RU2203088C2 - Therapeutic agents and autoimmune diseases - Google Patents
Therapeutic agents and autoimmune diseases Download PDFInfo
- Publication number
- RU2203088C2 RU2203088C2 RU98101907/14A RU98101907A RU2203088C2 RU 2203088 C2 RU2203088 C2 RU 2203088C2 RU 98101907/14 A RU98101907/14 A RU 98101907/14A RU 98101907 A RU98101907 A RU 98101907A RU 2203088 C2 RU2203088 C2 RU 2203088C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- etxb
- cells
- binding
- agent
- cell
- Prior art date
Links
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 title claims abstract description 19
- 239000003814 drug Substances 0.000 title abstract description 35
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 title description 29
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 85
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 claims abstract description 7
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 claims abstract description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 54
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 23
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 claims description 11
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 claims description 8
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 5
- 208000000389 T-cell leukemia Diseases 0.000 claims description 4
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 claims description 4
- 208000028530 T-cell lymphoblastic leukemia/lymphoma Diseases 0.000 claims description 3
- 150000002270 gangliosides Chemical class 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 53
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 abstract description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 20
- 230000004913 activation Effects 0.000 abstract description 17
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 7
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 92
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 89
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 48
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 44
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 42
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 41
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 41
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 33
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 33
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 33
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 33
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 30
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 30
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 30
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 20
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 19
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 17
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 17
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 17
- 230000004044 response Effects 0.000 description 16
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 13
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 12
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 12
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 12
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 12
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 11
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 11
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 11
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 11
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 description 9
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 9
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 8
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 8
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 7
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 7
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 7
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 7
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N benzoquinolinylidene Natural products C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 7
- 210000002011 intestinal secretion Anatomy 0.000 description 7
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 7
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 6
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 6
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 6
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 6
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 6
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 6
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 6
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 6
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 5
- DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N acridine orange free base Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3C=C21 DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 5
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 5
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 5
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 5
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 5
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 4
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 4
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 230000034994 death Effects 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 4
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 4
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 4
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003844 B-cell-activation Effects 0.000 description 3
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 3
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 3
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 3
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 3
- 102000000743 Interleukin-5 Human genes 0.000 description 3
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 3
- 241000607284 Vibrio sp. Species 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- QPJBWNIQKHGLAU-IQZHVAEDSA-N ganglioside GM1 Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC[C@H](NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC)[C@H](O)\C=C\CCCCCCCCCCCCC)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@]2(O[C@H]([C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C2)[C@H](O)[C@H](O)CO)C(O)=O)[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](CO)O1 QPJBWNIQKHGLAU-IQZHVAEDSA-N 0.000 description 3
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 3
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 3
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 3
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000009386 Experimental Arthritis Diseases 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 208000024340 acute graft versus host disease Diseases 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 2
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- 238000004989 laser desorption mass spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000020192 tolerance induction in gut-associated lymphoid tissue Effects 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 2
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 2
- GDALETGZDYOOGB-UHFFFAOYSA-N Acridone Natural products C1=C(O)C=C2N(C)C3=CC=CC=C3C(=O)C2=C1O GDALETGZDYOOGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 208000011691 Burkitt lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 102000003846 Carbonic anhydrases Human genes 0.000 description 1
- 108090000209 Carbonic anhydrases Proteins 0.000 description 1
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 description 1
- 101000609762 Gallus gallus Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001027128 Homo sapiens Fibronectin Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 1
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 1
- BAQCROVBDNBEEB-UBYUBLNFSA-N Metrizamide Chemical compound CC(=O)N(C)C1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C(=O)N[C@@H]2[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)OC2O)O)=C1I BAQCROVBDNBEEB-UBYUBLNFSA-N 0.000 description 1
- 206010028400 Mutagenic effect Diseases 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010089814 Plant Lectins Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000003923 Protein Kinase C Human genes 0.000 description 1
- 108090000315 Protein Kinase C Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 230000033540 T cell apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 108010078814 Tumor Suppressor Protein p53 Proteins 0.000 description 1
- 230000035508 accumulation Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- FZEYVTFCMJSGMP-UHFFFAOYSA-N acridone Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=CC=CC=C3NC2=C1 FZEYVTFCMJSGMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000000961 alloantigen Effects 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000003423 ankle Anatomy 0.000 description 1
- 230000003092 anti-cytokine Effects 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000006472 autoimmune response Effects 0.000 description 1
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 1
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000005266 beta plus decay Effects 0.000 description 1
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 230000025084 cell cycle arrest Effects 0.000 description 1
- 238000003783 cell cycle assay Methods 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000004662 cellular morphological change Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000001218 confocal laser scanning microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000001236 detergent effect Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101150021159 etxB gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012997 ficoll-paque Substances 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 108010055409 ganglioside receptor Proteins 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 239000000677 immunologic agent Substances 0.000 description 1
- 229940124541 immunological agent Drugs 0.000 description 1
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 description 1
- 230000002434 immunopotentiative effect Effects 0.000 description 1
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001861 immunosuppressant effect Effects 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000005024 intraepithelial lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000207 lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 1
- 230000000527 lymphocytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229960000554 metrizamide Drugs 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000016379 mucosal immune response Effects 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 231100000243 mutagenic effect Toxicity 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000003726 plant lectin Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000012342 propidium iodide staining Methods 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011536 re-plating Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000026267 regulation of growth Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000007781 signaling event Effects 0.000 description 1
- 230000007727 signaling mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000013595 supernatant sample Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K14/245—Escherichia (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/868—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving autoimmunity, allergy, immediate hypersensitivity, delayed hypersensitivity, immunosuppression, or immunotolerance
Abstract
Description
Это изобретение относится к терапевтическим агентам, предназначенным для использования в лечении аутоиммунных заболеваний млекопитающих, в особенности человека. Изобретение также относится к терапевтическим агентам, применяемым в лечении лейкемий человека Т-клеточного происхождения, как так называемые "вакцинные носители", и агентам, использующимся для предупреждения у человека отторжения трансплантата и при заболевании трансплантат против хозяина (GVHD). This invention relates to therapeutic agents for use in the treatment of autoimmune diseases of mammals, in particular humans. The invention also relates to therapeutic agents used in the treatment of human leukemia of T-cell origin, as the so-called "vaccine carriers", and to agents used to prevent a person from transplant rejection and graft versus host disease (GVHD).
В статье под названием "Morfologic and Functional Alterations of Mucosal Т-сells by Cholera Toxin and its В-subunit" by Charles O. Elson et al. The Journal of Immunology, 1995, 154; 1032-1040 обнаруживается, что холерный токсин (Ctx) и CtxB-субъединица ингибируют CD8+ и CD4+ Т-клетки.In an article entitled "Morfologic and Functional Alterations of Mucosal T-Cells by Cholera Toxin and its B-subunit" by Charles O. Elson et al. The Journal of Immunology, 1995, 154; 1032-1040, cholera toxin (Ctx) and the CtxB subunit are found to inhibit CD8 + and CD4 + T cells.
Также делались ссылки на статью под названием "Prevention of Acute Graf-Versus-Host Disease by Treatment with a Novel Immunosuppressant" by B. Yankelvich et al. The Journal of Immunology, 1995, 154; 3611-3617. В ней CtxB определяется как агент, предназначенный для использования при трансформации костного мозга для предупреждения острого заболевания трансплантат против хозяина (GVHD). Links were also made to an article entitled "Prevention of Acute Graf-Versus-Host Disease by Treatment with a Novel Immunosuppressant" by B. Yankelvich et al. The Journal of Immunology, 1995, 154; 3611-3617. In it, CtxB is defined as an agent intended for use in bone marrow transformation to prevent acute graft versus host disease (GVHD).
WO 95/10301 раскрывает иммунологические агенты, индуцирующие толерантность и содержащие молекулы, связанные со слизистой оболочкой и сцеплением со специфическим толерогеном. WO 95/10301 discloses immunological agents that induce tolerance and contain molecules associated with the mucosa and adhesion to a specific tolerogen.
При использовании здесь термин "Ctx" обозначает холерный токсин, и "CtxB" обозначает В-субъединицу холерного токсина. В других текстах, они могут иногда определяться соответственно как "СТ" или "Ct" и "СТВ" и "CtB". Термин "Etx" здесь обозначает теплолабильный энтеротоксин Е. coli, и "EtxB" - это В-субъединица Etx. В других текстах, они могут иногда называться как "LT" или "Lt", и "LTB" или "LtB" соответственно. As used herein, the term "Ctx" refers to a cholera toxin, and "CtxB" refers to the B subunit of a cholera toxin. In other texts, they can sometimes be defined respectively as “CT” or “Ct” and “CTB” and “CtB”. The term “Etx” as used herein refers to the heat labile enterotoxin of E. coli, and “EtxB” is the Etx B subunit. In other texts, they may sometimes be referred to as “LT” or “Lt”, and “LTB” or “LtB” respectively.
Обоснованием всех сторон настоящего изобретения является тот факт, что EtxB (чистая В-субъединица теплолабильного энтеротоксина Е.coli) связывается с GM-1-ганглизидными рецепторами, которые обнаруживаются на поверхности клеток млекопитающих, и что это связывание вызывает возникновение эффектов в популяции лимфоцитов, включающих специфическое истощение CD8+ Т-клеток и ассоциированную активацию В-клеток. Эти эффекты отсутствуют при применении мутантного EtxB белка, не имеющего GM-1-связывающей активности.The rationale for all aspects of the present invention is the fact that EtxB (the pure B-subunit of the heat-labile enterotoxin E. coli) binds to GM-1 gangliside receptors that are found on the surface of mammalian cells, and that this binding causes effects in a lymphocyte population including specific depletion of CD8 + T cells and associated activation of B cells. These effects are absent when using a mutant EtxB protein that does not have GM-1 binding activity.
Аутоиммунные заболевания
Аутоиммунитет - это термин, использующийся для описания механизма, посредством которого организм дает иммунный ответ на собственные антигены.Autoimmune diseases
Autoimmunity is a term used to describe the mechanism by which the body gives an immune response to its own antigens.
В соответствии с первым аспектом настоящего изобретения, предлагается:
(i) агент, обладающий GM-1-связывающей активностью, отличный от Ctx или Etx, или В-субъединица Ctx или Etx; или
(ii) агент, обладающий воздействием на GM-1 опосредованные внутриклеточные сигнальные события, но не имеющий GM-1-связывающей активности;
для использования в качестве средства для лечения или предупреждения аутоиммунных заболеваний.In accordance with the first aspect of the present invention, it is proposed:
(i) an agent having GM-1 binding activity other than Ctx or Etx, or a B subunit of Ctx or Etx; or
(ii) an agent having effects on GM-1 mediated intracellular signaling events but lacking GM-1 binding activity;
for use as a treatment or prevention of autoimmune diseases.
Обнаружено, что агент, в соответствии с настоящим изобретением, модулирует популяции лимфоцитов, приводя к индукции апоптоза в CD8+ Т-клетках, повышенной активности CD4+-клеток и поликлональной активации В-клеток. Эти явления вероятно приводят к сдвигу иммунного ответа в сторону индукции Тh2 ассоциированных цитокинов. Считается, что подобные ответы на собственные или перекрестно-реагирующие агенты опосредуют защиту для определения аутоиммунных заболеваний.It was found that the agent in accordance with the present invention modulates lymphocyte populations, leading to the induction of apoptosis in CD8 + T cells, increased activity of CD4 + cells and polyclonal activation of B cells. These phenomena probably lead to a shift in the immune response towards the induction of Th2 associated cytokines. It is believed that such responses to intrinsic or cross-reacting agents mediate protection for the detection of autoimmune diseases.
В первом воплощении этого первого аспекта настоящего изобретения, агент используется в методе лечения аутоиммунного заболевания в момент его прогрессирования. В этом воплощении агент назначается пациенту с или без одновременного применения собственных или перекрестно-реагирующих антигенов. Применение агента в соответствии с этим воплощением первого аспекта изобретения модулирует природу иммунного ответа на собственный антиген, исключая активацию вызывающего болезнь воспаления, и, следовательно, предохраняет от аутоиммунного заболевания. In a first embodiment of this first aspect of the present invention, the agent is used in a method for treating an autoimmune disease at the time of its progression. In this embodiment, the agent is administered to a patient with or without the simultaneous use of their own or cross-reacting antigens. The use of an agent in accordance with this embodiment of the first aspect of the invention modulates the nature of the immune response to its own antigen, excluding the activation of disease-causing inflammation, and therefore protects against autoimmune disease.
Во втором воплощении этого первого аспекта настоящего изобретения агент используется для "вакцинации" представителей млекопитающих против аутоиммунных заболеваний, при которой агент применяется одновременно с собственным или перекрестно-реагирующими антигенными детерминантами (или с комбинацией различных собственных или перекрестно-реагирующих антигенных детерминант), связанными с названным заболеванием. Подобным образом иммунный ответ субъекта на собственный антиген или на перекрестно-реагирующий антиген исключается из активации патогенеза, что предохраняет в будущем от аутоиммунного ответа на собственный антиген. In a second embodiment of this first aspect of the present invention, the agent is used to “vaccinate” mammals against autoimmune diseases, in which the agent is used simultaneously with its own or cross-reacting antigenic determinants (or with a combination of various own or cross-reacting antigenic determinants) associated with the named a disease. Similarly, the subject’s immune response to its own antigen or to a cross-reacting antigen is excluded from activation of pathogenesis, which prevents future autoimmune responses to its own antigen.
В этом первом аспекте изобретения, терапевтический агент и собственная или перекрестно-реагирующая антигенная детерминанта должны или могут быть совместно назначены субъекту. Таким образом мы имеем в виду, что место и время введения каждого терапевтического агента и антигенной детерминанты таковы, чтобы достигалась необходимая модуляция иммунной системы. Таким образом, хотя терапевтический агент и антигенная детерминанта могут быть назначены в один и тот же момент времени и в одном и том же месте, могут существовать преимущества в применении терапевтического агента и антигенной детерминанты в разное время и в разном месте. In this first aspect of the invention, the therapeutic agent and the intrinsic or cross-reactive antigenic determinant should or may be co-administered to the subject. Thus, we mean that the place and time of administration of each therapeutic agent and antigenic determinant are such that the necessary modulation of the immune system is achieved. Thus, although a therapeutic agent and an antigenic determinant can be administered at the same time and in the same place, there may be advantages in using the therapeutic agent and antigenic determinant at different times and places.
Хотя единичная доза терапевтического агента и антигенной детерминанты могут быть достаточными, множественные дозы рассматриваются, как входящие в область этого аспекта изобретения. Although a single dose of a therapeutic agent and antigenic determinants may be sufficient, multiple doses are contemplated as being within the scope of this aspect of the invention.
В этом втором воплощении первого аспекта изобретения, терапевтический агент и антигенная детерминанта могут связываться, например, ковалентной связью, с образованием единого активного агента, хотя раздельное применение, при котором терапевтический агент и антигенная детерминанта не связаны, предпочтительней, так как это делает возможным раздельное применение различных фрагментов. In this second embodiment of the first aspect of the invention, the therapeutic agent and the antigenic determinant may bind, for example, by covalent bonding, to form a single active agent, although separate use in which the therapeutic agent and antigenic determinant are not connected is preferable, as this allows separate use various fragments.
Специфические аутоиммунные заболевания, которые можно лечить в соответствии с этим аспектом настоящего изобретения, это такие аутоиммунные заболевания, как ревматоидный артрит, рассеянный склероз и диабет, в которых патология связана с клеточно-опосредованным иммунитетом. Specific autoimmune diseases that can be treated in accordance with this aspect of the present invention are autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, multiple sclerosis and diabetes, in which the pathology is associated with cell-mediated immunity.
Дополнительно, под этим первым аспектом настоящего изобретения предлагается использование Ctx, Etx или В-субъединиц Ctx или Etx в производстве лекарств для использования, в качестве агентов для предупреждения аутоиммунных заболеваний. Additionally, under this first aspect of the present invention, the use of Ctx, Etx, or B-subunits of Ctx or Etx in the manufacture of drugs for use as agents for the prevention of autoimmune diseases is provided.
Также предполагается фармацевтическая композиция для лечения аутоиммунного заболевания человека, содержащая
(i) агент, обладающий GМ-1-связывающей активность; или
(ii) агент, обладающий воздействием на GM-1 опосредованные внутриклеточные сигнальные события, но не имеющие GM-1-связывающей активности;
и их фармацевтически приемлемый носитель или растворитель.Also contemplated is a pharmaceutical composition for treating a human autoimmune disease, comprising
(i) an agent having GM-1 binding activity; or
(ii) an agent having effects on GM-1 mediated intracellular signaling events but lacking GM-1 binding activity;
and their pharmaceutically acceptable carrier or solvent.
Фармацевтическая композиция этого аспекта изобретения может быть представлена в таком виде, чтобы его можно было ввести в организм через слизистую оболочку, например с помощью спрея через нос, или парентерально, причем соединение представлено в форме, пригодной для инъекций, например, для применения внутривенно, внутримышечно или подкожно. The pharmaceutical composition of this aspect of the invention can be presented in such a way that it can be introduced into the body through the mucous membrane, for example by means of a spray through the nose, or parenterally, moreover, the compound is presented in a form suitable for injection, for example, for use intravenously, intramuscularly or subcutaneously.
Фармацевтическая композиция может быть оформлена в готовую форму вместе с соответствующим собственным или перекрестно-реагирующим антигеном. И наоборот, комплект может содержать отдельные композиции для каждого терапевтического агента и антигенной детерминанты. The pharmaceutical composition may be formulated with its own or cross-reacting antigen. Conversely, a kit may contain separate compositions for each therapeutic agent and antigenic determinant.
Специфические терапевтические агенты, которые могут быть использованы в этом аспекте изобретения, - это EtxB и CtxB или их мутантные разновидности, сохраняющие GM-1-связывающую активность. Specific therapeutic agents that can be used in this aspect of the invention are EtxB and CtxB, or mutant variants thereof, which retain GM-1 binding activity.
Агенты для использования в первом аспекте настоящего изобретения должны предпочтительно быть в основном нетоксичными, хотя некоторый уровень токсичности может быть допустим при тяжелом лечении подобного рода. The agents for use in the first aspect of the present invention should preferably be substantially non-toxic, although some level of toxicity may be acceptable in severe treatment of this kind.
Этот первый аспект изобретения распространяется на использование всех агентов, обладающих GM-1-связывающей активностью, для использования в лечении аутоиммунных заболеваний человека, так же как и тех агентов, которые обладают воздействием на GM-1 опосредованные внутриклеточные сигнальные события, и которые, следовательно, действуют подобно GM-1-связывающим агентам. This first aspect of the invention extends to the use of all agents having GM-1 binding activity for use in the treatment of human autoimmune diseases, as well as those agents which have an effect on GM-1 mediated intracellular signaling events, and which therefore act like GM-1 binding agents.
