RU2198900C2

RU2198900C2 - Improved copolymer-1 and method of preparation thereof

Info

Publication number: RU2198900C2
Application number: RU2000100831A
Authority: RU
Inventors: Элизер Конфайно; Майкл Села; Двора Тайтельбаум; Рут Арнон
Original assignee: Еда Рисерч энд Дивелопмент Ко., Лтд.
Priority date: 1994-05-24
Filing date: 1995-05-23
Publication date: 2003-02-20
Also published as: RU2161489C2; ZA954220B

Abstract

FIELD: polymer production. SUBSTANCE: invention provides method for preparation of copolymer- 1 representing mixture of polypeptides constituted by alanine, glutamic acid, lysine, and tyrosine at molar ratio approximately 6:2:5:1 and having molecular weight about 5 to 9 kDa, which consists in reaction of protected copolymer-1 with hydrobromic acid to form trifluoroacetyl-copolymer-1 and treatment of the latter with aqueous solution of piperidine to give copolymer-1, which, after purification, has required molecular weight. Copolymer-1 is used for treatment of disseminated sclerosis. EFFECT: improved preparation procedure. 6 cl, 2 dwg, 1 tbl, 4 ex

Description

Уровень техники
Сополимер-1 - синтетический полипептидный аналог основного белка миелина (ОБМ), который является природным компонентом миелиновой оболочки. Он был предложен в качестве потенциального терапевтического средства против рассеянного склероза (Eur J.lmmunol. [1971] 1:242; and J.Neurol. Sci. [1977] 31: 433). Все приведенные здесь ссылки полностью включены в эту заявку. Интерес к сополимеру-1 как иммунотерапевтическому средству против рассеянного склероза возник в 1950-х годах, когда обнаружили, что компоненты миелина, такие как ОБМ, предотвращают или задерживают экспериментальный аутоиммунный инцефаломиелит (ЭАИ). ЭАИ является заболеванием, имеющим сходство с рассеянным склерозом, которое может быть вызвано у подверженных этому заболеванию животных.State of the art
Copolymer-1 is a synthetic polypeptide analogue of the myelin basic protein (MBP), which is a natural component of the myelin sheath. It has been proposed as a potential therapeutic agent for multiple sclerosis (Eur J. lmmunol. [1971] 1: 242; and J. Neurol. Sci. [1977] 31: 433). All references cited herein are fully incorporated in this application. Interest in copolymer-1 as an immunotherapeutic agent against multiple sclerosis arose in the 1950s when it was discovered that myelin components, such as MBP, prevent or delay experimental autoimmune encephalomyelitis (EAI). EAI is a disease resembling multiple sclerosis that can be caused in animals affected by this disease.

Сополимер-1 был разработан докторами Села, Арноном и их коллегами в институте Вейсмана (Реховот, Израиль). Было показано, что он подавляет ЭАИ (Eur. J.lmmunol. [1971] 1:242, U.S. Patent 3849550). В последнее время было показано, что сополимер-1 оказывает благоприятное воздействие на пациентов с обостряющейся и ослабевающей формой рассеянного склероза (N. Engl. J.Med. [1987] 317: 408). У пациентов, которым ежедневно вводили сополимер-1, отмечено меньше случаев обострения и меньшее возрастание нетрудоспособности по сравнению с контрольными пациентами. Copolymer-1 was developed by doctors Sela, Arnon and their colleagues at the Weisman Institute (Rehovot, Israel). It has been shown to suppress EAI (Eur. J. lmmunol. [1971] 1: 242, U.S. Patent 3849550). Recently, it has been shown that copolymer-1 has a beneficial effect on patients with an exacerbating and weakening form of multiple sclerosis (N. Engl. J. Med. [1987] 317: 408). In patients who were injected with copolymer-1 daily, fewer cases of exacerbation and a smaller increase in disability were noted compared with control patients.

