно их продольной оси. При делении образующиеся клетки-потомки также остаются адгезированными на поверхности микроволокон и сохраняют ту же ориентацию. В результате получается культура однородно ориентированных клеток одноклеточных микроорганизмов. In the inventive method, the cells of unicellular microorganisms are cultured in a liquid or solid nutrient medium, and this nutrient medium (1) with the introduced cells of unicellular microorganisms impregnates a packet (2) of parallel oriented microfibers made of glass or other material wetted by water and having a cross section of any forms, mainly round. Due to adhesion on the fiber surface and surface tension forces at the fiber-liquid interface, cells (3) are attached to the fiber surface parallel to their longitudinal axis. During division, the resulting progeny cells also remain adhered to the surface of the microfibers and maintain the same orientation. The result is a culture of uniformly oriented cells of unicellular microorganisms.

В случае использования твердой среды, например на основе агар-агара, пакет микроволокон пропитывается питательной средой с внесенными в нее клетками за счет капиллярных сил, возникающих в пакете из-за малого зазора между отдельными микроволокнами. In the case of using a solid medium, for example, based on agar-agar, a packet of microfibers is impregnated with a nutrient medium with cells introduced into it due to the capillary forces arising in the packet due to the small gap between the individual microfibers.

Поворотом и различным расположением емкости с микроволокнами в питательной среде может быть задана любая выбранная ориентация клеток относительно ориентации внешнeгo поля. Состав питательной среды не имеет принципиального значения. By rotation and different arrangement of the container with microfibers in the nutrient medium, any selected orientation of the cells relative to the orientation of the external field can be set. The composition of the nutrient medium is not critical.

Способ был апробирован на примере клеток кишечной палочки Escherichia coli. Суспензией клеток в питательной жидкой среде пропитывали пакет микроволокон (стекловолокно), представляющий собой жгут, втянутый в стеклянную трубку, чтобы избежать высыхания препарата во время инкубирования в термостате. Исходная концентрация клеток в жидкой среде составляла от 10⁵ до 10⁶ 1/мл среды. Инкубирование прекращали по достижении концентрации размножившихся клеток, равной от 10⁷ до 10⁸ 1/мл. Образец помещали под микроскоп и фотографировали. Как следует из фиг. 2, размножившиеся клетки в культуре расположены в виде тяжей, параллельных отдельным микроволокнам.The method was tested on the example of Escherichia coli E. coli cells. A suspension of cells in a nutrient liquid medium was impregnated with a packet of microfibers (glass fiber), which is a bundle drawn into a glass tube to prevent the preparation from drying out during incubation in an incubator. The initial concentration of cells in a liquid medium was from 10 ⁵ to 10 ⁶ 1 / ml of medium. Incubation was stopped after reaching a concentration of multiplying cells equal to from 10 ⁷ to 10 ⁸ 1 / ml The sample was placed under a microscope and photographed. As follows from FIG. 2, the multiplied cells in the culture are located in the form of strands parallel to individual microfibres.

ЛИТЕРАТУРА
1. Методы общей бактериологии. Изд-во "Мир", М., 1983. Т. 1, с. 374-441.LITERATURE
1. Methods of general bacteriology. Publishing house "Mir", M., 1983. T. 1, p. 374-441.

2. Методы общей бактериологии. Изд-во "Мир" М., 1983. Т. 1, с. 356-373. 2. Methods of general bacteriology. Publishing house "Mir" M., 1983. T. 1, p. 356-373.

3. "Cell Culture Reagents". Sigma Corp. Issue. 1990, p. 97. 3. "Cell Culture Reagents". Sigma corp. Issue. 1990, p. 97.

4. Бреслер С.Е., Бреслер В М., Васильева Н.Н, Казаков Э.Н. ДАН. 1978, т. 242, с. 465-468. 4. Bresler S.E., Bresler V.M., Vasiliev N.N., Kazakov E.N. DAN. 1978, v. 242, p. 465-468.

Claims

A method of producing cell cultures of unicellular microorganisms, which consists in cultivating cells of unicellular microorganisms in a nutrient medium, characterized in that a packet of parallel oriented microfibers made of glass or other material wetted with water is introduced into a liquid or solid nutrient medium.