Таким образом, этот первый аспект настоящего изобретения не ограничивается использованием EtxB белка в качестве терапевтического агента в лечении аутоиммунных заболеваний человека. Однако использование EtxB белка (который является пентамером из пяти идентичных субъединиц) для подобного лечения представляет собой предпочтительное воплощение настоящего изобретения. В дополнение к дикому типу EtxB, этот предпочтительный аспект изобретения также распространяется на мутантные EtxB, которые имеют GM-1-связывающую активность, так же как и на другие эквивалентные белки, такие как В-субъединица холерного токсина (CtxB), и их мутантные формы, которые обладают GM-1-связывающей активностью. Thus, this first aspect of the present invention is not limited to the use of EtxB protein as a therapeutic agent in the treatment of human autoimmune diseases. However, the use of an EtxB protein (which is a pentamer of five identical subunits) for such treatment is a preferred embodiment of the present invention. In addition to the wild type EtxB, this preferred aspect of the invention also extends to mutant EtxBs that have GM-1 binding activity, as well as other equivalent proteins, such as the cholera toxin B subunit (CtxB), and their mutant forms that have GM-1 binding activity.
Другими терапевтическими агентами для лечения аутоиммунных заболеваний в соответствии с первым аспектом этого изобретения являются человеческие моноклональные антитела, которые связываются с GM-1. Способы известного уровня техники для определения и получения таких агентов хорошо известны. Other therapeutic agents for the treatment of autoimmune diseases in accordance with the first aspect of this invention are human monoclonal antibodies that bind to GM-1. Methods of the prior art for the determination and preparation of such agents are well known.
Т-лимфоцитарные лейкемии
В соответствии со вторым аспектом данного изобретения предлагается:
(i) агент, имеющий GM-1-связывающую активность, отличный от Ctx и Etx, или В-субъединицы Ctx или Etx; или
(ii) агент, обладающий воздействием на GM-1 опосредованные внутриклеточные сигнальные события, но не обладающий GM-1-связывающей активностью;
для использования в лечении лейкемий человека Т-клеточного происхождения, таких как лейкемии человека CD8 Т-клеточного происхождения.T-lymphocytic leukemia
In accordance with a second aspect of the present invention, there is provided:
(i) an agent having GM-1 binding activity other than Ctx and Etx, or the B subunit of Ctx or Etx; or
(ii) an agent having effects on GM-1 mediated intracellular signaling events but lacking GM-1 binding activity;
for use in the treatment of human leukemia of T cell origin, such as human leukemia of CD8 T cell origin.
Агенты для использования во втором аспекте настоящего изобретения должны предпочтительно быть в основном нетоксичными, хотя некоторый уровень токсичности может быть допустим при тяжелом лечении такого рода. Agents for use in the second aspect of the present invention should preferably be substantially non-toxic, although some level of toxicity may be acceptable in severe treatment of this kind.
Дополнительно под вторым аспектом настоящего изобретения может предусматриваться использование Ctx или Etx, или В-субъединицы Ctx и Etx для получения медикаментов для лечения лейкемий человека Т-клеточного происхождения, таких как лейкемии человека CD8 Т-клеточного происхождения. Additionally, under a second aspect of the present invention, the use of Ctx or Etx, or B-subunits of Ctx and Etx, for the manufacture of medicaments for the treatment of human T-cell leukemia, such as human CD8 T-cell leukemia, can be provided.
Также предлагается фармацевтическая композиция для лечения лейкемий человека Т-клеточного происхождения, содержащая
(i) агент, обладающий GM-1-связывающей активностью; или
(ii) агент, обладающий воздействием на GM-1 опосредованные внутриклеточные сигнальные события, но не обладающий GM-1-связывающей активностью; и их фармацевтически приемлемые носители и растворители.Also provided is a pharmaceutical composition for the treatment of human leukemia of T-cell origin, comprising
(i) an agent having GM-1 binding activity; or
(ii) an agent having effects on GM-1 mediated intracellular signaling events but lacking GM-1 binding activity; and their pharmaceutically acceptable carriers and solvents.
Фармацевтическая композиция этого аспекта изобретения может быть представлена в такой форме, чтобы его можно было ввести в организм через слизистую оболочку, например с помощью спрея через нос, или парентерально, причем соединение представлено в форме, пригодной для инъекций, например, для применения внутривенно, внутримышечно или подкожно. The pharmaceutical composition of this aspect of the invention can be presented in such a way that it can be introduced into the body through the mucous membrane, for example by means of a spray through the nose, or parenterally, the compound being presented in a form suitable for injection, for example, for use intravenously, intramuscularly or subcutaneously.
Этот второй аспект изобретения распространяется на все вещества, обладающие GM-1-связывающей активностью, для использования в лечении лейкемий человека Т-клеточного происхождения, так же как те агенты, которые имеют воздействие на GM-1 опосредованные внутриклеточные сигнальные события, и таким образом действуют подобно GM-1-связывающим агентам. This second aspect of the invention extends to all substances having GM-1 binding activity for use in the treatment of human leukemia of T-cell origin, as well as those agents that have an effect on GM-1 mediated intracellular signaling events, and thus act like GM-1 binding agents.
Таким образом, второй аспект настоящего изобретения не ограничивается использованием EtxB белка в качестве терапевтического агента для лечения лейкемий человека Т-клеточного происхождения. Однако использование EtxB белка для такого лечения представляет предпочтительное воплощение настоящего изобретения. В дополнение к дикому типу EtxB, этот предпочтительный аспект изобретения также распространяется на мутантные EtxB, которые имеют GM-1-связывающую активность, так же как и на другие эквивалентные белки, такие как В-субъединица холерного токсина (CtxB), и их мутантные формы, которые обладают GM-1-связывающей активностью. Thus, a second aspect of the present invention is not limited to the use of EtxB protein as a therapeutic agent for the treatment of human leukemia of T-cell origin. However, the use of the EtxB protein for such treatment represents a preferred embodiment of the present invention. In addition to the wild type EtxB, this preferred aspect of the invention also extends to mutant EtxBs that have GM-1 binding activity, as well as other equivalent proteins, such as the cholera toxin B subunit (CtxB), and their mutant forms that have GM-1 binding activity.
Другими терапевтическими агентами для лечения аутоиммунных заболеваний в соответствии с первым аспектом этого изобретения являются человеческие моноклональные антитела, которые связываются с GM-1. Способы известного уровня техники для определения и получения таких агентов хорошо известны. Other therapeutic agents for the treatment of autoimmune diseases in accordance with the first aspect of this invention are human monoclonal antibodies that bind to GM-1. Methods of the prior art for the determination and preparation of such agents are well known.
Отторжение трансплантата и GVHD
В соответствии с третьим аспектом данного изобретения предлагается:
(i) агент, обладающий GM-1-связывающей активностью, отличный от Ctx и Etx, или В-субъединиц Ctx или Etx; или
(ii) агент, обладающий воздействием на GM-1 опосредованные внутриклеточные сигнальные события, но не обладающий GM-1-связывающей активностью;
для использования в качестве терапевтического агента для предупреждения/лечения отторжения трансплантата GVHD.Graft Rejection and GVHD
In accordance with a third aspect of the present invention, there is provided:
(i) an agent having GM-1 binding activity other than Ctx and Etx, or Ctx or Etx B subunits; or
(ii) an agent having effects on GM-1 mediated intracellular signaling events but lacking GM-1 binding activity;
for use as a therapeutic agent for the prevention / treatment of GVHD transplant rejection.
Дополнительно под этим третьим аспектом настоящего изобретения предлагается использование Ctx или Etx или В-субъединиц Etx или Ctx для получения лекарств для предупреждения отторжения трансплантата или GVHD. Additionally, under this third aspect of the present invention, there is provided the use of Ctx or Etx or Etx or Ctx B subunits for the manufacture of medicaments for preventing transplant rejection or GVHD.
В предпочтительном воплощении этого изобретения описанный терапевтический агент может использоваться для предупреждения реакции отторжения трансплантатов твердых органов, как аллогенетических, так и ксеногенетических. Они также могут быть использованы для предупреждения острого заболевания трансплантат против хозяина (GVHD), например при проведении трансплантации костного мозга. In a preferred embodiment of the invention, the described therapeutic agent can be used to prevent the rejection reaction of solid organ transplants, both allogenetic and xenogenetic. They can also be used to prevent acute graft versus host disease (GVHD), for example, during bone marrow transplantation.
В воплощении этого аспекта изобретения, где пациент получает препарат до трансплантации, терапевтическое вещество должно быть применено одновременно с аллоантигеном и ксеноантигеном. В воплощениях, в которых пациент получает лечение после трансплантации, терапевтический агент применяется без одновременного применения антигена. In the embodiment of this aspect of the invention, where the patient receives the drug before transplantation, the therapeutic substance should be used simultaneously with alloantigen and xenoantigen. In embodiments in which the patient receives treatment after transplantation, the therapeutic agent is administered without the simultaneous use of antigen.
В воплощении этого аспекта изобретения, где терапевтическое вещество и алло- и ксено- антигенные детерминанты применяются одновременно, мы имеем в виду, что место и время применения каждого терапевтического вещества и антигенной детерминанты таковы, что достигается необходимая модуляция иммунной системы. Таким образом, хотя терапевтический агент и антигенная детерминанта могут применяться в один и тот же момент и в одно и то же место, есть преимущества в применении терапевтического вещества в другое время и в другом месте, чем антигенная детерминанта. Кроме того, терапевтическое вещество и антигенная детерминанта могут быть ковалентно связаны, образуя единый активный агент, хотя раздельное применение, при котором терапевтический агент и антигенная детерминанта на связаны таким образом, предпочтительно, так как это делает возможным раздельное применение различных фрагментов. In the embodiment of this aspect of the invention, where a therapeutic substance and allo- and xeno-antigenic determinants are used simultaneously, we mean that the place and time of application of each therapeutic substance and antigenic determinant are such that the necessary modulation of the immune system is achieved. Thus, although a therapeutic agent and an antigenic determinant can be applied at the same time and at the same place, there are advantages in using the therapeutic substance at a different time and place than the antigenic determinant. In addition, the therapeutic agent and antigenic determinant can be covalently linked to form a single active agent, although separate use, in which the therapeutic agent and antigenic determinant are not connected in this way, is preferable, since it allows the separate use of different fragments.
Хотя единичная доза терапевтического агента и антигенной детерминанты могут быть достаточными, множественные дозы рассматриваются, как входящие в область этого аспекта изобретения. Although a single dose of a therapeutic agent and antigenic determinants may be sufficient, multiple doses are contemplated as being within the scope of this aspect of the invention.
В этом аспекте изобретения, когда агент используется для предупреждения GVHD, он как правило может применяться для воздействия непосредственно на клетки, например клетки костного мозга, предназначенные для трансплантации. In this aspect of the invention, when the agent is used to prevent GVHD, it can generally be used to directly affect cells, such as bone marrow cells for transplantation.
Агент должен быть предпочтительно в основном нетоксичным, хотя некоторый уровень токсичности может быть допустим при тяжелом лечении такого рода. The agent should preferably be substantially non-toxic, although some level of toxicity may be acceptable in severe treatment of this kind.
Также предлагается фармацевтическая композиция для лечения отторжения трансплантата, содержащая
(i) агент, обладающий GM-1-связывающей активностью; или
(ii) агент, обладающий воздействием на GM-1 опосредованные внутриклеточные сигнальные события, но не имеющий GM-1-связывающей активности; и их фармацевтически приемлемый носитель или растворитель.Also provided is a pharmaceutical composition for treating transplant rejection, comprising
(i) an agent having GM-1 binding activity; or
(ii) an agent having effects on GM-1 mediated intracellular signaling events but lacking GM-1 binding activity; and their pharmaceutically acceptable carrier or solvent.
Фармацевтическая композиция этого аспекта изобретения может быть представлена в таком виде, чтобы его можно было ввести в организм через слизистую оболочку, например с помощью спрея через нос, или парентерально, причем соединение представлено в форме, пригодной для инъекций, например для применения внутривенно, внутримышечно или подкожно. The pharmaceutical composition of this aspect of the invention can be presented in such a way that it can be introduced into the body through the mucous membrane, for example by means of a spray through the nose, or parenterally, and the compound is presented in a form suitable for injection, for example, for use intravenously, intramuscularly or subcutaneously.
Фармацевтическая композиция может быть оформлена в готовую форму вместе с соответствующими алло- или ксено- антигенными детерминантами. И наоборот, комплект может содержать отдельные композиции для каждого терапевтического агента и антигенной детерминанты. The pharmaceutical composition may be formulated together with appropriate allo- or xeno-antigenic determinants. Conversely, a kit may contain separate compositions for each therapeutic agent and antigenic determinant.
Этот третий аспект изобретения распространяется на использование всех агентов, обладающих GM-1-связывающей активностью для использования в предупреждении/лечении отторжения трансплантата или GVHD, так же как и тех агентов, которые обладают воздействием на GM-1 опосредованные внутриклеточные сигнальные события, и которые, следовательно, действуют подобно GM-1-связывающим агентам. This third aspect of the invention extends to the use of all agents having GM-1 binding activity for use in the prevention / treatment of transplant rejection or GVHD, as well as those agents that have effects on GM-1 mediated intracellular signaling events, and which, therefore, they act like GM-1 binding agents.
Таким образом, этот третий аспект настоящего изобретения не ограничивается использованием EtxB белка в качестве терапевтического агента в лечении отторжения трансплантата. Однако использование EtxB белка (который является пентамером из пяти идентичных субъединиц) для подобного лечения представляет собой предпочтительное воплощение настоящего изобретения. В дополнение к дикому типу EtxB, этот предпочтительный аспект изобретения также распространяется на мутантные EtxB, которые имеют GM-1-связывающую активность, так же как и на другие эквивалентные белки, такие как В-субъединица холерного токсина (CtxB), и их мутантные формы, которые обладают GM-1-связывающей активностью. Thus, this third aspect of the present invention is not limited to the use of EtxB protein as a therapeutic agent in the treatment of transplant rejection. However, the use of an EtxB protein (which is a pentamer of five identical subunits) for such treatment is a preferred embodiment of the present invention. In addition to the wild type EtxB, this preferred aspect of the invention also extends to mutant EtxBs that have GM-1 binding activity, as well as other equivalent proteins, such as the cholera toxin B subunit (CtxB), and their mutant forms that have GM-1 binding activity.
Другими терапевтическими агентами для лечения аутоиммунных заболеваний в соответствии с первым аспектом этого изобретения являются человеческие моноклональные антитела, которые связываются с GM-1. Способы известного уровня техники для определения и получения таких агентов хорошо известны. Other therapeutic agents for the treatment of autoimmune diseases in accordance with the first aspect of this invention are human monoclonal antibodies that bind to GM-1. Methods of the prior art for the determination and preparation of such agents are well known.
Вакцинация
CtxB и EtxB уже были предложены в качестве так называемых "вакцинных носителей". В настоящее время обнаружено, что основой этого эффекта, частично, является способность EtxB модулировать популяции лимфоцитов (как обсуждалось выше) путем связывания GM-1 рецептора.Vaccination
CtxB and EtxB have already been proposed as so-called “vaccine carriers”. It has now been discovered that the basis of this effect, in part, is the ability of EtxB to modulate lymphocyte populations (as discussed above) by binding to the GM-1 receptor.
Таким образом, в соответствии с четвертым аспектом настоящего изобретения, предлагается:
(i) агент, обладающий GM-1-связывающей активностью, отличной от Ctx или Etx, или В-субъединиц Ctx или Etx; или
(ii) агент, обладающий воздействием на GM-1 опосредованные внутриклеточные сигнальные события, но не обладающий GM-1-связывающей активностью; для использования и вакцинации млекопитающего.Thus, in accordance with a fourth aspect of the present invention, it is proposed:
(i) an agent having GM-1 binding activity other than Ctx or Etx, or Ctx or Etx B subunits; or
(ii) an agent having effects on GM-1 mediated intracellular signaling events but lacking GM-1 binding activity; for use and vaccination of a mammal.
Агент способен к модуляции иммунного ответа, когда представлен вместе с неродственной чужеродной антигенной детерминантой. Когда агент вводится парентерально, такая иммуномодуляция с точки зрения иммунного ответа будет "прямой" в особенно ожидаемом направлении. Когда агент вводится через слизистую оболочку вместе с неродственным антигеном, таким как так называемый "слизистый адъювант", агент способен к облегчению слизистого иммунного ответа на неродственный антиген. Антиген и агент могут быть введены вместе как отдельные фрагменты, или могут быть связаны вместе, например, ковалентной связью. An agent is capable of modulating the immune response when presented with an unrelated foreign antigenic determinant. When an agent is administered parenterally, such immunomodulation in terms of an immune response will be “direct” in a particularly expected direction. When an agent is administered through the mucous membrane along with an unrelated antigen, such as the so-called “mucosal adjuvant”, the agent is capable of facilitating a mucosal immune response to the unrelated antigen. The antigen and agent can be introduced together as separate fragments, or can be linked together, for example, by a covalent bond.
Антиген должен быть предпочтительно нетоксичным. Кроме того, когда агент предназначен для введения через гастроэнтеральную слизистую, он должен быть способен сохранять стабильность во время передвижения по гастроэнтеральному тракту; например, он должен быть устойчив к детергентному влиянию желчи. The antigen should preferably be non-toxic. In addition, when the agent is intended for administration through the gastroenteric mucosa, it should be able to maintain stability during movement along the gastroenteric tract; for example, it must be resistant to the detergent effect of bile.
Также предлагается фармацевтическая композиция для использования при вакцинации млекопитающих, содержащая
(i) агент, обладающий GM-1-связывающей активностью; или
(ii) агент, обладающий воздействием на GM-1 опосредованные внутриклеточные сигнальные события, но не имеющий GM-1-связывающей активности;
и их фармацевтически приемлемый носитель или растворитель.Also provided is a pharmaceutical composition for use in mammalian vaccination, comprising
(i) an agent having GM-1 binding activity; or
(ii) an agent having effects on GM-1 mediated intracellular signaling events but lacking GM-1 binding activity;
and their pharmaceutically acceptable carrier or solvent.
Фармацевтическая композиция этого аспекта изобретения может быть представлена в таком виде, чтобы его можно было ввести в организм через слизистую оболочку, например с помощью спрея через нос, или парентерально, причем соединение представлено в форме, пригодной для инъекций, например для применения внутривенно, внутримышечно или подкожно. The pharmaceutical composition of this aspect of the invention can be presented in such a way that it can be introduced into the body through the mucous membrane, for example by means of a spray through the nose, or parenterally, and the compound is presented in a form suitable for injection, for example, for use intravenously, intramuscularly or subcutaneously.
Фармацевтическая композиция может быть оформлена в готовую форму вместе с соответствующей антигенной детерминантой. И наоборот, комплект может содержать отдельные композиции для каждого терапевтического агента и антигенной детерминанты. The pharmaceutical composition may be formulated together with an appropriate antigenic determinant. Conversely, a kit may contain separate compositions for each therapeutic agent and antigenic determinant.
