RU2205652C1 - Method for isolating arboviruses, tick- borne encephalitis, in paticular - Google Patents

Method for isolating arboviruses, tick- borne encephalitis, in paticular

Info

Publication number
RU2205652C1
RU2205652C1 RU2001128341/14A RU2001128341A RU2205652C1 RU 2205652 C1 RU2205652 C1 RU 2205652C1 RU 2001128341/14 A RU2001128341/14 A RU 2001128341/14A RU 2001128341 A RU2001128341 A RU 2001128341A RU 2205652 C1 RU2205652 C1 RU 2205652C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
infection
suspension
brain
animals
arboviruses
Prior art date
Application number
RU2001128341/14A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Г.Н. Леонова
В.Г. Борисевич
Original Assignee
Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии СО РАМН
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии СО РАМН filed Critical Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии СО РАМН
Priority to RU2001128341/14A priority Critical patent/RU2205652C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2205652C1 publication Critical patent/RU2205652C1/en

Links

Images

Classifications

    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02ATECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

FIELD: medicine, virology. SUBSTANCE: the resent innovation deals with virological diagnostics of arboviral infections, tick-borne encepalitis, in particular. One should collect infection-suspicious material, its preparation for trial and isolation of arboviruses due to combined infectioning in 1-3-d-aged experimental animals both into brain and subcutaneously with suspension of this material. In animals with manifestation form of infection one should sample brain to prepare suspension and conduct the next 3-4-fold passages into brain of experimental animals with this suspension to accumulate neurotropic viruses being in sufficient quantity for identification. In animals with inapparatus form of infection one should additionally study neuro- and immunocompetent organs by well- known immunoenzymatic method on 7th, 14th, 21st d. Samples for immunocompetent organs at the presence of positive test for antigen of arboviruses should be selected to prepare suspension, then one should carry out 3-5-fold passages due to infecting experimental animals with this suspension to store immunotropic viruses at sufficient quantity for identification. EFFECT: increased number of diagnostic methods in case of arboviral infection. 2 tbl

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к вирусологии, и может использоваться для вирусологической диагностики арбовирусных инфекций, в частности клещевого энцефалита. The invention relates to medicine, namely to virology, and can be used for virological diagnosis of arbovirus infections, in particular tick-borne encephalitis.

Известен способ выделения арбовирусов (патент РФ 1836422 A3, МКИ 5 С 12 N 7/00, от 23.04.91), включающий забор крови у больных и у лиц с укусом клеща, выделение лейкоцитарной массы крови, освобождение от ингибиторов и последующего 2-кратного пассажа на монослой культуры клеток СПЭВ. A known method of isolation of arboviruses (RF patent 1836422 A3, MKI 5 C 12 N 7/00, 04/23/91), including blood sampling in patients and in persons with a tick bite, isolation of leukocyte blood mass, release from inhibitors and the subsequent 2-fold passage to the monolayer cell culture SPEV.

Недостатком данного способа является низкий процент изоляции вируса за счет использования культуры клеток СПЭВ, на которой не выделяются невирулентные штаммы вируса. The disadvantage of this method is the low percentage of isolation of the virus due to the use of cell culture SPEV, which does not secrete non-virulent virus strains.

Наиболее близким по технической сущности является способ выделения арбовирусов (Итоги науки и техники. Серия Вирусология, т.25, М., 1991, с. 22-27), включающий сбор подозрительного на зараженность материала, подготовку его к исследованию и выделение высоковирулентных штаммов арбовирусов путем внутримозгового и подкожного заражения 1-3-дневных подопытных животных 10%- ной суспензией исследуемого материала с последующим отбором заболевших животных, забором у них мозга и 3-4-кратных пассажей для накопления в мозге нейротропных вирусов в достаточном количестве. The closest in technical essence is the method of isolation of arboviruses (Results of science and technology. Virology series, v.25, M., 1991, pp. 22-27), including the collection of suspicious material for infection, preparing it for research and isolation of highly virulent strains of arboviruses by intracerebral and subcutaneous infection of 1-3-day-old experimental animals with a 10% suspension of the test material, followed by selection of diseased animals, taking the brain from them and 3-4-fold passages to accumulate neurotropic viruses in the brain in sufficient quantity.