Сополимер-1 - это смесь полипептидов, состоящих из аланина, глутаминовой кислоты, лизина и тирозина в молярном соотношении примерно 6:2:5:1 соответственно. Его синтезируют, полимеризуя эти четыре аминокислоты с образованием продуктов со средней молекулярной массой 23000 Да (Патент США 3849550). Copolymer-1 is a mixture of polypeptides consisting of alanine, glutamic acid, lysine and tyrosine in a molar ratio of about 6: 2: 5: 1, respectively. It is synthesized by polymerizing these four amino acids to form products with an average molecular weight of 23,000 Da (US Patent 3,849,550).

Задачей изобретения является получение усовершенствованной композиции сополимера-1. The objective of the invention is to obtain an improved composition of the copolymer-1.

Краткое описание сущности изобретения
Изобретение относится к композиции сополимера-1, по существу свободной от сополимера-1, с молекулярной массой более 40 кДа.SUMMARY OF THE INVENTION
The invention relates to a composition of copolymer-1, essentially free of copolymer-1, with a molecular weight of more than 40 kDa.

Кроме того, изобретение относится к сополимеру-1, в котором молярная доля с молекулярной массой примерно от 2 кДа до примерно 20 кДа превышает 75%. In addition, the invention relates to copolymer-1, in which a molar fraction with a molecular weight of from about 2 kDa to about 20 kDa exceeds 75%.

Дополнительно, изобретение относится к сополимеру-1 со средней молекулярной массой примерно от 4 кДа до примерно 8,6 кДа. Additionally, the invention relates to copolymer-1 with an average molecular weight of from about 4 kDa to about 8.6 kDa.

Изобретение также относится к фармацевтической композиции и к способу лечения рассеянного склероза с применением описанного сополимера-1. The invention also relates to a pharmaceutical composition and to a method for treating multiple sclerosis using the described copolymer-1.

Краткое описание графических материалов
На фиг. 1 показано распределение молекулярной массы трех проб сополимера-1 и пропорция видов с молекулярной массой выше 40 кДа. На фиг.2 показаны те же данные, относящиеся к молярной доле.A brief description of the graphic materials
In FIG. Figure 1 shows the molecular weight distribution of the three samples of copolymer-1 and the proportion of species with a molecular weight above 40 kDa. Figure 2 shows the same data related to the molar fraction.

Подробное описание сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к композиции сополимера-1, по существу свободной от сополимера-1, имеющего молекулярную массу более 40 кДа. Эта композиция предпочтительно содержит менее 5% сополимера-1, имеющего молекулярную массу 40 кДа или более. Более предпочтительно композиция содержит менее 2,5% сополимера-1, имеющего молекулярную массу 40 кДа или более.Detailed Description of the Invention
The present invention relates to a copolymer-1 composition substantially free of copolymer-1 having a molecular weight of more than 40 kDa. This composition preferably contains less than 5% copolymer-1 having a molecular weight of 40 kDa or more. More preferably, the composition contains less than 2.5% copolymer-1 having a molecular weight of 40 kDa or more.

Изобретение относится также к сополимеру-1, в котором молярная фракция с молекулярной массой примерно от 2 кДа до примерно 20 кДа превышает 75%. The invention also relates to copolymer-1, in which a molar fraction with a molecular weight of from about 2 kDa to about 20 kDa exceeds 75%.

Дополнительно, изобретение относится к сополимеру-1 со средней молекулярной массой от примерно 4 до примерно 8,6 кДа. В частности изобретение относится к сополимеру-1 со средней молекулярной массой от примерно 4 до примерно 8 кДа и к сополимеру-1 со средней молекулярной массой от примерно 6,25 до примерно 8,4 кДа. Additionally, the invention relates to copolymer-1 with an average molecular weight of from about 4 to about 8.6 kDa. In particular, the invention relates to copolymer-1 with an average molecular weight of from about 4 to about 8 kDa and to copolymer-1 with an average molecular weight of from about 6.25 to about 8.4 kDa.