Этот четвертый аспект изобретения распространяется на использование всех агентов, обладающих GM-1-связывающей активностью, таких как иммуномодуляторы, так же как и тех агентов, которые обладают воздействием на GM-1 опосредованные внутриклеточные сигнальные события, и которые, следовательно, действуют подобно GM-1-связывающим агентам. This fourth aspect of the invention extends to the use of all agents having GM-1 binding activity, such as immunomodulators, as well as those agents that have GM-1 mediated intracellular signaling effects, and which therefore act like GM- 1-binding agents.
Таким образом, этот четвертый аспект настоящего изобретения не ограничивается использованием EtxB белка в качестве иммуномодулятора. Однако использование EtxB белка (который является пентамером из пяти идентичных субъединиц) подобным образом представляет собой одно из воплощений настоящего изобретения. В дополнение к дикому типу EtxB, этот предпочтительный аспект изобретения также распространяется на мутантные EtxB, которые имеют GM-1-связывающую активность, так же как и на другие эквивалентные белки, такие как В-субъединица холерного токсина (CtxB), и их мутантные формы, которые обладают GM-1-связывающей активностью. Thus, this fourth aspect of the present invention is not limited to the use of EtxB protein as an immunomodulator. However, the use of an EtxB protein (which is a pentamer of five identical subunits) in a similar manner represents one embodiment of the present invention. In addition to the wild type EtxB, this preferred aspect of the invention also extends to mutant EtxBs that have GM-1 binding activity, as well as other equivalent proteins, such as the cholera toxin B subunit (CtxB), and their mutant forms that have GM-1 binding activity.
Другими терапевтическими агентами для использования в качестве иммуномодуляторов, в соответствии с этим аспектом изобретения, являются человеческие моноклональные антитела, которые связываются с GM-1. Способы известного уровня техники для определения и получения таких агентов хорошо известны. Other therapeutic agents for use as immunomodulators in accordance with this aspect of the invention are human monoclonal antibodies that bind to GM-1. Methods of the prior art for the determination and preparation of such agents are well known.
Когда терапевтический агент настоящего изобретения является белком, таким как EtxB-субъединица или CtxB- субъединица, он может быть получен, для использования во всех аспектах данного изобретения, способом, в котором ген или гены, клонирующие специфическую полипептидную цепь (или цепи), из которых образован белок, встраиваются в подходящий вектор и затем используются для трансфекции подходящего хозяина. Например, ген, кодирующий полипептидную цепь, составляющую EtxB, может быть встроен в, например, плазмид рММВ68, который затем используется для трансфекции клеток хозяина, такого как Vibrio sp. 60. Белок очищается и выделяется способом, известным per se. Мутантные гены, экспрессирующие мутантный EtxB белок, могут затем быть получены известными методами из гена дикого типа. When the therapeutic agent of the present invention is a protein, such as an EtxB subunit or a CtxB subunit, it can be obtained, for use in all aspects of the present invention, in a method in which a gene or genes clone a specific polypeptide chain (or chains), of which a protein is formed, inserted into a suitable vector, and then used to transfect a suitable host. For example, a gene encoding a polypeptide chain constituting EtxB can be inserted into, for example, plasmid pMMB68, which is then used to transfect host cells such as Vibrio sp. 60. The protein is purified and isolated in a manner known per se. Mutant genes expressing a mutant EtxB protein can then be obtained by known methods from a wild-type gene.
Как ранее сообщалось, агенты, обладающие GM-1-связывающей способностью, такие как специфически предназначенные человеческие моноклональные антитела, могут быть задуманы и получены, как подчеркивалось выше, известными в технологии способами. As previously reported, agents possessing GM-1 binding ability, such as specifically designed human monoclonal antibodies, can be conceived and prepared, as emphasized above, by methods known in the art.
Во всех аспектах изобретения, агент, обладающий GM-1-связывающей активностью, может также быть способен к перекрестному связыванию GM-1-рецепторов. EtxB является одним из таких агентов, которые способны к перекрестному связыванию GM-1-рецепторов благодаря своей пентамерной форме. In all aspects of the invention, an agent having GM-1 binding activity may also be capable of cross-linking GM-1 receptors. EtxB is one such agent that is capable of cross-linking GM-1 receptors due to its pentameric form.
Теперь изобретение будет проиллюстрировано ссылками к сопровождающим чертежам и следующими примерами:
фиг. 1 представляет анализы физико-химических свойств EtxB и мутантных форм EtxB (EtxB (G33D));
фиг. 2 иллюстрирует, что рецепторное связывание EtxB необходимо для их сильной иммуногенности in vivo;
фиг. 3 иллюстрирует кинетику пролиферации лимфоцитов, следующую за инъекцией мыши EtxB;
фиг. 4 иллюстрирует, что EtxB вызывает повышение активации В-клеток;
фиг. 5 иллюстрирует, что EtxB вызывает повышение активности CD4+ Т-клеток и истощение CD8+ Т-клеток;
фиг. 6 показывает выборочное истощение OVA-ответственных CD8+ Т-клеток под действием EtxB;
фиг. 7 показывает, что рецепторное связывание EtxB вызывает изменения морфологических характеристик лимфоцитарного ядра клеток, подвергнутых апоптозу;
фиг. 8 показывает EtxB рецепторно опосредованный апоптоз CD8+ Т-клеток, как определено при исследовании клеточного цикла;
фиг. 9а и 9б показывает результаты экспериментов, проводимых с целью показать, что GM-1-связывание EtxB вызывает развитие коллаген индуцированного артрита на модели животного;
фиг. 10 показывает результаты эксперимента, проводимого для того, чтобы проиллюстрировать, что EtxB, но не EtxB (G33D), вызывает апоптоз в популяции нормальных человеческих мононуклеарных клеток периферической крови;
фиг. 11 показывает результаты эксперимента, который показывает, что перекрестное связывание GM1 ведет к апоптозу в части мышиных CTLL клеток.The invention will now be illustrated with reference to the accompanying drawings and the following examples:
FIG. 1 presents analyzes of the physicochemical properties of EtxB and mutant forms of EtxB (EtxB (G33D));
FIG. 2 illustrates that EtxB receptor binding is necessary for their strong immunogenicity in vivo;
FIG. 3 illustrates the kinetics of lymphocyte proliferation following injection of EtxB mouse;
FIG. 4 illustrates that EtxB causes an increase in B cell activation;
FIG. 5 illustrates that EtxB causes an increase in CD4 + T cell activity and depletion of CD8 + T cells;
FIG. 6 shows selective depletion of OVA-responsible CD8 + T cells by EtxB;
FIG. 7 shows that EtxB receptor binding causes changes in the morphological characteristics of the lymphocytic nucleus of apoptotic cells;
FIG. 8 shows EtxB receptor-mediated apoptosis of CD8 + T cells as determined by cell cycle assay;
FIG. 9a and 9b show the results of experiments conducted to show that GM-1 binding of EtxB causes the development of collagen-induced arthritis in an animal model;
FIG. 10 shows the results of an experiment conducted to illustrate that EtxB, but not EtxB (G33D), induces apoptosis in a population of normal human peripheral blood mononuclear cells;
FIG. 11 shows the results of an experiment which shows that cross-linking of GM1 leads to apoptosis in part of murine CTLL cells.
Детальное описание чертежей
Фиг. 1
Анализы физико-химических свойств EtxB и EtxB (G33D).Detailed Description of Drawings
FIG. 1
Physico-chemical analyzes of EtxB and EtxB (G33D).
(а) SDS-PAGE анализы EtxB или EtxB (G33D): 5 мкг каждого белка анализировались в восстановительных условиях в присутствии β-меркаптоэтанола с или без предварительного нагревания. Линия 1, дикий тип EtxB, ненагретый. Линия 2, EtxB (G33D), ненагретый. Линия 3, дикий тип EtxB, нагретый до 95oС. Линия 4, EtxB (G33D), нагретый до 95oС. Молекулярный вес стандартов (Bio-Rad.) показан слева от панели.(a) SDS-PAGE assays EtxB or EtxB (G33D): 5 μg of each protein was analyzed under reducing conditions in the presence of β-mercaptoethanol with or without pre-heating.
(б) Определение действительной молекулярной массы EtxB и EtxB (G33D) методом гель-фильтрационной хроматографии: стандартная кривая (кружки) получена с использованием, с верху до основания: бычьего сывороточного альбумина (66 кД), куриного яичного альбумина (45кД), карбоангидразы бычьих эритроцитов (29 кД) и цитохрома сердца лошади (12,4 кД); EtxB и EtxB (G33D) элюировали с соответствующими молекулярными массами 36 и 38 кД соответственно; Ve - элюирующий объем белка, Vo - свободный объем гель-фильтрационной колонки.(b) Determination of the actual molecular weight of EtxB and EtxB (G33D) by gel filtration chromatography: the standard curve (circles) was obtained using, from top to bottom: bovine serum albumin (66 kD), chicken egg albumin (45 kD), bovine carbonic anhydrase erythrocytes (29 kD) and horse heart cytochrome (12.4 kD); EtxB and EtxB (G33D) were eluted with corresponding molecular weights of 36 and 38 kD, respectively; V e is the eluting volume of the protein, V o is the free volume of the gel filtration column.
(в) ELISA для сравнительного связывания EtxB и EtxB (G33D) с ганглиозидом GM-1; платы были покрыты GM-1, блокированы и инкубировались с 1 мкг/мл или EtxB или EtxB (G33D) разведенными серийно (3 кратно) от 1 мкг/мл. (c) ELISA for comparative binding of EtxB and EtxB (G33D) with ganglioside GM-1; the boards were coated with GM-1, blocked and incubated with 1 μg / ml or EtxB or EtxB (G33D) diluted serially (3 fold) from 1 μg / ml.
Фиг. 2
Рецепторное связывание EtxB необходимо для их сильной им-муногенности in vivo.FIG. 2
EtxB receptor binding is essential for their strong immunogenicity in vivo.
Мышам BALB/c (по 4 в каждой группе) проводились подкожные инъекции или EtxB или EtxB (G33D) в PBS, или белки вводились через рот в бикарбонатном буфере. Сыворотка исследовалась в течение 10 дней, следующих за двумя подкожными инъекциями (А) или в течение 1 недели, следующей за 3 оральными дозами (В), и кишечные выделения исследовались в течение 1 недели, следующей за 3 оральными дозами (С). В образцах, полученных от контрольных мышей, реакция не была определена. Результаты выражены в титрах антител IgG в сыворотке, в то время как IgA в кишечных выделениях выражены в "специфической активности", как описано ниже. BALB / c mice (4 in each group) were given subcutaneous injections of either EtxB or EtxB (G33D) in PBS, or the proteins were administered by mouth in bicarbonate buffer. Serum was tested for 10 days following two subcutaneous injections (A) or for 1 week following 3 oral doses (B), and intestinal secretions were examined for 1 week following 3 oral doses (C). In samples obtained from control mice, the reaction was not determined. The results are expressed in serum IgG antibody titers, while IgA in intestinal secretions are expressed in “specific activity” as described below.
Фиг. 3
Кинетика пролиферации лимфоцитов
Мышам проводились интраперитонеальные инъекции 30 мкг EtxB (G33D) в полном адъюванте Фрейда. MLNs были изолированы 10 днями позже и клетки инкубировали в отсутствие антигена (незакрашенный квадрат) или в присутствии 80 мкг/мл EtxB (закрашенный треугольник), EtxB (G33D) (незакрашенный треугольник) или несобранных мономерных форм EtxB (закрашенный треугольник) и EtxB (G33D) (незакрашенный круг), полученных при нагревании до 95oС. После 6 часов каждого дня исследования клетки импульсно метили с 1 мкКи (3Н) Thd. Данные представляют среднее срm (число импульсов в минуту) и SEM из трех лунок.FIG. 3
Kinetics of lymphocyte proliferation
Mice received intraperitoneal injections of 30 μg EtxB (G33D) in Freud's complete adjuvant. MLNs were isolated 10 days later and cells were incubated in the absence of antigen (open square) or in the presence of 80 μg / ml EtxB (open triangle), EtxB (G33D) (open triangle) or unassembled monomeric forms of EtxB (open triangle) and EtxB (G33D ) (open circle) obtained by heating to 95 o C. After 6 hours of each day of the study, the cells were pulsed labeled with 1 µci ( 3 N) Thd. Data represent mean cpm (pulses per minute) and SEM of three wells.
Фиг. 4
EtxB вызывают повышенную активность В-клеток.FIG. 4
EtxB cause increased B cell activity.
Мышей иммунизировали EtxB (G33D) в CFA. Клетки изолировали из MLN 10 дней спустя и инкубировали в присутствии 80 мкг/мл или EtxB или EtxB (G33D), или смеси из 40 мкг/мл каждого белка. Клетки метили биотинилированным анти-СD25 (7D4) и Фикоэритрином (РЕ) анти-В220 (Ra3-6D2). Стрептавидин FITC использовался в качестве вторичного конъюгата антител. Включались также контроли для антител (не показаны). Двойной проточный цитометрический анализ проводился на 4 день пролиферации. Mice were immunized with EtxB (G33D) in CFA. Cells were isolated from
Фиг. 5
EtxB вызывает повышенную активность CD4+ Т-клеток и истощение CD8* Т-клеток.FIG. 5
EtxB causes increased activity of CD4 + T cells and depletion of CD8 * T cells.
Процесс иммунизации, выделение клеток и контрольное заражение in vitro такие же, как в описании фиг. 4. Для определения CD25 использовались биотинилированный анти-СD25 (7D4) и Стрептавидин FITC. Для определения CD4 и CD8 использовались FITC, меченный aнти-CD4 (RNRM4-5), и FITC, меченный aнти-CD8α (53-6.7). Соответствующие контроли для антител включались (не показаны). The immunization process, cell isolation and in vitro challenge are the same as in the description of FIG. 4. To determine CD25, biotinylated anti-CD25 (7D4) and Streptavidin FITC were used. To determine CD4 and CD8, FITC labeled anti-CD4 (RNRM4-5) and FITC labeled anti-CD8α (53-6.7) were used. Appropriate controls for antibodies were included (not shown).
Фиг. 6
Выборочное истощение ОVА-чувствительных CD8+ Т-клеток с помощью EtxB.FIG. 6
Selective depletion of OVA-sensitive CD8 + T cells with EtxB.
Культуры клеток из MLN, взятых у OVA-праймированных мышей, культивировались в течение 5 дней в отсутствие антигена или в присутствии OVA+EtxB, OVA+EtxB (G33D) или одного OVA при 100 мкг OVA и по 40 мкг/мл EtxB или EtxB (G33D) или 100 мкг только одного OVA. Клетки метили следующими крысиными антителами: FITC-aнти-CD4 или FIТС-анти-СD8α, и они оба с биотин-анти-CD25 (IL-2Rα) с последующим Стрептавидин-фикоэритрином. Непомеченные клетки или клетки, помеченные только вторым антителом, также включались в качестве контроля. Клетки исследовались с помощью FACS (Becton Dickinson). Большее увеличение количества клеток, являющихся CD25+ в культурах, содержащих EtxB по сравнению с другими способами обработки, происходит благодаря присутствию большего количества В-клеток, экспрессирующих этот маркер (не показано). Шкала интенсивности флюоресценции дана в виде логарифма.Cell cultures from MLN taken from OVA-primed mice were cultured for 5 days in the absence of antigen or in the presence of OVA + EtxB, OVA + EtxB (G33D) or one OVA at 100 μg OVA and 40 μg / ml EtxB or EtxB ( G33D) or 100 mcg of only one OVA. Cells were labeled with the following rat antibodies: FITC-anti-CD4 or FITS-anti-CD8α, and both of them with biotin anti-CD25 (IL-2Rα) followed by streptavidin-phycoerythrin. Unlabeled cells or cells labeled with only the second antibody were also included as a control. Cells were examined using FACS (Becton Dickinson). A greater increase in the number of CD25 + cells in cultures containing EtxB compared to other treatment methods is due to the presence of a larger number of B cells expressing this marker (not shown). The fluorescence intensity scale is given as a logarithm.
Фиг. 7
Рецепторное связывание EtxB вызывает изменение в морфологической характеристике ядра лимфоцитов в клетках, подвергнутых апоптозу.FIG. 7
The receptor binding of EtxB causes a change in the morphological characteristics of the nucleus of lymphocytes in apoptotic cells.
MLNC, содержащие >90% CD3+ Т-клеток и лишенные макрофагов, инкубировали в течение 18 часов с 80 мкг/мл EtxB или с 80 мкг/мл EtxB (G33D) и метили акридоном оранжевым. Клетки исследовались под обычным или конфокальным флуоресцентным микроскопом (Leica TCS 4D). Показана характерная микроскопическая картина (• 540) для каждого опыта [EtxB, снимок слева; EtxB (G33D), снимок справа] . Клетки, которые инкубировали в присутствии антигена, дают такой же результата, как клетки, обработанные EtxB (G33D) (не показано).MLNCs containing> 90% CD3 + T cells and lacking macrophages were incubated for 18 hours with 80 μg / ml EtxB or 80 μg / ml EtxB (G33D) and labeled with acridone orange. Cells were examined under a conventional or confocal fluorescence microscope (Leica TCS 4D). A characteristic microscopic picture (• 540) for each experiment is shown [EtxB, image on the left; EtxB (G33D), image on the right]. Cells that are incubated in the presence of antigen give the same result as cells treated with EtxB (G33D) (not shown).
Фиг. 8
EtxB рецепторно-опосредованный апоптоз CD8+ Т-клеток, как определено при анализе клеточного цикла.FIG. 8
EtxB receptor-mediated apoptosis of CD8 + T cells, as determined by cell cycle analysis.
Количество CD4+ и CD8+ SPLTC в суб-G0/G1 стадии клеточного цикла определялось проточным цитометрическим анализом содержания DNA, после окрашивания с пропидиум йодидом. SPLTC выделяли из селезенки отрицательным отбором, как описано выше. Клетки обрабатывали в течение 18 часов: (а) без антигена, (b) с 80 мкг/мл EtxB (G33D) или (с) с 80 мкг/мл EtxB и затем метили FITC-крысиными aнти-CD4 или FITC-крысиными анти-CD8α. Клетки последовательно метили пропидиум йодидом. Количество клеток, помеченных пропидиум йодидом, определялось путем установки дискриминационного окна на клетки, меченные или анти-СD4, или анти-CD8 антителами.The amount of CD4 + and CD8 + SPLTC in the sub-G 0 / G 1 stage of the cell cycle was determined by flow cytometric analysis of DNA content, after staining with propidium iodide. SPLTC was isolated from the spleen by negative selection, as described above. Cells were treated for 18 hours: (a) without antigen, (b) with 80 μg / ml EtxB (G33D) or (c) with 80 μg / ml EtxB and then labeled with FITC rat anti-CD4 or FITC rat anti CD8α. Cells were sequentially labeled with propidium iodide. The number of cells labeled with propidium iodide was determined by installing a discriminatory window on cells labeled with either anti-CD4 or anti-CD8 antibodies.
Этот эксперимент проведен на клетках, результаты также представлены на фиг. 7 и в таблице 3. This experiment was performed on cells; the results are also presented in FIG. 7 and in table 3.