Недостатком данного способа является низкий процент изоляции вируса за счет выделения только высоковирулентных нейротропных штаммов. The disadvantage of this method is the low percentage of virus isolation due to the isolation of only highly virulent neurotropic strains.

Задачей данного изобретения является повышение качественных и количественных показателей вирусологической диагностики за счет выделения не только высоковирулентных, но и слабовирулентных штаммов арбовирусов, в частности клещевого энцефалита. The objective of the invention is to increase the qualitative and quantitative indicators of virological diagnostics by isolating not only highly virulent, but also weakly virulent strains of arboviruses, in particular tick-borne encephalitis.

Задача решается следующим образом:
- сбор подозрительного на зараженность материала,
- подготовка его к исследованию,
- выделение вируса за счет комбинированного заражения в мозг и под кожу 1-3-дневных подопытных животных,
- отбор животных с манифестной формой инфекции,
- забор у них мозга и последующий 3-5-кратный пассаж для накопления в мозге нейротропных вирусов в достаточном количестве для его идентификации,
- исследование мозга и селезенки, животных с инаппарантной формой инфекции известным способом в иммуноферментном анализе (ИФА) на 7, 14, 21-е сутки,
- отбор проб с наличием положительного теста на антиген арбовирусов,
- проведение последующих 3-5-кратных пассажей для накопления иммунотропных вирусов в достаточном количестве для их идентификации.
The problem is solved as follows:
- collection of material suspicious of contamination,
- preparing him for research,
- virus isolation due to combined infection in the brain and under the skin of 1-3-day-old experimental animals,
- selection of animals with a manifest form of infection,
- the fence of their brain and the subsequent 3-5-fold passage for the accumulation of neurotropic viruses in the brain in sufficient quantity to identify it,
- a study of the brain and spleen, animals with an inapparent form of infection in a known manner in the enzyme immunoassay (ELISA) on the 7th, 14th, 21st day,
- sampling with the presence of a positive test for arbovirus antigen,
- Conducting subsequent 3-5-fold passages for the accumulation of immunotropic viruses in sufficient quantities for their identification.

Сущность способа заключается в следующем. В качестве исследуемого материала могут быть использованы:
- непосредственные носители арбовирусов - клещи, комары и др.;
- кровь лиц с "укусом" насекомых и клещей;
- лейкоцитарная масса крови людей и животных;
- кровь и органы больных людей и животных с подозрением на инфицирование арбовирусами.
The essence of the method is as follows. As the test material can be used:
- direct carriers of arboviruses - ticks, mosquitoes, etc .;
- blood of persons with a “bite” of insects and ticks;
- leukocyte mass of blood of people and animals;
- blood and organs of sick people and animals with suspected infection with arboviruses.

Исследуемый материал готовят в соответствии с общепринятыми методиками. Для выделения арбовирусов производят заражение 1-3-дневных белых мышей или других подопытных животных, в частности новорожденных хомячков, сосунков крыс или морских свинок, комбинированно внутримозговым и подкожным способами. Материал проб, способный пассироваться через мозг белых мышей и вызывать у них клинику заболевания, обладает нейровирулентными свойствами. Мозг этих мышей принимают за типичный нейротропный штамм. The test material is prepared in accordance with generally accepted methods. To isolate arboviruses, 1-3 days old white mice or other experimental animals are infected, in particular, newborn hamsters, rat suckers or guinea pigs, combined by intracerebral and subcutaneous methods. Sample material that can pass through the brains of white mice and cause a clinic of the disease in them has neurovirulent properties. The brain of these mice is mistaken for a typical neurotropic strain.