Сополимер-1 согласно изобретению может быть получен известными способами, например способом, изложенным в патенте США 3849550, согласно которому N-карбоксиангидриды тирозина, аланина, у-бензилглутамата и Е-N-трифторацетиллизина полимеризуют при температуре окружающей среды в безводном диоксане с диэтиламином в качестве инициатора. Деблокирование у-карбоксильной группы глутаминовой кислоты осуществляют бромистым водородом в ледяной уксусной кислоте с последующим удалением трифторацетильных групп из остатков лизина 1 М-ным пиперидином. В заявке термины "температура окружающей среды" и "комнатная температура" следует понимать как температуру от примерно 20 до примерно 26^oС.The copolymer-1 according to the invention can be obtained by known methods, for example, the method set forth in US Pat. initiator. The release of the y-carboxyl group of glutamic acid is carried out with hydrogen bromide in glacial acetic acid, followed by removal of trifluoroacetyl groups from lysine residues with 1 M-piperidine. In the application, the terms "ambient temperature" and "room temperature" should be understood as a temperature of from about 20 to about 26 ^o C.

Сополимер-1 с требуемым профилем молекулярной массы может быть получен по существу любым известным способом. Такие способы включают хроматографию сополимера-1, содержащего высокомолекулярные виды, и сбор фракций без нежелательных видов, или частичный кислый или ферментативный гидролиз для удалений высокомолекулярных видов с последующей очисткой диализом или ультрафильтрацией. Другой способ получения сополимера-1 с желаемым профилем молекулярной массы заключается в получении желаемого вида с защищенными аминокислотами и последующем получении необходимого вида непосредственно при снятии защиты. Композиции согласно изобретению могут быть составлены общеизвестными способами. Предпочтительно композицию лиофилизуют или готовят в виде водного раствора, пригодного для подкожной инъекции. Альтернативно, сополимеру-1 можно придать любую из форм, известных для приготовления пептидных лекарств для перорального, назального, буккального или ректального введения. The copolymer-1 with the desired molecular weight profile can be obtained essentially by any known method. Such methods include chromatography of copolymer-1 containing high molecular weight species, and collection of fractions without undesirable species, or partial acidic or enzymatic hydrolysis to remove high molecular weight species, followed by purification by dialysis or ultrafiltration. Another way to obtain copolymer-1 with the desired molecular weight profile is to obtain the desired species with protected amino acids and then obtain the desired species immediately upon deprotection. Compositions according to the invention can be formulated by well-known methods. Preferably, the composition is lyophilized or prepared as an aqueous solution suitable for subcutaneous injection. Alternatively, copolymer-1 can be given any of the forms known for the preparation of peptide drugs for oral, nasal, buccal or rectal administration.

Обычно пациентам, страдающим рассеянным склерозом, сополимер-1 вводят ежедневно в дозах по 20 мг. Typically, for patients suffering from multiple sclerosis, copolymer-1 is administered daily in doses of 20 mg.

Изобретение описано в примерах, не ограничивающих его объем. The invention is described in the examples, not limiting its scope.

Пример 1
Хроматографический способ получения низкотоксичного сополимера-1
Две пробы сополимера-1 получили известным способом, например, по патенту США 3849550.Example 1
Chromatographic method for producing a low toxicity copolymer-1
Two samples of copolymer-1 were obtained in a known manner, for example, according to US patent 3849550.

Затем одну пробу подвергли хроматографическому разделению, как описано ниже. Then one sample was subjected to chromatographic separation, as described below.

Колонку для гельфильтрации FRACTOGEL TSK HWSS (600•26 мм) приготовили в патроне Superbormance 26 Merck согласно инструкции изготовителя. Колонку уравновесили водой и впрыснули раствор ацетона для определения общего объема. Колонку уравновесили 0,2 М-ным буфером ацетата аммония с pH 5,0, нанесли на нее 30 мл проб сополимера-1 (20 мг/мл, в 0,2 М-ном буфере ацетата аммония, pH 5,0), и каждые 10 мин отбирали фракции. Фракция со средней молекулярной массой 7-8 кДа была выделена между 120-130 минутами (Проба А). The FRACTOGEL TSK HWSS gel filtration column (600 x 26 mm) was prepared in a Superbormance 26 Merck cartridge according to the manufacturer's instructions. The column was equilibrated with water and an acetone solution was injected to determine the total volume. The column was equilibrated with a 0.2 M buffer of ammonium acetate with a pH of 5.0, 30 ml of copolymer-1 samples were applied to it (20 mg / ml, in a 0.2 M buffer of ammonium acetate, pH 5.0), and fractions were taken every 10 min. A fraction with an average molecular weight of 7-8 kDa was isolated between 120-130 minutes (Sample A).