Примеры
Пример 1
Этот пример иллюстрирует условия GM-1-связывания для достижения различных эффектов на популяции лимфоцитов.Examples
Example 1
This example illustrates GM-1 binding conditions to achieve various effects on lymphocyte populations.
Материалы и методы
Получение рецептор-связанного мутанта EtxB.Materials and methods
Obtaining receptor-bound mutant EtxB.
Замещение Gly-33 на Asp происходит на участке, ответственном за рецепторное связывание человеческого EtxB, с использованием плазмида pTRH29, производного фагемид вектора pBluescript IIKS+, который содержит гены для А- и В- субъединиц (частиц) Etx (Yu J. , Webb H. & Hirst T.R. (1992). Molec. Microbiol. 6, 1949-1958). Мутагенез осуществляют с оленуклеотид-направленным комплектом для проведения мутагенеза in vitro (Amersham International), используя одноцепочечный pTRH29 в качестве матрицы и синтетический олигонуклеотид (5'-TCTCTTTTATCTGCCATCG-3')(из Microanalytical Facility, IAPGR, Cambridge Research Station, UK) в качестве мутагенного праймера. Правильность замещения Gly на Asp подтверждают дидеокси последовательностью, используя Sequenase II (United States Biochemical Corp.), и полученный в результате плазмид называют pTRH56. Мутантный etxB ген из pTRH56 возбуждается при использовании EcoRI и Spel рестрикционных ферментов, и встраивается в рММВ68 (Sandkvist М. , Hirst T. R. & Bagdasarian, M.,(1987) J. Bacteriol. 169, 4570-4576) для получения широкого радиуса действия экспрессирующего вектора, pTRH64 экспрессирующего EtxB (G33D). Substitution of Gly-33 with Asp takes place at the site responsible for receptor binding of human EtxB using plasmid pTRH29, a phagemid derivative of the pBluescript IIKS + vector, which contains genes for the A- and B- subunits (particles) of Etx (Yu J., Webb H. & Hirst TR (1992). Molec. Microbiol. 6, 1949-1958). Mutagenesis is carried out with an in vitro olenucleotide-directed mutagenesis kit (Amersham International) using single chain pTRH29 as a template and a synthetic oligonucleotide (5'-TCTCTTTTATCTGCCATCG-3 ') (from Microanalytical Facility, IAPGR, Cambridge Research Station, UK) mutagenic primer. The correct substitution of Gly for Asp is confirmed by the dideoxy sequence using Sequenase II (United States Biochemical Corp.), and the resulting plasmids are called pTRH56. The mutant etxB gene from pTRH56 is excited using EcoRI and Spel restriction enzymes, and is inserted into pMMB68 (Sandkvist M., Hirst TR & Bagdasarian, M., (1987) J. Bacteriol. 169, 4570-4576) to obtain a wide range of expression a vector pTRH64 expressing EtxB (G33D).
Антигены
Дикий тип EtxB и EtxB (G33D) очищают от культуральных супернатантов Vibrio sp. 60 (рММВ68) и Vibrio sp. 60 (pTRH64) соответственно, используя модификацию метода, предложенного Amin и Hirst (Amin, Т., & Hirst T.R. (1994) Prot. Express, and Purif. 5, 198-204). Кратко, белки очищают дифракцией и гидрофобной связывающей хроматографией и концентрируют анион-обменной хроматографией. Растворы белка обессоливают на колонке PD10 (Pharmacia, UK), уравновешенной фосфатным буферным солевым раствором (PBS; 10 мМ фосфата натрия, 150 мМ NaCl, pH 7,4) и хранят при -30oС.Antigens
The wild type EtxB and EtxB (G33D) are purified from the culture supernatants of Vibrio sp. 60 (rMMB68) and Vibrio sp. 60 (pTRH64), respectively, using a modification of the method proposed by Amin and Hirst (Amin, T., & Hirst TR (1994) Prot. Express, and Purif. 5, 198-204). Briefly, proteins are purified by diffraction and hydrophobic binding chromatography and concentrated by anion exchange chromatography. Protein solutions are desalted on a PD10 column (Pharmacia, UK) equilibrated with phosphate buffered saline (PBS; 10 mM sodium phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.4) and stored at -30 ° C.
Чистота EtxB и EtxB (G33D) подтверждается электрофорезом на SDS полиакриламидном геле. Молекулярная масса отдельных мономеров подтверждается лазерной дезорпционной масс-спектрометрией (Protein Science Facility, University of Kent). The purity of EtxB and EtxB (G33D) is confirmed by SDS polyacrylamide gel electrophoresis. The molecular weight of individual monomers is confirmed by laser desorption mass spectrometry (Protein Science Facility, University of Kent).
Приблизительную молекулярную массу EtxB и EtxB (G33D) определяют гель-фильтрационной хроматографией с использованием SMART системы (Pharmacia). Белки элюируют из колонки Superdex 75 PC 3.2/30 в PBS, pH 7,5. The approximate molecular weights of EtxB and EtxB (G33D) are determined by gel filtration chromatography using a SMART system (Pharmacia). Proteins are eluted from a Superdex 75 PC 3.2 / 30 column in PBS, pH 7.5.
Необратимая денатурация В-субъединиц пентамера для использования в исследовании лимфотарной пролиферации (см. ниже) достигается нагреванием белков до 95oС в течение 5 минут.Irreversible denaturation of the B-subunit of the pentamer for use in the study of lymphatic proliferation (see below) is achieved by heating the proteins to 95 o C for 5 minutes.
Животные, набор образцов и схемы иммунизации
Мыши BALB/c (H-2d; с высоким ответом на EtxB) 7-12 недельного возраста были приобретены в Charles River Laboratories и содержались в питомнике Университета Кента. Ответы антител на EtxB или EtxB (G33D) измеряли после подкожной инъекции мышам 30 мкг белка в PBS, с последующей поддерживающей инъекцией через 10 дней. Другой группе мышей тот же белок вводили через рот в бикарбонате натрия (50 мкг/мл) за три приема с интервалом в одну неделю. Контрольным мышам давали PBS. Забор крови производился в течение 10 дней, следующих за последней подкожной инъекцией, или в течение 1 недели, следующей за последним оральным применением. Кишечные выделения живых мышей выделяли в раствор ингибитора протеаз, как ранее описывалось (Elson С.О., Еаlding, W. & Lefkowitz, J. (1984) J. Immunol. Meth. 67, 101-108), в течение одной недели, следующей за последним кормлением. Образцы затем разрушали ультразвуком и осветляли цетрифугацией (13,226 • g, 10 минут, при 4oС).Animals, sample set and immunization schedule
BALB / c mice (H-2 d ; high response to EtxB) 7-12 weeks old were purchased from Charles River Laboratories and kept in a nursery at the University of Kent. Antibody responses to EtxB or EtxB (G33D) were measured after subcutaneous injection into mice of 30 μg of protein in PBS, followed by maintenance injection after 10 days. To another group of mice, the same protein was administered by mouth in sodium bicarbonate (50 μg / ml) in three doses with an interval of one week. Control mice were given PBS. Blood sampling was performed within 10 days following the last subcutaneous injection, or within 1 week following the last oral administration. Intestinal excretion of live mice was isolated into a protease inhibitor solution as previously described (Elson, C.O., Еlding, W. & Lefkowitz, J. (1984) J. Immunol. Meth. 67, 101-108), within one week, following the last feeding. The samples were then destroyed by ultrasound and clarified by centrifugation (13.226 • g, 10 minutes, at 4 o C).
Для исследования пролиферации мышам проводили интраперитонеальную инъекцию с 30 мкг EtxB или EtxB (G33D) в полном адъюванте Фрейда (CFA), и мезентериальные лимфоузлы выделялись 10 днями позже. В исследование также включались контрольные иммунизированные мыши и их лимфоузлы, выделенные подобным же образом. To study proliferation, mice were injected intraperitoneally with 30 μg EtxB or EtxB (G33D) in Freud's complete adjuvant (CFA), and mesenteric lymph nodes were excreted 10 days later. The study also included control immunized mice and their lymph nodes isolated in the same way.
Энзим-связанный иммуносорбентный анализ (ELISA's) (Твердо-фазный иммуносорбентный метод)
Связывание EtxB или EtxB (G33D) с GM-1 исследовались методом GM-1-ELISA (Amin, Т., & Hirst. T.R. (1994) Prot. Express. and Purif. 5, 198-204).Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA's) (Solid Phase Immunosorbent Assay)
The binding of EtxB or EtxB (G33D) to GM-1 was investigated by the GM-1 ELISA method (Amin, T., & Hirst. TR (1994) Prot. Express. And Purif. 5, 198-204).
Сыворотку и кишечные выделения исследуют в присутствии анти-В-субъединиц IgG и IgA антител методом ELISA's, в котором образцы помещают в микротитровальные платы (Immulon I, Dyna-teck, USA), покрытые 5 мкг/мл или EtxB или EtxB (G33D) в PBS. Анти-В-субъединицы антител IgA в супернатантах кишечных выделений экстраполируют из стандартной кривой, полученной при покрытии двух рядов лунок на каждой плате 1 мкг/мл кроличьего антимышиного IgA (α цепь специфичная; Zymed, Lab, USA) в PBS, с последующим добавлением 1мкг/мл IgA мышиной миеломы (МОРС 315, Sigma, USA). Для измерения общего количества IgA лунки покрывают кроличьим анти-мышиным IgA с последующим добавлением супернатантов кишечных выделений. Все образцы серийно разводят. Пероксидазный конъюгат козьего анти-мышиного IgG (Fc специфический фрагмент; Jackson Lab., USA) или козьего анти-мышиного IgA (специфическая цепь; Sigma) разводят и добавляют во все лунки. Определяют титр анти-В-субъединиц IgG, дающий A450nm≥0,2. Ответ анти-В-субъединиц IgA для EtxB и EtxB (G33D) в кишечных выделениях высчитывают как "IgA специфическую активность" [среднее отношение IgA анти-В-субъединиц (мкг/мл)/общее количество IgA (мкг/мл)].Serum and intestinal secretions were examined in the presence of anti-B IgG and IgA antibody subunits by ELISA's, in which the samples were placed on microtiter plates (Immulon I, Dyna-teck, USA) coated with 5 μg / ml or EtxB or EtxB (G33D) in PBS The anti-B subunits of IgA antibodies in intestinal secretion supernatants are extrapolated from the standard curve obtained by coating two rows of wells on each plate with 1 μg / ml rabbit anti-mouse IgA (α chain specific; Zymed, Lab, USA) in PBS, followed by 1 μg / ml mouse mouse myeloma IgA (MORS 315, Sigma, USA). To measure the total amount of IgA, the wells are coated with rabbit anti-mouse IgA, followed by the addition of intestinal secretion supernatants. All samples are serially bred. The peroxidase conjugate of goat anti-mouse IgG (Fc specific fragment; Jackson Lab., USA) or goat anti-mouse IgA (specific chain; Sigma) is diluted and added to all wells. The titer of anti-B IgG subunits is determined, giving A 450nm ≥0.2. The response of IgA anti-B subunits for EtxB and EtxB (G33D) in intestinal secretions is calculated as "IgA specific activity" [average IgA ratio of anti-B subunits (μg / ml) / total IgA (μg / ml)].
Метод ELISA для измерения уровня цитокинов IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 и IFN-γ применялся, как ранее описано (Harper H.M., PhD thesis, University of Bristol (1995)). Коротко, микротитровальные платы покрывают крысиными антителами к мышиным IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 и IFN-γ. Платы блокируют с 2% (вес/объем) бычьего сывороточного альбумина. Супернатант из культуральной среды добавляют в лунки и разводят. Один ряд на каждой пластинке для каждого цитокина содержит стандартное количество рекомбинантных цитокинов. Затем пластинки инкубируют с 0,5 мкг/мл биотинилированных антицитокин моноклональных антител, с последующим добавлением авидин-перксидазы и 3,3', 5,5'-Тетраметил-бензиденового (ТМВ) субстрата и читают при A450nm.The ELISA method for measuring the levels of the cytokines IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 and IFN-γ was used as previously described (Harper HM, PhD thesis, University of Bristol (1995)). Briefly, microtiter plates are coated with rat antibodies to murine IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 and IFN-γ. The boards are blocked with 2% (w / v) bovine serum albumin. The supernatant from the culture medium is added to the wells and diluted. One row on each plate for each cytokine contains a standard amount of recombinant cytokines. Then the plates are incubated with 0.5 μg / ml biotinylated anticytokine monoclonal antibodies, followed by the addition of avidin perxidase and 3.3 ', 5.5'-Tetramethylbenzene (TMB) substrate and read at A 450nm .
Исследование пролиферации лимфоцитов
Мышей убивают шейным вывихом, мезентеральные лимфоузлы асептически выделяют и измельчают в сите из нержавеющей стали в сбалансированном солевом растворе Хенкса (HBSS). (Flow Laboratories Irvine, Renfrewshire, UK.). Клетки промывают центрифугацией (500•g, 10 минут, 4oС) в HBSS и ресуспендируют в модифицированной Eagle's среде (Flow), к которой добавлено 20 мМ Hepes (Flow), 100 IU Пенициллина, 100 мкг/мл Стрептомицина, 4 мМ L-глютамина (Flow) и 2-меркаптоэтанол (полная среда). Свежую аутологичную нормальную мышиную сыворотку иммунизированных мышей добавляют до конечной концентрации 0,5% (объемных). Культуры содержат 2•106 жизнеспособных клеток/мл в каждых 2 мл объема в платах с 24 лунками или в 8 мл объема в 25 см3 флаконах (Nunc A/S, Roskide, Denmark) и культивируют в присутствии или в отсутствие антигенов, как показано в описании чертежей. Культуры инкубируют при 37oС во влажной атмосфере из 5% CO2 и 95% воздуха в течение шести дней. В ожидаемый момент времени 0,1 мл образцы извлекают из среды и переносят на платы с 96 лунками с U-образным дном (Nunc) и импульсно метят 1 мкКи/лунку [3H]-Thd (Amersham, UK) за 6 часов пред тем, как собрать (Mash III harvesting 96 Tomtec, Orange, Conn. USA) и посчитать стандартной жидкой сцинцилляцией 1450 Micro β plus, LKB-Wallas, Turku, Finland). Подобным образом 0,5 мл супернатанта выделяют из культуры для анализа цитокинов. Клетки осаждают и супернатанты до исследования хранят при 68oС.Lymphocyte proliferation study
Mice are killed by cervical dislocation, mesenteric lymph nodes are aseptically isolated and crushed in a stainless steel sieve in Hanks' balanced salt solution (HBSS). (Flow Laboratories Irvine, Renfrewshire, UK.). Cells were washed by centrifugation (500 x g, 10 minutes, 4 ° C) in HBSS and resuspended in modified Eagle's medium (Flow), to which 20 mM Hepes (Flow), 100 IU Penicillin, 100 μg / ml Streptomycin, 4 mM L were added. -glutamine (Flow) and 2-mercaptoethanol (complete medium). Fresh autologous normal mouse serum from immunized mice is added to a final concentration of 0.5% (volume). The cultures contain 2 • 10 6 viable cells / ml in every 2 ml of volume in 24-well plates or in 8 ml of volume in 25 cm 3 bottles (Nunc A / S, Roskide, Denmark) and cultured in the presence or absence of antigens, as shown in the description of the drawings. The cultures are incubated at 37 ° C. in a humid atmosphere of 5% CO 2 and 95% air for six days. At the expected point in time, 0.1 ml of samples was removed from the medium and transferred to 96-well plates with a U-shaped bottom (Nunc) and 1 μCi / well [ 3 H] -Thd (Amersham, UK) was pulsed 6 hours before how to collect (Mash III harvesting 96 Tomtec, Orange, Conn. USA) and count as standard liquid scintillation 1450 Micro β plus, LKB-Wallas, Turku, Finland). Similarly, 0.5 ml of the supernatant is isolated from the culture for cytokine analysis. Cells are pelleted and supernatants are stored at 68 ° C until testing.
Фенотипический анализ культивируемых клеток
Культивируемые клетки, собранные на 4 день культивирования, промывают, и жизнеспособные клетки извлекают на поверхность раздела градиента HBSS/18% метризамида (Nyegaard и Со.,Oslo, Norway) с последующей центрифугацией при 500•g в течение 15 минут при 20oС. Клетки дважды промывают и ресуспендируют в HBSS, содержащем 0,2% азида натрия (Sigma) и 10% нормальной крысиной сыворотки. Использовались следующие крысиные антитела (Pharmingen, San Diego, USA): флуоресцентный изотиоцианат (FINC), меченный анти-СD4 (RNRMA-5), FITC, меченный анти-СD8 (53-6.7), биотин, меченный анти-СD25 (7D4) и фикоэритрин (РЕ), меченный анти-В220 (RA3-6D2). Дополнительно для биотинмеченых антител использовался Стрептавидин-РЕ или Стрептавидин FITC (Serotech, UK). Все антитела разводят в HBSS, содержащей азид, и используют в предварительно определенных концентрациях. 200 мкл 2•106 клеток и 200 мкл каждого из антител смешивают и инкубируют на льду в течение 30 минут. Когда необходимы Стрептавидин-РЕ или FITC вторичные антитела, клетки инкубируют с этими антителами еще дополнительно 30 минут. Соответствующие контроли для FITC и РЕ антител также включают в исследование. Клетки промывают HBSS и затем анализируют 2 проточной цитометрией (Becton Dickinson).Phenotypic analysis of cultured cells
The cultured cells harvested on
Результаты
Получение и характеристика рецепторно связанного мутанта EtxB.results
Obtaining and characterization of the receptor bound mutant EtxB.