У животных, зараженных пробами, которые не вызывают заболевание, мозг и селезенку исследуют известным способом в иммуноферментном анализе (ИФА). Пробами, давшими положительный результат в ИФА, комбинированно внутримозговым и подкожным способами заражают 2-дневных белых мышей. За зараженными животными ведется наблюдение в течение 2-3 недель. У этих мышей обследуют мозг и селезенку в ИФА на 7, 14 и 21-е сутки наблюдения. Мозг клинически здоровых мышей при отрицательных результатах ИФА дальнейшим пассажам не подвергают. Из положительных проб селезенки готовят 10%-ную суспензию, проводят пассажи на 2-суточных белых мышах. Возможность многократного пассирования изолята только через иммунокомпетентные органы указывает на выделение иммунотропного штамма вируса КЭ. Идентификацию штаммов вируса проводят в МФА и РТГА. In animals infected with samples that do not cause disease, the brain and spleen are examined in a known manner in an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). 2-day-old white mice are infected with samples that give a positive result in ELISA, combined with intracerebral and subcutaneous methods. Infected animals are monitored for 2–3 weeks. In these mice, the brain and spleen in ELISA are examined on the 7th, 14th and 21st day of observation. The brain of clinically healthy mice with negative results of ELISA does not expose further passages. 10% suspension is prepared from positive samples of the spleen, passages are performed on 2-day-old white mice. The possibility of multiple passaging of the isolate only through immunocompetent organs indicates the isolation of an immunotropic strain of TBE virus. Identification of virus strains is carried out in MFA and rtga.

Пробы лейкоцитарных масс крови от лиц с укусом клеща обследованы с использованием культуры клеток СПЭВ (655 проб) и предлагаемым способом (92 пробы). В первой группе изолировано 53 нейротропных штаммов вируса КЭ, что составило 8,0%. Во второй группе изолировано 48 штаммов, что составило 52,2%. Из них выделено 14 нейротропных штаммов (15,2%) и 34 иммунотропных штаммов (36,9%). Разница показателей между первой и второй группами составила 6,5 раз. Это свидетельствует о том, что с помощью ранее применяемых способов не выделяли иммунотропные штаммы вирусов, которые составляют основную массу вирусной популяции, вызывающей, как правило, стертые и инаппарантные формы заболевания. Samples of leukocyte masses of blood from individuals with a tick bite were examined using a culture of SPEV cells (655 samples) and the proposed method (92 samples). In the first group, 53 neurotropic strains of TBE virus were isolated, which amounted to 8.0%. In the second group, 48 strains were isolated, which amounted to 52.2%. Of these, 14 neurotropic strains (15.2%) and 34 immunotropic strains (36.9%) were isolated. The difference between the indicators between the first and second groups was 6.5 times. This indicates that, using previously used methods, immunotropic strains of viruses that make up the bulk of the viral population, which usually causes erased and inapparent forms of the disease, were not isolated.

Примером накопления специфического антигена в селезенке мышей, зараженных 10-ю висцеротропными изолятами, явился опыт титрования 10%-ной суспензии иммунокомпетентных органов (101-1010) с последующим заражением клеточной культуры СПЭВ. Из этих клеток спустя 5 суток были приготовлены слайды по общепринятой методике МФА. Для каждого штамма получены показатели накопления вируса на 7 и 14-е сутки с помощью непрямого метода флюоресцирующих антител с использованием иммунной сыворотки крови больного КЭ в разведении 1: 20 и коньюгированной сыворотки против глобулинов человека. В табл. 1 представлены данные, подтверждающие присутствие в иммунокомпетентных органах, в частности в селезенке, специфического антигена (в ИФА) и вируса КЭ (в МФА). Титры его достигали до 10-7.An example of the accumulation of a specific antigen in the spleen of mice infected with 10 viscerotropic isolates was the experience of titration of a 10% suspension of immunocompetent organs (10 1 -10 10 ) followed by infection of the cell culture SPEV. After 5 days, slides were prepared from these cells using the standard MFA technique. For each strain, virus accumulation indices were obtained on the 7th and 14th days using the indirect method of fluorescent antibodies using immune serum from a patient with CE in a dilution of 1: 20 and conjugated serum against human globulins. In the table. 1 presents data confirming the presence in the immunocompetent organs, in particular in the spleen, of specific antigen (in ELISA) and virus CE (in MPA). Its titers reached 10 -7 .