Анализ молекулярной массы
Поглощение ультрафиолетового света (ПУС) при 275 нм определяли на спектрофотометре UVIKON 810. Образцы разбавляли для достижения уровня ПУС ниже 1 единицы поглощения. Молекулярное распределение 2-х проб определяли на калиброванной гельфильтрационной колонке (Superose 12).Molecular weight analysis
Absorption of ultraviolet light (CEM) at 275 nm was determined on a UVIKON 810 spectrophotometer. Samples were diluted to achieve a CEM level below 1 absorption unit. The molecular distribution of 2 samples was determined on a calibrated gel filtration column (Superose 12).

Было обнаружено, что проба А сополимера-1 имела среднюю молекулярную массу 7-8 кДа. В этой пробе из всех видов сополимера-1 2,5% имели молекулярную массу выше 32 кДа, и не было видов сополимера-1 с молекулярной массой более 40 кДа. It was found that sample A of copolymer-1 had an average molecular weight of 7-8 kDa. In this sample, of all types of copolymer-1, 2.5% had a molecular weight higher than 32 kDa, and there were no types of copolymer-1 with a molecular weight of more than 40 kDa.

Средняя молекулярная масса другой, не подвергнутой хроматографическому разделению пробы сополимера-1 составила 12 кДа. В этой пробе из всех видов сополимера-1 2,5% имели молекулярную массу выше 42 кДа, а 5% - более 40 кДа. The average molecular weight of another, not subjected to chromatographic separation of the copolymer-1 sample was 12 kDa. In this sample, of all types of copolymer-1, 2.5% had a molecular weight above 42 kDa, and 5% had more than 40 kDa.

Пример 2
Анализ на токсичность
A: In Vivo
Три пробы сополимера-1 со средней молекулярной массой 7,3, 8,4 кДа (менее 2,5% сополимера-1 имеет массу более 40 кДа) и 22 кДа (более 5% сополимера-1 имеет массу более 40 кДа) подвергли тесту на токсичность, как описано ниже. В каждом случае использовали по 5 мышей в каждой экспериментальной группе.Example 2
Toxicity test
A: In Vivo
Three samples of copolymer-1 with an average molecular weight of 7.3, 8.4 kDa (less than 2.5% of copolymer-1 has a mass of more than 40 kDa) and 22 kDa (more than 5% of copolymer-1 has a mass of more than 40 kDa) toxicity as described below. In each case, 5 mice were used in each experimental group.

Методика
Сополимер-1 растворили в дистиллированной воде для получения раствора с концентрацией активного ингредиента 2 мг/мл. Каждой мыши ввели 0,5 мл испытуемого раствора а вену хвоста. Мыши находились под наблюдением в течение более 48 часов для определения смертности и соответствующих клинических признаков. Результаты наблюдений записывали через 10 мин, 24 часа и 48 часов после инъекции Если к исходу 48 часов все животные были живы и никаких неблагоприятных признаков не было обнаружено, то такая проба считалась "нетоксичной". Если же одна или более чем одна мышь погибла или проявляла неблагоприятные признаки, то такая проба считалась "токсичной".Methodology
Copolymer-1 was dissolved in distilled water to obtain a solution with a concentration of the active ingredient of 2 mg / ml. Each mouse was injected with 0.5 ml of the test solution and a tail vein. Mice were monitored for more than 48 hours to determine mortality and related clinical signs. Observation results were recorded 10 minutes, 24 hours and 48 hours after injection. If by the end of 48 hours all the animals were alive and no adverse signs were found, then such a test was considered “non-toxic”. If one or more than one mouse died or showed adverse signs, then such a test was considered "toxic."