Замещение Gly на Asp встраивались в В-субъединицу тепло-лабильного энтеротоксина Е. coli путем олигонуклеотидно-направленного мутагенеза EtxB с целью производства мутантной формы В-субъединицы, имеющую дефект в рецепторном распознавании. Мутантный белок, названный EtxB (G33D), и дикий тип EtxB очищали до гомогенного состояния (смотри материалы и Методы). Молекулярную массу очищенного EtxB и EtxB (G33D) определяли лазерной дезорпционной масс-спектрометрией. Массы входили в 20 Д теоретических масс в 11702 и 11760 Д для мономеров EtxB и EtxB (G33D) соответственно. При анализе с SDS-PAGE без предварительного нагревания как EtxB, так и EtxB (G33D) мигрировали как дискретные стабильные олигомеры с соответствующим молекулярным весом в 42 кД и 56 кД (фиг.1а, линия 1 и линия 2 соответственно). Наблюдающаяся электрофоретическая подвижность и SDS-стабильность EtxB является характерным свойством В-субъединицы пентамера ( см. Sandkvist М., Hirst T.R. & Bagdasarian, M. , (1987) J. Bacteriol. 169, 4570-4576). Медленная электрофоретическая подвижность олигомерного EtxB (G33D) не является следствием различия в количестве составляющих В-субъединиц мономеров, так как оба пентамерных EtxB и EtxB (G33D) проявляют одинаковое время задержки при гель-фильтрационной хроматографии с высокой разрешающей способностью. Таким образом, отличие в электрофоретической подвижности EtxB (G33D) олигомера от дикого типа EtxB возможно существует благодаря встроенному отрицательно заряженному Asp остатку, вызывающему снижение в SDS-связывании и последующее замедление миграции. Substitution of Gly with Asp was inserted into the B-subunit of the heat-labile enterotoxin E. coli by oligonucleotide directed mutagenesis of EtxB to produce a mutant form of the B-subunit, which has a defect in receptor recognition. A mutant protein called EtxB (G33D) and wild type EtxB were purified to a homogeneous state (see Materials and Methods). The molecular weight of purified EtxB and EtxB (G33D) was determined by laser desorption mass spectrometry. The masses were included in 20 D theoretical masses in 11702 and 11760 D for the EtxB and EtxB monomers (G33D), respectively. When analyzed with SDS-PAGE without preheating, both EtxB and EtxB (G33D) migrated as discrete stable oligomers with corresponding molecular weights of 42 kD and 56 kD (Fig. 1a,
EtxB и EtxB (G33D) также сравнивались по их стабильности в буферах с низким рН, устойчивости к 1,0 мг/мл трипсина или протеиназы К, и по относительной реактивности с рядом анти-В-субъединиц моноклональных и поликлональных антител. В каждом из
этих опытов EtxB (G33D) проявлял такие же свойства, как и дикий тип EtxB. Из этого делается вывод, что замещение Gly на Asp в остатке 33 в EtxB не меняет олигомерную конфигурацию, SDS, рН и протеазную стабильность или реактивность антител по сравнению с диким типом EtxB.EtxB and EtxB (G33D) were also compared for their stability in low pH buffers, resistance to 1.0 mg / ml trypsin or proteinase K, and relative reactivity with a number of anti-B subunits of monoclonal and polyclonal antibodies. In each of
In these experiments, EtxB (G33D) showed the same properties as the wild type EtxB. From this it is concluded that substitution of Gly with Asp at residue 33 in EtxB does not change the oligomeric configuration, SDS, pH, and protease stability or reactivity of antibodies compared to wild type EtxB.
Способность EtxB (G33D) связываться со своим рецептором GM-1, оценивалась с использованием метода GM-1-ELISA (фиг.1в). Он показывает очень значительное снижение способности мутанта к связыванию GM-1 по сравнению с диким типом белка (>99% снижения при чтении А450nm). Более того, в отличие от дикого типа EtxB, EtxB (G33D) имеет недостаточную способность в связывании с СНО-клетками при проверке методом иммунофлуоресценции. Делается вывод, что EtxB (G33D) имеет дефект способности к связыванию GM-1 ганглиозида in vitro и in situ.The ability of EtxB (G33D) to bind to its GM-1 receptor was evaluated using the GM-1-ELISA method (FIG. 1 c). It shows a very significant decrease in the ability of the mutant to bind GM-1 compared to the wild type of protein (> 99% reduction when reading A 450nm ). Moreover, unlike the wild-type EtxB, EtxB (G33D) has insufficient ability to bind to CHO cells when tested by immunofluorescence. It is concluded that EtxB (G33D) has a deficiency in the ability to bind GM-1 ganglioside in vitro and in situ.
Сильная иммуногенность EtxB in vivo зависит от рецепторного связывания. The strong immunogenicity of EtxB in vivo depends on receptor binding.
Важность рецепторного связывания для иммуногенности EtxB оценивалась у мышей после орального введения, или подкожной инъекции EtxB или EtxB (G33D) в PBS. В результате орального введения EtxB определяется высокий титр IgG антител в сыворотке и IgA антител в кишечных выделениях (фиг.2). И наоборот, при таком же режиме оральной иммунизации EtxB (G33D) не обнаружено никакой определимой активности антител. EtxB вызывает ответ сывороточных антител после введения путем подкожной инъекции, хотя этот ответ значительно ниже по сравнению с ответом антител на дикий тип EtxB, с 160-кратным снижением титра антител, 1050 против 171000 соответственно. Делается вывод, что рецепторное связывание EtxB необходимо для их сильной иммуногенности in vivo. The importance of receptor binding for the immunogenicity of EtxB was evaluated in mice after oral administration, or subcutaneous injection of EtxB or EtxB (G33D) in PBS. As a result of oral administration of EtxB, a high titer of serum IgG antibodies and IgA antibodies in intestinal secretions is determined (Fig. 2). Conversely, no detectable antibody activity was detected with the same oral immunization regimen with EtxB (G33D). EtxB elicits a serum antibody response after administration by subcutaneous injection, although this response is significantly lower than the antibody response to wild-type EtxB, with a 160-fold decrease in antibody titer, 1050 versus 171000, respectively. It is concluded that EtxB receptor binding is necessary for their strong immunogenicity in vivo.
Рецепторное связывание не влияет на пролиферацию лимфоцитов в присутствии EtxB или EtxB (G33D). Receptor binding does not affect lymphocyte proliferation in the presence of EtxB or EtxB (G33D).
Проверялось влияние EtxB и EtxB (G33D) на пролиферацию лимфоцитов in vitro. Лимфоциты выделяли из подколенных и мезентериальных лимфоузлов (MLN) мышей, иммунизированных или EtxB, или EtxB (G33D), и стимулировали in vitro одним или другим белком или препаратом денатурированного нагреванием EtxB или EtxB (G33D). Пролиферативный ответ лимфоцитов, полученных из подколенных или MLN лимфоузлов, был одинаковым. В каждом случае пролиферация в ответ на каждый из белковых препаратов повышалась с повышением концентрации В-субъединиц. Представительное число данных эксперимента с использованием MLN показано в таблице 1. Величина ответа на дикий и мутантный тип пентамеров сравнивалась с ответом, полученным в присутствии денатурированного нагреванием дикого и мутантного типов мономеров. Фиг. 3 показывает кинетику пролиферативного ответа, полученного в присутствии 80 мкг/мл каждого из белковых препаратов. Реактивность зависела от присутствия антигена и носила одинаковый характер в присутствии любого белка. Реактивность становилась очевидной на 3 день культивирования с инкорпорированным [3H]-Thd, достигая пика на 4 день и колеблясь после этого. Минимальные различия во времени наступления пика ответов, очевидные на фиг. 3, не наблюдались при повторных проверках, показывая что анамнестические характеристики ответов на EtxB и EtxB (G33D) являются сравнимыми. Из этого делается вывод, что уровень стимуляции в присутствии нативного белка скорее всего не зависел от рецепторного связывания или встроенной мутации.The effect of EtxB and EtxB (G33D) on lymphocyte proliferation in vitro was tested. Lymphocytes were isolated from popliteal and mesenteric lymph nodes (MLN) of mice immunized with either EtxB or EtxB (G33D) and stimulated in vitro with one or another protein or heat-denatured preparation of EtxB or EtxB (G33D). The proliferative response of lymphocytes derived from popliteal or MLN lymph nodes was the same. In each case, proliferation in response to each of the protein preparations increased with increasing concentration of b-subunits. A representative number of experimental data using MLN is shown in Table 1. The response to the wild and mutant types of pentamers was compared with the response obtained in the presence of heat-denatured wild and mutant types of monomers. FIG. 3 shows the kinetics of the proliferative response obtained in the presence of 80 μg / ml of each protein preparation. Reactivity depended on the presence of antigen and was the same in the presence of any protein. Reactivity became apparent on
Рецепторное связывание токсина вызывает иммуномодуляцию В-клеточной и Т-клеточной популяций. Receptor binding of the toxin causes immunomodulation of B-cell and T-cell populations.
Чтобы проверить, оказывает ли рецепторное связывание какое-либо влияние на популяцию лимфоидных клеток in vitro, лимфоциты выделялись у MLN мышей, праймированных интраперитониально EtxB (G33D), и затем стимулировались или EtxB, или EtxB (G33D), или их смесью. Кроме того, параллельно проводился эксперимент с использованием лимфоцитов MLN-происхождения от мышей, инъецированных EtxB, причем были получены результаты, идентичные полученным при опыте с EtxB (G33D) праймированными мышами. To check whether receptor binding has any effect on the in vitro lymphoid cell population, lymphocytes were isolated from MLN mice, intraperitoneally primed EtxB (G33D), and then stimulated with either EtxB or EtxB (G33D), or a mixture thereof. In addition, an experiment was conducted in parallel with the use of MLN-derived lymphocytes from mice injected with EtxB, and the results were identical to those obtained in the experiment with EtxB (G33D) primed mice.
(i) EtxB вызывает повышение активации В-клеток. (i) EtxB causes an increase in B cell activation.
Воздействие EtxB и В-клетки проверялись путем экспрессии активирующего маркера CD25 (IL-2Rα) в ассоциации с В-клеточным маркером В220 (CD4 5R). Как показано на фиг.4, количество В-клеток в культуре, стимулированной EtxB, составляло 62,9% от общего количества клеток, из которых большое количество (28,4%) экспрессировало маркер клеточной активации CD25. В противоположность этому, количество В-клеток после стимуляции в присутствии EtxB (G33D) было вполовину меньше по сравнению с диким типом (22,26%) и меньшее количество было активировано (5,6%). Для подтверждения, является ли воздействие, оказанное EtxB, преобладающим, клетки инкубировали в присутствии эквимолярных концентраций EtxB и EtxB (G33D). Данные проточной цитометрии были одинаковыми с данными, полученными при стимуляции в присутствии только одного дикого типа EtxB (60,6% В-клеток, из которых 26% было активировано). Делается вывод, что способность EtxB к рецепторному связыванию опосредует повышение активации В-клеток in vitro. The effects of EtxB and B cells were tested by expression of the activating marker CD25 (IL-2Rα) in association with the B-cell marker B220 (CD4 5R). As shown in FIG. 4, the number of B cells in the culture stimulated with EtxB was 62.9% of the total number of cells, of which a large number (28.4%) expressed a CD25 cell activation marker. In contrast, the number of B cells after stimulation in the presence of EtxB (G33D) was half that of the wild type (22.26%) and a smaller number was activated (5.6%). To confirm whether the effect exerted by EtxB was predominant, the cells were incubated in the presence of equimolar concentrations of EtxB and EtxB (G33D). Flow cytometry data were the same as those obtained by stimulation in the presence of only one wild-type EtxB (60.6% of B cells, of which 26% was activated). It is concluded that the ability of EtxB to receptor binding mediates an increase in B cell activation in vitro.
(ii) EtxB вызывает повышенную активацию CD4+ Т-клеток и полное истощение CD8+ Т-клеток.(ii) EtxB causes increased activation of CD4 + T cells and complete depletion of CD8 + T cells.
Для проверки влияния рецепторного связывания В-субъединиц на Т-клетки, лимфоциты метили антителами к CD4 или CD8 в ассоциации с антителами CD25 (фиг. 5). Кроме того, некоторые клетки были избирательно помечены антителами к CD3 маркеру (не показано). Количество Т-клеток, экспрессирующих CD4 маркер, при стимуляции в присутствии EtxB составляло 36,7%, большое число которых (32,7%) было активировано. В противоположность этому, в культуре, содержащей EtxB, не присутствовало определимого количества CD8+ Т-клеток.To test the effect of receptor binding of B-subunits on T cells, lymphocytes were labeled with anti-CD4 or CD8 antibodies in association with CD25 antibodies (Fig. 5). In addition, some cells were selectively labeled with antibodies to the CD3 marker (not shown). The number of T cells expressing the CD4 marker, upon stimulation in the presence of EtxB, was 36.7%, a large number of which (32.7%) were activated. In contrast, a detectable amount of CD8 + T cells was not present in the culture containing EtxB.
Для сравнения, как CD4+, так и CD8+ Т-клетки присутствовали в культуре, стимулированной в присутствии EtxB (G33D). Такие культуры содержали большее количество CD4+ Т-клеток (66,6%), но только 12% из них было активировано. Количество CD8+ Т-клеток, определенных в присутствии EtxB (G33D), составляло 11,7% от общего числа клеток, но очень немногие из них были активированы, что определено по отсутствию CD25 маркера. Кроме того, в присутствии смеси, состоящей из эквимолярных концентраций EtxB и EtxB (G33D), характер клеточного ответа был таким же, как и в присутствии одного дикого типа EtxB; с 41,68% CD4+ Т-клеток (из которых 28,6% были CD25+) и без определимых CD8+ Т-клеток (фиг. 5). Во всех этих исследованиях количество клеток, меченных CD3, было приблизительно равно сумме клеток, экспрессирующих CD4 и CD8 маркеры. Эти данные показывают, что повышение активации В и CD4+ Т-клеток и избирательное истощение CD8+ Т-клеток опосредовано рецепторным связыванием токсина.For comparison, both CD4 + and CD8 + T cells were present in culture stimulated in the presence of EtxB (G33D). Such cultures contained a greater number of CD4 + T cells (66.6%), but only 12% of them were activated. The number of CD8 + T cells detected in the presence of EtxB (G33D) was 11.7% of the total number of cells, but very few of them were activated, as determined by the absence of the CD25 marker. In addition, in the presence of a mixture consisting of equimolar concentrations of EtxB and EtxB (G33D), the nature of the cellular response was the same as in the presence of one wild-type EtxB; with 41.68% of CD4 + T cells (of which 28.6% were CD25 +) and without detectable CD8 + T cells (Fig. 5). In all of these studies, the number of cells labeled with CD3 was approximately equal to the sum of cells expressing CD4 and CD8 markers. These data show that increased activation of B and CD4 + T cells and selective depletion of CD8 + T cells are mediated by toxin receptor binding.
Продукция цитокинов
Чтобы оценить, может ли воздействие EtxB на популяции лимфоцитов зависеть от изменения в продукции цитокинов, культуру клеток инкубировали или с EtxB, или с EtxB (G33D) и супернатанты удаляли на 2, 3, 4, 5 и 6 дни исследования. Результаты, полученные от образцов, собранных на 5 день, когда определялась максимальная концентрация цитокинов, показаны в таблице 2. Как IFN-γ, так и IL-2 определялись в супернатантах культур, стимулированных в присутствии EtxB или EtxB (G33D), хотя относительные уровни этих цитокинов варьировались. Среду от клеток, инкубированных с диким EtxB, содержащую 3-кратную повышенную концентрацию IL-2 и 1,5-кратно сниженный уровень IFN-γ, сравнивали с супернатантами из культур, стимулированных в присутствии EtxB (G33D). Несмотря на то, что было обнаружено, что другие культуры пролиферирующих Т-клеток, отвечающих на другие антигены, вырабатывают высокий уровень IL-4, IL-5 и IL-10, ни один из этих цитокинов не был определен в культуре, стимулированной с EtxB или EtxB (G33D). Повышенные уровни IL-2 и понижение уровня IFN-γ вслед за стимуляцией EtxB, по сравнению с EtxB (G33D), наиболее вероятно отражает состояние активации В и CD4+ Т-клеток. Тем не менее, результаты показывают, что абсолютное воздействие дикого типа EtxB на CD8+ Т-клетки вряд ли опосредовано большим сдвигом в пролиферации цитокинов, вследствие блокады рецепторов.Cytokine production
To assess whether the effect of EtxB on lymphocyte populations may be affected by changes in cytokine production, the cell culture was incubated with either EtxB or EtxB (G33D) and supernatants were removed on
Обсуждение
Это исследование показывает, что введение единичной точечной мутации (G33D) в область рецепторного связывания EtxB вызывает значительную потерю способности к связыванию с GM-1. Важно отметить, что мутантный EtxB (G33D) проявляет физико-химические свойства, идентичные свойствам дикого типа в том, что касается структуры, что обнаруживается при гель- хроматографии, стабильности в SDS, кислотах и протеазах. При определении специфического антительного ответа после иммунизации EtxB или EtxB (G33D), были отмечены серьезные различия. В результате подкожного инъецирования мышам EtxB (G33D) титр антител значительно падал по сравнению с диким типом (са >160 раз), в то время как после орального применения не определялось никакого антительного ответа. Возможно, что эти различия явились результатом разрушения доминантного эпитопа, включенного или в распознавание молекулы антителом, или в стимуляцию эффективной Т-клеточной помощи для продукции антител. Однако заслуживает внимания, что замещение Gly на Asp не влияет на распознавание В-субъединицы рядом специфических поликлональных и моноклональных антител. В дальнейшем, пролиферативные ответы, полученные при добавлении к культурам EtxB или EtxB (G33D), были сравнимы вне зависимости от того, какой из белков использовался для праймирования in vivo; это показывает, что Т-клеточная реактивность не специфична для этих двух молекул. Из этого делается вывод, что рецепторное связывание EtxB необходимо для проявления сильной иммуногенности in vivo.Discussion
This study shows that introducing a single point mutation (G33D) into the EtxB receptor binding region causes a significant loss in GM-1 binding ability. It is important to note that the mutant EtxB (G33D) exhibits physicochemical properties identical to those of the wild type in terms of structure, which is detected by gel chromatography, stability in SDS, acids and proteases. In determining the specific antibody response after immunization with EtxB or EtxB (G33D), serious differences were noted. As a result of subcutaneous injection into EtxB (G33D) mice, the antibody titer dropped significantly compared to the wild type (ca> 160 times), while no antibody response was determined after oral administration. It is possible that these differences were the result of the destruction of the dominant epitope involved either in the recognition of the molecule by the antibody or in the stimulation of effective T-cell assistance for antibody production. However, it is noteworthy that the replacement of Gly with Asp does not affect the recognition of the B subunit by a number of specific polyclonal and monoclonal antibodies. Subsequently, the proliferative responses obtained by adding EtxB or EtxB (G33D) to the cultures were comparable regardless of which protein was used for in vivo priming; this shows that T cell reactivity is not specific to these two molecules. From this, it is concluded that EtxB receptor binding is necessary for the manifestation of strong immunogenicity in vivo.