Другим примером, свидетельствующим в пользу антигенной принадлежности к вирусу КЭ этих же 10-и изолятов, полученных предлагаемым способом, являются результаты их идентификации. Для проведения РГА и РТГА готовили протаминсульфатный антиген из вируссодержащего иммунокомпетентного органа. При постановке РТГА использованы мышиные иммунные сыворотки к региональным штаммам Пищелкин (выделен из мозга умершего больного) и 828 (выделен из крови человека с инаппарантной формой КЭ), а также коммерческая иммунная сыворотка к стандартному вирусу КЭ. Another example, testifying in favor of the antigenicity of the TBE virus of the same 10 isolates obtained by the proposed method, are the results of their identification. To conduct RGA and RTGA, a protamine sulfate antigen was prepared from a virus-containing immunocompetent organ. When rtga was used, mouse immune sera were used against regional Pischelkin strains (isolated from the brain of a deceased patient) and 828 (isolated from human blood with an inapparent form of TBE), as well as commercial immune serum to the standard TBE virus.

Из данных табл. 2 видно, что все штаммы обладали гемагглютинирующими свойствами в титрах 64-128 АЕ. В РТГА выявлены более высокие специфические связи к штамму 828. Иммунные сыворотки к штамму Пищелкин реагировали слабее. Это свидетельствует об антигенной близости изучаемых изолятов к штамму 828, который также выделен из крови больного с инаппарантной формой КЭ. From the data table. 2 shows that all strains had hemagglutinating properties in titers 64-128 AE. In rtga, higher specific bonds to strain 828 were detected. Immune sera to Pischelkin strain responded weaker. This indicates the antigenic proximity of the studied isolates to strain 828, which is also isolated from the blood of a patient with an inapparent form of EC.

Пример конкретного применения. Кровь лиц с укусом клещей (92 человека) забирают из вены в количестве 5 мл в раствор гепарина из расчета 25 ЕД на 1 мл, отстаивают в термостате при температуре 37oС в течение 30 минут, отбирают лейкоцитарную взвесь и получают лейкоцитарную массу. Ею заражают в мозг и подкожно 92 семьи из 6-ти двухдневных белых мышей. Наблюдают за ними в течение 14 дней. Из общего количества зараженных семей у 14 проявились симптомы заболевания (малоподвижность, параличи, смерть). Это говорит о том, что 15,2% обследованных лиц с укусом клеща являются носителями нейротропных вирусов.An example of a specific application. The blood of individuals with a tick bite (92 people) is taken from a vein in an amount of 5 ml to a heparin solution at a rate of 25 PIECES per 1 ml, set in a thermostat at a temperature of 37 o C for 30 minutes, a leukocyte suspension is taken and a leukocyte mass is obtained. It infects 92 families of 6 two-day-old white mice in the brain and subcutaneously. Observe them for 14 days. Of the total number of infected families, 14 showed symptoms of the disease (immobility, paralysis, death). This suggests that 15.2% of the examined individuals with a tick bite are carriers of neurotropic viruses.