Пробы со средней молекулярной массой 7,3 и 8,4 кДа были отнесены к "нетоксичным", а в экспериментах с пробой со средней молекулярной массой 22 кДа 3 из 5 мышей погибли к исходу 48 часов, и поэтому ее признали "токсичной". Samples with an average molecular weight of 7.3 and 8.4 kDa were classified as "non-toxic", and in experiments with a sample with an average molecular weight of 22 kDa, 3 out of 5 mice died by the end of 48 hours, and therefore it was recognized as "toxic."

В: In Vitro
Тест на БЛК - дегрануляцию
I. Введение. Высвобождение из базофильных клеток гистамина (или серотонина) in vitro моделью повышенной чувствительности немедленного типа.In: In Vitro
BLK test - degranulation
I. Introduction. In vitro release of histamine (or serotonin) from basophilic cells by an immediate sensitivity model.

Была получена линия базофильных лейкозных клеток крыс (БЛК-2Н₃), которая представляла собой высоко чувствительную, однородную, легко поддерживаемую в культуре и репродуктивную систему (E.L.Basumian, C.Isersky, M.G.Petrino and R. P. Siraganian. Eur.J.Immunol. 11, 317 (1981)). Физиологический стимул для высвобождения гистамина предполагает связывание антигена с мембранно-связанными молекулами IgE, в результате чего возникают поперечные сшивки последних и последующий запуск сложного биохимического каскада. Кроме этих физиологических иммуноглобулинопосредствованных механизмов запуска дегрануляция может быть вызвана различными не-IgE-опосредствованными причинами. Среди них различные пептиды и синтетические полимеры, например полилилзин (R. P. Siraganian. Trends in Pharmacological Sciences, October 432 (1983)). Поэтому тест на БЛК-дегрануляцию используют, чтобы отобрать те пробы сополимера-1, которые вызывают существенную дегрануляцию и, таким образом, могут вызывать нежелательные локальные и/или системные побочные эффекты.A rat basophilic leukemia cell line (BLK-2H ₃ ) was obtained, which was a highly sensitive, homogeneous, easily maintained in culture and reproductive system (ELBasumian, C. Isersky, MG Petrino and RP Siraganian. Eur.J. Immmunol. 11, 317 (1981)). The physiological stimulus for histamine release involves the binding of antigen to membrane-bound IgE molecules, resulting in cross-linking of the latter and the subsequent launch of a complex biochemical cascade. In addition to these physiological immunoglobulin-mediated triggering mechanisms, degranulation can be caused by various non-IgE-mediated causes. Among them are various peptides and synthetic polymers, for example polylylzine (RP Siraganian. Trends in Pharmacological Sciences, October 432 (1983)). Therefore, the BLK degranulation test is used to take those samples of copolymer-1 that cause significant degranulation and, thus, can cause undesirable local and / or systemic side effects.

II. Основы методики испытаний. К базофильным лейкозным клеткам крыс (БЛК-2Н₃) добавляли [³H-серотонин и смесь инкубировали со 100 мг исследуемого сополимера-1. Пробы сополимера-1, вызывающие неспецифическую дегрануляцию, высвобождали [³Н]-серотонин в среду. Радиоактивность в среде определяли сцинтилляционным счетчиком, а общее количество включенного в клетки серотонина определяли в осажденных клетках. Степень дегрануляции вычисляли в процентном отношении высвобожденного из клеток серотонина к общему количеству включенного в клетки.II. Fundamentals of the test procedure. [ ³ H-serotonin was added to rat basophilic leukemia cells (BLK-2H ₃ ) and the mixture was incubated with 100 mg of the studied copolymer-1. Samples of copolymer-1 causing non-specific degranulation released [ ³ H] -serotonin into the medium. Radioactivity in the medium was determined by a scintillation counter, and the total amount of serotonin incorporated into the cells was determined in the precipitated cells. The degree of degranulation was calculated as a percentage of serotonin released from cells to the total amount incorporated into cells.

III. Результаты. Четыре пробы сополимера-1 со средней молекулярной массой в интервале 6250-14500 исследовали для определения в процентах доли видов с молекулярной массой более 40 кДа и на БЛК-дегрануляцию. Результаты обобщены в таблице. III. Results. Four samples of copolymer-1 with an average molecular weight in the range of 6250-14500 were examined to determine the percentage of species with a molecular weight of more than 40 kDa and for BLK degranulation. The results are summarized in the table.