Важность рецепторного связывания для сильной иммуногенности EtxB может объясняться различным образом. Прежде всего, связывание В-субъединицы с Etx и Ctx с GM-1 может повышать эффективность поглощения этих белков, повышая локальную концентрацию белка, подходящего для иммунной системы. Обнаружено, что другие классы белков, которые способны связываться со слизистыми оболочками, являются эффективными иммуногенами (De Aizpura H.J. & Russell-Jones G. J. (1988) J. Exp. Med. 167, 440-451). Наблюдаемые различия в иммуногенности EtxB и его мутанта после орального применения могут, конечно, существовать благодаря эффективному всасыванию EtxB из просвета кишечника. Однако серьезные отличия, отмеченные после парентеральной иммунизации (когда антиген поступал локально с высокой концентрацией), заставляют думать о других влияниях. Например, связывание EtxB с GM-1 может воздействовать на эффективность активности антиген-представляющих клеток. Такое связывание может вызывать активацию II-несущего класса клеток, особенно это касается экспрессии необходимых ко-стимулированных молекул, таких как В7, которые связаны со своей приобретенно усиленной антиген-представляющей активностью (Jenkins М.К. & Johnson J. G. (1993) Curr. Opin. Immunol. 5, 361-367). С другой стороны, рецепторное связывание может непосредственно воздействовать на субпопуляции лимфоцитов. Количество наблюдений в этом исследовании обеспечивает большую степень достоверности данного наблюдения. The importance of receptor binding for the strong immunogenicity of EtxB can be explained in various ways. First of all, the binding of the B subunit to Etx and Ctx to GM-1 can increase the absorption efficiency of these proteins, increasing the local concentration of a protein suitable for the immune system. Other classes of proteins that are capable of binding to mucous membranes have been found to be effective immunogens (De Aizpura, H. J. & Russell-Jones, G. J. (1988) J. Exp. Med. 167, 440-451). The observed differences in the immunogenicity of EtxB and its mutant after oral administration can, of course, exist due to the effective absorption of EtxB from the intestinal lumen. However, the serious differences noted after parenteral immunization (when the antigen was delivered locally with a high concentration) make us think of other influences. For example, the binding of EtxB to GM-1 may affect the activity efficiency of antigen-presenting cells. Such binding can cause activation of the II-bearing class of cells, especially for the expression of the necessary co-stimulated molecules, such as B7, which are associated with their acquired enhanced antigen-presenting activity (Jenkins M.K. & Johnson JG (1993) Curr. Opin Immunol. 5, 361-367). On the other hand, receptor binding can directly affect lymphocyte subpopulations. The number of observations in this study provides a greater degree of reliability of this observation.
Исследования in vitro показывают, что EtxB способен вызывать пролиферацию праймированных клеток из лимфатических узлов. Это свойство на зависит от рецепторного связывания, так как ответы с одинаковыми анамнестическими характеристиками были получены при использовании как дикого типа EtxB и EtxB (G33D), так и денатурированных нагреванием мономерных форм этих белков, которые не связываются с GM-1. Эти наблюдения интересны сами по себе, так как широко сообщалось, что коммерческие препараты Ctx и CtxB или очищенного рекомбинантного CtxB являются сильными ингибиторами лимфоцитарной пролиферации in vitro. Видимое противоречие может явиться результатом того факта, что предыдущие эксперименты были проведены с очищенными лимфоцитами, и что широко использовались лимфоцитарные культуры, стимулированные мутогеном (которые не являются клональными рестрикционными ответами), когда могли быть включены другие различные механизмы. С этим согласуется наше наблюдение, что пролиферация Con A-стимулированных лимфоцитов без сомнения ингибируется EtxB. Однако анализ клеточных популяций в культурах праймерованных клеток из лимфоузлов, стимулированных или EtxB, или EtxB (G33D), выявил важные различия, касающиеся как В-клеток, так и CD4 и CD8 -несущих Т-клеток. In vitro studies show that EtxB is capable of causing proliferation of primed cells from the lymph nodes. This property does not depend on receptor binding, since responses with the same anamnestic characteristics were obtained using both wild-type EtxB and EtxB (G33D) and heat-denominated monomeric forms of these proteins that do not bind to GM-1. These observations are interesting in their own right because it has been widely reported that commercial preparations of Ctx and CtxB or purified recombinant CtxB are potent inhibitors of in vitro lymphocyte proliferation. The apparent contradiction may arise from the fact that previous experiments were carried out with purified lymphocytes and that mutogen-stimulated lymphocyte cultures (which are not clonal restriction responses) were widely used when other different mechanisms could be included. This is consistent with our observation that the proliferation of Con A-stimulated lymphocytes is undoubtedly inhibited by EtxB. However, analysis of cell populations in cultures of primed cells from lymph nodes stimulated with either EtxB or EtxB (G33D) revealed important differences regarding both B cells and CD4 and CD8-bearing T cells.
В-клетки определялись через 4 дня после культивирования в присутствии или EtxB, или EtxB (G33D). Однако, по сравнению с EtxB (G33D), относительное количество В-клеток, присутствующих в среде с EtxB, было выше приблизительно на 100%. Это повышение сочеталось с экспрессией CD25 на очень большом количестве В-клеток. В показанном эксперименте отвечающие лимфоциты были праймированы EtxB (G33D) in vivo. Подобные эксперименты с клетками мышей, иммунизированных EtxB, показали сравнимые результаты. Таким образом, независимо от любых эффектов in vivo, связанных с рецепторным связыванием, среды в присутствии EtxB содержали большее количество В-клеток по сравнению со средами, стимулированными с EtxB (G33D). Подобные эффекты на В-клетках также проявлялись независимо, или частично завися, от регуляции Т-клетками, in vitro, так как результат не предполагает большого сдвига в профиле обнаруженных цитокинов. Таким образом, in vitro рецепторное связывание EtxB оказывается связанным с прямым воздействием на В-клетки, давая в результате как пропорциональное распространение этой популяции, так и ее активацию. Также заслуживает внимания, что CtxB показал повышение экспрессии МНС класса II на чистые В-клетки, свойство, которое не проявлялось GM-1- связывающим мутантом CtxB (G33D) (Francis M.L., Ryan J., Jobling M.G., Holmes R.K., Moss J. & Mond J. J. (1992) J. Immunol. 148, 1999-2005). Результат этих экспериментов предполагает наличие прямого мутантного эффект EtxB на антиген-праймированные В-клетки и показывает, что подобный эффект опосредован рецепторным связыванием. B cells were determined 4 days after cultivation in the presence of either EtxB or EtxB (G33D). However, compared to EtxB (G33D), the relative number of B cells present in the medium with EtxB was approximately 100% higher. This increase was combined with the expression of CD25 on a very large number of b cells. In the experiment shown, the responsive lymphocytes were primed with EtxB (G33D) in vivo. Similar experiments with cells of mice immunized with EtxB showed comparable results. Thus, regardless of any in vivo effects associated with receptor binding, media in the presence of EtxB contained a greater number of B cells than media stimulated with EtxB (G33D). Similar effects on B cells also appeared independently, or partially dependent, on T-cell regulation, in vitro, since the result does not suggest a large shift in the profile of the detected cytokines. Thus, in vitro EtxB receptor binding is associated with a direct effect on B cells, resulting in both a proportional distribution of this population and its activation. It is also noteworthy that CtxB showed increased expression of MHC class II on pure B cells, a property that was not exhibited by the GM-1 binding mutant CtxB (G33D) (Francis ML, Ryan J., Jobling MG, Holmes RK, Moss J. & Mond JJ (1992) J. Immunol. 148, 1999-2005). The result of these experiments suggests a direct mutant effect of EtxB on antigen-primed B cells and shows that a similar effect is mediated by receptor binding.
Кроме воздействия EtxB на В-клетки в культуре, проточный цитометирческий анализ выявляет, что этот токсоид вызывает полное истощение любых определимых CD8+ клеток. И снова показано, что этот эффект зависит от рецепторного связывания, так как эта же популяция Т-клеток не истощалась в среде, содержащей EtxB (G33D). Далее, наблюдалось полное истощение в культуре, содержащей EtxB, CD8+ клеток от мышей, иммунизированных диким типом EtxB. Существует три возможных механизма, которые могут опосредовать подобный эффект. 1) Известно, что связывание Ctx или CtxB с GM-1 на крысиных MLN- клетках вызывает образование бляшек и шапочки (Craig S.W. and Cuatrecasas P., (1975) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 72, p. 3844-3848). Возможно, что в этом процессе EtxB-GM-1 комплекс и другие молекулы, включая CD8, интернализированы. Подобный процесс может препятствовать определению этих клеток при проточной цитометрии при использовании CD8 в качестве маркера и может привести к их гибели благодаря ассоциативной потере пространственного TCR комплекса. Хотя последнее можно рассматривать как отсутствие CD8+ Т-клеток в культуре, другие не обнаруживают отсутствия TCR комплекса на поверхности Т-клеток человека линии Jarkat при использовании CtxB (Imboden J.B., Shoback D.M., Pattison G. & Stobo J.D., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 5673-5677). Отсутствие эффекта в результате кэппинга поддерживается тем, что обнаружено отсутствие влияния маркеров CD3 и CD4. 2) Альтернативный механизм включает эффект, осуществляемый цитокинами в культуре.В этом исследовании определялись как IL-2, так и IFN-γ. Результат, однако, не предполагает настолько большой сдвиг в профиле цитокина, который бы объяснил такое сильное воздействие на CD8+ Т-клетки. 3) Отсутствие CD8+ Т-клеток может быть следствием активной индукции апоптоза. Гибель лимфоцитов в результате апоптоза может включать кэппинг-феномен, как описывалось выше, или при отсутствии кэппинга может быть опосредовано воздействием на сигнальные события в клетке. Индуцированная активацией запрограммированная гибель зависит от Са2+ и включает фосфатазы и киназы. Показано, что связывание CtxB с лимфоцитами ингибирует протеинкиназную С-зависимую пролиферацию и индуцирует явное повышение внутриклеточного Са2+ события, которые не связаны с повышением уровня CAMP. Способность EtxB истощать CD8+, но не CD4+ Т-клетки может быть следствием воздействия различных сигналов, связанных с CD4/CD8-TCR комплексом, являясь результатом перекрестного связывания с GM-1 на поверхности клеток этих популяций лимфоцитов. Это может происходить, как результат различного связывания токсоида на мембране, как сообщалось для CtxB или наоборот, различных сигнальных механизмов в CD4+ и CD8+ Т-клетках.In addition to the effect of EtxB on B cells in culture, flow cytometric analysis reveals that this toxoid causes complete depletion of any detectable CD8 + cells. And again it was shown that this effect depends on receptor binding, since the same T-cell population was not depleted in a medium containing EtxB (G33D). Further, complete depletion in a culture containing EtxB of CD8 + cells from mice immunized with wild type EtxB was observed. There are three possible mechanisms that can mediate a similar effect. 1) It is known that the binding of Ctx or CtxB to GM-1 on rat MLN cells causes plaque and cap formation (Craig SW and Cuatrecasas P., (1975) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 72, p. 3844-3848). It is possible that in this process the EtxB-GM-1 complex and other molecules, including CD8, are internalized. A similar process can impede the determination of these cells by flow cytometry using CD8 as a marker and can lead to their death due to the associative loss of spatial TCR complex. Although the latter can be considered as the absence of CD8 + T cells in culture, others do not detect the absence of a TCR complex on the surface of Jarkat human T cells using CtxB (Imboden JB, Shoback DM, Pattison G. & Stobo JD, (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 5673-5677). The lack of effect as a result of capping is supported by the fact that a lack of influence of the CD3 and CD4 markers is detected. 2) An alternative mechanism involves the effect of cytokines in culture. In this study, both IL-2 and IFN-γ were determined. The result, however, does not suggest such a large shift in the cytokine profile that would explain such a strong effect on CD8 + T cells. 3) The absence of CD8 + T cells may be due to the active induction of apoptosis. The death of lymphocytes as a result of apoptosis can include a capping phenomenon, as described above, or in the absence of capping, it can be mediated by the effect on signaling events in the cell. The activation-induced programmed death is Ca 2+ dependent and includes phosphatases and kinases. Binding of CtxB to lymphocytes has been shown to inhibit protein kinase C-dependent proliferation and induce a clear increase in intracellular Ca 2+ events that are not associated with an increase in CAMP levels. The ability of EtxB to deplete CD8 + but not CD4 + T cells may be due to the effects of various signals associated with the CD4 / CD8-TCR complex, resulting from cross-linking with GM-1 on the cell surface of these lymphocyte populations. This can occur as a result of different toxoid binding on the membrane, as reported for CtxB or vice versa, different signaling mechanisms in CD4 + and CD8 + T cells.
При полном отсутствии определимых CD8+ Т-клеток, EtxB повышал количество CD4+ Т-клеток, которые были активированы, по сравнению с рецепторно связанным мутантом. Условия, необходимые для ответа CD4+ Т-клеток на Ctx продемонстрированы in vivo. Причины повышения активации этой Т-клеточной популяции, однако, остаются неясными. Заслуживает внимания, что показано, что CtxB стимулирует DNA синтез и клеточное деление в находящихся в покое нетрансформированных мышиных 3Т3 клетках. Избирательное мутагенное воздействие на CD4+ Т-клетки также было обнаружено в присутствии растительных лектинов, которые связываются с Galβ-1-3-3GalNAc, тем же компонентом, с которым EtxB связывается с GM-1. Нельзя исключить возможность, что EtxB опосредует зависимое от GM-1-связывания прямое воздействие на CD+ Т-клетки, вызывая их активацию. Однако, также возможно, что повышение активации CD4+ Т-клеток в культурах, содержащих EtxB, является результатом описанных изменений в В-клеточных и CD8+ Т-клеточных популяциях. Известно, что активация В-клеток связана с повышением их компетентности, как клеток, представляющих антиген для CD4+ Т-клеток. Кроме того, CD8+ Т-клетки широко связаны с регуляторной ролью в иммунной реактивности как in vivo, так и in vitro. Их удаление из Т-клеточных пролиферативных культур связано с пролонгированными и повышенными уровнями деления CD4+ Т-клеток.In the complete absence of detectable CD8 + T cells, EtxB increased the number of CD4 + T cells that were activated compared to the receptor-bound mutant. The conditions necessary for the response of CD4 + T cells to Ctx have been demonstrated in vivo. The reasons for the increased activation of this T-cell population, however, remain unclear. It is noteworthy that CtxB has been shown to stimulate DNA synthesis and cell division in resting untransformed murine 3T3 cells. Selective mutagenic effects on CD4 + T cells have also been detected in the presence of plant lectins that bind to Galβ-1-3-3GalNAc, the same component that EtxB binds to GM-1. It cannot be ruled out that EtxB mediates a direct GM-1 binding-dependent direct effect on CD + T cells, causing their activation. However, it is also possible that increased activation of CD4 + T cells in cultures containing EtxB is the result of the described changes in B-cell and CD8 + T-cell populations. Activation of B cells is known to be associated with an increase in their competence as cells representing the antigen for CD4 + T cells. In addition, CD8 + T cells are widely associated with a regulatory role in immune reactivity both in vivo and in vitro. Their removal from T-cell proliferative cultures is associated with prolonged and increased levels of division of CD4 + T-cells.
Обобщив, можно предположить, что сильная иммуногенность EtxB in vivo, как показало исследование, оказывается результатом их способности повышать активацию В-клеток под влиянием эффектов регуляции роста после связывания с GM-1. Активность CD4+ Т-клеток и способность EtxB увеличивать IL-2 в культуре in vitro могут служить необходимым сигналом для дальнейшего распространения клонов В-клеток. Истощение CD8+ Т-клеток EtxB in vitro в этом исследовании может также предполагать другой механизм иммунопотенцирование in vivo после системного или орального введения, особенно в свете включения этой популяции клеток в суппрессию иммунного ответа и в оральную толерантность. С этой точки зрения показано, что как Ctx, так и Etx отменяют оральную толерантность к одновременно орально введенным растворимым белкам, другие исследования для объяснения этого механизма включают эффект Ctx и CtxB истощения интраэпителиальных лимфоцитов в кишечнике или в своде Пейровой бляшки. Также показано, что CtxB-ингибирующее воздействие на CD8+ Т-клетки in vitro предупреждает реакцию трансплантат против хозяина.Summarizing, it can be assumed that the strong immunogenicity of EtxB in vivo, as the study showed, is the result of their ability to increase the activation of B cells under the influence of growth regulation after binding to GM-1. The activity of CD4 + T cells and the ability of EtxB to increase IL-2 in an in vitro culture can serve as a necessary signal for the further spread of B cell clones. The in vitro depletion of EtxB CD8 + T cells in this study may also suggest a different mechanism for in vivo immunopotentiation after systemic or oral administration, especially in light of the inclusion of this cell population in suppression of the immune response and in oral tolerance. From this point of view, it was shown that both Ctx and Etx cancel oral tolerance to simultaneously orally administered soluble proteins; other studies to explain this mechanism include the effect of Ctx and CtxB depletion of intraepithelial lymphocytes in the intestine or in the Peira plaque arch. It has also been shown that the in vitro CtxB inhibitory effect on CD8 + T cells prevents the graft versus host reaction.
В заключение продемонстрировано наличие сильного иммуномодуляторного воздействия EtxB на антительный ответ in vivo, и на популяции лимфоцитов in vitro. Кроме того, показано, что это воздействие опосредовано рецепторным связыванием. Наши выводы также относятся к пониманию способности Etx и Ctx действовать подобно сильному адъюванту и потенциальному белковому носителю для других антигенов, и предполагается, что такие свойства основаны на способности этих токсоидов связывать ганглиозидные рецепторы на поверхности лимфоидных клеток. In conclusion, the presence of a strong immunomodulatory effect of EtxB on the in vivo antibody response and on the in vitro lymphocyte population was demonstrated. In addition, it is shown that this effect is mediated by receptor binding. Our findings also relate to understanding the ability of Etx and Ctx to act like a strong adjuvant and potential protein carrier for other antigens, and it is suggested that such properties are based on the ability of these toxoids to bind ganglioside receptors on the surface of lymphoid cells.
Пример 2
Этот пример иллюстрирует, что воздействие на CD8 клетки не зависит от антигенного распознавания и медиируется апоптозом.Example 2
This example illustrates that exposure to CD8 cells is independent of antigenic recognition and is mediated by apoptosis.