Из оставшихся мышиных семей с инаппарантной формой течения инфекции на 14 сутки взяты мозг и селезенка мышей-сосунков, приготовлены пробы для исследования в ИФА и проведен анализ согласно инструкции по применению тест-системы иммуноферментной для выявления антигена вируса КЭ (инструкция прилагается). При этом ни в одной из этих проб антиген вируса КЭ в мозге не обнаружен. Пробы селезенок с отрицательными результатами дальнейшим исследованиям не подвергаются. From the remaining murine families with an inapparent form of the course of infection, the brain and spleen of sucker mice were taken on day 14, samples were prepared for ELISA testing and analysis was performed according to the instructions for using the enzyme-linked immunosorbent assay for detecting CE virus antigen (instructions attached). At the same time, in none of these samples was the CE virus antigen found in the brain. Samples of spleens with negative results are not further investigated.

Остальные пробы из селезенок с наличием антигена КЭ пассировали на сосунках белых мышей. При этом каждые 7, 14, 21-е сутки проводили исследования селезенок в ИФА. Из всех исследованных проб выделено 34 иммунотропных штаммов, что составило 36,9%. Полученные результаты свидетельствуют о том, что эти лица с укусом клеща заражены иммунотропными штаммами вируса КЭ. Такие случаи ранее не диагностировались, люди оставались без специфического лечения. The remaining samples from spleens with the presence of CE antigen were passaged on suckers of white mice. Moreover, every 7, 14, 21st day, spleen studies were performed in ELISA. Of all the studied samples, 34 immunotropic strains were isolated, which amounted to 36.9%. The results obtained indicate that these individuals with a tick bite are infected with immunotropic strains of TBE virus. Such cases were not previously diagnosed, people were left without specific treatment.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить качественные и количественные показатели вирусологической диагностики за счет использования иммунокомпетентных органов. Thus, the proposed method improves the qualitative and quantitative indicators of virological diagnosis through the use of immunocompetent organs.

Claims (1)

Способ выделения арбовирусов, в частности клещевого энцефалита, включающий сбор подозрительного на зараженность материала, подготовку его к исследованию и выделение арбовируса путем комбинированного заражения 1-3-дневных подопытных животных в мозг и под кожу суспензией этого материала, отбор животных с манифестной формой инфекции, забор у них мозга, приготовление из него суспензии и последующие 3-4-кратные пассажи в мозг опытных животных этой суспензией для накопления нейротропных вирусов в достаточном количестве для идентификации, отличающийся тем, что у животных с инаппарантной формой инфекции дополнительно исследуют нейро- и иммунокомпетентные органы известным иммуноферментным методом на 7, 14, 21-е сутки, причем пробы мозга с отрицательным результатом уничтожают, а пробы иммунокомпетентных органов с наличием положительного теста на антиген арбовирусов отбирают, готовят из них суспензию и проводят 3-5-кратные пассажи путем заражения подопытных животных этой суспензией для накопления иммунотропных вирусов в достаточном количестве для идентификации. A method for isolating arboviruses, in particular tick-borne encephalitis, including collecting suspicious material for infection, preparing it for research and isolating arbovirus by combined infection of 1-3-day-old experimental animals into the brain and under the skin with a suspension of this material, selection of animals with a manifest form of infection, sampling they have a brain, preparation of a suspension from it, and subsequent 3-4-fold passages to the brain of experimental animals with this suspension for the accumulation of neurotropic viruses in sufficient quantities for identification, exc characterized in that in animals with an inapparent form of infection, neuro- and immunocompetent organs are additionally examined by the known enzyme immunoassay on days 7, 14, 21, and brain samples with a negative result are destroyed, and samples of immunocompetent organs with a positive test for arbovirus antigen are taken , a suspension is prepared from them and 3-5-fold passages are carried out by infection of experimental animals with this suspension to accumulate immunotropic viruses in sufficient quantity for identification.
RU2001128341/14A 2001-10-18 2001-10-18 Method for isolating arboviruses, tick- borne encephalitis, in paticular RU2205652C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2001128341/14A RU2205652C1 (en) 2001-10-18 2001-10-18 Method for isolating arboviruses, tick- borne encephalitis, in paticular