Как видно, когда % сополимера-1 с высокой молекулярной массой низок (<2,5),% выделенного как индикатор токсичности серотонина низок, и наоборот. As can be seen, when% of high molecular weight copolymer-1 is low (<2.5),% of serotonin released as an indicator of toxicity is low, and vice versa.

Пример 3
Получение трифторацетилсополимера-1
Защищенный сополимер-1 получали, как описано Тейтельбаумом и др. (Eur. J. Immun. Vol.1 p.242 (1971)) из растворенных в 3,5 л диоксана 18 г N-карбоксиангидридов тинозина, 50 г аланина, 35 г у-бензилглутамата и 83 г трифторацетиллизина.Example 3
Obtaining trifluoroacetyl copolymer-1
The protected copolymer-1 was prepared as described by Teitelbaum et al. (Eur. J. Immun. Vol.1 p.242 (1971)) from 18 g of tinosin N-carboxyanhydrides dissolved in 3.5 l of dioxane, 50 g of alanine, 35 g y-benzylglutamate and 83 g of trifluoroacetyl lysine.

Процесс полимеризации инициировали добавлением 0,01-0,02% диэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов, а затем вливали в 10 литров воды. Продукт (защищенный сополимер-1) отфильтровывали, промывали водой и высушивали. Удаление гамма-бензильных блокирующих групп из остатков глутамата осуществляли обработкой защищенного сополимера-1 33%-ной бромистоводородной кислотой при комнатной температуре в течение 6-12 часов при перемешивании. Продукт вливали в избыточное количество воды, отфильтровывали, промывали и высушивали, получая на выходе трифторацетилсополимер-1. The polymerization process was initiated by the addition of 0.01-0.02% diethylamine. The reaction mixture was stirred at room temperature for 24 hours, and then poured into 10 liters of water. The product (protected copolymer-1) was filtered off, washed with water and dried. The removal of gamma-benzyl blocking groups from glutamate residues was carried out by treating the protected copolymer-1 with 33% hydrobromic acid at room temperature for 6-12 hours with stirring. The product was poured into excess water, filtered off, washed and dried, yielding trifluoroacetyl copolymer-1 at the outlet.

Пример 4
Получение трифторацетилсополимера-1
Защищенный сополимер-1 получают, как описано Тейтельбаумом (Eur. J.Immun. Vol.1 p.242 (1971)) из растворенных в 3,5 литрах диоксана N-карбоксиангидридов тинозина (18 г), аланина (50 г), τ-бензилглутамата (35 г) и трифторацетиллизина (83 г).Example 4
Obtaining trifluoroacetyl copolymer-1
The protected copolymer-1 is prepared as described by Teitelbaum (Eur. J. Immun. Vol.1 p.242 (1971)) from Tinosin N-carboxyanhydrides (18 g), alanine (50 g) dissolved in 3.5 liters of dioxane -benzylglutamate (35 g) and trifluoroacetyl lysine (83 g).

Процесс полимеризации инициировали добавлением 0,01-0,02% диэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов, а затем вливали в 10 л воды. Продукт (защищенный сополимер-1) отфильтровывали, промывали водой и высушивали. The polymerization process was initiated by the addition of 0.01-0.02% diethylamine. The reaction mixture was stirred at room temperature for 24 hours, and then poured into 10 L of water. The product (protected copolymer-1) was filtered off, washed with water and dried.

Защищенный сополимер-1 обрабатывали 33%-ной НВr в уксусной кислоте, удаляя защитную омега-бензильную группу из 5-карбоксилатного остатка глутамата, и расщепляли полимер на более короткие полипептиды. Время, необходимое для получения сополимера-1 с молекулярной массой 7000±2000 Да, зависит от температуры реакции и размера защищенного сополимера-1. При температуре между 20-28^oС тест-реакцию проводили для каждой пробы в течение разных периодов времени, например от 10-50 часов.The protected copolymer-1 was treated with 33% HBr in acetic acid, removing the protective omega-benzyl group from the 5-carboxylate residue of glutamate, and the polymer was split into shorter polypeptides. The time required to obtain copolymer-1 with a molecular weight of 7000 ± 2000 Da depends on the reaction temperature and the size of the protected copolymer-1. At a temperature between 20-28 ^o With the test reaction was carried out for each sample for different periods of time, for example from 10-50 hours.