Рекомбинантные препараты EtxB и EtxB (G33D) получают, как в Примере 1. Оба белка хорошо охарактеризованы в отношении связывания GM-1, связывания с рядом моноклональных и поликлональных антител и различных других физико-химических свойств. Яичный альбумин (OVA) приобретен у Sigma (Poole, UK). Мезентеральные лимфоузлы (MNL) выделяют у мышей BALB/c [линия с высоким ответом к EtxB (Nashar Т.О. and Hirst T.R. 1995. Immunoregulatory role of H-2 and intra-H-2 alleles on antibody responses to recombinant preparations of B-subunits of Escherichia coli heat-labile enterotoxin (rEtxB) and cholera toxin (rCtxB). Vaccine 13:803.)] 8-10 недель жизни. Мышам делают интраперитонеальную инъекцию с 200 мкг OVA (Sigma) эмульгированным в неполном адъюванте Фрейда (Sigma). MNL удаляют через 10 дней после инъекции, измельчают в сите из нержавеющей стали в HBSS (Flow, Irvine, UK). Удаленные клетки промывают в HBSS центрифугацией (500•g, 10 минут, 4oС) и ресуспендируют в модифицированной Eagle's среде (Flow), содержащей 20 мМ HEPES (Flow), 100 IU пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 4мМ L-глютамина и 5•10-5 М 2-меркаптоэтанола (полная среда), к которой добавляют 0,5% (вес/вес) свежей аутологичной мышиной сыворотки. Культуры содержат 2•106 жизнеспособных клеток/мл в каждых 2 мл объема в платах с 24 лунками (Nunc, Roskide, Denmark) и культивируют в присутствии 100 мкг/мл OVA (экстенсивно диализованного в полной среде), или самого по себе, или с 40 мкг/мл EtxB или EtxB (G33D). Культуры инкубируют при 37oС в 5% CO2 и 95% воздуха в течение 5 дней. В ожидаемый момент времени 0,1 мл образцы извлекают из среды и переносят на платы с 96 лунками с U-образным дном (Nunc) и импульсно метят 1 мкКи/лунку [3H]-тимидина (Amersham, UK) за 6 часов перед тем, как собрать (Mash III harvesting 96; Tomtec, Orange, CT) и посчитать стандартной жидкой сцинцилляцией (1450 Micro b plus, LKB-Wallac, Turku, Finland). Для проточного цитометрического анализа (Becton Dickinson, Erenbodegem-Aalst, Belgium) Т-клетки метят следующими крысиными антителами: (PharMin-gen, Cambridge, UK): FITC, меченный анти-СD4 (RNRM4-5) или FIТС-анти-СD8α (53-6.7) и биотин, меченный анти-СD25 (IL-2Rα) (7D4) с последующим Стрептавидин-фикоэритрином. Кроме того, для биотинмеченых антител используют FITC-меченый Стрептавидин. FACS анализы выделенных клеток проводят на пике пролиферации (4 день), как определено путем [3Н]-тимидин инкорпорации.Recombinant preparations EtxB and EtxB (G33D) are prepared as in Example 1. Both proteins are well characterized for binding to GM-1, binding to a number of monoclonal and polyclonal antibodies, and various other physicochemical properties. Egg Albumin (OVA) was purchased from Sigma (Poole, UK). Mesenteric lymph nodes (MNL) are isolated in BALB / c mice [high response line to EtxB (Nashar T.O. and Hirst TR 1995. Immunoregulatory role of H-2 and intra-H-2 alleles on antibody responses to recombinant preparations of B -subunits of Escherichia coli heat-labile enterotoxin (rEtxB) and cholera toxin (rCtxB). Vaccine 13: 803.)] 8-10 weeks of life. Mice are given an intraperitoneal injection with 200 μg OVA (Sigma) emulsified in Freud's incomplete adjuvant (Sigma). MNL is removed 10 days after injection, crushed in a stainless steel sieve in HBSS (Flow, Irvine, UK). The removed cells were washed in HBSS by centrifugation (500 x g, 10 minutes, 4 ° C) and resuspended in modified Eagle's medium (Flow) containing 20 mM HEPES (Flow), 100 IU penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 4 mM L-glutamine and 5 • 10 -5 M 2-mercaptoethanol (complete medium), to which 0.5% (w / w) fresh autologous mouse serum is added. Cultures contain 2 • 10 6 viable cells / ml in every 2 ml of volume in 24-well plates (Nunc, Roskide, Denmark) and are cultured in the presence of 100 μg / ml OVA (extensively dialyzed in complete medium), or by itself, or with 40 μg / ml EtxB or EtxB (G33D). The cultures are incubated at 37 ° C. in 5% CO 2 and 95% air for 5 days. At the expected point in time, 0.1 ml of samples was removed from the medium and transferred to 96-well plates with a U-shaped bottom (Nunc) and 1 μCi / well of [ 3 H] -thymidine (Amersham, UK) was pulsed 6 hours before how to collect (Mash III harvesting 96; Tomtec, Orange, CT) and count as standard liquid scintillation (1450 Micro b plus, LKB-Wallac, Turku, Finland). For flow cytometric analysis (Becton Dickinson, Erenbodegem-Aalst, Belgium) T cells were labeled with the following rat antibodies: (PharMin-gen, Cambridge, UK): FITC labeled with anti-CD4 (RNRM4-5) or FITC-anti-CD8α ( 53-6.7) and biotin labeled with anti-CD25 (IL-2Rα) (7D4) followed by streptavidin-phycoerythrin. In addition, FITC-labeled Streptavidin is used for biotagged antibodies. FACS analyzes of isolated cells were performed at the peak of proliferation (4 days), as determined by [ 3 H] -thymidine incorporation.
Для оценки апоптоза, свежие MNL-клетки (MLNC) и селезеночные Т-клетки (SPLTC) выделяют у BALB/c мышей 8-10 недель жизни. MLNC, содержащие >90% CD3+ Т-клеток, как определено при проточном цитометрическом анализе, инкубируют в течение 2 часов в чашках Петри (Costar, Cambridge, MA) в полной среде, содержащей 10% FCS, при 37oС в 5% СO2 и 95% воздуха для удаления прилипших клеток. Неприлипшие клетки последовательно отсасывают пипеткой, осаждают и дважды промывают в HBSS перед использованием. SPLTC очищают отрицательным отбором, используя стеклянные гранулы, покрытые нормальной мышиной сывороткой с последующими кроличьими анти-мышиными глобулинами. Как было описано (Wigzell Н. (1976). Specific affinity fractionation of lymphocytes using glass or plastic bead columns. Scand. J. Immunol. 5: (suppl. 5) 23). Выделенная популяция Т-клеток содержала 90% CD3+, как определено проточным цитометрическим анализом.To evaluate apoptosis, fresh MNL cells (MLNC) and splenic T cells (SPLTC) were isolated from BALB / c mice for 8-10 weeks of life. MLNCs containing> 90% CD3 + T cells, as determined by flow cytometric analysis, are incubated for 2 hours in Petri dishes (Costar, Cambridge, MA) in complete medium containing 10% FCS, at 37 ° C. in 5% CO 2 and 95% air to remove adherent cells. Non-adherent cells are successively pipetted, pelleted and washed twice in HBSS before use. SPLTC was purified by negative selection using glass pellets coated with normal mouse serum followed by rabbit anti-mouse globulins. As described (Wigzell, N. (1976). Specific affinity fractionation of lymphocytes using glass or plastic bead columns. Scand. J. Immunol. 5: (suppl. 5) 23). The isolated T-cell population contained 90% CD3 + , as determined by flow cytometric analysis.
CD4+ и CD8+ Т-клетки разделяют следующим образом: прилипшие MLNC метят крысиными фикоэритрин-анти-мышиными CD4 (4708-02) или FITC-анти-мышиными CD8α (53-6.7) (PharMingen) и затем инкибируют с MACS коллоидными супер-парамагнитными микрогранулами, конъюгированными с козьими анти-крысиными IgG (Н + L) F(ab')2 (PharMingen), в соответствии с инструкцией по получению. Их наносят на мини-МАСS колонку (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) для разделения положительных (>99% чистоты) и отрицательных (>90% чистоты) выбранных популяций CD4 и CD8+ Т-клеток, как определено проточным цитометрическим анализом.CD4 + and CD8 + T cells are separated as follows: adherent MLNCs are labeled with rat phycoerythrin anti-mouse CD4 (4708-02) or FITC anti-mouse CD8α (53-6.7) (PharMingen) and then incubated with MACS colloidal super- paramagnetic microbeads conjugated to goat anti-rat IgG (H + L) F (ab ') 2 (PharMingen), in accordance with the instructions for receipt. They are applied to a mini-MACS column (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) to separate the positive (> 99% purity) and negative (> 90% purity) selected populations of CD4 and CD8 + T cells, as determined by flow cytometric analysis.
Два метода используются для количественного анализа апоптоза: i) DNA метят акридин оранжевым для проверки морфологии ядра и ii) анализ клеточного цикла после того, как DNA был помечен пропидиум йодидом и анти-СD4 или анти-CD8 антителами. Two methods are used to quantify apoptosis: i) DNA is labeled with acridine orange to check the core morphology; and ii) cell cycle analysis after DNA has been labeled with propidium iodide and anti-CD4 or anti-CD8 antibodies.
Культуры 2•105/мл MLNC, SPLTC и фракционированных MLNC культивируют в полной среде, содержащей 10% FCS, в отсутствие или в присутствии 80 мкг/мл или EtxB или EtxB (G33D) и проверяют через 4-18 часов. После инкубации, клетки осаждают, промывают с HBSS и метят 5 мкг/мл акридина оранжевого (Sigma).Cultures of 2 x 10 5 / ml MLNC, SPLTC and fractionated MLNC were cultured in complete medium containing 10% FCS in the absence or presence of 80 μg / ml or EtxB or EtxB (G33D) and checked after 4-18 hours. After incubation, the cells are pelleted, washed with HBSS and labeled with 5 μg / ml orange acridine (Sigma).
Тимоциты выделяют и обрабатывают в отсутствие или в присутствии 10-7 М дексаметазона и используют в качестве положительного контроля для клеток, подвергнутых апоптозу. Морфологические изменения ядра в лимфоцитах исследовали нормальной или конфокальной флуорисцентной микроскопией (Leica TCS 4D). Количество CD4+ и CD8+ SPLTC в суб-G0/G1 стадии клеточного цикла определяют при проточном цитометрическом анализе содержания DNA после окрашивания пропидиум йодидом, как было описано (О'Connor P.M., Jackman J., Jondle D., Bhatia K., Magrath I. and Kohn K.W. 1993. Role of p53 tumor suppressor gene in cell cycle arrest and radiosensitivity of Burkitt's lymphoma cell lines. Cancer. Res. 53:4776). Клетки выделяют из 18-часовой культуры SPLTC, инкубируют сами по себе или с 40 мкг/мл EtxB или EtxB (G33D) меченными FITC крысиными анти-СD4 или FITC-анти-CD8α. Меченые клетки доводят до 1•106/мл холодным HBSS, содержащим 20 мМ HEPES и 0,5 мМ EDTA и фиксируют холодным этанолом, добавляемым капельно. Затем добавляют 50 мкг/мл проподиум йодида и 40 мкг/мл рибонуклеазы A (DNasa свободная) и клетки инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре. Относительную интенсивность DNA окрашивания проподиум йодидом в CD4 и CD8+ Т-клетках определяют путем установки дискриминационного окна на клетки, одновременно помеченные с каждым mАВ.Thymocytes are isolated and treated in the absence or in the presence of 10 -7 M dexamethasone and are used as a positive control for apoptotic cells. Morphological changes in the nucleus in lymphocytes were examined by normal or confocal fluorescence microscopy (Leica TCS 4D). The amount of CD4 + and CD8 + SPLTC in the sub-G 0 / G 1 stage of the cell cycle is determined by flow cytometric analysis of DNA content after staining with propidium iodide, as described (O'Connor PM, Jackman J., Jondle D., Bhatia K. , Magrath I. and Kohn KW 1993. Role of p53 tumor suppressor gene in cell cycle arrest and radiosensitivity of Burkitt's lymphoma cell lines. Cancer. Res. 53: 4776). Cells were isolated from an 18-hour SPLTC culture, incubated alone or with 40 μg / ml EtxB or EtxB (G33D) FITC-labeled rat anti-CD4 or FITC-anti-CD8α. Labeled cells were adjusted to 1 x 10 6 / ml with cold HBSS containing 20 mM HEPES and 0.5 mM EDTA and fixed with cold ethanol added dropwise. Then add 50 μg / ml propodium iodide and 40 μg / ml ribonuclease A (DNasa free) and the cells are incubated for 1 hour at room temperature. The relative intensity of DNA staining with propodium iodide in CD4 and CD8 + T cells is determined by installing a discriminatory window on cells simultaneously labeled with each mAB.
В Примере 1, наблюдение, что CD8+ Т-клетки полностью истощаются из культуры клеток лимфоузлов, пролифилируя в ответ на EtxB, предполагает, что EtxB вызывает поликлональное воздействие на эту Т-клеточную популяцию. Для выяснения, зависит ли подобный эффект от активации EtxB чувствительных клеток, культуры создавали из клеток OVA-праймированных мышей и стимулировали только одним OVA или OVA с EtxB или с мутантным EtxB (G33D). Одинаковые пиковые уровни пролиферации (4 день культивирования в каждом случае) достигались в присутствии одного OVA, OVA плюс EtxB или OVA плюс EtxB (G33D) (9734±347, 12,031±135 и 9305±290 c.p.m. соответственно). Однако существуют серьезные различия в распределении популяций Т-клеток в этих культурах через 4 дня (фиг. 6). Все культуры содержат CD4+ Т-клетки, из которых одинаковое количество одновременно экспрессирует активирующий маркер CD25. Однако CD8+ Т-клетки не определяются в культурах, инкубированных с OVA плюс EtxB, но очевидно присутствуют (хотя не активированные, как определено по CD25 экспрессии) в культурах с OVA плюс EtxB (G33D) или с одним OVA. Это доказывает, что EtxB вызывает истощение CD8+ Т-клеток, реагируя на антиген, отличный от EtxB. Более того, отсутствие такого ответа на EtxB (G33D) указывает на то, что истощение запускается вслед за рецепторным воздействием токсоида. Также отмечалось, что присутствие дикого типа EtxB вызывает значительное повышение количества В-клеток, среди которых большое число составляют CD25+ (не показано), как раннее было обнаружено для EtxB чувствительных культур (Пример 1). Из этого делается вывод, что рецепторное связывание EtxB оказывает абсолютное иммуномодуляторное воздействие на лимфоциты независимо от их антигенной специфичности.In Example 1, the observation that CD8 + T cells are completely depleted from a lymph node cell culture, proliferating in response to EtxB, suggests that EtxB induces a polyclonal effect on this T cell population. To determine whether a similar effect depends on the activation of EtxB sensitive cells, cultures were created from cells of OVA-primed mice and stimulated with only one OVA or OVA with EtxB or with mutant EtxB (G33D). The same peak proliferation levels (4 days of cultivation in each case) were achieved in the presence of one OVA, OVA plus EtxB or OVA plus EtxB (G33D) (9734 ± 347, 12.031 ± 135 and 9305 ± 290 cpm, respectively). However, there are serious differences in the distribution of T-cell populations in these cultures after 4 days (Fig. 6). All cultures contain CD4 + T cells, of which the same amount simultaneously expresses the activating marker CD25. However, CD8 + T cells are not detected in cultures incubated with OVA plus EtxB, but are obviously present (although not activated, as determined by CD25 expression) in cultures with OVA plus EtxB (G33D) or with one OVA. This proves that EtxB causes depletion of CD8 + T cells in response to an antigen other than EtxB. Moreover, the absence of such a response to EtxB (G33D) indicates that depletion is triggered following the receptor exposure of the toxoid. It was also noted that the presence of wild-type EtxB causes a significant increase in the number of B cells, among which a large number are CD25 + (not shown), as was previously found for EtxB sensitive cultures (Example 1). From this it is concluded that the receptor binding of EtxB has an absolute immunomodulatory effect on lymphocytes, regardless of their antigenic specificity.
Исследовалась возможность того, что CD8+ Т-клетки подвергаются апоптозу, когда культивируются в присутствии EtxB. MLNC или очищенные SPLTC от непраймированных мышей инкубируют с EtxB или EtxB (G33D) и изменения в морфологии клеточного ядра после окрашивания акридином оранжевым обнаруживают через 4-18 часов (таблица 3 и фиг. 7). Клеточные морфологические изменения характеризуются присутствием скоплений хроматина, что проявляется в появлении дольчатости ядра (фиг. 7). Также наблюдались другие клеточные структуры, такие как пузырьки плазматической мембраны и присутствие апоптозных тел. Эти морфологические изменения появлялись в каждом третьем клеточном препарате, обработанном EtxB, тогда как значительно меньший охват наблюдался в клетках, культивированных с EtxB (G33D) или без экзогенного антигена (таблица 3). Так как CD8+ Т-клетки составляют 35-40% MLNC и SPLTC препаратов, истощение этих клеток не может быть ответственным за наблюдаемый апоптоз. Для выяснения, тот ли это случай, популяция очищенных CD8 и CD4+ Т-клеток культивировали в течение 18 часов в присутствии антигенов (таблица 3). Одинаковый процент морфологических изменений был вызван в отрицательно отобранных популяциях CD4+ Т-клеток (содержащих >90% CD4-несущих клеток) при обработке с EtxB, EtxB (G33D) или без антигена, указывая, что связывание EtxB со своим рецептором не является пусковым механизмом апоптоза в этой Т-клеточной популяции. В противоположность этому, в >70% отрицательно отобранных CD8+ Т-клеток (>90% очищения) выявлены морфологические изменения при культивировании с диким типом EtxB; в то время как инкубация или без антигена, или с EtxB (G33D) вызывала изменения только в 11-19% этих Т-клеточных популяций соответственно. Кроме того, присутствие небольшого числа загрязняющих клеток в использованной очищенной популяции (~10% в каждом случае) не могли считать за наблюдаемый эффект, так как более хорошо очищенные популяции, содержащие >99% CD8 или CD4+ Т-клеток (выделенных положительным отбором) отвечали на EtxB таким же образом (60% были апоптичными в присутствии EtxB по сравнению с 7% как для отсутствия антигена, так и для EtxB (G33D) обработки) (таблица 3). Апоптоз определялся в 40% и 98% тимоцитов после 18 часов инкубации в отсутствие или в присутствии дексаметазона соответственно.The possibility was studied that CD8 + T cells undergo apoptosis when cultured in the presence of EtxB. MLNCs or purified SPLTCs from non-primed mice were incubated with EtxB or EtxB (G33D) and changes in the cell nucleus morphology after staining with acridine orange were detected after 4-18 hours (table 3 and Fig. 7). Cellular morphological changes are characterized by the presence of accumulations of chromatin, which is manifested in the appearance of lobation of the nucleus (Fig. 7). Other cell structures such as vesicles of the plasma membrane and the presence of apoptotic bodies have also been observed. These morphological changes appeared in every third cell preparation treated with EtxB, while significantly less coverage was observed in cells cultured with EtxB (G33D) or without exogenous antigen (table 3). Since CD8 + T cells make up 35-40% of MLNC and SPLTC drugs, depletion of these cells cannot be responsible for the observed apoptosis. To find out if this is the case, the population of purified CD8 and CD4 + T cells was cultured for 18 hours in the presence of antigens (table 3). The same percentage of morphological changes was caused in negatively selected populations of CD4 + T cells (containing> 90% of CD4-bearing cells) when treated with EtxB, EtxB (G33D) or without antigen, indicating that binding of EtxB to its receptor is not a trigger apoptosis in this T cell population. In contrast, morphological changes were revealed in> 70% of the negatively selected CD8 + T cells (> 90% of purification) when cultured with wild type EtxB; while incubation with or without antigen or with EtxB (G33D) caused changes in only 11-19% of these T-cell populations, respectively. In addition, the presence of a small number of contaminating cells in the used purified population (~ 10% in each case) could not be considered the observed effect, since more well-purified populations containing> 99% of CD8 or CD4 + T cells (isolated by positive selection) responded to EtxB in the same way (60% were apoptotic in the presence of EtxB compared to 7% for both the absence of antigen and the EtxB (G33D) treatment) (table 3). Apoptosis was detected in 40% and 98% of thymocytes after 18 hours of incubation in the absence or presence of dexamethasone, respectively.