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2001128341/14A RU2205652C1 (en) 2001-10-18 2001-10-18 Method for isolating arboviruses, tick- borne encephalitis, in paticular

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2205652C1 true RU2205652C1 (en) 2003-06-10

Family

ID=29210682

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2001128341/14A RU2205652C1 (en) 2001-10-18 2001-10-18 Method for isolating arboviruses, tick- borne encephalitis, in paticular

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2205652C1 (en)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2491341C2 (en) * 2007-11-15 2013-08-27 Эбботт Продактс Гмбх New method for recovery and viral load test in pancreatine sample

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Итоги науки и техники. Серия "Вирусология". - М., 1991, с.22-27. Вирусология. Методы. /Под ред. Б.Мейхи. - М.: Мир, 1988, с.12-42. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2491341C2 (en) * 2007-11-15 2013-08-27 Эбботт Продактс Гмбх New method for recovery and viral load test in pancreatine sample

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Galinska et al. Brucellosis in humans-etiology, diagnostics, clinical forms
Darwish et al. A sero-epidemiological survey for certain arboviruses (Togaviridae) in Pakistan
Phillips et al. Clinical and subclinical Barmah Forest virus infection in Queensland
Alaeddine et al. Reduced infection and protection from clinical signs of cerebral neosporosis in C57BL/6 mice vaccinated with recombinant microneme antigen NcMIC1
Lindsay et al. Direct agglutination test for the detection of antibodies to Sarcocystis neurona in experimentally infected animals
Samaha et al. Serodiagnosis of brucellosis in cattle and humans in Egypt
CN107216373A (en) Detect antigen polypeptide pond and its application of mycobacterium tuberculosis infection
Yong et al. ‘Arc 5’antibodies in sera of sheep infected with Echinococcus granulosus, Taenia hydatigena and Taenia ovis
Cybinski et al. Preliminary Characterization of D? Aguilar Virus and Three Palyam Group Viruses New to Australia
Felix Technique and interpretation of the Weil-Felix test in typhus fever
Rahman et al. Brucellosis among ruminants in some districts of Bangladesh using four conventional serological assays
Sharma et al. Seroprevalence studies of brucellosis among goats using different serological tests
RU2205652C1 (en) Method for isolating arboviruses, tick- borne encephalitis, in paticular
Digoutte et al. Isolation of the Rift Valley fever virus by inoculation into Aedes pseudoscutellaris cells: comparison with other diagnostic methods
Schmidt et al. Microneutralization test for the reoviruses. Application to detection and assay of antibodies in sera of laboratory animals.
FAWZY et al. THE VIRUS WATCH PROGRAM: A CONTINUING SURVEILLANCE OF VIRAL INFECTION IN METROPOLITAN NEW YORK FAMILIES: V. OBSERVATIONS IN EMPLOYED ADULTS ON ETIOLOGY OF ACUTE UPPER RESPIRATORY DISEASE AND HETEROLOGOUS ANTIBODY RESPONSE TO RHINOVIRUSES
Alkhaled et al. An investigation of Toxoplasmosis in Free Range chickens, Industrial chickens and Duck in mid Euphrates area of Iraq
Gibbs et al. Differential diagnosis of virus infections of the bovine teat skin by electron microscopy
Sharma et al. Seroprevalence studies of brucellosis among human using different serological tests
H Abd-El Halim et al. Prevalence of brucellosis in buffaloes and its control measures
CN2518107Y (en) Fast diagnostic reagent paper for trichinosis
Smaron et al. Diagnosis of measles by fluorescent antibody and culture of nasopharyngeal secretions
Chand et al. Control of brucellosis at an endemically infected sheep farm in Haryana (India)
Maayoof Isolation and Diagnosis of Toxoplasma gondii among Abortive Women Attending Salah al-Din Hospital and Emergency Hospital in Iraq
Terzin et al. Some viral, rickettsial and leptospiral infections diagnosed in Serbia. A serological study

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20051019