Результаты, касающиеся молекулярных масс, в этих маломасштабных реакциях подсчитывали и строили кривую зависимости молекулярной массы от времени. Время, необходимое для получения молекулярной массы 7000±2000 Да, рассчитывали по кривой, и этот показатель использовали при реакциях большего масштаба. В среднем при 26^oС время составляет 17 часов. Продукт вливали в избыточное количество воды, отфильтровывали, промывали и высушивали, получая на выходе трифторацетилсополимер-1.Molecular mass results in these small-scale reactions were calculated and plotted against molecular time. The time required to obtain a molecular weight of 7000 ± 2000 Da was calculated from the curve, and this indicator was used in larger scale reactions. On average at 26 ^o With the time is 17 hours. The product was poured into excess water, filtered off, washed and dried, yielding trifluoroacetyl copolymer-1 at the outlet.

Получение низкотоксичного сополимера-1
20 г трифторацетилсополимера-1 диспергировали в 1 л воды и добавляли 100 г пиперидина. Смесь перемешивали в течение 24 часов при комнатной температуре и фильтровали. Раствор сырого сопопимера-1 распределяли в камеры для диализа и диализовали при 10^o-20^oC против воды до достижения pH=8. Затем проводили диализ против 0,3% уксусной кислоты и снова против воды до получения pH=5,5-6,0. Затем раствор концентрировали и лиофилизовали.Obtaining a low toxicity copolymer-1
20 g of trifluoroacetyl copolymer-1 was dispersed in 1 L of water and 100 g of piperidine was added. The mixture was stirred for 24 hours at room temperature and filtered. The crude copopimer-1 solution was distributed into dialysis chambers and dialyzed at 10 ^° -20 ^° C against water until a pH of 8 was reached. Then dialysis was performed against 0.3% acetic acid and again against water until a pH of 5.5-6.0 was obtained. Then the solution was concentrated and lyophilized.

Claims

1. A method of manufacturing a copolymer-1, which is a mixture of polypeptides consisting of alanine, glutamic acid, lysine and tyrosine in a molar ratio of about 6: 2: 5: 1, with a molecular weight of from about 5 to 9 kDa, in which the protected copolymer-1 with hydrobromic acid to form trifluoroacetyl copolymer-1, treating said trifluoroacetyl copolymer-1 with an aqueous piperidine solution to form copolymer-1, and purifying said copolymer-1 to obtain copolymer-1 with molecular weight soi from about 5 to about 9 kD.

2. The method according to claim 1, characterized in that the interaction of the specified protected copolymer-1 with hydrobromic acid is carried out for about 10-50 hours at a temperature of about 20-28 ^o C.

3. The method according to claim 2, characterized in that the interaction of the specified protected copolymer-1 with hydrobromic acid is carried out for about 17 hours at a temperature of about 26 ^o C.

4. The copolymer-1, which is a mixture of polypeptides consisting of alanine, glutamic acid, lysine and tyrosine in a molar ratio of about 6: 2: 5: 1, with a molecular weight of about 5 to 9 kDa, obtained by a method involving the interaction of the protected copolymer -1 with hydrobromic acid to form trifluoroacetyl copolymer-1, treatment of said trifluoroacetyl copolymer-1 with an aqueous solution of piperidine to form copolymer-1, and purification of copolymer-1 to obtain copolymer-1 with a molecular weight of about 5 to 9 kDa.

5. Copolymer-1 according to claim 4, characterized in that the interaction of the specified protected copolymer-1 with hydrobromic acid is carried out for about 10-50 hours at a temperature of about 20-28 ^o C.

6. Copolymer-1 according to claim 5, characterized in that the interaction of the specified protected copolymer-1 with hydrobromic acid is carried out for about 17 hours at a temperature of about 26 ^o C.