Чтобы продемонстрировать, что морфологические изменения, наблюдавшиеся в наших культурах, согласуются с индукцией апоптоза, оценивалось появление субдиплоидного DNA в культурах SPLTC, обработанных EtxB в течение 18 часов. Клетки подвергали проточному цитометрическому анализу после того, как их одновременно метили пропидиум йодидом и или анти-CD8 или анти-СD4 антителами (фиг. 8). Приблизительно 48% CD8+ Т-клеток из культур, инкубированных с EtxB, падает ниже диплоидного G0/G1 пика пропидиум йодидного окрашивания, показывая, что они подвержены апоптозу (О'Connor P.M. et al. supra). Небольшое количество клеток, экспрессирующих CD4, в культурах EtxB, также показывает суб-G0/G1 уровни DNA (~11%; которые могут быть результатом гибели такого большого количества CD8+ Т-клеток). В противоположность этому, большинство CD4 или CD8+ Т-клеток, культивированных без антигена или в присутствии EtxB (G33D), находилось в G0/G1 фазе клеточного цикла, с <0,5% проявленного апоптоза. Мы делаем вывод, что наблюдаемые ядерные морфологические изменения и присутствие суб-G0/G1 уровней DNA в значительном количестве CD8+ Т-клеток, обработанных EtxB, демонстрируют избирательный апоптоз, запущенный холероподобным энтеротоксоидом. Недостаток в рецепторном связывании мутанта, EtxB (G33D), чтобы вызвать такое воздействие, демонстрирует, что индукция CD8+ Т-клеточного апоптоза связана с их способностью связывать GM-1 ганглиозид.To demonstrate that the morphological changes observed in our cultures are consistent with the induction of apoptosis, the appearance of subdiploid DNA was evaluated in SPLTC cultures treated with EtxB for 18 hours. The cells were subjected to flow cytometric analysis after they were simultaneously labeled with propidium iodide and either anti-CD8 or anti-CD4 antibodies (Fig. 8). Approximately 48% of CD8 + T cells from cultures incubated with EtxB drop below the diploid G 0 / G 1 peak of propidium iodide staining, indicating that they are prone to apoptosis (O'Connor PM et al. Supra). A small number of CD4 expressing cells in EtxB cultures also show sub-G 0 / G 1 DNA levels (~ 11%; which may result from the death of such a large number of CD8 + T cells). In contrast, most CD4 or CD8 + T cells cultured without antigen or in the presence of EtxB (G33D) were in the G 0 / G 1 phase of the cell cycle, with <0.5% of apoptosis manifested. We conclude that the observed nuclear morphological changes and the presence of sub-G 0 / G 1 DNA levels in a significant number of CD8 + T cells treated with EtxB demonstrate selective apoptosis triggered by a cholera-like enterotoxoid. A deficiency in the receptor binding of the mutant, EtxB (G33D) to induce such an effect, demonstrates that the induction of CD8 + T-cell apoptosis is related to their ability to bind GM-1 ganglioside.
Пример 3
Группы из 8 самцов DBA/l мышей не подвергаются контрольному заражению (группа А) или инъецируются 100 мкг бычьего коллагена в CFA в 0 день интрадермальной инъекцией в бок. Мыши, инъецированные коллагеном, или не защищены (группа В; положительный контроль), или сделана попытка предупредить развитие болезни интрадермальным введением в область, смежную с областью заражения коллагеном, 100 мкг EtxB в IFA в 0 день (группа С), 100 мкг EtxB в IFA на 14 день (группа D), или 100 мкг EtxB (G33D) в IFA в 0 день (группа Е). Все животные, за исключением входящих в группу А, получали возрастающие дозы коллагена в IFA интрадермально на 21 день, и тяжесть заболевания оценивалась на 45 день измерением слабости лодыжки задней конечности (эксперимент А) или учитывая каждый палец задней конечности по распуханию (значения 0-3, где 0=норма, 3=максимум распухания; эксперимент В).Example 3
Groups of 8 male DBA / l mice were not challenged (Group A) or 100 μg of bovine collagen in CFA was injected on
Полученные результаты проиллюстрированы на фиг. 9а и 9б. Они показывают, что EtxB, но не EtxB (G33D), существенно предохраняют мышей от развития коллаген-вызванного артрита. The results obtained are illustrated in FIG. 9a and 9b. They show that EtxB, but not EtxB (G33D), significantly protects mice from developing collagen-induced arthritis.
Пример 4а
Два раздельных человеческих образца светлого слоя кровяного сгустка (полученного из нормальной человеческой крови доноров) используют в качестве источника мононуклеарных клеток. Клетки выделяют под Ficollpaque и экстенсивно промывают перед культивированием в отсутствие антигена или с 80 мкг/мл или EtxB, или EtxB (G33D), как указывалось. До культивирования клеточные популяции содержали 24% CD8+, 27% CD4+ и 27% CD8+, 22,9% CD4+ для каждого образца соответственно. После культивирования в течение 18 часов появление апоптических клеток определяют в образцах клеток, окрашенных акридином оранжевым (как детализировано в Примере 2). Полученные результаты показаны на фиг. 10; они иллюстритуют, что EtxB, но не EtxB (G33D) вызывает апоптоз в популяции нормальных человеческих мононуклеарных клеток периферической крови.Example 4a
Two separate human samples of a light layer of a blood clot (obtained from normal human donor blood) are used as a source of mononuclear cells. Cells were isolated under Ficollpaque and washed extensively before cultivation in the absence of antigen with either 80 μg / ml or EtxB or EtxB (G33D), as indicated. Prior to cultivation, cell populations contained 24% CD8 + , 27% CD4 + and 27% CD8 + , 22.9% CD4 + for each sample, respectively. After culturing for 18 hours, the appearance of apoptotic cells was determined in cell samples stained with acridine orange (as detailed in Example 2). The results are shown in FIG. 10; they illustrate that EtxB but not EtxB (G33D) induces apoptosis in a population of normal human peripheral blood mononuclear cells.
Пример 4б
Т-клетки мышиной линии, CTLL-2, культивируют до слияния, и затем клетки промывают перед повторным посевом при 1•106 клеток/мл в отсутствие антигена или с 80 мкг/мл или EtxB, или EtxB (G33D), как было указано. Через 18 часов образцы удаляют и определяют процентное содержание клеток, показывающих признаки апоптоза, используя акридин оранжевый (детали в Примере 2). Полученные результаты проиллюстрированы на фиг. 11. Они показывают, что перекрестное связывание GM-1 ведет к апоптозу в части мышиных CTLL клеток.Example 4b
Mouse line T cells, CTLL-2, are cultured before fusion, and then the cells are washed before re-plating at 1 x 10 6 cells / ml in the absence of antigen or with 80 μg / ml or EtxB or EtxB (G33D), as indicated . After 18 hours, the samples were removed and the percentage of cells showing signs of apoptosis was determined using acridine orange (details in Example 2). The results obtained are illustrated in FIG. 11. They show that cross-linking of GM-1 leads to apoptosis in part of murine CTLL cells.
Мышей инъецируют интраперитонеально 30 мкг EtxB (G33D) в полном адъюванте Фрейда (CFA). Мезентериальные лимфоузлы выделяют через 10 дней. Клетки выделяют и инкубируют в течение 4 дней в присутствии EtxB, EtxB (G33D) или разобранных мономеров этих белков (*), полученных при нагревании до 95oС. Пролиферацию определяют при добавлении 1 мкКи (3H) dThd в последние 6 часов 4 дня. Данные представляют среднюю срm и SEM из трех лунок. Клетки, выделенные из иммунизированных мышей, дают <1500 срm (доза 160 мкг/мл).Mice were injected intraperitoneally with 30 μg EtxB (G33D) in Freud's complete adjuvant (CFA). Mesenteric lymph nodes secrete after 10 days. Cells are isolated and incubated for 4 days in the presence of EtxB, EtxB (G33D) or disassembled monomers of these proteins (*) obtained by heating to 95 ° C. Proliferation is determined by adding 1 μCi ( 3 H) dThd in the last 6
Мышей инъецируют EtxB (G33D) в CFA и клетки мезентериальных лимфоузлов изолируют 10 днями позже. Затем клетки инкубируют in vitro или с EtxB, или EtxB (G33D) и образцы супернатантов исследуют на содержание цитокинов на 5 день клеточной пролиферации. Mice are injected with EtxB (G33D) in CFA and the cells of the mesenteric lymph nodes are isolated 10 days later. Cells are then incubated in vitro with either EtxB or EtxB (G33D) and supernatant samples are examined for cytokines on
Нуклеарные морфологические изменения во фракционированных CD4 и CD8+ Т-клетках после 4 или после 18 часов инкубации в отсутствие антигена, или с 80 мкг/мл EtxB, или EtxB (G33D) исследуют флуоресцентной микроскопией с акридином оранжевым. Все MLN из приросших были истощены. SPLTC выделяют отрицательным выделением со стеклянными гранулами, покрытыми мышиными γ-глобулинами и кроличьими анти-мышиными, как вторичными антителами. Фракционированные SPLTC получают после того, как их метят крысиными фикоэритрин-анти-мышиными CD4 или FITC-анти-мышиными CD8α, которые затем инкубируют с MACS коллоидными суперпарамагнитными микрогранулами, конъюгированными с козьими анти-крысиными IgG (Н+L) F(ab')2. Их разделяли, используя мини-MACS колонку для получения как положительных (>99% чистоты), так и отрицательных (>90% чистоты) избирательных фракций CD4 и CD8+ Т-клеток. Нуклеарные морфологические изменения выявлялись с 4 по 18 часы в случайно выбранных образцах из 200 клеток на опыт, как описывалось в описании к фиг. 7. Максимальное число клеток с апоптозом появилось после 18 часов. Данные в скобках, когда указывается результат из другого отдельного эксперимента. Данные для MLN и SPLTC представлены как общие из четырех экспериментов.Nuclear morphological changes in fractionated CD4 and CD8 + T cells after 4 or after 18 hours of incubation in the absence of antigen, or with 80 μg / ml EtxB or EtxB (G33D) are examined by acridine orange fluorescence microscopy. All of the grown MLNs were depleted. SPLTCs are isolated by negative excretion with glass granules coated with murine γ-globulins and rabbit anti-murine like secondary antibodies. Fractionated SPLTCs are prepared after they have been labeled with rat phycoerythrin anti-mouse CD4 or FITC anti-mouse CD8α, which are then incubated with MACS colloidal superparamagnetic microbeads conjugated to goat anti-rat IgG (H + L) F (ab ') 2 . They were separated using a mini-MACS column to obtain both positive (> 99% purity) and negative (> 90% purity) selective fractions of CD4 and CD8 + T cells. Nuclear morphological changes were detected from 4 to 18 hours in randomly selected samples of 200 cells per experiment, as described in the description of FIG. 7. The maximum number of cells with apoptosis appeared after 18 hours. Data in parentheses when the result from another separate experiment is indicated. Data for MLN and SPLTC are presented as common of four experiments.
Claims (3)
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB9513733.7 | 1995-07-05 | ||
| GBGB9513733.7A GB9513733D0 (en) | 1995-07-05 | 1995-07-05 | Therapeutic agents |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU98101907A RU98101907A (en) | 1999-11-10 |
| RU2203088C2 true RU2203088C2 (en) | 2003-04-27 |
Family
ID=10777189
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU98101907/14A RU2203088C2 (en) | 1995-07-05 | 1996-07-05 | Therapeutic agents and autoimmune diseases |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6287563B1 (en) |
| EP (1) | EP0841939B1 (en) |
| JP (1) | JP4024298B2 (en) |
| KR (1) | KR100452000B1 (en) |
| CN (1) | CN1313150C (en) |
| AT (1) | ATE275968T1 (en) |
| AU (1) | AU724516B2 (en) |
| CA (1) | CA2225788C (en) |
| CZ (1) | CZ298670B6 (en) |
| DE (1) | DE69633393T2 (en) |
| DK (1) | DK0841939T3 (en) |
| ES (1) | ES2229276T3 (en) |
| GB (1) | GB9513733D0 (en) |
| HK (1) | HK1006496A1 (en) |
| HU (1) | HU224248B1 (en) |
| MX (1) | MX9800241A (en) |
| NO (1) | NO319747B1 (en) |
| NZ (1) | NZ311762A (en) |
| PL (1) | PL187266B1 (en) |
| PT (1) | PT841939E (en) |
| RU (1) | RU2203088C2 (en) |
| SI (1) | SI0841939T1 (en) |
| WO (1) | WO1997002045A1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7588763B2 (en) | 1995-07-05 | 2009-09-15 | Trident Pharmaceuticals, Inc. | Methods for the prevention against or treatment of diabetes with ETXB and/or insulin |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9326174D0 (en) * | 1993-12-22 | 1994-02-23 | Biocine Sclavo | Mucosal adjuvant |
| US7097845B2 (en) | 1997-04-23 | 2006-08-29 | Jacob Sten Petersen | Combinations of antigen and mucosal binding component for inducing specific immunological tolerance |
| GB9800487D0 (en) | 1998-01-09 | 1998-03-04 | Oratol Limited | Therapies |
| GB9801871D0 (en) * | 1998-01-28 | 1998-03-25 | Univ Bristol | Therapies |
| US7914791B1 (en) * | 1998-05-08 | 2011-03-29 | Trident Pharmaceuticals, Inc. | Vaccine |
| HUP0104842A3 (en) * | 1998-05-08 | 2002-12-28 | Univ Bristol Bristol | Vaccine |
| CA2391415C (en) * | 1999-11-12 | 2013-08-06 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Methods of treating inflammatory bowel disease using cholera toxin b subunit |
| US7041296B1 (en) | 1999-11-12 | 2006-05-09 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Methods of treating inflammatory bowel disease using cholera toxin B subunit |
| CA2358061A1 (en) * | 2000-09-08 | 2002-03-08 | Stemcell Technologies Inc. | Novel antibody compositions for the negative selection of specific rat leukocyte subsets |
| GB0115382D0 (en) | 2001-06-22 | 2001-08-15 | Univ Bristol | Mutant |
| US20050084967A1 (en) | 2002-06-28 | 2005-04-21 | Xcyte Therapies, Inc. | Compositions and methods for eliminating undesired subpopulations of T cells in patients with immunological defects related to autoimmunity and organ or hematopoietic stem cell transplantation |
| JP6448554B2 (en) | 2013-02-14 | 2019-01-09 | コーネル ユニバーシティー | Methods for preventing and treating multiple sclerosis |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5571787A (en) * | 1993-07-30 | 1996-11-05 | Myelos Corporation | Prosaposin as a neurotrophic factor |
| US5681571A (en) * | 1993-10-08 | 1997-10-28 | Duotol Ab | Immunological tolerance-inducing agent |
-
1995
- 1995-07-05 GB GBGB9513733.7A patent/GB9513733D0/en active Pending
-
1996
- 1996-07-05 CA CA2225788A patent/CA2225788C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-05 HU HU9900147A patent/HU224248B1/en not_active IP Right Cessation
- 1996-07-05 PT PT96922162T patent/PT841939E/en unknown
- 1996-07-05 DK DK96922162T patent/DK0841939T3/en active
- 1996-07-05 AU AU63142/96A patent/AU724516B2/en not_active Expired
- 1996-07-05 EP EP96922162A patent/EP0841939B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-05 WO PCT/GB1996/001614 patent/WO1997002045A1/en active IP Right Grant
- 1996-07-05 RU RU98101907/14A patent/RU2203088C2/en active
- 1996-07-05 NZ NZ311762A patent/NZ311762A/en not_active IP Right Cessation
- 1996-07-05 DE DE69633393T patent/DE69633393T2/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-05 CZ CZ0001298A patent/CZ298670B6/en not_active IP Right Cessation
- 1996-07-05 JP JP50492797A patent/JP4024298B2/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-07-05 SI SI9630697T patent/SI0841939T1/en unknown
- 1996-07-05 CN CNB961962585A patent/CN1313150C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-05 ES ES96922162T patent/ES2229276T3/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-05 AT AT96922162T patent/ATE275968T1/en active
- 1996-07-05 PL PL96324424A patent/PL187266B1/en unknown
- 1996-07-05 KR KR1019970709899A patent/KR100452000B1/en not_active IP Right Cessation
-
1997
- 1997-12-29 US US08/999,458 patent/US6287563B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-01-02 NO NO19980005A patent/NO319747B1/en not_active IP Right Cessation
- 1998-01-07 MX MX9800241A patent/MX9800241A/en active IP Right Grant
- 1998-06-02 HK HK98104738A patent/HK1006496A1/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ELSON et al. Morfologic and functional alterations of Mucosal Т-cells by cholera toxin and its B-subunit. J. of Immunology, 1995, v.154, pp.3611-3617. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7588763B2 (en) | 1995-07-05 | 2009-09-15 | Trident Pharmaceuticals, Inc. | Methods for the prevention against or treatment of diabetes with ETXB and/or insulin |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0722463B1 (en) | Methods and composition for the modulation of host immune response to allergens | |
| Zeitz et al. | Mucosal T cells provide helper function but do not proliferate when stimulated by specific antigen in lymphogranuloma venereum proctitis in nonhuman primates | |
| Trembleau et al. | Deviation of pancreas‐infiltrating cells to Th2 by interleukin‐12 antagonist administration inhibits autoimmune diabetes | |
| JP3098739B2 (en) | Inducers of antigen-specific T cell tolerance | |
| RU2203088C2 (en) | Therapeutic agents and autoimmune diseases | |
| Doe | The intestinal immune system. | |
| JPH09512271A (en) | Methods for inducing T cell resistance in tissue or organ transplants | |
| US20140322274A1 (en) | Therapeutic Agents | |
| Zafiropoulos et al. | Induction of antigen-specific isotype switching by in vitro immunization of human naive B lymphocytes | |
| Gieni et al. | Allergen-specific modulation of cytokine synthesis patterns and IgE responses in vivo with chemically modified allergen. | |
| Ruedl et al. | Humoral and cellular immune responses in the murine respiratory tract following oral immunization with cholera toxin or Escherichia coli heat-labile enterotoxin | |
| Kiyono et al. | Contrasuppression in the mucosal immune system | |
| Mårtensson et al. | Enhancement of specific immunoglobulin production in SCID-hu-PBL mice after in vitro priming of human B cells with superantigen. | |
| Kanellopoulos-Langevin et al. | Regulation of anti-hapten antibody responses in vivo: memory, carrier-specific Lyt-2+ T cells can terminate antibody production without altering the peak of response. | |
| Yamashita et al. | Schistosoma japonicum soluble egg antigens activate naive B cells to produce antibodies: definition of parasite mechanisms of immune deviation. | |
| WO1997038089A1 (en) | Uses of oncofetal antigen specific cd4, cd8 cytotoxic and suppressor t cells and interleukin-10 | |
| Schilizzi et al. | Increased production of antigen-specific B lymphocytes during in vitro immunization using carrier-specific T helper hybridomas | |
| CA2131898A1 (en) | Methods and compositions for the modulation of host immune response to allergens | |
| Martin | Immunomodulatory effects of type I and type II heat-labile enterotoxins on mucosal and systemic immunity | |
| Samodal et al. | Immunomodulatory Effects by a Heat Shock Protein dnaJ-Derived Peptide in Rheumatoid Arthritis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC4A | Invention patent assignment |
Effective date: 20051229 |
|
| PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20111003 |